DE102004037081A1 - Hybridization assay of nucleic acid, useful particularly for identifying nitrogen-fixing microorganisms, where the complex formed includes a lable in, or close to, the hybrid region - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Analysieren von Proben mittels Ligandenbindungsverfahren, Zielmoleküle, die in solchen Verfahren einsetzbar sind, und Kits zur Bereitstellung solcher Zielmoleküle und/oder Durchführung der eingangs genannten Verfahren.The The present invention relates to methods for analyzing samples by ligand binding methods, target molecules used in such procedures and kits for providing such target molecules and / or execution the aforementioned method.
Hintergrund der Erfindungbackground the invention
Nukleinsäuren liegen normalerweise in Form doppelsträngiger Moleküle vor, die auch als Heteroduplexe bezeichnet werden und aus zwei Nukleinsäuremolekülen zusammengesetzt sind. Setzt man Duplexe einer Temperaturerhöhung aus, disoziieren sie in zwei einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle. Bei einer Erniedrigung der Temperatur können diese zu einem Heteroduplex reassozieren. Die Hinreaktion zu Duplexen bezeichnet man als Hybridisierung oder Rehybridisierung. Duplexe werden auch als Hybride bezeichnet.Nucleic acids are usually in the form of double-stranded molecules which are also referred to as heteroduplexes and composed of two nucleic acid molecules are. If duplexes are subjected to a temperature increase, dissociate into two single-stranded ones Nucleic acid molecules. at lowering the temperature, these can become a heteroduplex reassozieren. The forward reaction to duplexes is called hybridization or Rehybridization. Duplexes are also called hybrids.
Nukleinsäuren sind Polymere der Nukleotide Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil, Inosin (a, c, g, t, u, i), künstlicher oder modifizierter Nukleotide, die in dem Poly mer wie Perlen an einer Perlenkette aneinander gereiht sind. Die Abfolge der Nukleotide in einem Nukleinsäuremolekül ist für das jeweilige Nukleinsäuremolekül spezifisch. Die Bildung von Doppelsträngen erfolgt über Wasserstoff-Brückenbindungen, die zum Beispiel zwischen Einzelnukleotiden a und t, sowie c und g entstehen können, wenn auf einem Einzelstrang genügend Nukleotide aufeinander folgen, die auf ein jeweiliges Gegennukleotid auf einem anderen Einzelstrang – und dort in der entsprechenden Reihenfolge – treffen. In der Natur kommen Nukleinsäuren in Form solcher zueinander komplementärer Einzelstränge als Doppelstrang vor.Nucleic acids are Polymers of the nucleotides adenine, cytosine, guanine, thymine, uracil, Inosine (a, c, g, t, u, i), artificial or modified nucleotides in the polymer such as beads a string of pearls are strung together. The sequence of nucleotides in A nucleic acid molecule is specific for the particular nucleic acid molecule. The formation of double strands over Hydrogen bonds, for example, between single nucleotides a and t, as well as c and g can arise, if enough on a single strand Nucleotides follow each other, which are based on a respective Gegennukleotid another single strand - and there in the appropriate order - meet. Come in nature nucleic acids in the form of such complementary single strands as Double strand before.
Häufig steht man vor dem Problem, dass das Vorhandensein einer bestimmten Nukleinsäure in einem Reaktionsgemisch oder einer biologischen Probe (im Folgenden unter dem Begriff „Reaktionsgemisch" zusammengefasst) nachgewiesen werden soll. Dies geschieht in der Regel durch den Einsatz von Fängermolekülen, die einzelsträngige Nukleinsäuren aufweisen, die mit einem einzelsträngigen oder partiell einsträngigien Nukleinsäuremolekül, im Folgenden Zielmolekül genannt, zu Duplexen hybridiseren, und der Nachweis des Duplexes erlaubt eine Aussage über das Vorhandensein des Zielmoleküls. Da auf Nukleinsäuren bestimmte Sequenzen mehrmals vorkommen können bzw. mehrmals vorkommen, wird das Fängermolekül so ausgewählt, das es vorzugsweise mit einer Zielsequenz reagiert, die einen Abschnitt der Gesamtsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure darstellt und für diese möglichst spezifisch ist. Dabei versucht man in der Regel eine größtmögliche Stringenz der Fänger-Zielsequenz-Hybride bzw. Duplexe und eine größtmögliche Spezifität bzw. Einzigartigkeit der Zielsequenz für die betreffende Nukleinsäure zu gewährleisten.Frequently stands One faces the problem of having the presence of a particular nucleic acid in one Reaction mixture or a biological sample (hereinafter the term "reaction mixture" summarized) to be detected. This is usually done by the Use of catcher molecules, the single nucleic acids have, with a single-stranded or partially einsträngigien Nucleic acid molecule, below target molecule called hybridise to duplexes, and the detection of the duplex allows a statement about the presence of the target molecule. There on nucleic acids certain sequences can occur several times or occur several times, the catcher molecule is selected so that it preferably reacts with a target sequence containing a section represents the total sequence of the nucleic acid to be detected and for this preferably is specific. As a rule, one tries to achieve the highest possible stringency the catcher target sequence hybrid or duplexes and the greatest possible specificity or uniqueness the target sequence for the nucleic acid in question to ensure.
Das Nachweisen von Nukleinsäuren mittels Fänger-Zielsequenz-Hybriden ist seit langem bekannt. Es hat sich aus dem sogenannten Southern-Blot über viele Varianten bis hin zu Oligonukleotid-Chips oder DNA-Mikroarrays entwickelt, bei denen auf wenigen cm2 Tausende von Oligonukleotidsequenzen als Spots räumlich separiert an einer festen Phase vorgesehen sind und als Fängermoleküle fungieren. Viele dieser Spots ermöglichen zeitlich parallel eine qualitative und im begrenzten Umfang quantitative Antwort auf An- oder Abwesenheit bestimmter Sequenzen in einem Reakti onsgemisch. Es gibt darüber hinaus eine Vielzahl von Variationen des Fängerzielsequenzhybridnachweisprinzips, die der Fachwelt allgemein bekannt sind.Detection of nucleic acids using capture-target sequence hybrids has been known for a long time. It has evolved from the so-called Southern blot over many variants to oligonucleotide chips or DNA microarrays, in which a few cm 2 of thousands of oligonucleotide sequences are spatially separated as spots on a solid phase and act as catcher molecules. Many of these spots simultaneously allow for a qualitative and, to a limited extent, quantitative response to the presence or absence of particular sequences in a reaction mixture. There are also a variety of variations of the capture target sequence hybrid detection principle that are well known in the art.
Um einen Nachweis eines Fängerzielsequenzhybrides zu ermöglichen, braucht man hierfür eine hinreichende Menge nachweisbarer Hybride.Around a proof of a capture target sequence hybrid to enable you need one for this sufficient amount of detectable hybrids.
Häufig ist man mit geringen Probenmengen konfrontiert, die mittels einer PCR-Reaktion in mehreren Zyklen amplifiziert werden müssen. Jeder Zyklus einer PCR-Reaktion gleicht einem Kopiervorgang, wobei die Anzahl der Kopien mit jedem Schritt exponentiell zunimmt. Jeder Schritt kostet Zeit und Material und je weiter der Kopiervorgang fortgeschritten ist, desto fehlerhafter können die Kopien ausfallen.Frequently one confronts with small amounts of sample, which by means of a PCR reaction in several Cycles must be amplified. Every cycle of a PCR reaction is like copying, with the number of copies with each Step increases exponentially. Each step costs time and material and the further the copying progressed, the more erroneous can the copies fail.
Je weniger Zyklen erforderlich sind, um eine nachweisbare Probenmenge zu erzeugen, desto günstiger und verlässlicher wird darum das mit einer so aufbereiteten Probe durchgeführte Hybridisierungsexperiment.ever fewer cycles are required to produce a detectable amount of sample to produce, the cheaper and more reliable Therefore, the hybridization experiment carried out with such a prepared sample becomes.
Bei der Quantifizierung von Hybriden gibt es erhebliche Unwägbarkeiten. Die maximale Zahl von Hybriden in einem Sondenpunkt oder Spot eines Mikroarrays kann höchstens der Zahl der Fängermoleküle in dem Spot entsprechen. Diese ist im allgemeinen bekannt. Darüber, wieviele der Fängermoleküle eines Spots in einem Experiment Fänger-Zielsequenz-Moleküle ausbilden, kann man aber kaum verlässliche Aussagen treffen. Etliche Faktoren, die die Hybridisierungseffizienz beeinflussen, sind bereits bekannt (Southern et al., 1999), wie z.B. der Abstand der zum Zielmolekül komplementären Sequenz des Fängeroligonukleotids von der Glasoberfläche. Als sterischer Effekt wurde auch eine Verschlechterung der Effizienz beschrieben, wenn der Duplex zu einem langen Überhang des Zielmoleküls in Richtung Glasoberfläche führt (Peplies et al. 2003). Die Intensität der Detektionssignale, anhand derer man das Vorliegen von Hybriden nachweist, scheint zwar in etwa proportional zu der Zahl der in einem Sondenpunkt vorliegenden Hybride zu sein, aber der Proportionalitätsfaktor ist von Sondenpunkt zu Sondenpunkt anscheinend schon nicht identisch, wenn in unterschiedlichen Sondenpunkten verschiedene Hybride vorliegen.When quantifying hybrids, there are considerable uncertainties. The maximum number of hybrids in a probe spot or spot of a microarray may correspond at most to the number of capture molecules in the spot. This is generally known. On the other hand, how many of the catcher molecules of a spot form capture-target-sequence molecules in an experiment can hardly be reliably predicted. Several factors affecting hybridization efficiency are already known (Southern et al., 1999), such as the distance of the target molecule complementary sequence of the capture oligonucleotide from the glass surface. The steric effect was also described as a decrease in efficiency when the duplex leads to a long overhang of the target towards the glass surface (Peplies et al., 2003). The intensity of the detection signals, on the basis of which the Vorlie Although hybridization of hybrids appears to be approximately proportional to the number of hybrids present in a probe point, the proportionality factor does not appear to be identical from probe point to probe point if different hybrids are present at different probe points.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Analysieren von Proben mittels einer Hybridisierung zur Verfügung zu stellen, mit dem auch sehr geringe Probenmengen sicherer und deutlicher detektiert werden können als bisher, und bei dem die detektierten Signale besser in Korrelation zueinander gesetzt werden können als bei bekannten Verfahren.task The present invention is therefore a method for analyzing of samples by means of a hybridization, with that too very small amounts of sample can be detected more reliably and more clearly can than before, and in which the detected signals better in correlation can be set to each other as in known methods.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Analysieren von Proben mittels eines Ligandenbindungsverfahrens, bei dem durch Bindung von Zielsequenzen von Zielmolekülen mit Fängersequenzen von Sonden Duplexe oder Komplexe erzeugt und/oder bei dem so erzeugte Duplexe oder Komplexe analysiert werden, wobei die Duplexe oder Komplexe in räumlicher Nähe zu und/oder innerhalb der Zielsequenz eine detektierbare Markierung oder eine Anhäufung von Markierungen aufweisen.The Task is solved by a method of analyzing samples by a ligand binding method, in which binding of target sequences of target molecules with capture sequences generated by probes duplexes or complexes and / or in the thus generated Duplexes or complexes are analyzed using the duplexes or Complex in spatial Close to and / or within the target sequence a detectable label or a buildup of markings.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die Verwendung von Fängersequenzen, die komplementär zu Zielsequenzen der Zielmoleküle sind, die in räumlicher Nähe hierzu und/oder innerhalb der Zielsequenz eine detektierbare Markierung oder eine Anhäufung von Markierungen aufweisen, in erfindungsgemäßen Verfahren zu Signalintensitäten führen, die gegenüber Signalintensitäten, wie sie in vergleichbaren Verfahren unter Verwendung von nicht erfindungsgemäß ausgewählten Fängersequenzen erzielt werden, so dass sich die Markierung nicht in räumlicher Nähe zur Zielsequenz befindet, erheblich höher sind.It has surprisingly demonstrated the use of capture sequences that are complementary to target sequences are the target molecules, the in spatial Close to it and / or within the target sequence a detectable label or a buildup have markings, lead in the inventive method to signal intensities, the across from Signal intensities, as in comparable methods using catcher sequences not selected according to the invention be achieved so that the mark is not in spatial Close to Target sequence is significantly higher.
Vorzugsweise ist die detektierbare Markierung oder die Anhäufung von Markierungen ausschließlich in räumlicher Nähe zu und/oder innerhalb der Zielsequenz angeordnet.Preferably is the detectable label or the accumulation of labels exclusively in spatial Close to and / or within the target sequence.
Zielmoleküle können mit einer einzigen Markierung markiert sein. Grundsätzlich ist es jedoch auch üblich, Zielmolküle mit mehreren Markierungen zu versehen. Hier ist die Anhäufung von Markierungen in räumlicher Nähe zu und/oder innerhalb der Zielsequenz vorzusehen.Target molecules can with be marked with a single mark. In principle, however, it is also common to target molecules with several To provide markings. Here is the accumulation of marks in spatial Close to and / or within the target sequence.
Als Anhäufung von Markierungen im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die vorzugsweise größte Anhäufung von Markierungen auf dem Zielmolekül verstanden, die sich innerhalb eines Bereiches befindet, der nicht länger als die Zielsequenz ist, und eine spezifische Duplexbildung erlaubt. Grundsätzlich ist es möglich, dass am Zielmolekül weitere Markierungen bzw. Anhäufungen von Markierungen vorgesehen sind, die jedoch nicht immer in Bereichen liegen, die für das Zielmolekül spezifisch sind und daher nicht als Zielsequenz geeignet sind.When accumulation of markings in the context of the present invention is preferably the largest accumulation of Markings on the target molecule understood, which is located within an area that is not longer as the target sequence, allowing for specific duplex formation. in principle Is it possible, that at the target molecule further markings or accumulations markings are provided, but they are not always located in areas the for the target molecule are specific and therefore are not suitable as a target sequence.
Dadurch, dass die Zielsequenz auf für das Zielmolekül spezifische Bereiche beschränkt ist, ist sie oftmals nicht frei variierbar, weshalb gemäß der Erfindung sowohl zumindest eine Markierung in der Nähe zu oder innerhalb eines für das Zielmolekül spezifischen Bereichs vorzusehen ist und die Fängersequenz komplementär zu diesem Bereich zu bestimmen ist, der dann die Zielsequenz darstellt.Thereby, that the target sequence on for the target molecule limited to specific areas is often not freely variable, which is why according to the invention both at least one marker close to or within one for the Target molecule specific Provision is to be made and the capture sequence is complementary to this Range, which then represents the target sequence.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren werden mehrere Proben gleichzeitig mittels Ligandenbindung analysiert, wobei alle Zielmoleküle zumindest eine detektierbare Markierung in räumlicher Nähe zu der oder in der jeweiligen Zielsequenz aufweisen.at a method according to the invention several samples simultaneously analyzed by ligand binding, where all target molecules at least one detectable marker in spatial proximity to or in the respective one Have target sequence.
Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren weisen alle Zielmoleküle die gleiche Anzahl von Markierungen auf.To a further inventive method assign all target molecules the same number of marks on.
In erfindungsgemäßen Verfahren werden zumindest zehn Proben, vorzugsweise zumindest hundert Proben beziehungsweise zumindest tausend Proben gleichzeitig analysiert.In inventive method be at least ten samples, preferably at least a hundred samples or at least a thousand samples analyzed simultaneously.
In erfindungsgemäßen Verfahren kann die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung sein.In inventive method For example, the label may be a fluorescent label.
In erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fluoreszenzmarkierung mittels eines oder mehrerer der folgenden Markierungsmittel erzielt: Cy3, Cy5, Fluorescein, Texas-Red, Alexa-Fluor-Farbstoffe und/oder andere Fluoreszenzfarbstoffe.In inventive method the fluorescent label is determined by one or more of the following Marking Agent: Cy3, Cy5, Fluorescein, Texas Red, Alexa Fluorine Dyes and / or other fluorescent dyes.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Zielmolekülen, die in räumlicher Nähe zur jeweiligen Zielsequenz oder innerhalb der jeweiligen Ziel sequenz zumindest eine Markierung aufweisen.The Task is further solved by a method of producing target molecules which in spatial Close to respective target sequence or within the respective target sequence have at least one mark.
Bei der Erfindung werden Zielmoleküle verwendet, welche Zielsequenzen und eine Markierung in räumlicher Nähe zur oder innerhalb der jeweiligen Zielsequenz umfassen bzw. aufweisen.at The invention becomes target molecules uses which target sequences and a marker in spatial Close to or within the respective target sequence.
Diese Zielmoleküle sind einsetzbar in den zuvor dargestellten erfindungsgemäßen Verfahren und führen zu Fänger-Zielsequenz-Hybriden, die eine höhere Signalintensität aufweisen, als eben solche Hybride, die unter zu Hilfenahme von Zielmolekülen erzeugt werden, welche Zielsequenzen und eine Markierung zur jeweiligen Zielsequenz aufweisen, die sich nicht in räumlicher Nähe zu dieser befindet.These target molecules can be used in the previously described inventive methods and lead to capture-target sequence hybrids which have a higher signal intensity than just those hybrids which are generated with the aid of target molecules which have target sequences and a label for the respective target sequence sen, which is not in close proximity to this.
Die Markierung der Zielmoleküle kann mittels enzymatischer Endmarkierung, reverser Transkription, indirekter Markierung und/oder „Sandwich"-Methoden erfolgen.The Labeling of the target molecules can be detected by enzymatic end-labeling, reverse transcription, indirect labeling and / or "sandwich" methods.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Erzeugung von Zielmolekülen mittels eines PCR-Verfahrens, bei dem zumindest ein mit einem Markierungsmittel versehener Primer eingesetzt wird.The Task is further solved by a method for generating target molecules by means of a PCR method, in which at least one primer provided with a marking agent is used.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann zumindest ein weiterer mit einem identischen oder einem weiteren Markierungsmittel versehener Primer eingesetzt werden. Auf diese Weise lassen sich unterschiedliche Signalarten vorsehen, um Ergebnisse in erfindungsgemäßen Verfahren zu verifizieren, aber auch um die Intensität von unterschiedlichen Spots, in denen unterschiedlich viele Hybride vorliegen, aneinander an zu gleichen, so dass die Intensitäten im selben Größenordnungsbereich liegen. Der Spot, in dem mehr Hybride vorliegen kann beispielsweise das Markierungsmittel mit der geringeren Signalintensität aufweisen. Da sich die Signale aufgrund unterschiedlicher Markierungsmittel voneinander unterscheiden lassen und der Faktor, um den sich ihre Signalintensitäten voneinander unterscheiden, bekannt ist, ermöglicht ein solches Verfahren eine Quantifizierung und einen besseren Vergleich der Intensitäten in beiden Spots. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die Verwendung eines eine höhere Signalintensität aufweisenden Markierungsmittels zu einem Sättigungswert bei der Detektionsvorrichtung, etwa einem Photomultiplier, führen würde. Dann wäre nämliche eine Quantifizierung aufgrund apparativer Gegebenheiten nicht möglich oder zumindest erschwert.In the method according to the invention can be at least another with an identical or another Labeling primed primer can be used. To this In this way, different types of signals can be provided in order to obtain results in inventive method to verify, but also to the intensity of different spots, in which have different numbers of hybrids, to each other same, so the intensities in the same order of magnitude lie. The spot in which more hybrids can be present, for example have the marking agent with the lower signal intensity. Because the signals are due to different labeling means differentiate from each other and the factor around which theirs signal intensities differ from each other, is known, allows such a method a quantification and a better comparison of the intensities in both Spots. This is particularly advantageous if the use one higher signal intensity having marking agent to a saturation value in the detection device, about a photomultiplier, would lead. Then would be the same one Quantification due to technical conditions not possible or at least more difficult.
Setzt man bei einem PCR-Verfahren Primer ein, die markiert sind, und dNTPs, die über keine Markierung verfügen, so ist das PCR-Produkt an dem Ende, das durch den Primer gebildet wird, markiert, und an den übrigen Stellen nicht markiert. Wählt man die Primer so, dass die Zielsequenz des PCR-Produktes sich in räumlicher Nähe zum Primer befindet, so stellt das PCR-Produkt ein Zielmolekül dar, das ausschließlich in räumlicher Nähe zur Zielsequenz eine Markierung gemäß der Erfindung aufweist. Es ist dies ein denkbar einfaches und unkompliziertes Verfahren, um zu erfindungsgemäßen Zielmolekülen zu gelangen. Dadurch, dass man definierte Primer mit einer bestimmten Länge einsetzt, lässt sich eine genauere Aussage darüber machen, wieviel Markierungsagens in jeweils ein Zielmolekül eingebaut wurde, als wenn eine Mischung aus markierten und nicht markierten dNTPs zum Erzeugen eines markierten PCR-Produktes verwendet wird; denn wenn einzelne dNTPs markiert sind, so ist darum nicht immer klar, wie viele markierte dNTPs in einem PCR-Produkt eingebaut werden, und wie viele nicht markierte darin eingebaut werden, bzw. die PCR-Produkte unterscheiden sich hinsichtlich der Zahl der darin eingebauten markierten Nukleotide. Es ist dies außerdem von der jeweils amplifizierten Sequenz abhängig. Üblicherweise ist eine der vier einzubauenden Basen markiert. Taucht diese in einem Amplifikationsprodukt weniger häufig auf, so enthält das Amplifikationsprodukt weniger Markierungsmittel als andere Amplifikationsprodukte. Dieser Umstand erschwert in erheblichem Maße das Treffen quantitativer Aussagen anhand eines Mikroarray-Experimentes. Durch eine entsprechende Primerauswahl lässt sich sicherstellen, dass die in einem Experiment verwendeten Primer jeweils in etwa die gleiche Menge Markierungsmittel aufweisen. Diese Mengen variieren nicht mehr in Abhängigkeit von einer zu amplifizierenden Zielsequenz, sondern hängen einzig und allein vom Aufbau und der Gestaltung des jeweils verwendeten Primers ab. Abgesehen von den erhöhten Signalintensitäten, die die Empfindlichkeit von Mikroarrayexperimenten erheblich verbessern, stellen erfindungsgemäße Verfahren aus den genannten Gründen auch wesentlich genauere Verfahren als bisher nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren dar.Puts in a PCR method, primers that are labeled and dNTPs, the above have no mark, so the PCR product is at the end formed by the primer is marked, and on the others Do not mark marks. Chooses the primers so that the target sequence of the PCR product is in spatial Proximity to Primer, the PCR product is a target molecule that is exclusively available in spatial Close to Target sequence a marker according to the invention having. This is a very simple and uncomplicated process, to arrive at target molecules of the invention. By using defined primers with a certain length, let yourself a more precise statement about it make how much labeling agent incorporated into each one target molecule was as if a mix of marked and unmarked dNTPs is used to generate a labeled PCR product; because if individual dNTPs are marked, that is not always the case clearly how many labeled dNTPs are incorporated into a PCR product, and how many unmarked ones are incorporated therein, or the PCR products differ with regard to the number of labeled markers incorporated therein Nucleotides. It is also from depending on the amplified sequence. Usually one of the four Marked bases marked. Dip these in an amplification product less often on, so contains the amplification product will contain less labeling agent than other amplification products. This circumstance makes the meeting much more difficult Statements based on a microarray experiment. By an appropriate Primer selection leaves make sure that the primers used in an experiment each have approximately the same amount of marking agent. These Quantities no longer vary depending on a target sequence to be amplified, but hang solely by the structure and the design of the primer used in each case from. Apart from the raised Signal intensities, which significantly improve the sensitivity of microarray experiments, represent inventive method for the reasons mentioned also much more accurate than in the prior art known method.
Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Zielmolekülen, werden Zielmoleküle mittels eines PCR-Verfahrens erzeugt, und es wird dabei zumindest eine Art dNTPs eingesetzt, die mit einem Markierungsmittel versehen sind, wobei die markierten dNTPs in unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz und/oder in die Zielsequenz selbst eingebaut werden.at a method according to the invention for the production of target molecules according to the invention are targets generated by a PCR method, and it is doing at least used a kind of dNTPs that provided with a marker are, with the labeled dNTPs in close proximity to the target sequence and / or incorporated into the target sequence itself.
Im Unterschied zum Stand der Technik ist bei einem solchen erfindungsgemäßen Verfahren sichergestellt, dass Markierungsagens in unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz tatsächlich vorkommt. In unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz bedeutet in diesem Zusammenhang, dass Markierungsagens an in die Zielsequenz eingebauten Nukleotiden oder an direkt neben der Zielsequenz eingebauten Nukleotiden gebunden ist. In unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Markierung bzw. dass das Markierungsagens nicht weiter als 100 bzw. 60, vorzugsweise nicht weiter als 0 – 20 Basen von der Zielsequenz entfernt ist. Signifikante positive Effekte (Faktoren 2-146) können noch in einem Abstand von 100 Basen detektiert werden. Vorzugsweise ist die Markierungsagens ausschließlich in unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz angeordnet.in the A difference from the prior art is in such a method according to the invention ensure that labeling agent is in close proximity to the target sequence indeed occurs. Close to the target sequence in this context means that labeling agent to nucleotides incorporated into the target sequence or to directly adjacent the target sequence incorporated nucleotides is bound. In immediate Close to Target sequence in the sense of the invention means that the marking or that the labeling agent is not more than 100 or 60, preferably not more than 0 - 20 Bases away from the target sequence. Significant positive effects (Factors 2-146) still be detected at a distance of 100 bases. Preferably the tag is exclusively in close proximity to the target sequence arranged.
Weitere erfindungsgemäße Verfahren umfassen die Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) mittels anderer Methoden, z.B. durch enzymatische Endmarkierung (wie z.B. durch terminale Transferase, Polynukleotidkinase, Poly(a)-Polymerase oder andere Enzyme) oder durch reverse Transkription mit fluoreszenzmarkierten Primern, oder durch indirekte Markierungsverfahren.Further methods according to the invention include the fluorescence labeling of nucleic acids (DNA or RNA) by means of other methods, for example by enzymatic end-labeling (such as, for example, by terminal transferase, polynucleotide kinase, Po ly (a) polymerase or other enzymes) or by reverse transcription with fluorescently labeled primers, or by indirect labeling methods.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Zielmoleküle, ist ein Verfahren, bei dem Zielmoleküle mittels eines PCR-Verfahrens erzeugt werden, bei dem zumindest eine Art dNTPs eingesetzt werden, die mit einem Markierungsmittel versehen sind, bei dem die markierten dNTPs bzw. eine Anhäufung davon in unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz und/oder in die Zielsequenz selbst eingebaut werden, und bei dem ein oder mehrere Primer eingesetzt wird oder eingesetzt werden, der oder die mit dem gleichen oder weiteren Markierungsmitteln versehen ist oder sind.One Another inventive method for Preparation of target molecules according to the invention is a Method in which target molecules be generated by a PCR method in which at least one Type dNTPs are used, which are provided with a marker are in which the labeled dNTPs or an accumulation thereof in the immediate Close to Target sequence and / or incorporated into the target sequence itself, and in which one or more primers is used or used be the one or the other with the same or further markers is or are provided.
Weitere erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Zielmoleküle sind Verfahren, in denen Markierungsmittel in unmittelbarer Nähe zur Zielsequenz und/oder in die Zielsequenz selbst eingebaut werden.Further inventive method for the preparation of target molecules according to the invention are methods, in which labeling agents in close proximity to the target sequence and / or be incorporated into the target sequence itself.
Hier sind viele Verfahren möglich, z.B. Einbau markierter dNTPs in cDNA durch reverse Transkription, oder Post-labeling-Protokolle, die den Einbau von Aminoallyl-nNTP in cDNA nutzen und dann eine chemische Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen, oder direkte nicht-enzymatische Markierung der RNA mit Fluoreszenzfarbstoffen.Here many processes are possible e.g. Incorporation of labeled dNTPs into cDNA by reverse transcription, or post-labeling protocols that utilize the incorporation of aminoallyl-nNTP into cDNA and then a chemical coupling with fluorescent dyes, or direct non-enzymatic labeling of the RNA with fluorescent dyes.
Ein solches Verfahren führt zu erfindungsgemäßen Zielmolekülen, die auch bei sehr geringen Konzentrationen gebildeter Hybride noch gut nachweisbar sind, da durch den Einbau von Markierungsmittel in die Zielsequenz vergleichsweise viel Markierungsmittel eingebaut werden kann. Zumindest bei in normalen Konzentrationen vorliegenden Zielmolekülen kann anhand des weiteren Markierungsmittels im verwendeten Primer das Ergebnis in einem Spot außerdem verifiziert werden.One such procedure leads to target molecules of the invention, the even at very low concentrations of formed hybrids still good are detectable, since by the incorporation of marker in the Target sequence comparatively much labeling agents are incorporated can. At least for target molecules present in normal concentrations on the basis of the further marking agent in the primer used the Result in a spot as well be verified.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch die Zielmoleküle zum Einsatz in erfindungsgemäßen Verfahren, die eine Markierung bzw. eine Anhäufung von Markierungen in räumlicher Nähe zur oder innerhalb der jeweiligen Zielsequenz aufweisen.The Task is further solved through the target molecules for use in methods according to the invention, the one mark or an accumulation of markers in spatial Close to or within the respective target sequence.
Bevorzugt sind nach erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellte erfindungsgemäße Zielmoleküle.Prefers are by the method according to the invention provided target molecules according to the invention.
Die Aufgabe wird schließlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gelöst, bei dem erfindungsgemäße Zielmoleküle zum Einsatz kommen, die auch nach einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung solcher Moleküle hergestellt worden sein können.The Task finally becomes by a method according to the invention solved, used in the target molecules according to the invention which also come after a process according to the invention for the preparation such molecules may have been produced.
Ein erfindungsgemäßer Satz Fängermoleküle für die Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren umfasst:
- – eine vorbestimmte Anzahl unterschiedlicher Fängermoleküle umfassend jeweils unterschiedliche Fängersequenzen, die jeweils zum Ausbilden von Ligandenbindungen mit Zielsequenzen von erfindungsgemäßen Zielmolekülen derart ausgebildet sind, dass sie komplementär zu den jeweiligen Abschnitten der Zielsequenzen sind, die sich in räumlicher Nähe zu einer Markierung bzw. einer Anhäufung von Markierungen befinden.
- A predetermined number of different capture molecules each comprising different capture sequences, each designed to form ligand bonds with target sequences of target molecules of the invention such that they are complementary to the respective segments of the target sequences that are in spatial proximity to a label or an aggregate of Markings are located.
Ein erfindungsgemäßer Satz Fängermoleküle weist zumindest 10, 30, 50, 100, 1.000 beziehungsweise 5.000 unterschiedliche Fängersequenzen auf. Vorzugsweise sind alle Fängermoleküle des Satzes Fängermoleküle derart ausgebildet, dass sie komplementär zu den jeweiligen Abschnitten der Zielsequenzen sind, die sich in räumlicher Nähe zu einer Markierung bzw. einer Anhäufung von Markierungen befinden.One inventive sentence Catcher molecules points at least 10, 30, 50, 100, 1,000 or 5,000 different capture sequences on. Preferably, all catcher molecules of the set are Catcher molecules like this trained to be complementary to the respective sections of the target sequences, which are in spatial Close to one Marking or accumulation of markings.
Bei einem erfindungsgemäßen Satz sind die Fängersequenzen Bestandteile der Sonden eines DNA-Arrays.at a sentence according to the invention are the catcher sequences Components of the probes of a DNA array.
Nach einem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Fängermoleküle derart bestimmt bzw. berechnet, dass sie komplementär zu den jeweiligen Abschnitten der Zielsequenz sind, die sich in räumlicher Nähe zu einer Markierung bzw. zu einer Anhäufung von Markierungen befinden. Als Zielsequenz wird hierbei ein Bereich des Zielmoleküls bestimmt, der für das Zielmolekül spezifisch ist.To a method according to the invention the catcher molecules in such a way determines or calculates that they are complementary to the respective sections the target sequence, which are in proximity to a mark or to an accumulation of markings. The target sequence here is an area of the target molecule definitely, for the target molecule is specific.
Genaue Beschreibung der ErfindungPrecise description the invention
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die Figuren zeigen in:The The invention will be described below with reference to the figures and some embodiments explained in more detail. The Figures show in:
Der Erfindung liegt der überraschende Befund zugrunde, dass die Signalausbeute bei fluoreszenzmarkierten Zielmolekülen, die mit Fängersequenzen Hybride bzw. Duplexe bilden, höher sind, wenn die Fluoreszenzmarkierung in der Nähe des gebildeten Hybrides liegt. Unerwarteterweise ist dieser Effekt strang- und damit sequenzunabhängig.Of the Invention is the surprising Findings based on the signal yield in fluorescently labeled Target molecules, the with catcher sequences Form hybrids or duplexes, higher are when the fluorescent label is near the hybrid formed lies. Unexpectedly, this effect is extraneous and thus sequence independent.
Überraschenderweise ist der beobachtete Effekt auch unabhängig von der chemischen Natur der Fluoreszenzmarkierung. Der Effekt tritt sowohl bei Verwendung langer (z. B. 50mere), als auch kurzer Fängeroligonukleotide (z. B. 16-17 mere) auf. Überraschenderweise ist dieser Effekt außerdem unabhängig von der verwendeten Glasmikroarrayoberflächen bzw. -beschichtung zur Immobilisierung von Fängeroligonukleotiden.Surprisingly the observed effect is also independent of the chemical nature of the Fluorescent label. The effect occurs both when using long (eg 50mers), as well as short capture oligonucleotides (e.g. 16-17 mere). Surprisingly this effect is as well independently from the glass microarray surfaces or coating used Immobilization of capture oligonucleotides.
Anhand der nun folgenden Ausführungsbeispiele lässt sich die Erfindung besser erläutern. Die Ausführungsbeispiele machen deutlich, dass die Erfindung zu einer dramatischen Verbesserung der Signalausbeute in und der Aussagekraft von Mikroarray-Hybridisierungsexperimenten führt.Based the following embodiments let yourself better explain the invention. The embodiments make it clear that the invention is a dramatic improvement the signal yield in and the significance of microarray hybridization experiments leads.
Die Erfindung lässt sich anhand der folgenden Ausführungsbeispiele besser erläutern.The Invention leaves on the basis of the following embodiments better explain.
Die nun folgenden Ausführungsbeispiele zeigen, dass die Erfindung die Signalintensität bei Mikroarrayexperimenten erheblich verbessert. Gezeigt wird dies anhand bestimmter Fluoreszenzmarkierungen. Die Ausführungsbeispiele demonstrieren, dass es im Wesentlichen auf die Position des Markierungsagens in Bezug auf das nachzuweisende Hybrid ankommt. Es ist hierbei vollkommen egal, um was für ein Markierungsagens es sich im Einzelnen handelt. Es kommt einzig und allein auf die Position des Markierungsagens in Bezug auf das nachzuweisende Hybrid bzw. Duplex an, wobei natürlich Mischeffekte mit anderen Faktoren, die die Hybridisierungeeffizienz beeinflussen können (z.B. Länge des Oligonukleotidspacers, sterische Effekte, Effekte der Sekundärstruktur), auftreten. Die folgenden Ausführungsbeispiele sind darum lediglich als Erläuterungsbeispiele zu verstehen. Insbesondere schränken die folgenden Ausführungsbeispiele und das eben erläuterte Experiment die Lehre der Erfindung nicht ein im Hinblick auf nachzuweisende Sequenzen, zu verwendende Markierungen oder dergleichen.The now following embodiments show that the invention the signal intensity in microarray experiments significantly improved. This is shown by means of certain fluorescent labels. The embodiments demonstrate that it is essentially the position of the tagging agent arrives with respect to the hybrid to be detected. It is perfect here no matter what a marking agent in detail. It only comes and only on the position of the tagging agent in relation to the to be demonstrated hybrid or duplex, of course, mixed effects with others Factors that may affect hybridization efficiency (e.g. Length of the Oligonucleotide spacers, steric effects, secondary structure effects), occur. The following embodiments are therefore only illustrative examples to understand. In particular, restrict the following embodiments and that just explained Do not experiment with the teachings of the invention with a view to be proved Sequences, labels to use or the like.
Ausführungsbeispiele:EXAMPLES
Die
Ausführungsbeispiele
sind Bestandteile eines Beispielexperimentes, das wie folgt angelegt war:
Das
Zielmolekül
in dem Beispiel-Experiment ist eine 5'-endmarkierte oder durch random labeling
mit Fluorescein-12-dUTP markierte einzelsträngige DNA, und zwar im Fragment
des Nitrogenasegens nifH (Hurek et al., 1995) aus dem Bakterium
Azoarcus sp. Stamm BH72. Das Fragment wurde mittels PCR mit den
Primern Zehr-nifH aus chromosomaler DNA des Stammes BH72 amplifiziert
(Hurek et al., 2002), wobei einer der Primer mit Cy3/Cy5 markiert
war, der andere mit Biotin. Fluoreszenzmarkierte einzelsträngige DNA
konnte so aus dem PCR-Produkt isoliert werden. Beim Gebrauch von
mit Fluorescein-12-dUTP für
random labeling wurde lediglich biotinylierter Primer eingesetzt.
Die Primer hatten für alle
Experimente die in
Biotin markierte Stränge wurden
mittels Streptavidin-beschichteter paramagnetischer Kugeln (Fa.
Roche) abgetrennt (Niemeyer et al, 1999). Die Konzentration der
verbleibenden Einzelstrang-DNA wurde spektralfotometrisch bestimmt.
Vor der jeweiligen Hybridisierung wurde die Einzelstrang-DNA 10
Minuten bei 95 °C
denaturiert und dann mindestens drei Minuten auf Eis inkubiert.The embodiments are components of an example experiment, which was designed as follows:
The target molecule in the example experiment is a 5'-end-labeled or by random labeling with fluorescein-12-dUTP labeled single-stranded DNA, in the fragment of the nitrogenase gene nifH (Hurek et al., 1995) from the bacterium Azoarcus sp. Strain BH72. The fragment was amplified by PCR with the primers Zehr-nifH from chromosomal DNA of strain BH72 (Hurek et al., 2002), one of the primers being labeled with Cy3 / Cy5, the other with biotin. Fluorescence-labeled single-stranded DNA could thus be isolated from the PCR product. Using fluorescein-12-dUTP for random labeling, only biotinylated primer was used. The primers had the in
Biotin-labeled strands were separated by streptavidin-coated paramagnetic beads (Roche) (Niemeyer et al, 1999). The concentration of the remaining single-stranded DNA was determined spectrophotometrically. Prior to each hybridization, the single-stranded DNA was denatured at 95 ° C for 10 minutes and then incubated on ice for at least three minutes.
Die
in diesem Experiment verwendeten Oligonukleotide binden alle an
das oben genannte nifH-Genfragement des Stammes BH72. Die entsprechenden
Sequenzen und ihre Charakteristika ergeben sich aus den Tabellen
1 in
Zur Durchführung der Hybrisierungsexperimente wurden DNA-Mikroarrays auf standardmikroskopischen Glasobjektträgern der Firma Menzel, Braunschweig, Deutschland, hergestellt. Chemikalien und Lösungsmittel stammten von der Firma Fluka (Neu-Ulm, Deutschland). Zur Herstellung der Mikroarrays wurden die Glassubstrate gereinigt, silyliert, und aktiviert, wie von Bentas et al (2002) beschrieben. Die aktivierten Oberflächen wurden direkt zur Immobilisierung von entweder 5'- oder 3'-Amino-modifizierten Fänger-Oligonukleotiden mittels kovalenter Bindung eingesetzt.to execution The hybridization experiments were performed on standard micrographs using DNA microarrays Glass slides made by Menzel, Braunschweig, Germany. chemicals and solvents came from the company Fluka (Neu-Ulm, Germany). For the production In the microarrays, the glass substrates were cleaned, silylated, and activated as described by Bentas et al (2002). The activated surfaces were directly immobilized to either 5'- or 3'-amino-modified Capture oligonucleotides used by covalent bonding.
Die Auftragung der Sonden auf die so aktivierten Objektträgeroberflächen erfolgte mittels eines Piezo-getriebenen Spotter Robodrop (BIAS, Bremen, Deutschland) oder mittels eines MicroGrid II Compact 400 der Firma BioRobotics, Vereinigtes Königreich. Die Konzentration der Oligonukleotide betrug etwa 10 μM pro ml Wasser. Das verwendete Wasser enthielt 1 % Glyzerin. In jeden Spot des Mikroarrays wurden ca. 250 pl aufgetragen, was einen Spotdurchmesser von etwa 200 μm entspricht.The Application of the probes on the so activated slide surfaces was carried out using a piezo-driven spotter Robodrop (BIAS, Bremen, Germany) or by means of a MicroGrid II Compact 400 from BioRobotics, United Kingdom. The concentration of oligonucleotides was about 10 μM per ml Water. The water used contained 1% glycerin. In every spot of the microarray, about 250 pl were applied, which is a spot diameter of about 200 μm equivalent.
Die Objektträger wurden über Nacht bei Zimmertemperatur in Wasser gesättigter Atmosphäre inkubiert, um die kovalente Bindung zu bewerkstelligen. Eine Blockierung der Mikroarrays erfolgt mittels 6-Amino-1-Hexanol (50mM) und Diisopropylethylamin (150mM) in Dimethylformit nach Beier et al (1999). Anschließend wurden die Objektträger mit deionisiertem, partikelfreiem Wasser gewaschen, luftgetrocknet und bei 4 °C unter N2 gelagert.The slides were incubated overnight at room temperature in saturated aqueous humor to effect covalent attachment. The microarrays are blocked by means of 6-amino-1-hexanol (50 mM) and diisopropylethylamine (150 mM) in dimethylformite according to Beier et al (1999). Subsequently, the slides were washed with deionized, particle-free water, air-dried and stored at 4 ° C. under N 2 .
Das Hybridisieren der Zielmoleküle an die Sonden des Mikroarrays und Waschen erfolgte in einem Personal Hyb Ofen der Firma Stratagene, Vereinigte Staaten von Amerika. Die Dauer der Hybridisierung betrug von 1 – 16 Stunden. Soweit nicht anders angegeben, erfolgte die Hybridisierung bei Zimmertemperatur mit 50 % Formamid, bei 46 °C mit 50 % Formamid, und es wurde dabei 10 nM einzelsträngige DNA eingesetzt. Der verwendete Hybridisierungspuffer enthielt 4 × SET, 10 × Denhardt's. Während der Hybridisierung wurde der Objektträger mit einem Deckglas bedeckt. Im Anschluss an die Hybridisierung erfolgte eine Waschung mit 2 × SET (0,1 % SDS) für 5 min und 1 × SET (0,1 %SDS) für 10 min bei Zimmertemperatur, oder mit 1 × (0,1 % SDS) für 5 min und 0,1 × SET (0,1 % SDS) für 10 min bei 46 °C. Die getrockneten Mikroarrays wurden bei einer Auflösung von 10 μm mit einem GenePix 4000 Microarray Scanner der Firma Axon, Union City, Kalifornien bei gleichbleibender Stärke des Lasers und bei gleichbleibender Empfindlichkeit des Photomultipliers ausgewertet. Aus diesem Grund lassen sich die in den jeweiligen Ausführungsbeispielen ermittelten Signalintensitäten vergleichen.The Hybridize the target molecules to the probes of the microarray and washing took place in a staff Hyb kiln of the company Stratagene, United States of America. The Duration of hybridization was from 1 to 16 hours. If not stated otherwise, the hybridization was carried out at room temperature with 50% formamide, at 46 ° C with 50% formamide, resulting in 10 nM single-stranded DNA used. The hybridization buffer used contained 4x SET, 10x Denhardt's. During hybridization became the slide covered with a coverslip. Following hybridization occurred a wash with 2 × SET (0.1% SDS) for 5 min and 1 x SET (0.1% SDS) for For 10 min at room temperature, or with 1 x (0.1% SDS) for 5 min and 0.1 × SET (0.1% SDS) for 10 min at 46 ° C. The dried microarrays were at a resolution of 10 μm with a GenePix 4000 microarray scanner from Axon, Union City, California with consistent power of the laser and at the same time Sensitivity of the photomultiplier evaluated. For this reason let the signal intensities determined in the respective exemplary embodiments be compared.
Ausführungsbeispiel 1:Embodiment 1
Der
revers komplementäre
Strang bzw. der Antisense-Strang des oben bereits erwähnten nifH-Genfragementes
vom Stamm BH72 wurde mit den Sense-Oligonukleotiden S307 (6A), S114(6A) und
S20 (6A) hybridisiert. Der Antisense-Strang ist in
In
In
Ausführungsbeispiel 2:Embodiment 2:
Dieses
Ausführungsbeispiel
zeigt, dass der im Ausführungsbeispiel
1 beschriebene Effekt strang- und damit sequenzunabhängig ist.
Es wurden Cy5-markierte Gegenstränge
(Sense-Strang) mit den entsprechenden Antisense-Oligonukleotiden
hybridisiert. Es wurde der gleiche Effekt beobachtet wie in Beispiel
1 (vgl.
Wie
anhand der grafischen Darstellung der Signalintensitäten in
Es wird in diesem Zusammenhang darauf hingewiesen, dass bei Mikroarrayhybridisierungsexperimenten falsch negative Resultate dadurch entstehen können, dass eine Markierung sich in einer ungünstigen Position befindet, die zu einer niedrigen Signalintensität führt, wie zum Beispiel im Fall des Fänger-Oligonukleotides A307(6A)3'; ähnliche sterische Effekte der Hybridisierung wurden von Peplies et al. (2003) beschrieben. Dieses Oligonukleotid liefert eine 48-fach niedrigere Signalintensität als A20(6A). Die ungünstigste Position ist weit entfernt von der Zielsequenz.It It is noted in this context that in microarray hybridization experiments false negative results can be caused by a marking yourself in an unfavorable Position that leads to a low signal intensity, such as for example, in the case of the capture oligonucleotide A307 (6A) 3 '; similar steric effects of hybridization were reported by Peplies et al. (2003) described. This oligonucleotide provides a 48-fold lower signal intensity as A20 (6A). The worst Position is far from the target sequence.
Ausführungsbeispiel 3:Embodiment 3
Dieses
Ausführungsbeispiel
zeigt, dass der in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen beobachtete
Effekt sich durch größere Nähe der Markierung
zur Zielsequenz noch verstärken
läßt. Dafür wurde
ein Antisense-Fängeroligonukleotid
verwendet, A1 (6A) in
Der
positive Positionseffekt wird auch in
Ausführungsbeispiel 4:Embodiment 4
Dieses
Ausführungsbeispiel
zeigt, dass der in den vorangegangenen Ausführungsbeispielen beobachtete
Effekt unabhängig
von der chemischen Natur der Markierung ist. Die gleichen Experimente wie
im Ausführungsbeispiel
2 wurden mit einem Cy3-markiertem
Sense-Strang anstelle eines Cy5-markierten Sense-Stranges durchgeführt und lieferten
im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 2 beschrieben.
Diese Ergebnisse sind in den
Wie bereits angedeutet, entsprechen die Ergebnisse im Wesentlichen den im Ausführungsbeispiel 2 diskutierten Ergebnissen. Dass eine andere Markierung zu im wesentlichen gleichen Ergebnissen führt, belegt, dass es keine Rolle spielt, welche Art der Fluoreszenz-Markierung gewählt wird, um die Erfindung auszuführen.As already indicated, the results essentially correspond to the in the embodiment 2 discussed results. That another mark too substantially results in the same results, proves that it does not matter what kind of fluorescence label chosen is to carry out the invention.
Ausführungsbeispiel 5:Embodiment 5:
Das
in Ausführungsbeispiel
1 beschriebene Experiment wurde wiederholt mit Cy3-markiertem Sense-Strang
und Cy3-markiertem Antisense-Strang. Die Ergebnisse im Fall des
Cy3-markierten Sense-Stranges sind in den
Diese mit dem Ausführungsbeispiel 1 vergleichbaren Experimente belegen, dass sowohl Cy3-markierter Sense-Strang als auch Cy3-markierter Antisense-Strang dann mit hohen Signalausbeuten nachweisbar sind, wenn die mit Fängersequenzen gebildeten Hybride die Markierung in unmittelbarer räumlicher Nähe aufweisen. Bei der Sonde A20(6A) oder S307(6A) ist die Signalintensität gegenüber anderen Hybriden bis zu einem Faktor 22 erhöht.These with the embodiment 1 comparable experiments show that both Cy3-labeled Sense strand as well as Cy3-labeled antisense strand then with high Signal yields are detectable when the hybrids formed with capture sequences have the mark in the immediate vicinity. For the A20 probe (6A) or S307 (FIG. 6A) is the signal intensity over other hybrids up to increased by a factor of 22.
Ausführungsbeispiel 6:Embodiment 6:
Dieses Ausführungsbeispiel belegt, dass die Erfindung auch bei Verwendung längerer Oligonukleotide funktioniert. Es wurden in diesem Fall 50mer Oligonukleotide eingesetzt, die jeweils an den äußeren Enden des Zielmoleküls binden. Cy3-markierter Sense-Strang zeigt das stärkere Signal, wenn die Markierung nahe dem Duplex lie gen (A19-68). Die Signalintensität war in diesem Fall gegenüber den übrigen Signalen um den Faktor 2 erhöht.This embodiment demonstrates that the invention also works when using longer oligonucleotides. In this case, 50mer oligonucleotides were used, each at the outer ends of the target molecule tie. Cy3-labeled sense strand shows the stronger signal when the marker near the duplex (A19-68). The signal intensity was in in this case the rest Signals increased by a factor of 2.
Bezeichnung
und Sequenzen der verwendeten 50mer Oligonukleotid-Fänger bzw.
Zielsequenzen lassen sich der Tabelle 2 in
In
Dasselbe
Experiment wurde mit Cy3-markiertem Antisense-Strang durchgeführt. Auch
in diesem Fall zeigte sich das stärkste Signal, wenn die Markierung
nahe dem Duplex lag (S289-338), vgl. die
Ausführungsbeispiel 7:Embodiment 7:
Dieses
Ausführungsbeispiel
belegt, dass auch andere Markierungsstrategien zur Erzeugung von
Zielmolekülen
eingesetzt werden können.
Unter Verwendung unmarkierter PCR-Primer und dem zufälligen Einbau
von Fluorescein-12-dUTP („random labeling") wurde ein entsprechend
markierter Sense-Strang erzeugt, der mit kurzen Antisense-Oligonukleotiden
hybridisiert wurde. In
Aus
Tabelle I in
Zusätzlich zu dem wie oben beschriebenen Glasobjektträgern wurden kommerzielle Träger für Mikroarrays verwendet, wie zum Beispiel Aldehyde Slides und Amin Slides, Aldehyd plus Slides der Firma Genetics, QMT® Aldehyde Slides von Peqlab, Pan® Amine Slides von MWG-Biotech. Bei diesen Mikroarrays wurden dieselben Ergebnisse gefunden wie eben anhand der Ausführungsbeispiele 1 – 7 erläutert.In addition to the above-described glass slides commercial carrier for Micro-arrays were used, such as aldehydes and amine Slides slides, aldehyde plus slides the company Genetics, QMT ® slides from aldehydes Peqlab, Pan amines ® slides from MWG-Biotech. In these microarrays, the same results were found as just explained with reference to the embodiments 1-7.
Dies belegt, dass die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit beliebigen Mikroarrays verwendbar ist.This proves that the present invention in connection with any Microarray is usable.
Vorstehend wurde anhand erfindungsgemäß markierter Zielsequenzen, die in Lösung auf DNA-Arrays aufgetragen werden, aufgezeigt, dass die Erfindung strang- und somit sequenzunabhängig ist.above was labeled according to the invention Target sequences in solution applied to DNA arrays, demonstrated that the invention strand and thus sequence independent is.
Im Rahmen der Erfindung ist dies Vorgehensweise ohne weiteres umkehrbar, d.h. es lassen sich zu untersuchende Zielmoleküle auf einem Array vorsehen, die mit erfindungsgemäß markierten, in Lösung befindlichen Fängermolekülen versetzt werden, so dass Duplexe bzw. Komplexe mit hohen Signalintensitäten entstehen. Mit anderen Worten: der Begriff „Zielmolekül" ist so zu lesen, dass er austauschbar ist mit dem Begriff „Fängermolekül" und umgekehrt. Zugleich ist dann der Begriff „Zielsequenz" so zu lesen, dass er auszutauschen ist gegen den Begriff „Fängersequenz" und umgekehrt.In the context of the invention, this procedure is readily reversible, ie it can be Provide target molecules to be examined on an array, which are added according to the invention labeled, in solution catcher molecules, so that duplexes or complexes with high signal intensities arise. In other words, the term "target molecule" should be read as being interchangeable with the term "capture molecule" and vice versa. At the same time, the term "target sequence" is read in such a way that it has to be exchanged for the term "capture sequence" and vice versa.
Auch lässt sich im Rahmen der Erfindung die gesamte Ligandenbindungsreaktion grundsätzlich in Lösung bewerkstelligen.Also let yourself in the context of the invention, the entire ligand binding reaction is basically accomplished in solution.
LiteraturlisteBibliography
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Claims (26)
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE200410037081 DE102004037081A1 (en) | 2004-07-30 | 2004-07-30 | Hybridization assay of nucleic acid, useful particularly for identifying nitrogen-fixing microorganisms, where the complex formed includes a lable in, or close to, the hybrid region |
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DE112005001815T DE112005001815A5 (en) | 2004-07-30 | 2005-07-27 | Method for analyzing samples by means of hybridization |
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Peplies,J., Flöckner,F.O., Amann,R.: Optimization Strategies for DNA Microarray-Based Detection of Bacteria with 16S rRNA-Targeting Oligonucleot- ide Probes. Applied and Environmental Microbiology 2003, Vol. 69, No. 3, S. 1397-1407 |
Peplies,J., Flöckner,F.O., Amann,R.: Optimization Strategies for DNA Microarray-Based Detection of Bacteria with 16S rRNA-Targeting Oligonucleot- ide Probes. Applied and Environmental Microbiology2003, Vol. 69, No. 3, S. 1397-1407 * |
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