DE102004038443A1 - Process for the enzymatic preparation and / or modification of phospholipids - Google Patents

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Tatjana Allin
Geoffrey Hills
Katrin Häser
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden beansprucht, bei dem der Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD) durchgeführt wird, die aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis stammt. Das Enzym kann bei diesem Verfahren sowohl in aufgereinigter Form als auch als rohe oder teilaufgereinigte PLD-haltige Fermentationsbrühe auch in immobilisierter Form eingesetzt werden. Als Ausgangsmaterial kommen Lecithine in Frage, die in Gegenwart zweiwertiger Metallionen bei pH-Werten zwischen 4,0 und 9,0 sowie Reaktionstemperaturen zwischen 5 bis 60 DEG C insbesondere zu Phosphatidylsäure, Phosphatidylserin, Phosphahatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinisitol und/oder Phosphatidylglycerin umgesetzt werden. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch seine Wirkungsspezifizität und die ausgeprägte Aktivität der eingesetzten PLD aus, wobei die erhaltenen Reaktionslösungen beinahe frei von Phosphatidylsäure sind.A process for the enzymatic production and / or modification of phospholipids is claimed in which the headgroup exchange is carried out with the aid of phospholipase D (PLD), which originates from Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis and / or Streptomyces netropsis. The enzyme can be used in this process both in purified form and as a crude or partially purified PLD-containing fermentation broth in immobilized form. Suitable starting materials are lecithins which are reacted in the presence of divalent metal ions at pH values between 4.0 and 9.0 and reaction temperatures between 5 and 60 ° C., in particular to phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphahatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinisitol and / or phosphatidylglycerol. The method is characterized in particular by its effect specificity and the pronounced activity of the PLD used, wherein the reaction solutions obtained are almost free of phosphatidic acid.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden durch Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD).object The present invention is a method for enzymatic production and / or Modification of phospholipids by headgroup exchange with help of phospholipase D (PLD).

Verfahren zur Herstellung von Phospholipiden unter Verwendung von Enzymen und insbesondere Phospholipase D sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt, wobei das Hauptaugenmerk auf nachgeschalteten Aufreinigungs- und Abtrennungsschritten zur Gewinnung hochreiner Phospholipide liegt. Beispielhaft verwiesen sei in diesem Zusammenhang auf das Patentdokument EP 1048738 B1 , welches ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserinen beschreibt, bei dem Phosphatide mit Serin in Gegenwart einer Phospholipase D umgesetzt werden. Das Reaktionsmedium stellt eine wässrige Dispersion dar und die Reaktion verläuft in Gegenwart mindestens eines oberflächenaktiven Mittels. Bezüglich der eingesetzten PLD ist angegeben, dass diese durch den Stamm Streptomyces ATCC 55717 produziert wurde.Methods for the preparation of phospholipids using enzymes, and in particular phospholipase D, are well known in the art, with a focus on subsequent purification and separation steps to obtain high purity phospholipids. By way of example, reference is made in this connection to the patent document EP 1048738 B1 , which describes a process for the preparation of phosphatidylserines in which phosphatides are reacted with serine in the presence of a phospholipase D. The reaction medium is an aqueous dispersion and the reaction proceeds in the presence of at least one surfactant. With regard to the PLD used, it is stated that this was produced by the strain Streptomyces ATCC 55717.

Aus dem japanischen Patentdokument, veröffentlicht unter der Nr. 02079990, ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatidylserin bekannt, bei dem zur Umsetzung von Phosphatidylcholin und Serin eine Phospholipase D eingesetzt wird, die aus Streptomyces stammt.Out Japanese Patent Document Publication No. 02079990, is also a process for the production of phosphatidylserine known in which for the implementation of phosphatidylcholine and serine a phospholipase D is used which originates from Streptomyces.

Das japanische Patentdokument Nr. 2001-279612 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Phosphatiden, wobei die Ausgangsphosphatide mit einer Alkohol-Komponente in einem einphasigen wässrigen System mit einer Phospholipase D umgesetzt werden, die eine Transphosphatidylierungsaktivität besitzt und durch Streptoverticillium hachijoense (ATCC 19769) produziert wird.The Japanese Patent Document No. 2001-279612 describes a method for the preparation of phosphatides, wherein the Ausgangsphosphatide with an alcohol component in a single-phase aqueous System can be reacted with a phospholipase D, which has a Transphosphatidylierungsaktivität and produced by Streptoverticillium hachijoense (ATCC 19769) becomes.

Gegenstand der internationalen Patentanmeldung WO 02/12485 ist ein Promoter aus der DNA von Streptoverticillium cinnamoneum, mit dem es möglich sein soll, spezielle Eiweiß-Verbindungen, wie bspw. Phospholipase D, herzustellen.object International patent application WO 02/12485 is a promoter from the DNA of Streptoverticillium cinnamoneum with which it may be possible should, special protein compounds, such as For example, phospholipase D to produce.

Gemäß dem Dokument CA 2,005,990 können Phospholipid-Vitamin-Konjugate enzymatisch hergestellt werden, indem eine Phospholipase D eingesetzt wird, die aus Streptomyces-Stämmen und insbesondere Streptoverticillium flavopersicum stammt. Hierbei wird insbesondere von Dimyristoylphosphatidylcholin und Pyridoxin oder Pyrodylcarbinol ausgegangen.According to the document CA 2,005,990 Vitamin phospholipid conjugates be prepared enzymatically by using a phospholipase D. is made from Streptomyces strains and in particular Streptoverticillium flavopersicum. in this connection is especially of dimyristoylphosphatidylcholine and pyridoxine or pyrodylcarbinol.

Streptomyces-Stämme werden generell für Fermentationsprozesse oder zur Gewinnung spezifischer Enzyme verwendet. So beschreibt bspw.Streptomyces strains are generally for fermentation processes or used to obtain specific enzymes. So describes for example.

EP 141 613 A1 u.a. ein Verfahren zur Herstellung des optisch aktiven 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-Serins unter Beteiligung von Streptomyces aureoverticillatus, Streptomyces bicolor, Streptomyces blastmyceticus, Streptomyces chartreusis, Streptomyces flavopersicus, Streptomyces flavotricini, Streptomyces hachijoensis, Streptomyces halstedii, Streptomyces tendae, Streptomyces toyocaensis, Streptoverticillium griseocarneum oder Streptoverticillium hiroshimense. Aus dem japanischen Patentdokument JP 83107175 ist ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterinoxidase bekannt, wobei das Enzym aus Streptomyces aspergilloides, Streptomyces capuensis, Streptomyces flavopersicus oder Streptomyces griseolavendus stammen kann. EP 141 613 A1 inter alia, a process for the preparation of optically active 3- (3,4-dihydroxyphenyl) serine with the participation of Streptomyces aureoverticillatus, Streptomyces bicolor, Streptomyces blastmyceticus, Streptomyces chartreusis, Streptomyces flavopersicus, Streptomyces flavotricini, Streptomyces hachijoensis, Streptomyces halstedii, Streptomyces tendae, Streptomyces toyocaensis, Streptoverticillium griseocarneum or Streptoverticillium hiroshimense. From the Japanese patent document JP 83107175 a process for the production of cholesterol oxidase is known, wherein the enzyme can be from Streptomyces aspergilloides, Streptomyces capuensis, Streptomyces flavopersicus or Streptomyces griseolavendus.

Die Herstellung von Phospholipiden mit Hilfe einer PLD aus Streptoverticillium cinneamoneum in Gegenwart von EDTA beschreibt JP 06269287 A2 .The production of phospholipids using a PLD from Streptoverticillium cinneamoneum in the presence of EDTA describes JP 06269287 A2 ,

Aus Biotechnology and Bioengineering 1994, 44 (10), 1193 bis 1198 ist die Herstellung von Phosphatidylethanolamin aus Phosphatidylcholin unter Verwendung einer Kulturbrühe eines Actinomyceten bekannt, wobei die ursprünglich geringe Selektivität durch Zugabe von EDTA in einem Zweiphasensystem deutlich gesteigert werden soll. Als typische Actinomyceten sind Streptomyces mediocidicus, Streptoverticillium cinnamoneum und Streptoverticillium hachijoense aufgeführt.Out Biotechnology and Bioengineering 1994, 44 (10), 1193-1198 the production of phosphatidylethanolamine from phosphatidylcholine using a culture broth an actinomycete known, the original low selectivity by Addition of EDTA can be significantly increased in a two-phase system should. Typical actinomycetes are Streptomyces mediocidicus, Streptoverticillium cinnamoneum and Streptoverticillium hachijoense.

Auch die beiden japanischen Patentdokumente JP 05336984 A2 und JP 05336984 A2 beschreiben die Verwendung einer Kulturbrühe von Streptoverticillium cinnamoneum, wobei Phosphatidylcholin zu Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylsäure in einem Zweiphasensystem umgesetzt wird.Also the two Japanese patent documents JP 05336984 A2 and JP 05336984 A2 describe the use of a culture broth of Streptoverticillium cinnamoneum wherein phosphatidylcholine is converted to phosphatidylethanolamine and phosphatidic acid in a two-phase system.

Die Herstellung von Phospholipase D mit Hilfe von bestimmten Streptomyces-Vertretern ist ebenfalls im Stand der Technik umfangreich vorbeschrieben. So ist der Publikation General of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2003), 23(2-5), 107 bis 115 die Konstruktion eines Überexprimierungssystems zur extrazellulären Produktion zu entnehmen, wobei die Umsetzung von Phosphatidylcholin zu Phosphatidylethanolamin im Vordergrund steht und zur Herstellung des Enzyms Streptoverticillium cinnamoneum eingesetzt wird. Die Herstellung von PLD mit Hilfe immobilisierter Zellen von Streptoverticillium cinnamoneum beschreibt Biotechnology Letters (1996), 18(8), 951 bis 956. Gemäß JP 05056776 A2 soll die Verbesserung der Transferase-Aktivität durch Zugabe von Phospholipiden in das Kulturmedium von bspw. Streptoverticillium möglich sein, wobei die Mikroorganismen anschließend im Zweiphasensystem eingesetzt werden. Die Isolation bzw. Aufreinigung einer PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum beschreiben SU 1125246 und SU 986923 sowie Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya (1982), 18(1), 41 bis 47.The preparation of phospholipase D with the aid of certain Streptomyces representatives is also extensively described in the prior art. For example, the publication General of Molecular Catalysis B: Enzymatic (2003), 23 (2-5), 107-115 discloses the construction of an overexpression system for extracellular production, focusing on the conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylethanolamine and the production of the enzyme Streptoverticillium cinnamoneum is used. The preparation of PLD using immobilized cells of Streptoverticillium cinnamoneum is described by Biotechnology Letters (1996), 18 (8), 951-956 JP 05056776 A2 should the improvement of the transferase activity by addition of phospholipids in the culture medium of, for example. Streptoverticillium be possible, the microorganisms then in the two-phase system be used. The isolation or purification of a PLD from Streptoverticillium cinnamoneum describes SU 1125246 and SU 986923 and Prikladnaya Biokhimiya i Mikrobiologiya (1982), 18 (1), 41 to 47.

Aus Biochimica et Biophysica Acta (2001), 1530(1), 23 bis 31 ist eine membrangebundene PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum bekannt, die ausschließlich hydrolytische Aktivität besitzt und Phosphatidylethanolamin sowie Phosphatidylserin als Substrate bevorzugt. Diese PLD ist nicht zu einer Transferase-Reaktion fähig.Out Biochimica et Biophysica Acta (2001), 1530 (1), 23 to 31 is a Membrane-bound PLD from Streptoverticillium cinnamoneum known the exclusively hydrolytic activity and phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine as Substrates preferred. This PLD is not a transferase reaction able to.

Die Reinigung, Sequenzierung und Charakterisierung einer sekretorischen PLD aus Streptoverticillium cinnamoneum beschreibt das Journal of Biochemistry (Tokyo) (1999), 125(2), 263 bis 269. Diese PLD katalysiert die Hydrolyse und die Transphosphatidylierung unterschiedlicher PLDs, wie bspw. Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylserin, wobei die eigentliche Transphosphatidylierungsaktion durch die Zugabe von Metallionen aktiviert wird.The Purification, sequencing and characterization of a secretory PLD from Streptoverticillium cinnamoneum describes the Journal of Biochemistry (Tokyo) (1999), 125 (2), 263-269. This PLD catalyzes the hydrolysis and the Transphosphatidylierung different PLDs, such as, for example, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine and Phosphatidylserine, wherein the actual Transphosphatidylierungsaktion activated by the addition of metal ions.

Im Hinblick auf die Herstellung von Phospholipiden in enzymatischen Systemen ist neben der Auswahl des geeigneten Reaktionssystems immer auch der Einsatz von Phospholipase D ausschlaggebend. Zwar sind aus dem Stand der Technik Phospholipasen D unterschiedlicher Herkunft bekannt, jedoch besteht nach wie vor der Bedarf nach neuen PLDs, insbesondere mit ausgeprägter Wirkungsspezifität.in the With regard to the production of phospholipids in enzymatic Systems is next to the selection of the appropriate reaction system always the use of phospholipase D is crucial. Although are from the Prior art phospholipases D of different origin known, however, there is still a need for new PLDs, in particular with pronounced Specificity of action.

Für die vorliegende Erfindung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden bereitzustellen, bei dem der Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD) durchgeführt wird. Die in diesem Verfahren eingesetzte PLD sollte eine ausgeprägte Wirkungsspezifität aufweisen, so dass nach Beendigung der Umsetzung das Reaktionsmedium arm an unreagierten Gehalten von eingesetzten Phospholipiden ist und gleichzeitig nur geringe Gehalte an unerwünschten Nebenprodukten aufweist. Außerdem sollte eine PLD eingesetzt werden, die nicht nur in stark aufgereinigter Form eingesetzt werden kann, sondern deren Aktivität ausreicht, um auch in Form einer wenig aufgereicherten Fermentations- oder Reaktionsbrühe eingesetzt zu werden.For the present The invention therefore has the task of providing a method for enzymatic production and / or modification of phospholipids in which the headgroup exchange with the aid of Phospholipase D (PLD) performed becomes. The PLD used in this process should have a distinct specificity of action, so that after completion of the reaction, the reaction medium poor unreacted levels of phospholipids used and simultaneously only low levels of unwanted by-products having. Furthermore should be used a PLD, which is not only in heavily purified Form can be used, but whose activity is sufficient also used in the form of a little-enriched fermentation or reaction broth to become.

Gelöst wurde diese Aufgabe mit einem entsprechenden Verfahren, bei dem eine Phospholipase D verwendet wird, die aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis stammt.Was solved this task with a corresponding method in which a phospholipase D is used, which consists of Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis and / or Streptomyces netropsis.

Überraschend wurde beim Einsatz dieses neuen Verfahrens festgestellt, dass nicht nur die Aufgabenstellung vollständig erfüllt wurde, indem die eingesetzten PLDs eine ausgeprägte Wirkungsspezifikät aufweisen und zudem auch in nicht-aufgereinigter Form zu zufriedenstellenden Umsätzen führen. Zusätzlich wurde nämlich auch gefunden, dass die Kopfgruppenaustauschreaktion, also die eigentliche Transphosphatidylierung nicht auf bestimmte Phospholipid-Vertreter beschränkt ist und dass die PLD auch in immobilisierter Form eingesetzt werden kann, was deren Verluste minimiert und zudem die Reaktion steuerbar macht. Diese Vorteile waren in Vorkenntnis der bislang bekannten Phospholipase D-Varianten nicht vorhersehbar.Surprised was found in the use of this new procedure that not only the task completely Fulfills was the fact that the PLDs used have a pronounced effect specificity and also in non-purified form to satisfactory sales to lead. In addition was namely also found that the Kopfgruppenaustauschreaktion, ie the actual Transphosphatidylierung is not limited to specific phospholipid agents and that the PLD can also be used in immobilized form, which minimizes their losses and also makes the reaction controllable. These advantages were in foreknowledge of the hitherto known phospholipase D variants unpredictable.

Wie bereits als überraschender Effekt angesprochen, handelt es sich bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Phospholipasen D um Enzyme mit einer ausgeprägten Aktivität. Es hat sich deshalb im vorliegenden Zusammenhang auch als vorteilhaft gezeigt, dass neben dem Einsatz der PLD in aufgereinigter Form auch eine rohe oder zumindest teilaufgereinigte PLD-haltige Fermentationsbrühe eingesetzt werden kann. Wie ebenfalls bereits erwähnt, entwickeln die von dieser Erfindung mitumfassten PLDs ihre Aktivität und Wirkungsspezifität auch in immobilisierter Form, wobei bevorzugt kovalente und/oder adsorbtive Bindungsarten für die Enzyme in Betracht kommen, was von der vorliegenden Erfindung ebenfalls mitumfasst wird.As already as a surprise Effect addressed, it is in the process of the invention used phospholipases D to enzymes with a pronounced activity. It has Therefore, in the present context also shown to be advantageous that in addition to the use of the PLD in a purified form and a crude or at least partially purified PLD-containing fermentation broth used can be. As already mentioned, they develop from this Invention also included their activity and specificity in PLDs immobilized form, preferably covalent and / or adsorbent Types of binding for the enzymes come into consideration, which is of the present invention is also included.

Die für das vorliegende Verfahren geeigneten Phospholipide sind zwar nicht auf bestimmte Varietäten beschränkt, jedoch hat es sich als empfehlenswert herausgestellt, wenn als Ausgangsmaterialien Lecithine und besonders bevorzugt Soja-, Rapsöl- oder Eigelb-Lecithine eingesetzt werden, wobei selbstverständlich auch entsprechende Mischungen Anwendung finden können. Auch die jeweils eingesetzte Menge des Ausgangsmaterials ist völlig unkritisch, so dass bevorzugte Mengen zwischen 1,0 und 20,0 Gew.-%, bezogen auf das Reaktionsgemisch, im Verfahren gemäß Erfindung eingesetzt werden können, wobei Dispersionen von Phospholipiden als besonders bevorzugt anzusehen sind. Besonders empfehlenswert sind Mengen, die zwischen 3,0 und 12,0 Gew.-% bzw. zwischen 5,0 und 9,0 Gew.-% liegen, wiederum bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch.The for the Although the present process suitable phospholipids are not on certain varieties limited, however, it has proved to be recommended if as starting materials Lecithins and particularly preferably soybean, rapeseed oil or egg yolk lecithins used being, of course It is also possible to use corresponding mixtures. Also the respectively used Amount of starting material is completely uncritical, so preferred Amounts between 1.0 and 20.0 wt .-%, based on the reaction mixture, in Process according to the invention can be used wherein dispersions of phospholipids are considered to be particularly preferred are. Especially recommended are quantities that are between 3.0 and 12.0 Wt .-% or between 5.0 and 9.0 wt .-%, in turn, based to the total reaction mixture.

Bezüglich der weiteren Reaktionsbedingungen ist festzustellen, dass diese ebenfalls vollkommen unkritisch sind. Im Sinne optimaler Ausbeuten und Umsatzraten empfiehlt die vorliegende Erfindung allerdings pH-Werte des Reaktionsgemisches, die zwischen 4,0 und 9,0 liegen, wobei Werte zwischen 5,0 und 7,5 als bevorzugt und pH-Werte zwischen 5,5 und 6,5 als besonders bevorzugt anzusehen sind. Die Reaktionstemperatur sollte sich zwischen 5 und 60 °C bewegen, wobei unter Beachtung des jeweils eingesetzten Ausgangsmaterials und des Reinheitsgrades der PLD Temperaturbereiche zwischen 20 und 50 °C bevorzugt werden und Temperaturen zwischen 25 und 45 °C als besonders geeignet zu betrachten sind.Regarding the further reaction conditions, it should be noted that these are also completely uncritical. However, in terms of optimum yields and turnover rates, the present invention recommends pH values of the reaction mixture that are between 4.0 and 9.0, with values between 5.0 and 7.5 being preferred and pH values between 5.5 and 6 5 are to be regarded as particularly preferred. The reaction temperature should be between 5 and 60 ° C, taking into account the particular starting material used and the degree of purity of the PLD temperature ranges between 20 and 50 ° C are preferred and temperatures between 25 and 45 ° C are considered to be particularly suitable.

Zwar kann das beanspruchte Verfahren auch in Abwesenheit von Cofaktoren durchgeführt werden, doch kann es in speziellen Fällen durchaus empfehlenswert sein, dem Reaktionsgemisch zur Steigerung der Enzym-Aktivität Metallionen zuzusetzen. Hierfür sieht die Erfindung vor, dass das Reaktionsgemisch dann zweiwertige Metallionen, wie Ca2+, Mg2+ und/oder Zn2+ enthält, vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,5 und 100 mM.Although the claimed process can also be carried out in the absence of cofactors, it may be advisable in specific cases to add metal ions to the reaction mixture to increase the enzyme activity. For this purpose, the invention provides that the reaction mixture then contains divalent metal ions, such as Ca 2+ , Mg 2+ and / or Zn 2+ , preferably in concentrations between 0.5 and 100 mM.

Es wurde bereits mehrfach darauf hingewiesen, dass die im beanspruchten Verfahren eingesetzten PLD-Varianten eine ausgeprägte Wirkungs- und Substratspezifität besitzen, weshalb sie auch in roher, also unaufgereinigter, Form eingesetzt werden können. Dies bedeutet im Hinblick auf deren Einsatzmengen, dass diese zwar in Abhängigkeit vom Aufreinigungsgrad von den Reaktionsbedingungen und dem jeweils verwendeten Ausgangsmaterial deutlich variieren können, jedoch empfiehlt die vorliegende Erfindung PLD-Mengen, die einer Enzym-Aktivität von 0,1 bis 1 000 Units/g eingesetzten Ausgangsmaterial entsprechen.It has been repeatedly pointed out that in the claimed Method used PLD variants have a pronounced effect and substrate specificity which is why they are also in raw, so unclean, form can be used. This means in terms of their amounts used, although this dependent on the degree of purification of the reaction conditions and the respective used raw material can vary significantly, however For example, the present invention recommends PLD levels that have an enzyme activity of 0.1 up to 1 000 units / g of starting material used.

Hinsichtlich der durch Kopfgruppenaustausch erhältlichen Produkte sieht die vorliegende Erfindung vorzugsweise Phosphatidylsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol und/oder Phosphatidylglycerin als bevorzugte Reaktionsprodukte vor.Regarding the product available by headgroup replacement sees the present invention preferably phosphatidic acid, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol and / or phosphatidylglycerol as preferred reaction products.

Schließlich wird mit der vorliegenden Erfindung auch eine Verfahrensvariante beansprucht, bei der die Gesamtreaktionsdauer zwischen 0,5 und 20 Stunden liegt, wobei vorzugsweise die Reaktion innerhalb von 1 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt zwischen 3 und 6 Stunden abgeschlossen sein sollte. Überraschenderweise wurde (wie bereits angesprochen) festgestellt, dass die Reaktionslösung des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Reaktionsende als annähernd frei von Phosphatidylsäure anzusehen ist. Aus diesem Grund schließt die vorliegende Erfindung auch eine zusätzliche Variante ein, bei der die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch an Phosphatidylsäure, enthält. Eine weitere erfindungsgemäße Variante sieht vor, dass die Reaktionslösung nach Beendigung der Reaktion maximal 15 Gew.-% an Phosphatidylsäure enthält, wobei diese Mengenangabe sich aber nun auf den Phospholipid-Anteil bezieht.Finally will claimed with the present invention also a variant of the method, where the total reaction time is between 0.5 and 20 hours, preferably the reaction within 1 to 8 hours, especially preferably between 3 and 6 hours should be completed. Surprisingly was (as already mentioned) found that the reaction solution of inventive method after the end of the reaction as approximate free of phosphatidic acid is to be considered. For this reason, the present invention concludes also an additional one Variant on, in which the reaction solution after the end of the reaction maximum 1.0 wt .-%, based on the total reaction mixture of phosphatidic acid contains. A another variant of the invention provides that the reaction solution after completion of the reaction contains a maximum of 15 wt .-% of phosphatidic acid, wherein However, this quantity is now based on the phospholipid content.

Abschließend kann das erhaltene Phospholipid bzw. das hergestellte Phospholipid-Gemisch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zusätzlich durch eine alkoholische Extraktion aufgereinigt werden, wofür insbesondere ein Alkohol mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder beliebige Mischungen davon eingesetzt werden. Als besonders geeignet hat sich hierfür Ethanol erwiesen.In conclusion, can the resulting phospholipid or the phospholipid mixture produced in the context of the present invention additionally by an alcoholic Extraction are cleaned, for which in particular an alcohol having 1 to 3 carbon atoms or any mixtures thereof become. Ethanol has proven particularly suitable for this purpose.

Die mit diesem neuen und äußerst wirtschaftlichen Verfahren hergestellten Phospholipide sind natürlich nicht auf spezielle Anwendungsgebiete beschränkt. Aufgrund der Möglichkeit, sowohl die Substrate als auch die Produkte gezielt auszuwählen und die Zielverbindungen in großer Reinheit auf äußert wirtschaftliche Weise herzustellen, kommen die so erhältlichen Phospholipide sowohl für technische als auch für physiologische Anwendungen in Frage, wobei im letzten Fall insbesondere die Verbesserung der Gehirnleistung im Vordergrund steht, zu deren Zweck die gemäß Erfindung hergestellten Phospholipide in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, Funktionsnahrungsmitteln oder auch im Rahmen der klinischen Sonderernähung eingesetzt werden können.The with this new and extremely economical Of course, the phospholipids produced are of course not limited to specific fields of application. by virtue of The possibility, to select both the substrates and the products targeted and the target connections in large Purity on expresses economic To produce a way, the phospholipids thus obtainable both for technical as also for physiological applications in question, in the latter case in particular the improvement of brain performance is in the foreground, for their purpose according to the invention prepared phospholipids in the form of dietary supplements, Functional foods or used in the context of clinical special nutrition can be.

Die nachfolgenden Beispiele verdeutlichen die Vorteile des beanspruchten Verfahrens:The The following examples illustrate the advantages of the claimed procedure:

Beispiel 1:Example 1:

In einem Reaktionsgefäß wurden 30 g eines entölten Standardlecithins (EPIKURON® 100 P, Degussa Food Ingredients GmbH, 20 – 24 Gew.-% Phosphatidylcholin, PC; 18 – 24 Gew.-% Phosphatidylethanolamin, PE; 12 – 15 Gew.-% Phosphatidylinostol, PI; 4 – 7 Gew.-% Phosphatidsäure, PA) in einem Liter vollentsalztem Wasser bei 45 °C unter Rühren dispergiert. Anschließend wurden 14 g CaCl2 (wasserfrei) und 300 g L-Serin zugegeben und der pH-Wert auf 6,0 eingestellt. Während der Reaktion wird der pH-Wert mit Hilfe eines Autotitrators (Firma Metrohm, Titrino 716 S, 0,1 N Natronlauge) konstant gehalten. Zum Start der Umsetzung wurden 500 μl einer Präparation der PLD aus Streptoverticillium flavopersicum (950 U/ml) zur Reaktionsmischung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von vier Stunden wurde die Reaktion durch einen pH-Shift (pH: 3,0) beendet.In a reaction vessel were added 30 g of a de-oiled Standard lecithin (EPIKURON 100 P ®, Degussa Food Ingredients GmbH, 20-24 wt .-% of phosphatidylcholine, PC; 18-24 wt .-% phosphatidylethanolamine, PE, 12-15 wt .-% Phosphatidylinostol , PI; 4-7% by weight of phosphatidic acid, PA) in one liter of demineralized water at 45 ° C. with stirring. Subsequently, 14 g of CaCl 2 (anhydrous) and 300 g of L-serine were added and the pH was adjusted to 6.0. During the reaction, the pH is kept constant using an autotitrator (Metrohm, Titrino 716 S, 0.1 N sodium hydroxide solution). To start the reaction, 500 μl of a preparation of PLD from Streptoverticillium flavopersicum (950 U / ml) were added to the reaction mixture. After a reaction time of four hours, the reaction was stopped by a pH shift (pH: 3.0).

Die Phospholipidverteilung im Reaktionsrohprodukt war wie folgt:
PA: 10 Gew.-% (0,25 Gew.-% bezogen auf die Reaktionslösung)
PC: 6 Gew.-%
PE: 6 Gew.-%
PS: 26 Gew.-%
PI: 13 Gew.-%The phospholipid distribution in the crude reaction product was as follows:
PA: 10% by weight (0.25% by weight based on the reaction solution)
PC: 6% by weight
PE: 6% by weight
PS: 26% by weight
PI: 13% by weight

Beispiel 2:Example 2:

In einem Reaktionsgefäß wurden 30 g eines angereicherten Lecithins (62 Gew.-% PC, 9 Gew.-% PE, 2 Gew.-% PA) in einem Liter vollentsalztem Wasser bei 45 °C unter Rühren dispergiert. Anschließend wurden 1,4 g CaCl2 (wasserfrei) und 200 g L-Serin zugegeben und der pH-Wert auf 5,6 eingestellt. Während der Reaktion wurde der pH-Wert mit Hilfe eines Autotitrators (Firma Metrohm, Titrino 716 S, 0,1 N Natronlauge) konstant gehalten. Zum Start der Umsetzung wurden 350 Units einer Präparation der PLD aus Streptoverticillium netropsis zur Reaktionsmischung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von vier Stunden wurde die Reaktion durch einen pH-Shift (pH: 3,0) beendet.In a reaction vessel, 30 g of an enriched lecithin (62 wt .-% PC, 9 wt .-% PE, 2 wt .-% PA) were dispersed in one liter of deionized water at 45 ° C with stirring. Subsequently, 1.4 g of CaCl 2 (anhydrous) and 200 g of L-serine were added and the pH was adjusted to 5.6. During the reaction, the pH was kept constant with the aid of an autotitrator (Metrohm, Titrino 716 S, 0.1 N sodium hydroxide solution). To start the reaction, 350 units of a preparation of the PLD from Streptoverticillium netropsis were added to the reaction mixture. After a reaction time of four hours, the reaction was stopped by a pH shift (pH: 3.0).

Die Phospholipidverteilung im Reaktionsrohprodukt war wie folgt:
PA: 6 Gew.-% (0,25 Gew.-% bezogen auf die Reaktionslösung)
PC: 6 Gew.-%
PE: 1 Gew.-%
PS: 62 Gew.-%
PI: 0 Gew.-%The phospholipid distribution in the crude reaction product was as follows:
PA: 6% by weight (0.25% by weight based on the reaction solution)
PC: 6% by weight
PE: 1% by weight
PS: 62% by weight
PI: 0% by weight

Claims (14)

Verfahren zur enzymatischen Herstellung und/oder Modifikation von Phospholipiden durch Kopfgruppenaustausch mit Hilfe von Phospholipase D (PLD), dadurch gekennzeichnet, dass eine Phospholipase D aus Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis und/oder Streptomyces netropsis verwendet wird.Process for the enzymatic preparation and / or modification of phospholipids by head group exchange with the aid of phospholipase D (PLD), characterized in that a phospholipase D from Streptoverticillium flavopersicum, Streptoverticillium netropsis and / or Streptomyces netropsis is used. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine rohe oder teilaufgereinigte PLD-haltige Fermentationsbrühe oder eine aufgereinigte PLD eingesetzt wird.Method according to claim 1, characterized in that a crude or partially purified PLD-containing fermentation broth or a purified PLD is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die PLD in immobilisierter Form, bevorzugt in kovalenter und/oder adsorbtiver Bindungsart verwendet wird.Method according to one of claims 1 or 2, characterized that the PLD in immobilized form, preferably in covalent and / or adsorbtiver binding type is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial Lecithin und besonders bevorzugt Soja-, Rapsöl- und/oder Eigelblecithin eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 3, characterized that as a starting material lecithin and particularly preferably soybean, Rapeseed oil and / or Egg yolk lecithin is used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangsmaterial in Mengen von 1,0 bis 20,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch und bevorzugt als Dispersion, eingesetzt wird.Method according to one of claims 1 to 4, characterized that the starting material in amounts of 1.0 to 20.0 wt .-%, based to the total reaction mixture and preferably as a dispersion used becomes. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 4,0 und 9,0, bevorzugt zwischen 5,0 und 7,5 und besonders bevorzug zwischen 5,5 und 6,5, liegt.Method according to one of claims 1 to 5, characterized the pH of the reaction mixture is between 4.0 and 9.0, preferably between 5.0 and 7.5, and more preferably between 5.5 and 6.5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionstemperatur 5 bis 60 °C beträgt, bevorzugt 20 bis 50 °C und besonders bevorzugt 25 bis 45 °C.Method according to one of claims 1 to 6, characterized that the reaction temperature is 5 to 60 ° C, preferably 20 to 50 ° C and especially preferably 25 to 45 ° C. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgemisch zweiwertige Metallionen wie Ca2+, Mg2+ und/oder Zn2+ enthält, vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,5 und 100 mM.Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the reaction mixture contains divalent metal ions such as Ca 2+ , Mg 2+ and / or Zn 2+ , preferably in concentrations between 0.5 and 100 mM. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die PLD-Komponente in Mengen eingesetzt wird, die einer Enzym-Rktivität von 0,1 bis 1 000 Units/g eingesetztem Ausgangsmaterial, entspricht.Method according to one of claims 1 to 8, characterized that the PLD component is used in amounts that have an enzyme activity of 0.1 up to 1 000 units / g of starting material used. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylsäure und/oder Phosphatidylglycerin erhalten werden.Method according to one of claims 1 to 9, characterized that phosphatidylserine, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinositol, phosphatidic acid and / or phosphatidylglycerol to be obtained. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtreaktionsdauer 0,5 bis 20 Stunden, bevorzugt 1 bis 8 Stunden und besonders bevorzugt 3 bis 6 Stunden beträgt.Method according to one of claims 1 to 10, characterized the total reaction time is 0.5 to 20 hours, preferably 1 to 8 hours and more preferably 3 to 6 hours. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 1,0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtreaktionsgemisch, an Phosphatidylsäure enthält.Method according to one of claims 1 to 11, characterized that the reaction solution after the end of the reaction, a maximum of 1.0% by weight, based on the total reaction mixture, to phosphatidic acid contains. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionslösung nach Reaktionsende maximal 15 Gew.-%, bezogen auf den Phospholipid-Anteil, an Phosphatidylsäure enthält.Method according to one of claims 1 to 11, characterized that the reaction solution after the end of the reaction a maximum of 15% by weight, based on the phospholipid content, to phosphatidic acid contains. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das erhaltene Phospholipid(-Gemisch) durch eine alkoholische Extraktion aufgereinigt wird.Method according to one of claims 1 to 12, characterized that the obtained phospholipid (mixture) by an alcoholic Extraction is purified.
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