DE102004034995A1

DE102004034995A1 - Confocal laser scanning microscope, has control unit for controlling scanning assembly during operation of wide panel illumination source, and selects spot-detection assembly so as to obtain image of illuminated sample

Info

Publication number: DE102004034995A1
Application number: DE200410034995
Authority: DE
Inventors: Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2006-02-02

Abstract

The microscope has a spot-detection assembly (5) illustrating a spot of a sample (23) over a scanning assembly (3,4) using a confocal diaphragm (26) on a detection unit (28). A wide panel illumination source (29, 34) is provided for illuminating the sample (23). The control unit controls the assembly (3,4) during an operation of the source (29, 34), and selects the assembly (5) so as to obtain an image of the illuminated sample (23).

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein konfokales Laserscanningmikroskop mit einer Spot-Beleuchtungsanordnung, die einen Beleuchtungsstrahl zum punkt- oder punktgruppenförmigen Beleuchten einer Probe bereitstellt, einer Scananordnung, die den punkt- oder punktgruppenförmigen Beleuchtungsstrahl scannend über die Probe führt, einer Spot-Detektoranordnung, die über die Scananordnung den beleuchteten Punkt- oder Punktgruppenspot der Probe mittels mindestens einer konfokalen Blende auf mindestens eine Detektoreinheit abbildet, und einer Steuereinheit, die die Scananordnung ansteuert und die Spot-Detektoranordnung ausliest.The This invention relates to a confocal laser scanning microscope with a spot lighting arrangement, the an illumination beam to the point or point group lighting a sample provides, a scanning device, the point or point-shaped group Lighting beam scanning over the sample leads, a spot detector arrangement, the above the scan array the illuminated spot or spot group spot the sample by means of at least one confocal aperture on at least a detector unit, and a control unit, which the Scanning device controls and reads the spot detector array.

Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur Laserscanningmikroskopie, wobei ein Bild einer Probe durch Scannen und konfokaler Abbildung eines Punkt- oder Punktgruppenspots erzeugt wird und Mittel zur gescannten punkt- oder punktgruppenförmigen Probenbeleuchtung vorgesehen werden.The Invention further relates to a method of laser scanning microscopy, taking an image of a sample by scanning and confocal imaging a point or point group spot is generated and means for Scanned point or point group-shaped sample illumination can be provided.

Konfokale Laserscanningmikroskope der eingangs genannten Art sind im Stand der Technik bekannt, beispielhalber sei hierzu auf die DE 197 02 753 A1 verwiesen. In jüngster Zeit wurden vermehrt mikroskopische Aufbauten, insbesondere konfokal abbildende Laserscanningmikroskope, für spektroskopische Aufnahmetechniken eingesetzt. Auf diese Weise ist es möglich, die spektroskopischen Eigenschaften eines ausgewählten Probenbereichs zerstörungs- und berührungslos zu vermessen. Die konfokale optische Mikroskopie ermöglicht dabei die selektive Detektion optischer Signale, welche innerhalb eines beugungsbegrenzten Konfokalvolumens erzeugt werden, dessen Größe im Mikrometerbereich liegt. Laserscanningmikroskope mit abtastenden Laserstrahlen und/oder Probenvorschubeinheiten können mit hoher Ortsauflösung zwei- oder dreidimensionale Darstellungen der untersuchten Probe erzeugen. Durch diese Eigenschaft hat sich die konfokale Laserscanningmikroskopie für fluoreszierende Proben im biomedizinischen Bereich nahezu als Standard durchgesetzt.Confocal laser scanning microscopes of the type mentioned in the introduction are known in the prior art; DE 197 02 753 A1 directed. Recently, microscopic structures, in particular confocal laser scanning microscopes, have increasingly been used for spectroscopic recording techniques. In this way, it is possible to measure the spectroscopic properties of a selected sample area destructive and non-contact. The confocal optical microscopy thereby allows the selective detection of optical signals which are generated within a diffraction-limited confocal volume whose size is in the micrometer range. Laser scanning microscopes with scanning laser beams and / or sample feeding units can produce two- or three-dimensional representations of the examined sample with high spatial resolution. This feature has made confocal laser scanning microscopy the norm for fluorescent biomedical specimens.

Über die genannte Fluoreszenzmessung hinaus sieht die genannte DE 197 02 753 A1 auch vor, eine Transmissionsmessung an der Probe durchzuführen. Dazu ist ein Detektor aktivierbar, der bezogen auf die Beleuchtungsrichtung der gescannten Laserstrahlung unter der Probe liegt und der den transmittierten Anteil der über den Scanner eingestrahlten punktförmigen Strahlung aufnimmt. Dadurch wird ein sogenannter „Durchlichtscan" realisiert. Die optische Einbindung des unter der Probe liegenden Detektors bereitet gewisse Schwierigkeiten, insbesondere da man am Mikroskopteil des Laserscanningmikroskopes üblicherweise auch einen optischen Einblick für einen Beobachter vorsieht. Dies hat zur Folge, daß eine Umschaltung zwischen der Beleuchtung für die normale Mikroskopie und dem separaten Detektor für den Durchlichtscan erforderlich ist.Beyond said fluorescence measurement, said one sees DE 197 02 753 A1 also to carry out a transmission measurement on the sample. For this purpose, a detector can be activated, which lies with respect to the illumination direction of the scanned laser radiation under the sample and which receives the transmitted portion of the incident on the scanner point radiation. The optical integration of the detector under the sample poses certain difficulties, in particular since the microscope part of the laser scanning microscope usually also provides an optical insight for an observer, with the result that switching between the illumination is required for normal microscopy and the separate detector for the transmitted light scan.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß Transmissionsmessungen an der Probe ohne erhöhten Aufwand vorgenommen werden können.Of the Invention is based on the object, a microscope of the beginning educate so-called type so that transmission measurements the sample without increased Effort can be made.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Laserscanningmikroskop der eingangs genannten Art gelöst, bei dem zusätzlich eine Weitfeldbeleuchtungsquelle vorgesehen ist, die die Probe beleuchtet, und bei dem die Steuereinheit bei Betrieb der Weitfeldbeleuchtungsquelle die Scananordnung so ansteuert und die Spot-Detektoranordnung so ausliest, daß ein Bild der weitfeldbeleuchteten Probe (23) gewonnen ist.This object is achieved according to the invention with a laser scanning microscope of the type mentioned, in which additionally a wide field illumination source is provided which illuminates the sample, and in which the control unit so controls the scanning arrangement during operation of the wide field illumination source and reads the spot detector array so that an image the far-field illuminated sample ( 23 ) is won.

Die Erfindung wird weiter mit einem Verfahren zur Laserscanningmikroskopie der eingangs genannte Art gelöst, bei dem die Probe weitfeldbeleuchtet wird und durch Scannen des Punkt- oder Punktgruppenspots abgebildet wird.The The invention further proceeds with a method for laser scanning microscopy of the type mentioned above, in which the sample is far field illuminated and by scanning the Point or point group spots is shown.

Die Erfindung setzt also nunmehr erstmals eine Weitfeldbeleuchtung in Kombination mit einer gescannten Detektion ein. Mit dieser überraschend einfachen Maßnahme wird ein separater Detektor verzichtbar. Gleichzeitig erreicht man eine Fülle von Vorteilen.The Thus, for the first time, the invention now uses wide-field illumination Combination with a scanned detection. With this surprisingly simple measure a separate detector is dispensed with. At the same time you reach a wealth of advantages.

Für die Weitfeldbeleuchtung können Strahlungsquellen verwendet werden, die am Laserscanningmikroskop für normale optische Beobachtung ohnehin vorhanden sind. Ein Umschaltmechanismus wird nicht mehr benötigt. Es ergibt sich also insgesamt eine bauliche Vereinfachung. Vorzugsweise wird die Weitfeldbeleuchtungsquelle eine Durchlichtbeleuchtung der Probe realisieren. Alternativ und zusätzlich ist natürlich auch eine Weitfeld-Auflichtbeleuchtung möglicht, um beispielsweise Epi-Fluoreszenzmessungen oder Reflexionsmessungen durchzuführen. Auch kann man beide Modi (Auf- und Durchlicht) gleichzeitig realisieren.For the wide field illumination can Radiation sources are used, the laser scanning microscope for normal optical observation are available anyway. A switching mechanism will no longer needed. Overall, this results in a structural simplification. Preferably the far-field illumination source transmits transmitted light of the sample realize. Alternative and additional is natural also a wide-field incident illumination enables, for example, epi-fluorescence measurements or reflection measurements perform. You can also realize both modes (incident and transmitted light) simultaneously.

Die Tiefendiskreminierungsfähigkeit der konfokalen Detektoranordnung läßt im übrigen erstmals eine tiefenaufgelöste Transmissionsmessung zu.The Tiefendiskreminierungsfähigkeit Incidentally, the confocal detector arrangement for the first time leaves a depth-resolved transmission measurement to.

Durch den Einsatz der meist ohnehin vorhandenen Weitfeldbeleuchtungsquellen, die üblicherweise verglichen mit dem zum Scannen vorgesehenen Anregungsbeleuchtungsquellen sehr breitbandig sind, kann ein Weißlicht-Durchlichtbetrieb realisiert werden, der aufgrund der Erfordernisse konfokaler Abbildung in herkömmlichen Laserscanningmikroskopen so nicht oder nur unter enormem lichtquellenseitigen Aufwand möglich war. Gleiches gilt analog hinsichtlich Weifteld-Auflichtfluoreszenzanregung.By using the mostly existing wide-field illumination sources, which usually compared to the intended for scanning excitation lighting sources very broadband a white light transmitted light mode can be realized, which was not possible due to the requirements of confocal imaging in conventional laser scanning microscopes or only under enormous light source side effort. The same applies analogously with regard to white field incident light fluorescence excitation.

Durch die Abtastung der weitfeldbeleuchteten Probe mit den gescannten Detektoren kann eine in einem Laserscanningmikroskop vorhandene spektrale Analysefähigkeit der Detektoranordnung auch im Transmissionsbetrieb ausgenutzt werden, was zu einer besseren Probencharakterisierung führt. Es ist deshalb eine Weiterbildung bevorzugt, bei der die Spot-Detektoranordnung mehrere spektrale Kanäle aufweist.By the scan of the far-field illuminated sample with the scanned Detectors may be a laser scanning microscope spectral analysis capability the detector arrangement can also be utilized in the transmission mode, resulting in better sample characterization. It is therefore a further education preferred in which the spot detector array has multiple spectral channels.

Die Weitfeldbeleuchtung kann unabhängig von der gescannten spotförmigen Beleuchtung betrieben werden. Natürlich kann die Steuereinheit auch einen gleichzeitigen Betrieb einleiten, in dem dann die Probe gleichzeitig im Transmissions- wie auch im herkömmlichen Fluoreszenzbetrieb analysiert wird.The Wide field illumination can be independent of the scanned spot-shaped Lighting be operated. Of course, the control unit can also initiate a simultaneous operation in which then the sample simultaneously in transmission as well as in conventional fluorescence operation is analyzed.

Beispielsweise kann die Steuereinheit verschiedene spektrale Kanäle geeignet auslesen, so daß in einigen spektralen Kanälen Fluoreszenzinformation über die Probe, in anderen spektralen Kanälen Transmissionsinformation anfällt. Eine geeignete Zusammenführung dieser Information, beispielsweise in einem überlagerten Bild, gibt eine herkömmlichen Systemen überlegene Probenanalyse. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Steuereinheit die Spot-Beleuchtungsanordnung und die Weitfeldbeleuchtungsquelle simultan im Betrieb steuert und die spektralen Kanäle der Spot-Detektoranordnung geeignet ausliest.For example The control unit may be suitable for different spectral channels read out so that in some spectral channels Fluorescence information about the sample, in other spectral channels transmission information accrues. An appropriate merge This information, for example in a superimposed image, gives one usual Systems superior Sample analysis. It is therefore preferable that the control unit use the spot lighting arrangement and controls the wide field illumination source simultaneously in operation and the spectral channels the spot detector array reads out suitable.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Ansatzes liegt darin, daß nun auch an mehreren Punkten gleichzeitig ein Durchlichtscan möglich ist, was herkömmliche, unter der Probe angeordneten separaten Detektoren mangels geeigneter Ortsauflösung nicht erlaubten. Die nun durch die Erfindung eröffnete Verwendung eines Multipunkt- oder Punktgruppenscanners im Durchlichtbetrieb mindert eventuelle Probleme durch zeitliche Fluktuationen der Weitfeldbeleuchtung, da diese durch geeignete Verlängerung der Integrationszeit bei Mehrpunkt- oder Punktgruppensystemen ausgeglichen werden kann. Es ist deshalb bevorzugt, daß die Weitfeldbeleuchtung und die gescannte punkt- oder punktgruppenförmige Beleuchtung gleichzeitig vorgenommen werden. Unter Punktgruppe wird dabei jede Anordnung von mehreren Punkten verstanden, insbesondere in Form einer Linie, die das Laserscanningmikroskop konfokal beleuchtet und abbildet. Durch diesen Ansatz werden weiter vorteilhaft geringere Probenbelastungen bzw. kürzere Meßzeiten realisiert, die im Stand der Technik so nicht möglich waren. Es ist deshalb besonders bevorzugt, daß die Spot-Detektoranordnung eine konfokale Punktgruppenabbildung verwirklicht, z. B. mit mindestens einer Nipkow-Scheibe und mindestens einem Matrixdetektor.One Another advantage of the approach of the invention is that now too at several points at the same time a transmitted light scan is possible, which conventional, under the sample arranged separate detectors for lack of appropriate spatial resolution not allowed. The use of a multi-point method now opened by the invention or dot group scanner in transmitted light mode reduces possible Problems due to temporal fluctuations of the wide field illumination, because of this by suitable extension the integration time is balanced in multipoint or point group systems can be. It is therefore preferred that the wide field illumination and the scanned point or point group lighting simultaneously be made. Under point group is thereby every arrangement of understood several points, in particular in the form of a line, the the laser scanning microscope confocally illuminates and images. By This approach will further advantageously lower sample loads or shorter ones measurement times realized that were not possible in the prior art. It is because of that particularly preferred that the Spot detector arrangement a confocal point group image realized, z. B. with at least a Nipkow disc and at least one matrix detector.

Hier wird auf Multipunkt oder Nipkow Anordnungen in US 6.028.306 , WO 88 07695 oder DE 2360197 A1 verwiesen, die in die Offenbarung einbezogen werden.This is based on multipoint or Nipkow arrangements in US 6,028,306 , WO 88 07695 or DE 2360197 A1 referred to, which are included in the disclosure.

Gleichfalls einbezogen sind Resonanzscanneranordnungen wie in Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press 1994, Seite 461ff beschrieben.Likewise Included are resonant scanner arrangements as in Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press 1994, page 461ff described.

Auch kann die Spotdetektoranordnung auch eine konfokale Schlitzblende mit einem Zeilendetektor verwenden, wenn eine Linie als Punktgruppe dinet.Also For example, the spot detector arrangement may also have a confocal slit Use with a line detector if a line is a point group dinet.

Die Verwendung einer Weitfeldbeleuchtung erschließt schließlich völlig neue Kontrastierungsverfahren für die Durchlichtmessung. Es sind jetzt alle Kontrastierungsverfahren möglicht, wie sie im Stand der Technik für herkömmliche optische Lichtmikroskope bekannt sind. Um dies zu realisieren, ist es zu bevorzugen, daß die Weitfeldbeleuchtungsquelle einen Kondensor aufweist, in den Kontrastierungsmittel schaltbar sind. Beispielsweise kann man Dunkelfeldbeleuchtung realisieren, indem im Kondensor eine geeignete Ringlende angeordnet wird.The Finally, the use of wide-field illumination opens up completely new contrasting techniques for the Transmitted light measurement. All contrasting methods are now possible as in the prior art for conventional optical light microscopes are known. To realize this is to prefer that the Wide field illumination source has a condenser, in the contrasting agent are switchable. For example, you can realize dark field lighting, by placing a suitable ring-end in the condenser.

Es sind aber auch noch weitere Kontrastierungsmethoden denkbar, wenn die Scananordnung ein Scanobjektiv aufweist, in dessen Pupillenebene geeignete Kontrastierungsmittel schaltbar sind. In Kombination mit der Einbringung von Kontrastierungsmitteln in den Kondensor sind dann nicht nur Dunkelfeldkontrast, sondern auch Phasenkontrast, VAREL-Kontrast, Polarisationskontrast oder Differentialinterferenzkontrast möglich.It but also other contrasting methods are conceivable, if the scan arrangement has a scan objective, suitable in its pupil plane Contrasting agents are switchable. In combination with the introduction of contrasting agents in the condenser are not just dark field contrast, but also phase contrast, VAREL contrast, polarization contrast or differential interference contrast possible.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:The The invention will be described below with reference to the drawings for example, even closer explained. In the drawings show:

1 eine schematische Darstellung eines punktscannenden Laserscanningmikroskops, 1 a schematic representation of a point scanning laser scanning microscope,

2 eine schematische Darstellung eines Punktgruppen scannenden Laserscanningmikroskops, 2 a schematic representation of a point group scanning laser scanning microscope,

3 eine schematische Darstellung des Laserscanningmikroskops der 2 in einer ersten Schnittebene, 3 a schematic representation of the laser scanning microscope of 2 in a first cutting plane,

4 einen Hauptstrahlteiler des Laserscanningmikroskops der 2. 4 a main beam splitter of the laser scanning microscope 2 ,

1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das im wesentlichen aus fünf Komponenten aufgebaut ist: einem Strahlungsquellenmodul 2, das Anregungsstrahlung für die Laserscanningmikroskopie erzeugt, einem Scanmodul 3, das die Anregungsstrahlung konditioniert und zum Scannen über eine Probe geeignet ablenkt, einem Mikroskopmodul 4, das die vom Scanmodul bereitgestellte scannende Strahlung in einem mikroskopischen Strahlengang auf eine Probe richtet, sowie einem Detektormodul 5, das optische Strahlung von der Probe erhält und detektiert. Das Detektormodul 5 kann dabei, wie es in 1 dargestellt ist, spektral mehrkanalig ausgeführt sein. 1 schematically shows a laser scanning microscope 1 , which consists essentially of five components: a radiation source module 2 , which generates excitation radiation for laser scanning microscopy, a scan module 3 which conditions the excitation radiation and suitably deflects it to scan over a sample, a microscope module 4 , which directs the scanning radiation provided by the scanning module in a microscopic beam path to a sample, and a detector module 5 which receives and detects optical radiation from the sample. The detector module 5 can do it as it is in 1 is shown, spectrally executed multi-channel.

Das Strahlungsquellenmodul 2 erzeugt Beleuchtungsstrahlung, die für die Laserscanningmikroskopie geeignet ist, also insbesondere Strahlung, die Fluoreszenz auslösen kann. Je nach Applikation weist das Strahlungsquellenmodul dazu mehrere Strahlungsquellen auf. In einer dargestellten Ausführungsform werden zwei Laser 6 und 7 im Strahlungsquellenmodul 2 vorgesehen, denen jeweils ein Lichtventil 8 sowie ein Abschwächer 9 nachgeschaltet sind und die ihre Strahlung über eine Koppelstelle 10 in eine Lichtleitfaser 11 einkoppeln. Das Lichtventil 8 wirkt als Strahlablenker, mit dem eine Strahlabschaltung bewirkt werden kann, ohne den Betrieb der Laser in der Lasereinheit 6 bzw. 7 selbst abschalten zu müssen. Das Lichtventil 8 ist beispielsweise als AOTF ausgebildet, das zur Strahlabschaltung den Laserstrahl vor der Einkopplung in die Lichtleitfaser 11 in Richtung einer nicht dargestellten Lichtfalle ablenkt.The radiation source module 2 generates illumination radiation that is suitable for laser scanning microscopy, ie in particular radiation that can trigger fluorescence. Depending on the application, the radiation source module has a plurality of radiation sources for this purpose. In an illustrated embodiment, two lasers 6 and 7 in the radiation source module 2 provided, each with a light valve 8th as well as an attenuator 9 are connected downstream and their radiation via a coupling point 10 in an optical fiber 11 inject. The light valve 8th acts as a beam deflector, with which a beam shutoff can be effected without the operation of the laser in the laser unit 6 respectively. 7 to switch off yourself. The light valve 8th is designed, for example, as AOTF, which, for the purpose of stopping the beam, switches off the laser beam before it is coupled into the optical fiber 11 deflects in the direction of a light trap, not shown.

In der beispielhaften Darstellung der 1 weist die Lasereinheit 6 drei Laser B, C, D auf, wohingegen die Lasereinheit 7 nur einen Laser A beinhaltet. Die Darstellung in Figur 6 und 7 ist also beispielhaft für eine Kombination aus Einzel- und Multiwellenlängenlaser, die einzeln oder auch gemeinsam an eine oder mehrere Fasern angekoppelt sind. Auch kann die Ankopplung über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung später nach Durchlaufen einer Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird. Es ist somit möglich, verschiedenste Wellenlängen oder -bereiche für die Anregungsstrahlung zu verwenden.In the exemplary illustration of the 1 has the laser unit 6 three lasers B, C, D on, whereas the laser unit 7 only one laser A included. The representation in FIG 6 and 7 is thus exemplary of a combination of single and multi-wavelength lasers, which are individually or jointly coupled to one or more fibers. The coupling can also take place simultaneously via a plurality of fibers, the radiation of which is later mixed after passing through an adjustment optics by means of color combiner. It is thus possible to use a wide variety of wavelengths or ranges for the excitation radiation.

Die in die Lichtleitfaser 11 eingekoppelte Strahlung wird mittels verschieblichen Kollimationsoptiken 12 und 13 über Strahlvereinigungsspiegel 14, 15 zusammengeführt.The in the optical fiber 11 Coupled radiation is by means of sliding collimating optics 12 and 13 about beam merging mirror 14 . 15 merged.

Die Kollimatoren 12, 13 sorgen dafür, daß die vom Strahlungsquellenmodul 2 an das Scanmodul 3 zugeführte Strahlung in einen Unendlichstrahlengang kollimiert wird. Dies erfolgt jeweils vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung entlang der optischen Achse unter Steuerung (einer nicht dargestellten) zentralen Ansteuereinheit eine Fokussierungsfunktion hat, indem der Abstand zwischen Kollimator 12, 13 und dem jeweiligen Ende der Lichtleitfaser veränderbar ist.The collimators 12 . 13 make sure that the radiation source module 2 to the scan module 3 supplied radiation is collimated in an infinite beam path. This is advantageously done with a single lens having a focusing function by displacement along the optical axis under the control of a central drive unit (not shown) by adjusting the distance between the collimator 12 . 13 and the respective end of the optical fiber is changeable.

Dieser Beleuchtungsstrahl dient als Anregungsstrahlung und wird über einen Hauptfarbteiler 17 zu einem Scanner 18 geleitet. Auf den Hauptfarbteiler wird später noch eingegangen, hier sei lediglich erwähnt, daß er die Funktion hat, vom Mikroskopmodul 4 zurückkehrende Probenstrahlung von der Anregungsstrahlung zu trennen.This illumination beam serves as excitation radiation and is transmitted via a main color splitter 17 to a scanner 18 directed. On the main color divider will be discussed later, here is merely mentioned that he has the function of the microscope module 4 to separate returning sample radiation from the excitation radiation.

Der Scanner 18 lenkt den Strahl zweiachsig ab, wonach er durch ein Scanobjektiv 19 sowie eine Tubuslinse 20 und ein Objektiv 21 in einen Fokus 22 gebündelt wird, der in einem Präparat bzw. in einer Probe 23 liegt. Die optische Abbildung erfolgt dabei so, daß die Probe 23 in einem Brennpunkt mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird.The scanner 18 deflects the beam biaxially, after which it passes through a scanning lens 19 as well as a tube lens 20 and a lens 21 into a focus 22 bundled in a preparation or in a sample 23 lies. The optical imaging is carried out so that the sample 23 is illuminated in a focal point with excitation radiation.

Derart im linienförmigen Fokus 22 angeregte Fluoreszenz-Strahlung gelangt über das Objektiv 21, die Tubuslinse 20 und das Scanobjektiv 19 zurück zum Scanner 18, so daß in Rückrichtung nach dem Scanner 18 wieder ein ruhender Strahl vorliegt. Man spricht deshalb auch davon, daß der Scanner 18 die Fluoreszenz-Strahlung descannt.Such in the linear focus 22 excited fluorescence radiation passes through the lens 21 , the tube lens 20 and the scan lens 19 back to the scanner 18 so that in return for the scanner 18 again a static beam is present. It is therefore also known that the scanner 18 the fluorescence radiation descanted.

Der Hauptfarbteiler 17 läßt die in anderen Wellenlängenbereichen als die Anregungsstrahlung liegende Fluoreszenz-Strahlung passieren, so daß sie über einen Umlenkspiegel 24 im Detektormodul 5 umgelenkt und dann analysiert werden kann. Das Detektormodul 5 weist in der Ausführungsform der 1 vier spektrale Kanäle auf, d.h. die vom Umlenkspiegel 24 kommende Fluoreszenz-Strahlung wird mittels Nebenfarbteilern 25, 25a, 25b, 25c in vier spektrale Kanäle aufgeteilt.The main color divider 17 lets pass the fluorescence radiation lying in other wavelength ranges than the excitation radiation, so that they have a deflection mirror 24 in the detector module 5 be redirected and then analyzed. The detector module 5 has in the embodiment of 1 four spectral channels, ie from the deflection mirror 24 upcoming fluorescence radiation is by means of secondary color separators 25 . 25a . 25b . 25c divided into four spectral channels.

Jeder spektrale Kanal weist eine konfokale Pinholeblende 26 auf, die eine konfokale Abbildung bezüglich der Probe 23 realisiert und deren Größe die Tiefenschärfe, mit der die Strahlung detektiert werden kann, festlegt. Die Geometrie der Blende 26 bestimmt somit die Schnittebene innerhalb des (dicken) Präparates, aus der Strahlung detektiert wird.Each spectral channel has a confocal pinhole diaphragm 26 which has a confocal image on the sample 23 realized and the size of the depth of field, with which the radiation can be detected determines. The geometry of the aperture 26 thus determines the cutting plane within the (thick) preparation from which radiation is detected.

Der Blende 26 ist noch ein Blockfilter 27 nachgeordnet, das unerwünschte, in das Detektormodul 5 gelangte Anregungsstrahlung abblockt. Die derart abseparierte, aus einem bestimmten Tiefenabschnitt stammende, zeilenförmig aufgefächerte Strahlung wird dann von einem geeigneten Detektor 28 analysiert. Analog zum geschilderten ersten Farbkanal sind auch die weiteren spektralen Detektionskanäle aufgebaut, die ebenfalls eine Pinholeblende 26a bzw. 26b, 26c, ein Blockfilter 27a bzw. 27b, 27c, sowie einen Detektor 28a bzw. 28b, 28c umfassen.The aperture 26 is still a block filter 27 downstream, the unwanted, in the detector module 5 reached excitation radiation blocks. The thus separated, originating from a certain depth section, line-shaped fanned radiation is then from a suitable detector 28 analyzed. Analogous to the described first color channel, the other spectral detection channels are also constructed, which are also a Pinholeblende 26a respectively. 26b . 26c , a block filter 27a respectively. 27b . 27c , as well as a detector 28a respectively. 28b . 28c include.

Neben der konfokalen Abtastung eines mit einen Brennpunkt oder -linie beleuchteten Probenbereiches ermöglicht das Laserscanningmikroskop 1 der 1 in der dargestellten, diesbezüglich optionalen Bauweise auch eine weitere Meßbetriebsart. Dazu ist eine Halogenleuchte 29 vorgesehen, deren Strahlung über eine Lampenoptik 30 und einen Kondensor 31 entgegen der Blickrichtung der Scanoptik 19 auf die Probe 23 in einer Weitfeldbeleuchtung gerichtet wird. Von dieser Beleuchtung transmittierte Anteile werden ebenfalls durch das Objektiv 21, die Tubuslinse 20, das Scanobjektiv 19 und den Scanner 18 im Scanverfahren abgetastet und mittels des Hauptfarbteilers 17 und der Nebenfarbteiler im Detektormodul 5 spektral analysiert. Die Detektion über den Scanner 18 bewirkt die Ortsauflösung in Form der Probenabtastung, und zugleich ist eine Weitfeldbeleuchtung über die Halogenlampe 29 möglich.In addition to the confocal scanning of a lighted with a focal point or line sample area allows the laser scanning microscope 1 of the 1 in the illustrated, in this regard optional design also another measurement mode. This is a halogen light 29 provided, whose radiation via a lamp optics 30 and a condenser 31 contrary to the viewing direction of the scanning optics 19 to the test 23 is directed in a wide field illumination. Shares transmitted by this illumination are also transmitted through the lens 21 , the tube lens 20 , the scan lens 19 and the scanner 18 scanned in the scanning process and by means of the main color splitter 17 and the minor color splitter in the detector module 5 spectrally analyzed. The detection via the scanner 18 causes the spatial resolution in the form of Probenabtastung, and at the same time is a wide field illumination over the halogen lamp 29 possible.

Das gleiche Konzept kann auch zur Auswertung rückreflektierter Strahlung und Epifluoreszenz-Strahlung eingesetzt werden, in dem über eine Quecksilberdampflampe 34 mit Lampenoptik 35 an einem Strahlteiler 36 Beleuchtungsstrahlung in den Tubus des Mikroskopmoduls 4 eingekoppelt wird. Diese Strahlung gelangt dann über das Objektiv 21 auf die Probe 23. Auch hier erfolgt die Beleuchtung ohne Mitwirkung des Scanners 18. Die Detektion erfolgt dagegen wiederum über die Scanoptik 19 und den Scanner 18 im Detektormodul 5. Das Detektormodul 5 hat für diese Weiterbildung somit eine Doppelfunktion, zum einen dient es als Detektor für gescannt eingestrahlte Anregungsstrahlung. Zum anderen wirkt das Detektormodul 5 als ortsauflösender Detektor, wenn auf die Probe nicht weiter strukturierte Strahlung eingestrahlt wird, nämlich entweder als Weitfeldbeleuchtung von unten oder über das Objektiv 21. Aber auch der Scanner 18 hat doppelte Wirkung, da er die Ortsauflösung durch punktförmige Abtastung der Probe nicht nur bei punktförmig eingestrahlter Anregungsstrahlung, sondern auch bei Weitfeldbeleuchtung erreicht.The same concept can also be used to evaluate back-reflected radiation and epifluorescence radiation in which a mercury vapor lamp 34 with lamp optics 35 at a beam splitter 36 Illuminating radiation into the tube of the microscope module 4 is coupled. This radiation then passes through the lens 21 to the test 23 , Again, the lighting is done without the involvement of the scanner 18 , The detection, in turn, takes place via the scanning optics 19 and the scanner 18 in the detector module 5 , The detector module 5 has for this training thus a double function, on the one hand it serves as a detector for scanned irradiated excitation radiation. On the other hand, the detector module acts 5 as a spatially resolving detector, if the sample not further structured radiation is irradiated, namely either as a wide-field illumination from below or through the lens 21 , But also the scanner 18 has double effect, since it achieves the spatial resolution by punctiform scanning of the sample not only with punctiform irradiated excitation radiation, but also with far-field illumination.

Durch diesen Ansatz können nicht gescannte Detektoren in Transmissions- oder Auflichtbetriebsweise am Mikroskopmodul 4 eingespart werden.By this approach, non-scanned detectors in transmission or incident light mode can be used on the microscope module 4 be saved.

Darüber hinaus ermöglicht das Laserscanningmikroskop 1 der 1 nun einen Kombinationsbetrieb, bei dem sowohl punkt- oder punktgruppenförmig eingestrahlte Anregungsstrahlung aus dem Strahlungsquellenmodul 2 als auch Weitfeldbeleuchtung aus der Halogenlampe 29 bzw. der Quecksilberdampflampe 34 auf die Probe 23 gerichtet wird und mittels des Scanners 18 und des Detektormoduls 5 eine entsprechend punkt- oder punktgruppenförmige Abtastung der derlei mehrfach bestrahlten Probe erreicht wird. Durch geeignete Wahl der Nebenfarbteiler 25 bis 25c kann somit die klassische Transmissions- oder Reflektionsmikroskopie mit Laserfluoreszenz-Messung kombiniert werden. Die so durch Abtastung mittels der Auswertung der Signale der Detektoren 28 bis 28c gewonnenen Bildinformationen können dann eigenständig oder überlagert ausgewertet bzw. dargestellt werden.In addition, the laser scanning microscope allows 1 of the 1 now a combination operation in which both point or point group irradiated excitation radiation from the radiation source module 2 as well as wide-field illumination from the halogen lamp 29 or the mercury vapor lamp 34 to the test 23 is directed and by means of the scanner 18 and the detector module 5 a corresponding point or point group-shaped scanning of such a multi-irradiated sample is achieved. By suitable choice of the secondary color divider 25 to 25c Thus, classical transmission or reflection microscopy can be combined with laser fluorescence measurement. The so by sampling by means of the evaluation of the signals of the detectors 28 to 28c obtained image information can then be evaluated independently or superimposed or presented.

Die Bauweise der 1 ist insbesondere hinsichtlich des Detektormoduls 5 lediglich beispielhaft zu verstehen. 2 zeigte eine alternative Bauweise, bei der statt eines punktförmigen Fokus 22 eine linienförmige konfokale Abbildung verwendet wird. Dazu sind im Detektormodul 5, das beispielshalber nun mit zwei spektralen Kanälen ausgestattet ist, anstelle der Pinholeblenden 26 Schlitzblenden 26' vorgesehen.The construction of the 1 is particular to the detector module 5 merely to be understood as an example. 2 showed an alternative construction, in place of a point-shaped focus 22 a line-shaped confocal figure is used. These are in the detector module 5 , which by way of example is now equipped with two spectral channels instead of the pinholes 26 slit diaphragms 26 ' intended.

Diese schlitzförmige teil-konfokale Abbildung bedarf natürlich auch einer entsprechenden Beleuchtung der Probe 23 durch das Laserstrahlungsmodul 3 mit einer Brennlinie. Den Strahlvereinigungsspiegeln 14 und 15 ist deshalb in der Bauweise der 2 zusätzlich eine Strahlformungseinheit 16 nachgeordnet, die aus dem von den Lasern gelieferten rotationssymmetrischen, gaußförmig profilierten Laserstrahl einen zeilenförmigen Strahl, der nicht mehr rotationssymmetrisch ist, sondern im Querschnitt zur Erzeugung eines rechteckig beleuchteten Feldes geeignet ist, herstellt. Der Scanner 18 lenkt somit einen als zeilenförmig zu bezeichnenden Beleuchtungsstrahl als Anregungsstrahlung über die Probe 23 ab. Bei ausreichender Länge der Brennlinie kann der Scanner 18 dann, wie 2 auch zeigt, auf eine einachsige Ablenkung beschränkt werden.Of course, this slit-shaped partial-confocal image also requires a corresponding illumination of the sample 23 through the laser radiation module 3 with a focal line. The beam merging mirrors 14 and 15 is therefore in the construction of the 2 additionally a beam-shaping unit 16 downstream, which produces a line-shaped beam from the rotationally symmetrical, Gaussian-profiled laser beam delivered by the lasers, which is no longer rotationally symmetrical but is suitable in cross section for producing a rectangularly illuminated field. The scanner 18 thus directs an illuminating beam to be designated as a line-shaped excitation radiation over the sample 23 from. With sufficient length of the focal line, the scanner 18 then, how 2 also shows to be confined to a uniaxial distraction.

Die Verwendung einer konfokalen Schlitz-Apertur im Detektormodul 5 ist nur beispielhaft. Prinzipiell können beliebige Mehrpunktanordnungen, wie Punktwolken- oder Nipkow-Scheibenkonzepte, verwendet werden. Wesentlich ist allerdings, daß der Detektor 28 dann ortsauflösend ist, damit eine parallele Erfassung mehrerer Probenpunkte beim Durchlauf des Scanners erfolgt.The use of a confocal slot aperture in the detector module 5 is only an example. In principle, arbitrary multipoint arrangements, such as point cloud or Nipkow disk concepts, can be used. It is essential, however, that the detector 28 then spatially resolving, so that a parallel recording of multiple sample points takes place while the scanner is running.

Durch dieses Konzept entfallen die im Stand der Technik bislang erforderlichen nichtdescannten Detektoren am Mikroskopmodul 4. Außerdem kann durch die konfokale Detektion eine hohe Ortsauflösung erreicht werden, die ansonsten bei nichtdescannter Detektion nur mit aufwendigen Matrixsensoren machbar wäre. Darüber hinaus können zeitliche Fluktuationen der einstrahlenden Weitfeldbeleuchtung, z.B. der Halogenlampe 29 oder der Quecksilberdampflampe 34 u.ä., können durch eine geeignete Integration im ortsauflösenden Detektor 28, 28a ausgeschaltet werden.This concept eliminates the non-scanned detectors previously required in the prior art on the microscope module 4 , In addition, a high spatial resolution can be achieved by the confocal detection, which would otherwise be feasible in nichtdescannte detection only with complex matrix sensors. In addition, temporal fluctuations of einstrahlenden wide field illumination, such as the halogen lamp 29 or the mercury vapor lamp 34 and the like, can by suitable integration in the spatially resolving detector 28 . 28a turned off.

Für diese Betriebsart des Laserscanningmikroskops 1 ist natürlich der Hauptfarbteiler 17 sowie der Nebenfarbteiler 25 geeignet eingestellt. Dies ermöglicht es auch, beide Beleuchtungsarten, d.h. Weitfeldbeleuchtung von unten und Beleuchtung durch das Objektiv 21, gleichzeitig vorzunehmen, wenn die Farbteiler als geeignete Dichroiten ausgestaltet sind. Auch sind beliebige Kombinationen mit gescannter Beleuchtung aus dem Strahlungsquellenmodul 2 möglich. Eine entsprechende überlagerte grafische Darstellung der ausgewerteten Signale bietet dann eine gegenüber herkömmlichen Konzepten überragende Bildinformation.For this mode of operation of the laser scanning microscope 1 is of course the main color divider 17 as well as the secondary color divider 25 set appropriately. This also allows for both types of illumination, ie wide field illumination from below and illumination through the lens 21 to perform at the same time, if the color splitters are designed as suitable dichroites. Also, any combinations with scanned illumination from the radiation source module 2 possible. A corresponding superimposed graphical representation of the evaluated signals then offers superior image information over conventional concepts.

Die Kombination einer konfokalen Mehrpunktabbildung, z. B. eines Linienscanners, mit einer spektralen mehrkanaligen Detektion ermöglicht eine hochparallele Datenaufnahme. Es ist eine Bildaufnahmerate von über 200 Bildern pro Sekunde erreichbar und eine Laserscanningmikroskopen bislang nicht realisierte Echtzeit-Fähigkeit gegeben. Alternativ ermöglicht das Laserscanningmikroskop 1 auch eine hochsensitive Detektion besonders schwacher Signalintensitäten. Verglichen mit einem konfokalen Einzel-Punkt-Laserscanningmikroskop ist bei gleicher Bildaufnahmezeit, bei gleicher in der Probe abgebildeter Fläche, bei gleichem Sehfeld und bei gleicher Laserleistung pro Pixel ein um einen Faktor √n verbessertes Signal-/Rauschverhältnis realisiert, wenn man mit n die Anzahl der Mehrpunktabbildungen bezeichnet. Bei einer Detektorzeile ist ein Wert von 500 bis 2.000 typisch.The combination of a confocal multipoint mapping, e.g. B. a line scanner, with a spectral multi-channel detection allows highly parallel data acquisition. An image acquisition rate of over 200 frames per second is achievable and given a laser scanning microscopy hitherto unrealized real-time capability. Alternatively, the laser scanning microscope allows 1 also a highly sensitive detection of particularly weak signal intensities. Compared with a confocal single-point laser scanning microscope, with the same image acquisition time, with the same area imaged in the sample, with the same field of view and with the same laser power per pixel, this is a factor √ n improved signal-to-noise ratio is realized when n is the number of multipoint mappings. For a detector line, a value of 500 to 2,000 is typical.

Das Strahlquellenmodul 2 der Laserscanningmikroskops 1 erfüllt die dafür nötige Voraussetzung, nämlich daß die Mehrpunktbeleuchtung, z. B. die Beleuchtungszeile, die z. B. von der Strahlformungseinheit 16 bereitgestellt wird, die n-fache Leistung aufweist, wie der Laserfocus eines vergleichbaren konfokalen Einzel-Punktscanners.The beam source module 2 the laser scanning microscope 1 meets the necessary condition, namely that the multi-point lighting, z. B. the lighting line, the z. B. from the beam forming unit 16 which has n times performance, such as the laser focus of a comparable confocal single-point scanner.

Alternativ kann im Vergleich zum konfokalen Einzel-Punktscanner bei gleicher Bildaufnahmezeit und gleichem Signal-/Rauschverhältnis die Probenbelastung, d.h. die Strahlungsmenge der die Probe ausgesetzt wird und die zum Ausbleichen der Probe führen kann, um den Faktor n gesenkt werden, wenn die bislang in einem konfokalen Einzel-Punktscanner aufgewandte Strahlungsleistung nun auf mehrere Punkte, z. B. die Zeile verteilt wird.alternative can compare to the confocal single-point scanner at the same Image acquisition time and the same signal-to-noise ratio the sample load, i.e. the amount of radiation that is exposed to the sample and the Cause fading of the sample can be lowered by the factor n, if so far in one Confocal single-point scanner spent radiation power now on several points, z. B. the line is distributed.

Das mehrpunktabtastende Laserscanningmikroskop ermöglichst es also im Vergleich zum konfokalen Einzel-Punktscannern, intensitätsschwache Signale empfindlicher Probensubstanzen bei gleichen Signal-/Rauschverhältnis und gleicher Probenbelastung um den Faktor n schneller, bei gleicher Aufnahmezeit mit einem um den Faktor √n verbesserten Signal-/Rauschverhältnis oder bei gleiche Aufnahmezeit mit gleichem Signal-/Rauschverhältnis und einer um den Faktor n geringeren Probenbelastung abzubilden.The multi-point scanning laser scanning microscope thus makes it possible, compared to confocal single-point scanners, low-intensity signals of sensitive sample substances with the same signal / noise ratio and the same sample load by the factor n faster, with the same recording time by a factor of √ n Improved signal / noise ratio or the same recording time with the same signal / noise ratio and a smaller sample load by a factor of n.

3 zeigt schematisch einen beispielhaften Strahlengang für das Laserscanningmikroskop 1 der 1 oder 2 in Bauweise mit einem Linienscanner. Die Punktgruppe ist hier also als Zeile verwirklicht. Dementsprechend ist der beleuchtete Spot eine Linie. Wie in den 1 und 2 sind dort bereits erscheinende Bauteile mit denselben Bezugszeichen bezeichnet, weshalb bezüglich der Beschreibung zumindest teilweise auch auf die 1 und 2 verwiesen wird. 3 schematically shows an exemplary beam path for the laser scanning microscope 1 of the 1 or 2 in construction with a line scanner. The point group is realized here as a line. Accordingly, the illuminated spot is a line. As in the 1 and 2 there already appearing components are denoted by the same reference numerals, which is why with respect to the description at least partially on the 1 and 2 is referenced.

In 3 ist der Beleuchtungsstrahlengang B mit durchgezogenen Linien veranschaulicht, wogegen der Detektionsstrahlengang D durch gestrichelte Linien symbolisiert ist. 3 zeigt, daß die Probe 23 auf zwei Arten beleuchtet wird. Zum einen erfolgt über die Halogenlampe 29, die Lampenoptik 30 sowie den Kondensor 31, für den in 3 zwei Optiken 31a, 31b eingezeichnet sind, eine Weitfeldbeleuchtung. Zum anderen bewirkt der Laser 7 eine linienförmige Beleuchtung, weshalb die Darstellung in 3 in der gezeigten Schnittrichtung keinen Fokus in der Probe aufweist.In 3 the illumination beam path B is illustrated by solid lines, whereas the detection beam path D is symbolized by dashed lines. 3 shows that the sample 23 illuminated in two ways. On the one hand via the halogen lamp 29 , the lamp optics 30 as well as the condenser 31 for which in 3 two optics 31a . 31b are drawn, a wide-field illumination. On the other hand, the laser causes 7 a linear lighting, which is why the representation in 3 has no focus in the sample in the illustrated cutting direction.

Der Scanner 18 lenkt eine Linie über die Probe 23 ab und bildet diese konfokal auf eine dem Spotbild zugeordnete konfokale Blende 26, die aufgrund des linienförmigen Spots als Schlitzblende ausgebildet ist. In der Probe 23 wird die Kohärenz der linienförmig einfallenden Anregungsstrahlung durch die Fluoreszenzanregung aufgehoben, da die Fluoreszenz ein inkohärenter Wechselwirkungsprozeß ist. Die Dimension der Farbstoffmoleküle liegt unterhalb der optischen Auflösung des Mikroskops. Jedes Farbstoffmolekül strahlt als Punktstrahler unabhängig von den anderen Probenorten und füllt die komplette Objektivpupille. Es ergibt sich der gestrichelt eingezeichnete Detektionsstrahlengang in 3. Die derart als Brennlinie realisierbare spotförmige Beleuchtung wird über den Hauptfarbteiler 17 vom Detektionsstrahlengang D getrennt. Dieser Hauptfarbteiler ist als Streifenspiegel gemäß der DE 10257237 A1 in der vorliegenden Ausführungsform ausgeführt. Er ist in Draufsicht in 4 gezeigt. Ein solcher Streifenspiegel, der einen hochreflektierenden Teil HR und einen hochtransmittierenden Teil HT aufweist, wirkt als spektral unabhängiger Hauptteiler. Er liegt, wie zu sehen ist, in einer Pupillenebene der Scananordnung, in der in der Probenebene reflektierte, d. h. kohärente Beleuchtungsstrahlung linienförmige (bei einem Einzelpunktdetektor punktförmig) fokussiert ist. Inkohärente, zu detektierende Signalstrahlung füllt dagegen die gesamte Pupillenebene aus und wird durch den hochreflektierenden Teil HT im wesentlichen transmittiert. Unter einem „Farbteiler" wird also im Sinne der Erfindung also auch ein nichtspektral wirkender Teiler verstanden.The scanner 18 directs a line over the sample 23 and forms this confocal on a confocal aperture associated with the spot image 26 , which is formed as a slit diaphragm due to the linear spot. In the sample 23 the coherence of the linear incident excitation radiation is canceled by the fluorescence excitation, since the fluorescence is an incoherent interaction process. The dimension of the dye molecules is below the optical resolution of the microscope. Each dye molecule radiates as a spotlight independently of the other sample locations and fills the entire lens pupil. This results in the dashed line detection beam path in 3 , The thus realized as a focal line spot-shaped illumination is on the main color splitter 17 separated from the detection beam D. This main color divider is as a streak mirror according to the DE 10257237 A1 executed in the present embodiment. He is in top view 4 shown. Such a strip mirror, which has a highly reflective part HR and a high-transmission part HT, acts as a spectrally independent main divider. As can be seen, it is located in a pupil plane of the scanning arrangement in which linear (in the case of a single-point detector) point-shaped reflection, ie coherent illumination radiation, is focused in the sample plane. In contrast, incoherent signal radiation to be detected fills the entire pupil plane and is essentially transmitted through the highly reflective part HT. For the purposes of the invention, a "color splitter" is therefore also understood to mean a non-spectrally acting splitter.

Für die Weitfeldbeleuchtung ist zwischen Lampenoptik 30 und Kondensor 31a, 31b eine Feldblende vorgesehen, um den beleuchteten Bereich einstellen zu können. Weiter ist in den Kondensor 31a, 31b eine Aperturblende A1 schaltbar. Sie liegt in konjugierter Lage zu den Pupillenebenen des Laserscanningmikroskops. Bei diesen Pupillenebenen handelt es sich um die Pupillenebene P1, die Ebene, in der der Scanner 18 liegt sowie die Ebene, in der der Hauptfarbteiler 17 angeordnet ist. Als Aperturblende A1 sowie in der Pupillenebene P1 kann man nun verschiedene optische Elemente einsetzen, um aus der klassischen Mikroskopie bekannte Kontrastierungsmethoden zu verwenden, wie beispielsweise Dunkelfeld, Phasenkontrast, VAREL-Kontrast oder Differenzialinterferenzkontrast. Geeignete Aperturblenden A1 oder in die Pupillenebene P1 einzubringenden Elemente sind beispielsweise in der Publikation „Microscopy from the very beginning", Carl Zeiss Mikroskopie, D-07740 Jena, 1997, Seiten 18-23, erläutert sind. Der Offenbarungsgehalt dieser Firmenpublikation wird diesbezüglich explizit hier eingebunden. Für solche Kontrastierungseingriffe ist natürlich nicht nur die Pupillenebene P1 geeignet. Auch andere Pupillenebenen sind dazu tauglich.For the wide field illumination is between lamp optics 30 and condenser 31a . 31b a field stop provided in order to adjust the illuminated area can. Next is in the condenser 31a . 31b an aperture A1 switchable. It lies in a conjugate position to the pupil planes of the laser scanning microscope. These pupil planes are the pupil plane P1, the plane in which the scanner is located 18 lies as well as the plane in which the main color divider 17 is arranged. As the aperture diaphragm A1 and in the pupil plane P1, various optical elements can now be used to use contrasting methods known from classical microscopy, such as dark field, phase contrast, VAREL contrast or differential interference contrast. Suitable aperture diaphragms A1 or elements to be introduced into the pupil plane P1 are described, for example, in the publication "Microscopy from the very beginning", Carl Zeiss Microscopy, D-07740 Jena, 1997, pages 18 to 23. The disclosure content of this company publication is explicitly here in this regard Of course, not only the pupil plane P1 is suitable for such contrasting interventions, other pupil planes are also suitable.

Beispielsweise könnte der Eingriff auch in Nähe des Hauptfarbteilers 17 oder mittels einer Relayoptik nach dem Nebenfarbteiler 25 in einem (oder mehreren) spektralen Kanälen des Detektorstrahlenganges erfolgen.For example, the intervention could also be in the vicinity of the main color divider 17 or by means of a relay optics after the secondary color splitter 25 take place in one (or more) spectral channels of the detector beam path.

Der Strahlengang der 3 weist zusätzlich zu den anhand der 1 und 2 bereits geschilderten Elemente noch eine Relayoptik RO auf, die zusätzlich zu der Zwischenbildebene ZB1 zwischen Scannoptik 19 und Tubuslinse 20 eine weitere Zwischenbildebene ZB2 für den Beleuchtungsstrahlengang bereitstellt. Eine dritte Zwischenbildebene ZB3 des Beleuchtungsstrahlengangs findet sich vor dem Hauptteiler 17, so daß eine Pupillenebene für Farbteiler geschaffen ist. Will man den Aufbau kompakt halten, kann die Relayoptik RO auch entfallen.The ray path of the 3 In addition to those based on the 1 and 2 Already described elements nor a relay optics RO, in addition to the intermediate image plane ZB1 between scanning optics 19 and tube lens 20 provides a further intermediate image plane ZB2 for the illumination beam path. A third intermediate image plane ZB3 of the illumination beam path is located in front of the main divider 17 , so that a pupil plane for color divider is created. If you want to keep the structure compact, the relay optics RO can also be omitted.

Die beschriebene Erfindung stellt eine bedeutende Ausweitung der Anwendungsmöglichkeiten von schnellen konfokalen Laserscanmikroskopen dar. Die Bedeutung einer solchen Weiterentwicklung lässt sich anhand der zellbiologischen Standardliteratur und den dort beschriebenen schnellen zellulären und subzellulären Vorgängen¹ und den eingesetzten Untersuchungsmethoden mit einer Vielzahl von Farbstoffen² ablesen.The invention described represents a significant expansion of the application possibilities of fast confocal laser scanning microscopes. The significance of such a further development can be read off from the standard cell biological literature and the fast cellular and subcellular processes ¹ described therein and the examination methods used with a plurality of dyes ² .

Siehe z.B.:

¹B. Alberts et al. (2002): Molecular Biology of the Cell; Garland Science.
^1,2G. Karp (2002): Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
^1,2R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons – a laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
²R.P. Haugland (2003): Handbook of fluorescent Probes and research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV.

See for example:

¹ B. Alberts et al. (2002): Molecular Biology of the Cell; Garland Science.
^1,2 G. Karp (2002): Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
^1.2 R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons - a laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
² RP Haugland (2003): Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV.

De Erfindung hat insbesondere große Bedeutung für die folgenden Prozesse und Vorgange:de Invention has particular great Meaning of the following processes and procedures:

Entwicklung von OrganismenDevelopment of organisms

Die beschriebene Erfindung ist u.a. für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen geeignet, die sich vor allem durch dynamische Prozesse im Zehntelsekunden bis hin zum Stundenbereich auszeichnen. Beispielanwendungen auf der Ebene von Zellverbänden und ganzen Organismen sind z.B. hier beschrieben:

• Abdul-Karim, M.A. et al. beschreiben 2003 in Microvasc. Res., 66:113-125 eine Langzeitanalyse von Blutgefässveränderungen im lebenden Tier, wobei Fluoreszenzbilder in Intervallen über mehrere Tage aufgenommen wurde. Die 3D-Datensätze wurden mit adaptiven Algorithmen ausgewertet, um die Bewegungstrajektorien schematisch darzustellen.
• Soll, D.R. et al. beschreiben 2003 in Scientific World Journ. 3:827-841 eine softwarebasierte Bewegungsanalyse von mikroskopischen Daten von Kernen und Pseudopodien lebender Zellen in allen 3 Raumdimensionen.
• Grossmann, R. et al. beschreiben 2002 in Glia, 37:229-240 eine 3D-Analyse der Bewegungen von Mikrogliazellen der Ratte, wobei die Daten über bis zu 10 Stunden aufgenommen wurden. Gleichzeitig kommen nach traumatischer Schädigung auch schnelle Reaktionen der Glia vor, so dass eine hohe Datenrate und entsprechendes Datenvolumen entsteht.

The invention described is suitable, inter alia, for the investigation of development processes, which are distinguished above all by dynamic processes in tenths of a second up to the hourly range. Example applications at the level of cell aggregates and whole organisms are described, for example:

Abdul-Karim, MA et al. describe 2003 in Microvasc. Res., 66: 113-125 a long-term analysis of vascular changes in the living animal, wherein fluorescence images were taken at intervals over several days. The 3D data sets were evaluated with adaptive algorithms to represent the movement trajectories schematically.
• Soll, DR et al. describe 2003 in Scientific World Journ. 3: 827-841 is a software-based motion analysis of microscopic data from nuclei and pseudopods of living cells in all 3 spatial dimensions.
• Grossmann, R. et al. describe in 2002 in Glia, 37: 229-240 a 3D analysis of the movements of microglial cells of the rat, the data being recorded for up to 10 hours. At the same time, rapid reactions of the glia occur after traumatic injury, resulting in a high data rate and corresponding data volume.

Das betrifft insbesondere folgende Schwerpunkte:

• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung, deren Nachbarzellen empfindlich auf Laserbeleuchtung reagieren und die von der Beleuchtung der 3D-ROI geschützt werden müssen;
• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt durch Laserbeleuchtung in 3D gebleicht werden sollen, z.B. FRET-Experimente;
• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt durch Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch ausserhalb der ROI beobachtet werden sollen, z.B. FRAP- und FLIP-Experimente in 3D;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen und Pharmaka, die manipulationsbedingte Änderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. Aktivierung von Transmittern in 3D;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die manipulationsbedingte Farbänderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit sehr schwachen Markierungen, die z.B. eine optimale Balance von Konfokalität gegen Detektionsempfindlichkeit erfordern.
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit variierenden Mehrfachmarkierungen, z.B. CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed u.ä.
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die funktionsabhängige Farbänderungen aufweisen, z.B. Ca+-Marker
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die entwicklungsbedingte Farbänderungen aufweisen, z.B. transgene Tiere mit GFP
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die manipulationsbedingte Farbänderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit sehr schwachen Markierungen, die eine Einschränkung der Konfokalität zugunsten der Detektionsempfindlichkeit erfordern.
• Letztgenannter Punkt in Kombination mit den Vorangehenden.

This concerns in particular the following emphases:

• Analysis of living cells in a 3D environment whose neighboring cells are sensitive to laser illumination and need to be protected by 3D ROI lighting;
• Analysis of living cells in a 3D environment with markers to be specifically bleached by laser illumination in 3D, eg FRET experiments;
• Analysis of living cells in a 3D environment with markers that are targeted to be bleached by laser illumination and, at the same time, observed outside the ROI, eg FRAP and FLIP experiments in 3D;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markers and pharmaceuticals exhibiting manipulation-induced changes by laser illumination, eg activation of Transmitters in 3D;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markings that exhibit manipulation-related color changes through laser illumination, eg paGFP, Kaede;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with very weak markers that require, for example, an optimal balance of confocality versus detection sensitivity.
• Living cells in a 3D tissue association with varying multiple markers, eg CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed and the like.
• Living cells in a 3D tissue association with markers that have function-dependent color changes, eg Ca + markers
• Living cells in a 3D tissue association with markers showing developmental color changes, eg transgenic animals with GFP
• Living cells in a 3D tissue association with markings that exhibit manipulation-related color changes due to laser illumination, eg paGFP, Kaede
• Living cells in a 3D tissue association with very weak markers that require restriction of confocality in favor of detection sensitivity.
• Last point in combination with the previous ones.

Transportvorgänge in ZellenTransport processes in cells

Die beschriebene Erfindung ist für die Untersuchung von innerzellulären Transportvorgängen exzellent geeignet, da hierbei recht kleine motile Strukturen, z.B. Proteine, mit hoher Geschwindigkeit (meist im Bereich von Hundertstelsekunden) dargestellt werden müssen. Um die Dynamik von komplexen Transportvorgängen zu erfassen, kommen oft auch Anwendungen wie FRAP mit ROI-Bleichen zum Einsatz. Beispiele für solche Studien sind z.B. hier beschrieben:

• Umenishi, F. et al. beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse der räumlichen Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen. Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
• Gimpl, G. et al. beschreiben 2002 in Prog. Brain Res., 139:43-55 Experimente mit ROI-Bleichen und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung von GFP-markierten Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten. Dabei stellen sich hohe Anforderungen an die räumliche Positionierung und Auflösung sowie die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
• Zhang et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging von GFP-transfizierten Nervenzellen, wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes Bleichen und Fluoreszenzimaging analysiert wurde. Die Dynamik der Nervenzellen stellt dabei hohe Anforderungen an die Geschwindigkeit des Imaging.

The described invention is excellently suitable for the investigation of intracellular transport processes, since in this case quite small motile structures, eg proteins, have to be displayed at high speed (usually in the range of hundredths of a second). In order to capture the dynamics of complex transport processes, applications such as FRAP with ROI bleaching are often used. Examples of such studies are described here, for example:

• Umenishi, F. et al. describe in 2000 in Biophys J., 78: 1024-1035 an analysis of the spatial mobility of aquaporin in GFP-transfected culture cells. For this purpose, points in the cell membranes were locally bleached and the diffusion of fluorescence in the environment was analyzed.
Gimpl, G. et al. Describe 2002 in Prog. Brain Res., 139: 43-55 ROI bleaching and fluorescence imaging experiments to analyze the mobility and distribution of GFP-labeled oxytocin receptors in fibroblasts. This places high demands on the spatial positioning and resolution as well as the direct temporal sequence of bleaching and imaging.
• Zhang et al. describe in 2001 in Neuron, 31: 261-275 live cell imaging of GFP-transfected nerve cells, where the movement of granules was analyzed by combined bleaching and fluorescence imaging. The dynamics of the nerve cells places high demands on the speed of the imaging.

Wechselwirkungen von Moleküleninteractions of molecules

Die beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer und anderer subzellulärer Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde) dargestellt werden. Um die für die Wechselwirkung notwendige räumliche Position der Moleküle aufzulösen, sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen. Beispielanwendungen sind z.B. hier beschrieben:

• Petersen, M.A. und Dailey, M.E. beschreiben 2004 in Glia, 46:195-206 eine Zweikanalaufnahme lebender Hippokampuskulturen der Ratte, wobei die zwei Kanäle für die Marker Lectin und Sytox räumlich in 3D und über einen längeren Zeitraum aufgezeichnet werden.
• Yamamoto, N. et al. beschreiben 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20:633-638 ein Zweifarbimaging von humanen fibrosarcoma Zellen, wobei grünes und rotes fluoreszentes Protein (GFP und RFP) simultan in Echtzeit beobachtet wurde.
• Bertera, S. et al. beschreiben 2003 in Biotechniques, 35:718-722 ein Multicolorimaging von transgenen Mäusen markiert mit Timer reporter Protein, welches seine Farbe nach Synthese von grün in rot ändert. Die Bildaufnahme erfolgt als schnelle Serie 3-dimensional im Gewebe am lebenden Tier.

The described invention is particularly suitable for the presentation of molecular and other subcellular interactions. In this case, very small structures must be displayed at high speed (in the range of the hundredth of a second). In order to resolve the spatial position of the molecules necessary for the interaction, indirect techniques such as FRET with ROI bleaching must also be used. Example applications are described here, for example:

• Petersen, MA, and Dailey, ME describe a two-channel record of live rat hippocampus cultures in Glia, 46: 195-206, in which the two channels for marker lectin and sytox are spatially recorded in 3D and over a longer period of time.
Yamamoto, N. et al. describe 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20: 633-638 a two-color imaging of human fibrosarcoma cells, with green and red fluorescent protein (GFP and RFP) simultaneously observed in real time.
Bertera, S. et al. describe in 2003 in Biotechniques, 35: 718-722 a multicolorimaging of transgenic mice labeled with timer reporter protein which changes color from green to red after synthesis. The image acquisition takes place as a rapid series 3-dimensional in the tissue of the living animal.

Signalübertragung zwischen Zellensignal transmission between cells

Die beschriebene Erfindung ist für die Untersuchung von meist extrem schnellen Signalübertragungsvorgängen hervorragend sehr gut geeignet. Diese meist neurophysiologischen Vorgänge stellen höchste Anforderungen an die zeitliche Auflösung, da die durch Ionen vermittelten Aktivitäten sich im Bereich von Hundertstel- bis kleiner als Tausendstelsekunden abspielen. Beispielanwendungen von Untersuchungen im Muskel- oder Nervensystem sind z.B. hier beschrieben:

• Brum G et al. beschreiben 2000 in J Physiol. 528: 419-433 die Lokalisation von schnellen Ca+ Aktivitäten in Muskelzellen des Frosches nach Reizung mit Caffeine als Transmitter. Die Lokalisation und Mikrometer-genaue Auflösung gelang nur durch Einsatz eines schnellen, konfokalen Mikroskopes.
• Schmidt H et al. beschreiben 2003 in J Physiol. 551:13-32 eine Analyse von Ca+ Ionen in Nervenzellfortsätzen von transgenen Mäusen. Die Untersuchung von schnellen Ca+-Transienten in Mäusen mit veränderten Ca+ bindenden Proteinen konnte nur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden, da auch die Lokalisation der Ca+ Aktivität innerhalb der Nervenzelle und deren genaue zeitliche Kinetik eine wichtige Rolle spielt.

The invention described is very well suited for the investigation of mostly extremely fast signal transmission processes. These mostly neurophysiological processes place the highest demands on the temporal resolution, since the activities mediated by ions take place in the range of hundredths to less than thousandths of a second. Example applications of examinations in the muscular or nervous system are described, for example:

• Brum G et al. describe 2000 in J Physiol. 528: 419-433 the localization of fast Ca + activities in muscle cells of the frog after stimulation with caffeine as a transmitter. The localization and micrometer-accurate resolution was only possible by using a fast, confocal microscope.
• Schmidt H et al. describe 2003 in J Physiol. 551: 13-32 an analysis of Ca + ions in nerve cell processes of transgenic mice. The investigation of fast Ca + transients in mice with altered Ca + binding proteins was only possible with high resolution confocal micro The localization of Ca + activity within the nerve cell and its exact temporal kinetics also play an important role.

Claims

Light scanning microscope, in particular confocal laser scanning microscope with - a perforated disc ( 2 ), which illuminates a beam of light for point-group illumination of a sample ( 23 ) and scanning the spot-group illumination beam across the sample ( 23 ), - a spot detector array ( 5 ), via the scan arrangement ( 3 . 4 ) the illuminated point group spot of the sample ( 23 ) by means of at least one confocal aperture ( 26 ) to at least one detector unit ( 28 ), and - a control unit that controls the scanning arrangement ( 3 . 4 ) and the spot detector arrangement ( 5 ), characterized in that in addition a wide field illumination source ( 29 . 34 ) which is the sample ( 23 ), and that the control unit is in operation of the wide field illumination source ( 29 . 34 ) the scan arrangement ( 3 . 4 ) and the spot detector arrangement ( 5 ) so that an image of the far-field illuminated sample ( 23 ) is won.

Laser scanning microscope according to claim 1, characterized in that the wide-field illumination source ( 29 Transmittance measurement is a transmitted-light illumination or, for fluorescence excitation, incident light illumination of the sample ( 23 ) realized.

Laser scanning microscope according to one of the above claims, characterized in that the spot detector arrangement ( 5 ) has multiple spectral channels.

Laserscanningmikroskop according to claim 3, characterized in that the control unit, the spot lighting arrangement ( 2 ) and the wide field illumination sources ( 29 . 34 ) controls in operation simultaneously and reads out the spectral channels of the spot detector array.

Laser scanning microscope according to one of the above claims, characterized in that the spot detector arrangement ( 5 ) has at least one Nipkovscheibe and at least one matrix detector.

Laser scanning microscope according to one of Claims 1 to 4, characterized in that the spot detector arrangement ( 5 ) at least one slit ( 26 ' ) and at least one line detector ( 28 ) having.

Laser scanning microscope according to one of the above claims, characterized in that the wide-field illumination source ( 29 ) a condenser ( 31 ), are switchable in the contrasting A1.

Laser scanning microscope according to one of the above claims, characterized in that the scanning arrangement has a scanning objective ( 19 ) having the dot or dot group spot associated therewith at least one pupil plane P1 into which contrasting means are switchable.

A method of laser scanning microscopy, wherein an image of a sample ( 23 ) is produced by scanning and confocal imaging of a spot or spot group spot, and means are provided for scanned point or dot group-shaped sample illumination, characterized in that the sample ( 23 ) is illuminated wide-field and imaged by scanning the dot or dot group spot.

Process according to claim 9, characterized in that the sample ( 23 ) is illuminated with the wide field illumination.

Method according to one of the above method claims, characterized characterized in that the confocal Image spectrally resolving is made.

Method according to claim 11, characterized in that that the Wide field illumination and the scanned point or punk group-shaped illumination be made simultaneously.

Method according to one of the above method claims, characterized characterized in that at confocal figure at least Nipkov disc in combination with at least one matrix detector or at least one slit diaphragm used in combination with at least one line detector.

Method according to one of the above method claims, characterized characterized in that one of the following contrasting methods is used: dark field contrast, Phase contrast, VAREL contrast, polarization contrast, differential interference contrast.

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for the investigation of development processes, in particular dynamic processes in tenths of a second up to the hourly range, in particular on the level of cell aggregates and whole organisms, in particular for at least one of the following: • Analysis of living cells in a 3D environment whose neighboring cells are sensitive to laser illumination and which need to be protected by the illumination of the 3D ROI; • Analysis of living cells in a 3D environment with markers to be specifically bleached by laser illumination in 3D, eg FRET experiments; • Analysis of living cells in a 3D environment with markers that are targeted to be bleached by laser illumination and, at the same time, observed outside the ROI, eg FRAP and FLIP experiments in 3D; • Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markers and pharmaceuticals that exhibit manipulation-induced changes due to laser illumination, eg activation of transmitters in 3D; • Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markings that exhibit manipulation-related color changes through laser illumination, eg paGFP, Kaede; • Targeted analysis of living cells in a 3D environment with very weak markers that require, for example, an optimal balance of confocality versus detection sensitivity. • Living cells in a 3D tissue association with varying multiple markers, eg CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed and the like. • Living cells in a 3D tissue association with markers showing function-dependent color changes, eg Ca + markers • Living cells in a 3D tissue association with markers showing developmental color changes, eg transgenic animals with GFP • Living cells in a 3D tissue association Markings that show manipulation-related color changes due to laser illumination, eg paGFP, Kaede • Living cells in a 3D tissue association with very weak markings that require restriction of confocality in favor of detection sensitivity. • Last point in combination with the previous ones.

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for the investigation of intracellular transport processes, in particular for illustration small motile structures, e.g. Proteins, high Speed (usually in the range of hundredths of a second) in particular for applications like FRAP with ROI bleaching

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for the representation of molecular and other subcellular Interactions, especially the representation of very small structures at high speed, preferably using indirect Techniques such as FRET with ROI bleaching to the resolution submolecular structures

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims fast signal transmission operations, in particular neurophysiological processes with high temporal resolution, since the ion-mediated activities are in the range of hundreds of play to less than thousandths of a second, especially at Investigations in the muscle or nervous system