DE102004034982A1

DE102004034982A1 - Probe images detecting method for light raster microscope, involves storing detected image data, which corresponds to three-dimensional probe area, and effecting data compression by considering image data lying adjacent and above probe

Info

Publication number: DE102004034982A1
Application number: DE200410034982
Authority: DE
Inventors: Ralf Wolleschensky; Frank Hecht; Ralf Dr. Engelmann
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2004-07-16
Filing date: 2004-07-16
Publication date: 2006-02-02

Abstract

The method involves detecting and storing detected image data, which corresponds to a three-dimensional probe area. A data compression is effected by considering the image data lying adjacent and above the probe during the compression. An image stack is recorded and adjacent images of the image stack are consulted for the data compression. Temporally and spectrally detected and stored data are consulted for the data compression. An independent claim is also included for a utilization of arrangement and/or method for analysis of development processes e.g. dynamic processes.

Description

Bilddatenserien von konfokalen bzw. 4D-Mikroskopen werden bezüglich der räumlichen wie zeitlichen Informationsdichte weitgehend 1:1 abgespeichert. Die resultierenden Datenmengen erreichen mittlerweile Grössenordnungen, die mit üblichen, durchaus leistungsfähigen Rechnern nur noch zäh verarbeitet werden können. Die Archivierung der Bilddatenserien ist trotz DVD-Technik schwierig, und teilweise nur noch über Netzwerk auf teuren Fileservern möglich. Die lokale oder gar mobile Ablage wird aus Datensicherheitsgründen ebenfalls oft bevorzugt. Zudem steigen die Scangeschwindigkeiten moderner parallelisierender konfokaler bzw. 4D-Mikroskope deutlich an, was eine weitere Vergrösserung der Datenmengen bedeutet.Image data series of confocal or 4D microscopes are related to the spatial and temporal information density largely stored 1: 1. The resulting data volumes reach meanwhile orders of magnitude, those with usual, quite powerful Calculating only tough can be processed. The archiving of image data series is difficult despite DVD technology, and partly only via network on expensive file servers possible. The local or even mobile storage is also for data security reasons often preferred. In addition, scan speeds are becoming more modern parallelizing confocal or 4D microscopes, which is another Enlargement the amount of data means.

Neue vorgeschlagene Lösung:New proposed solution:

Die Erfindung beschreibt eine Methode zum effizienten Datenmanagement in der Mikroskopie. Durch Weglassen bzw. Komprimierung von Informationen bei geringer Eventdichte in einer Dimension soll Platz für die Speicherung von mehr Informationen in anderen Dimensionen mit höherer Eventdichte geschaffen werden. Das entsprechende Datenformat stellt eine Neuheit in der schnellen konfokalen bzw. 4D-Mikroskopie dar.The Invention describes a method for efficient data management in microscopy. By omitting or compressing information If the event density is low in one dimension, there should be room for storage of more information in other dimensions with higher event density be created. The corresponding data format represents a novelty in fast confocal or 4D microscopy.

Zur Lösung des Problems soll in der konfokalen bzw. 4D-Mikroskopie ein neuartiges, effizientes Datenmanagement benutzt werden. Dies ist insbesondere erforderlich, da in Zukunft Langzeitexperimente mit hoher zeitlicher Auflösung in allen drei Raumdimensionen durchgeführt werden (= 4D).to solution In confocal or 4D microscopy, the problem is supposed to be a novel, efficient data management. This is special required, as in the future long-term experiments with high temporal resolution in all three spatial dimensions (= 4D).

Die Lösung besteht darin, dass die Informationsdichte gemäss der Eventdichte der Dimensionen angepasst wird. Dies bedeutet zunächst, dass bei geringer Eventdichte Informationen übersprungen und später durch Interpolation zurückgewonnen werden. Desweiteren wird der Datensatz komprimiert, und zwar ebenfalls verschieden stark entsprechend der Informationsdichte. Zudem erfolgt eine Wichtung der Dimensionen gegeneinander; bei geringer zeitlicher Eventdichte wird die räumliche Information höher aufgelöst, bei hoher zeitlicher Eventdichte dagegen niedriger. Innerhalb der Raumdimensionen ist wiederum X/Y (Fläche) höher gewichtet als Z (Tiefe). Für eine flüssige Komprimierung, Interpolation und spätere Darstellung solcher Bilddatenserien ist zudem eine günstige Belastung der eingesetzten Rechner erforderlich. Es bietet sich an, diese auf dem Framegrabber oder der Graphikkarte durchzuführen oder diese Komponenten zumindest mitzubelasten.The solution is that the information density according to the event density of the dimensions is adjusted. This means first that at low event density Information is skipped and later through Recovered interpolation become. Furthermore, the record is compressed, and also different strong according to the information density. In addition, a weighting is done the dimensions against each other; with low temporal event density becomes the spatial Information higher resolved lower at high temporal event density. Within the Room dimensions is again X / Y (area) weighted higher than Z (depth). For one liquid Compression, interpolation and later presentation of such image data series is also a cheap Loading of the used computers required. It lends itself to do this on the frame grabber or the graphics card or these components at least mitzubelasten.

Das erforderliche diskontinuierliche und intelligente Datenformat für multimodate Bildinformationen incl. späterer Informationsrückgewinnung durch Interpolation existiert in der konfokalen bzw. 4D-Mikroskopie bisher nicht.The required discontinuous and intelligent data format for multimodates Picture information incl. Later Information retrieval by interpolation exists in confocal or 4D microscopy so far Not.

Soll, D.R. et al. beschreiben 2003 in Scientific World Journ. 3:827-841 eine softwarebasierte Bewegungsanalyse von mikroskopischen Daten von Kernen und Pseudopodien lebender Zellen in allen 3 Raumdimensionen. Diese Datensätze erreichen trotz moderater Aufnahmegeschwindigkeit erhebliche Grösse, so dass die Ergebnisse z.T. nur mathematisch und nicht visuell dargestellt werden.Should, D.R. et al. describe 2003 in Scientific World Journ. 3: 827-841 a software-based motion analysis of microscopic data of nuclei and pseudopodia of living cells in all 3 space dimensions. These records reach considerable size despite a moderate take-up speed, so that the results z.T. only mathematically and not visually represented become.

Abdul-Karim, M.A. et al. beschreiben 2003 in Microvasc. Res., 66:113-125 eine Langzeitanalyse von Blutgefässveränderungen im lebenden Tier, wobei Fluoreszenzbilder in Intervallen über mehrere Tage aufgenommen wurde. Die 3D-Datensätze wurden mit adaptiven Algorithmen ausgewertet, um die Bewegungstrajektorien schematisch darzustellen. Die Grösse der Datensätze stellt ein Problem dar, Originalstrukturen wurden nicht rekonstruiert.Abdul-Karim, M.A. et al. describe 2003 in Microvasc. Res., 66: 113-125 a Long-term analysis of blood vessel changes in the living animal, with fluorescence images at intervals over several Days was recorded. The 3D records were evaluated with adaptive algorithms to the movement trajectories to represent schematically. The size the records is a problem, original structures were not reconstructed.

Grossmann, R. et al. beschreiben 2002 in Glia, 37:229-240 eine 3D-Analyse der Bewegungen von Mikrogliazellen der Ratte, wobei die Daten über bis zu 10 Stunden aufgenommen wurden. Gleichzeitig kommen nach traumatischer Schädigung auch schnelle Reaktionen der Glia vor, so dass eine hohe Datenrate und entsprechendes Datenvolumen entsteht.Grossmann, R. et al. describe in 2002 in Glia, 37: 229-240 a 3D analysis of the Movements of microglial cells of the rat, the data being up to recorded to 10 hours. At the same time come to traumatic damage also fast reactions of the glia before, allowing a high data rate and corresponding data volume arises.

1 zeigt eine Prinzipdarstellung der ereignisabhängigen Datenreduktion in 4 Dimensionen und der Entzerrung bei der Widergabe. 1 shows a schematic representation of the event-dependent data reduction in 4 dimensions and the equalization in the reproduction.

In 1a ist ein mehrdimensionaler kompletter Bilddatensatz dargestellt, bezüglich der aufgenommenen Koordinaten X, Y, Z und der dazugehörigen Aufnahmezeit t. Anhand der unterschiedlichen Strichdicke ist schematisch dargestellt, daß die Datenkomprimierung innerhalb des Bildatensatzes unterschiedlich sein kann, dickere Linien stehen beispielsweise für eine höhere Komprimierung als dünnere Linien.In 1a a multi-dimensional complete image data set is shown, with respect to the recorded coordinates X, Y, Z and the associated recording time t. It is shown schematically on the basis of the different line thickness that the data compression within the picture data set can be different; for example, thicker lines represent a higher compression than thinner lines.

In 1b ist der endgültig abgespeicherte Datensatz darggestellt, der zur Widergabe für den Benutzer dient.In 1b is the final stored record darggestellt, which serves for the reproduction for the user.

Dieser hat vorteilhaft die Möglichkeit, zeitlich oder räumlich je nach Einstellung mit unterschiedlicher Auflödsdsung beobachten oder aufzeichnen zu können.This has the advantage, temporally or spatially depending on the setting, observe or record with different resolutions to be able to.

2 zeigt schematisch den Ablauf der Datenreduzierung von der Aufnahme bis zur endgültigen Datenspeicherung. 2 schematically shows the process of data reduction from recording to final data storage.

Hier ist die gezielte Datenreduktion schematisch dargestellt:

– Datenaufnahme 1:1, über Kamera bzw. Framegrabber
– Zwischenablage der Daten, z.B. RAM oder Grafikboard
– Komprimierung/Datenreduktion durch CPU oder Grafikboard
– Endgültige Speicherung der Bilddaten auf Festplatte

Here the targeted data reduction is shown schematically:

- Data recording 1: 1, via camera or frame grabber
- Clipboard of data, eg RAM or graphics board
- Compression / data reduction by CPU or graphics board
- Final storage of image data on hard disk

Prinzipiell kann die Datenreduzierung nach unterschiedlichen Vorgaben erfolgen:in principle the data reduction can be done according to different specifications:

1. Automatisch:1. Automatic:

Bei geringer zeiltlicher Eventdichte könnte die räumliche Information höher aufgelöst abgespeichert werden während zeitliche Informationen (beispielsweise durch Weglassen eines Zeittaktes) übersprungen werden können.at low spatial event density, the spatial information could be stored higher resolution while temporal information (for example, by omitting a clock) are skipped can.

Bei starken zeitlichen Änderungen (sehr schnell bewegte Probenteile) könnte die Zeitauflösung voll beibehalten werden und die räumliche Auflösung verringert werden.at strong temporal changes (very fast moved sample parts) could fully maintain the time resolution be and the spatial resolution be reduced.

2. Durch Benutzervorgaben:2. By user preferences:

Der Benutzer legt anhand seiner Erwartungen fest, ob und wie er mit stark räumlich oder stark zeitlich veränderlichen Vorgängen rechnet und auf dieser Vorgabe wird die entsprechende Datenkomopnente reduziert bzw. beibehalten.Of the User determines based on his expectations if and how he is using strong spatial or strongly variable over time operations calculates and on this specification the corresponding Datenkomopnente reduced or maintained.

Der Benutzer kann auch ein- oder mehrdimensional bestimmte Bildbereiche (Regions of Interest) festlegen, für die eine bestimmte Datenkompression vorgenommen oder automatisch eingestellt wird.Of the User can also have one-dimensional or multi-dimensional image areas (Regions of Interest), for which a certain data compression is made or automatically set.

Beispielsweise bei Ca+ imaging oder Kaede Farbstoffen ist die zeitliche Information.For example with Ca + imaging or Kaede dyes is the temporal information.

3 zeigt beispielhaft ein zugrundeliegendes schnelles Mikroskopsystem, welches Bilddaten in bisher unüblich grossem Umfang generiert. 3 shows an example of an underlying fast microscope system, which generates image data in a previously unusually large extent.

Schematisch dargestellt ist ein Linienscanner mit einer Zeilenlichtquelle und einem Zeilebndetektor, wobei über einen Y Scanner eine in X Richtung liegende Beleuchtungszeile über die Probe bewegt wird, In einer Softwareebene werden die mit denm Zeilendetektor detektierten Bilddaten wir in 2 dargestellt abgespeichert.Schematically represented is a line scanner with a line light source and a line detector, wherein a line of illumination in the X direction is moved over the sample via a Y scanner. In a software level, the image data detected with the line detector is transformed into 2 stored stored.

Über eine Tischverstellung oder eine Z Verstellung der Fokussiereinrichtung wird eine vertikale Verstellung generiert, so dass Probenkoordinatren in X, Y und Z Richtung zeitabhängig abgespeichert werden.Over a Table adjustment or a Z adjustment of the focusing device a vertical adjustment is generated so that sample co-ordinates in X, Y and Z direction time-dependent be stored.

4 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das im wesentlichen aus fünf Komponenten aufgebaut ist: einem Strahlungsquellenmodul 2, das Anregungsstrahlung für die Laserscanningmikroskopie erzeugt, einem Scanmodul 3, das die Anregungsstrahlung konditioniert und zum Scannen über eine Probe geeignet ablenkt, einem zur Vereinfachung nur schematisch gezeigten Mikroskopmodul 4, das die vom Scanmodul bereitgestellte scannende Strahlung in einem mikroskopischen Strahlengang auf eine Probe richtet, sowie einem Detektormodul 5, das optische Strahlung von der Probe erhält und detektiert. Das Detektormodul 5 kann dabei, wie es in 4 dargestellt ist, spektral mehrkanalig ausgeführt sein. 4 schematically shows a laser scanning microscope 1 , which consists essentially of five components: a radiation source module 2 , which generates excitation radiation for laser scanning microscopy, a scan module 3 which conditions the excitation radiation and deflects it appropriately for scanning over a sample, a microscope module shown only schematically for the purpose of simplification 4 , which directs the scanning radiation provided by the scanning module in a microscopic beam path to a sample, and a detector module 5 which receives and detects optical radiation from the sample. The detector module 5 can do it as it is in 4 is shown, spectrally executed multi-channel.

Zur allgemeinen Beschreibung eines punktweise abtastenden Laser Scanning Mikroskopes wird auf DE 19702753 A1 verwiesen, die somit Bestandteil der hier vorliegenden Beschreibung ist.For a general description of a point scanning laser scanning microscope is on DE 19702753 A1 referred, which is thus part of the present description.

Das Strahlungsquellenmodul 2 erzeugt Beleuchtungsstrahlung, die für die Laserscanningmikroskopie geeignet ist, also insbesondere Strahlung, die Fluoreszenz auslösen kann. Je nach Applikation weist das Strahlungsquellenmodul dazu mehrere Strahlungsquellen auf. In einer dargestellten Ausführungsform werden zwei Laser 6 und 7 im Strahlungsquellenmodul 2 vorgesehen, denen jeweils ein Lichtventil 8 sowie ein Abschwächer 9 nachgeschaltet sind und die ihre Strahlung über ein Koppelstelle 10 in eine Lichtleitfaser 11 einkoppeln. Das Lichtventil 8 wirkt als Strahlablenker, mit dem eine Strahlabschaltung bewirkt werden kann, ohne den Betrieb der Laser in der Lasereinheit 6 bzw. 7 selbst abschalten zu müssen. Das Lichtventil 8 ist beispielsweise als AOTF ausgebildet, das zur Strahlabschaltung den Laserstrahl vor der Einkopplung in die Lichtleitfaser 11 in Richtung einer nicht dargestellten Lichtfalle ablenkt.The radiation source module 2 generates illumination radiation that is suitable for laser scanning microscopy, ie in particular radiation that can trigger fluorescence. Depending on the application, the radiation source module has a plurality of radiation sources for this purpose. In an illustrated embodiment, two lasers 6 and 7 in the radiation source module 2 provided, each with a light valve 8th as well as an attenuator 9 are downstream and their radiation via a coupling point 10 in an optical fiber 11 inject. The light valve 8th acts as a beam deflector, with which a beam shutoff can be effected without the operation of the laser in the laser unit 6 respectively. 7 to switch off yourself. The light valve 8th is designed, for example, as AOTF, which, for the purpose of stopping the beam, switches off the laser beam before it is coupled into the optical fiber 11 deflects in the direction of a light trap, not shown.

In der beispielhaften Darstellung der 4 weist die Lasereinheit 6 drei Laser B, C, D auf, wohingegen die Lasereinheit 7 nur einen Laser A beinhaltet. Die Darstellung ist also beispielhaft für eine Kombination aus Einzel- und Multiwellenlängenlaser, die einzeln oder auch gemeinsam an eine oder mehrere Fasern angekoppelt sind. Auch kann die Ankopplung über mehrere Fasern gleichzeitig erfolgen, deren Strahlung später nach Durchlaufen einer Anpaßoptik durch Farbvereiniger gemischt wird. Es ist somit möglich, verschiedenste Wellenlängen oder -bereiche für die Anregungsstrahlung zu verwenden.In the exemplary illustration of the 4 has the laser unit 6 three lasers B, C, D on, whereas the laser unit 7 only one laser A included. The illustration is thus exemplary of a combination of single and multi-wavelength lasers, which are individually or jointly coupled to one or more fibers. The coupling can also take place simultaneously via a plurality of fibers, the radiation of which is later mixed after passing through an adjustment optics by means of color combiner. It is thus possible to use a wide variety of wavelengths or ranges for the excitation radiation.

Die in die Lichtleitfaser 11 eingekoppelte Strahlung wird mittels verschieblichen Kollimationsoptiken 12 und 13 über Strahlvereinigungsspiegel 14, 15 zusammengeführt und in einer Strahlformungseinheit hinsichtlich des Strahlprofils verändert.The in the optical fiber 11 Coupled radiation is by means of sliding collimating optics 12 and 13 about beam merging mirror 14 . 15 merged and changed in a beam shaping unit with respect to the beam profile.

Die Kollimatoren 12, 13 sorgen dafür, daß die vom Strahlungsquellenmodul 2 an das Scanmodul 3 zugeführte Strahlung in einen Unendlichstrahlengang kollimiert wird. Dies erfolgt jeweils vorteilhaft mit einer einzelnen Linse, die durch Verschiebung entlang der optischen Achse unter Steuerung (einer nicht dargestellten) zentralen Ansteuereinheit eine Fokussierungsfunktion hat, indem der Abstand zwischen Kollimator 12, 13 und dem jeweiligen Ende der Lichtleitfaser veränderbar ist.The collimators 12 . 13 make sure that the radiation source module 2 to the scan module 3 supplied radiation is collimated in an infinite beam path. This is advantageously done with a single lens having a focusing function by displacement along the optical axis under the control of a central drive unit (not shown) by adjusting the distance between the collimator 12 . 13 and the respective end of the optical fiber is changeable.

Die Strahlformungseinheit, welche später noch eingehend erläutert wird, erzeugt aus dem rotationssymmetrischen, gaußförmig profilierten Laserstrahl, wie er nach den Strahlvereinigungsspiegeln 14, 15 vorliegt, einen zeilenförmigen Strahl, der nicht mehr rotationssymmetrisch ist, sondern im Querschnitt zur Erzeugung eines rechteckig beleuchteten Feldes geeignet ist.The beam-shaping unit, which will be explained in detail later, generates from the rotationally symmetrical, Gaussian-profiled laser beam, as it does after the beam combination mirrors 14 . 15 is present, a line-shaped beam, which is no longer rotationally symmetrical, but is suitable in cross section to produce a rectangularly illuminated field.

Dieser auch als zeilenförmig bezeichnete Beleuchtungsstrahl dient als Anregungsstrahlung und wird über einen Hauptfarbteiler 17 und eine noch zu beschreibende Zoomoptik zu einem Scanner 18 geleitet. Auf den Hauptfarbteiler wird später ebenfalls noch eingegangen, hier sei lediglich erwähnt, daß er die Funktion hat, vom Mikroskopmodul 4 zurückkehrende Probenstrahlung von der Anregungsstrahlung zu trennen.This illumination beam, also referred to as a line-shaped line, serves as excitation radiation and is transmitted via a main color splitter 17 and a yet to be described zoom optics to a scanner 18 directed. The main color splitter will also be discussed later, it should be mentioned only that it has the function of the microscope module 4 to separate returning sample radiation from the excitation radiation.

Der Scanner 18 lenkt den zeilenförmigen Strahl ein- oder zweiachsig ab, wonach er durch ein Scanobjektiv 19 sowie eine Tubuslinse und ein Objektiv des Mikroskopmoduls 4 in einen Fokus 22 gebündelt wird, der in einem Präparat bzw. in einer Probe liegt. Die optische Abbildung erfolgt dabei so, daß die Probe in einer Brennlinie mit Anregungsstrahlung beleuchtet wird.The scanner 18 deflects the line-shaped beam one or two axes, after which he through a scan lens 19 and a tube lens and a lens of the microscope module 4 into a focus 22 is bundled, which lies in a preparation or in a sample. The optical imaging is carried out so that the sample is illuminated in a focal line with excitation radiation.

Derart im linienförmigen Fokus angeregte Fluoreszenz-Strahlung gelangt über Objektiv und Tubuslinse des Mikroskopmoduls 4 und das Scanobjektiv 19 zurück zum Scanner 18, so daß in Rückrichtung nach dem Scanner 18 wieder ein ruhender Strahl vorliegt. Man spricht deshalb auch davon, daß der Scanner 18 die Fluoreszenz-Strahlung descannt.Fluorescence radiation excited in the linear focus thus passes over the objective and tube lens of the microscope module 4 and the scan lens 19 back to the scanner 18 so that in return for the scanner 18 again a static beam is present. It is therefore also known that the scanner 18 the fluorescence radiation descanted.

Der Hauptfarbteiler 17 läßt die in anderen Wellenlängenbereichen als die Anregungsstrahlung liegende Fluoreszenz-Strahlung passieren, so daß sie über einen Umlenkspiegel 24 im Detektormodul 5 umgelenkt und dann analysiert werden kann. Das Detektormodul 5 weist in der Ausführungsform der 4 mehrere spektrale Kanäle auf, d.h. die vom Umlenkspiegel 24 kommende Fluoreszenz-Strahlung wird in einem Nebenfarbteiler 25 in zwei spektrale Kanäle aufgeteilt.The main color divider 17 lets pass the fluorescence radiation lying in other wavelength ranges than the excitation radiation, so that they have a deflection mirror 24 in the detector module 5 be redirected and then analyzed. The detector module 5 has in the embodiment of 4 several spectral channels, ie from the deflection mirror 24 upcoming fluorescence radiation is in a secondary color splitter 25 divided into two spectral channels.

Jeder spektrale Kanal verfügt über eine Schlitzblende 26, die eine konfokale oder teil-konfokale Abbildung bezüglich der Probe 23 realisiert und deren Größe die Tiefenschärfe, mit der die Fluoreszenz-Strahlung detektiert werden kann, festlegt. Die Geometrie der Schlitzblende 26 bestimmt somit die Schnittebene innerhalb des (dicken) Präparates, aus der Fluoreszenz-Strahlung detektiert wird.Each spectral channel has a slit diaphragm 26 showing a confocal or partially-confocal image with respect to the sample 23 realized and the size of the depth of field, with which the fluorescence radiation can be detected determines. The geometry of the slit diaphragm 26 thus determines the cutting plane within the (thick) preparation from which fluorescence radiation is detected.

Der Schlitzblende 26 ist noch ein Blockfilter 27 nachgeordnet, das unerwünschte, in das Detektormodul 5 gelangte Anregungsstrahlung abblockt. Die derart abseparierte, aus einem bestimmten Tiefenabschnitt stammende, zeilenförmig aufgefächerte Strahlung wird dann von einem geeigneten Detektor 28 analysiert. Analog zum geschilderten Farbkanal ist auch der zweite spektrale Detektionskanal aufgebaut, der ebenfalls eine Schlitzblende 26a, ein Blockfilter 27a sowie einen Detektor 28a umfaßt.The slit 26 is still a block filter 27 downstream, the unwanted, in the detector module 5 reached excitation radiation blocks. The thus separated, originating from a certain depth section, line-shaped fanned radiation is then from a suitable detector 28 analyzed. Analogous to the described color channel and the second spectral detection channel is constructed, which also has a slit 26a , a block filter 27a and a detector 28a includes.

Die Verwendung einer konfokalen Schlitz-Apertur im Detektormodul 5 ist nur beispielhaft. Natürlich kann auch ein Einzelpunktscanner realisiert sein. Die Schlitzblenden 26, 26a sind dann durch Lochblenden ersetzt und die Strahlformungseinheit kann entfallen. Im übrigen sind für eine solche Bauweise alle Optiken rotationssymmetrisch ausgeführt. Dann können natürlich statt einer Einzelpunktabtastung und -detektion auch prinzipiell beliebige Mehrpunktanordnungen, wie Punktwolken oder Nipkow-Scheibenkonzepte, verwendet werden, wie sie später noch anhand 6 und 7 erläutert werden. Wesentlich ist dann allerdings, daß der Detektor 28 ortsauflösend ist, da eine parallele Erfassung mehrerer Probenpunkte beim Durchlauf des Scanners erfolgt.The use of a confocal slot aperture in the detector module 5 is only an example. Of course, a single-point scanner can be realized. The slit diaphragms 26 . 26a are then replaced by pinholes and the beam shaping unit can be omitted. Moreover, all such optics are designed rotationally symmetric for such a construction. Then, of course, instead of a single point sampling and detection in principle any multipoint arrangements, such as point clouds or Nipkow disk concepts, can be used, as described later 6 and 7 be explained. It is essential, however, that the detector 28 is spatially resolved, since a parallel acquisition of multiple sample points takes place during the passage of the scanner.

In 4 ist zu sehen, daß die nach den beweglichen, d.h. verschieblichen Kollimatoren 12 und 13 vorliegenden Gauß'schen Strahlenbündel über eine Spiegeltreppe in Form der Strahlvereinigungsspiegel 14, 16 vereinigt und bei der gezeigten Bauweise mit konfokaler Schlitzblende anschließend in ein Strahlbündel mit rechteckigem Strahlquerschnitt konvertiert werden. In der Ausführungsform der 1 wird in der Strahlformungseinheit ein Zylinderteleskop 37 verwendet, dem eine Asphäreneinheit 38 nachgeordnet ist, auf das eine Zylinderoptik 39 folgt.In 4 It can be seen that after the moving, that is displaceable collimators 12 and 13 present Gaussian beam over a mirror staircase in the form of the beam combination mirror 14 . 16 united and then converted in the illustrated construction with confocal slit diaphragm in a beam with rectangular beam cross-section. In the embodiment of the 1 becomes a cylindrical telescope in the beam shaping unit 37 which uses an aspheric unit 38 is subordinate to a cylinder optics 39 follows.

Nach der Umformung liegt ein Strahl vor, der in einer Profilebene im wesentlichen ein rechteckiges Feld ausleuchtet, wobei die Intensitätsverteilung entlang der Feldlängsachse nicht gaußförmig, sondern kastenförmig ist.To The deformation is a beam that in a profile plane in essentially illuminates a rectangular field, the intensity distribution along the field longitudinal axis not gaussian, but box-shaped is.

Die Beleuchtungsanordnung mit der Asphäreneinheit 38 kann zur gleichmäßigen Füllung einer Pupille zwischen einer Tubuslinse und einem Objektiv dienen. Damit kann die optische Auflösung des Objektivs voll ausgeschöpft werden. Diese Variante ist somit auch zweckmäßig in einem Einzelpunkt oder Multipunkt scannenden Mikroskopsystem, z. B. in einem linien-scannenden System (bei letzterem zusätzlich zu der Achse, in der auf bzw. in die Probe fokussiert wird).The lighting arrangement with the aspherical unit 38 can be used to uniformly fill a pupil between a tube lens and a lens. Thus, the optical resolution of the lens can be fully utilized. This variant is therefore also useful in a single-point or multi-point scanning microscope system, z. In a line-scanning system (in the latter, in addition to the axis in which the sample is focused).

Die z. B. linienförmig konditionierte Anregungsstrahlung wird auf den Hauptfarbteiler 17 gelenkt. Dieser ist in einer bevorzugten Ausführungsform als spektral-neutraler Teilerspiegel gemäß der DE 10257237 A1 ausgeführt, deren Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich einbezogen ist. Der Begriff „Farbteiler" umfaßt also auch nichtspektral wirkende Tellersysteme. Anstelle des beschriebenen spektral unabhängigen Farbteilers kann auch ein homogener Neutralteiler (z.B. 50/50, 70/30, 80/20 o.ä.) oder ein dichroitischer Teiler Verwendung finden. Damit applikationsabhängig eine Auswahl möglich ist, ist der Hauptfarbteiler vorzugsweise mit einer Mechanik versehen, die einen einfachen Wechsel ermöglicht, beispielsweise durch ein entsprechendes Tellerrad, das einzelne, austauschbare Teiler enthält.The z. B. linearly conditioned excitation radiation is applied to the main color splitter 17 directed. This is in a preferred embodiment as a spectrally neutral splitter mirror according to the DE 10257237 A1 whose disclosure is fully incorporated herein. The term "color splitter" thus also encompasses non-spectral dish systems Instead of the described spectrally independent color splitter, it is also possible to use a homogeneous neutral splitter (eg 50/50, 70/30, 80/20 or the like) or a dichroic splitter a choice is possible, the main color splitter is preferably provided with a mechanism that allows easy change, for example, by a corresponding ring gear containing individual, interchangeable divider.

Ein dichroitischer Hauptfarbteiler ist besonders dann vorteilhaft, wenn kohärente, d. h. gerichtete Strahlung detektiert werden soll, wie z.B. Reflexion, Stokes'sche bzw. anti-Stokes'sche Raman-Spektroskopie, kohärente Raman-Prozesse höherer Ordnung, allgemein parametrische nicht-lineare optische Prozesse, wie Second Harmonic Generation, Third Harmonic Generation, Sum Frequency Generation, Zwei- und Mehrfotonenabsorption bzw. Fluoreszenz. Mehrere dieser Verfahren der nicht-linearen optischen Spektroskopie erfordern den Einsatz zweier oder mehrer Laserstrahlen, die kollinear überlagert werden. Hierbei erweist sich die dargestellte Strahlvereinigung der Strahlung mehrerer Laser als besonders vorteilhaft. Grundsätzlich können die in der Fluoreszenzmikroskopie weltverbreiteten dichroitischen Strahlteiler verwendet werden. Auch ist es für Raman-Mikroskopie vorteilhaft vor den Detektoren holografische Notch-Teiler oder -Filter zu Unterdrückung des Rayleigh-Streuanteils zu verwenden.One The main dichroic color splitter is particularly advantageous when coherent, d. H. directed radiation is to be detected, e.g. Reflection, Stokes'sche or anti-Stokes Raman spectroscopy, coherent Raman processes higher Order, general parametric non-linear optical processes, Second Harmonic Generation, Third Harmonic Generation, Sum Frequency Generation, two- and multi-photon absorption or fluorescence. Several require these methods of non-linear optical spectroscopy the use of two or more laser beams superimposed collinear become. This proves the beam union shown the radiation of multiple lasers as particularly advantageous. Basically, the in fluorescence microscopy, world-wide dichroic beam splitters be used. It is also for Raman microscopy advantageous in front of the detectors holographic notch divider or filter to suppress the Rayleigh Streuanteils to use.

In der Ausführungsform der 4 wird die Anregungsstrahlung bzw. Beleuchtungsstrahlung dem Scanner 18 über eine motorisch steuerbare Zoom-Optik 41 zugeführt. Damit kann der Zoom-Faktor angepaßt werden und das abgetastete Sehfeld ist in einem bestimmten Verstellbereich kontinuierlich variierbar. Besonders vorteilhaft ist eine Zoom-Optik, bei der während Anpassung der Fokuslage und des Abbildungsmaßstabes die Pupillenlage im kontinuierlichen Durchstimmvorgang erhalten bleibt. Die in 4 dargestellten, durch Pfeile symbolisierten, drei motorischen Freitheitsgrade der Zoom-Optik 41 entsprechen genau der Zahl der Freitheitsgrade, die zur Anpassung der drei Parameter, Abbildungsmaßstab, Fokus-, Pupillenlage, vorgesehen sind. Besonders bevorzugt ist eine Zoom-Optik 41, an deren ausgangsseitigen Pupille eine feste Blende 42 angeordnet ist. In einer praktischen einfachen Realisierung kann die Blende 42 auch durch die Begrenzung der Spiegelfläche des Scanners 18 vorgegeben sein. Die ausgangsseitige Blende 42 mit der Zoom-Optik 41 erreicht, daß unabhängig vom Verstellen der Zoomvergrößerung immer ein festgelegter Pupillendurchmesser auf das Scanobjektiv 19 abgebildet wird. Somit bleibt die Objektivpupille auch bei beliebiger Verstellung der Zoomoptik 41 vollständig ausgeleuchtet. Die Verwendung einer eigenständigen Blende 42 verhindert vorteilhaft das Auftreten ungewollter Streustrahlung im Bereich des Scanners 18.In the embodiment of the 4 the excitation radiation or illumination radiation is the scanner 18 via a motor-controllable zoom optics 41 fed. Thus, the zoom factor can be adjusted and the scanned field of view is continuously variable in a certain adjustment range. Particularly advantageous is a zoom lens, in which the pupil position is maintained in the continuous tuning process during adaptation of the focus position and the image scale. In the 4 illustrated, symbolized by arrows, three motor degrees of freedom of the zoom optics 41 correspond exactly to the number of degrees of freedom that are provided for the adaptation of the three parameters, magnification, focus, pupil position. Particularly preferred is a zoom optics 41 , on the output side pupil of a fixed aperture 42 is arranged. In a practical simple realization, the aperture 42 also by limiting the mirror surface of the scanner 18 be predetermined. The output side panel 42 with the zoom optics 41 achieved that regardless of adjusting the zoom magnification always a fixed pupil diameter on the scan lens 19 is shown. Thus, the objective pupil also remains with any adjustment of the zoom optics 41 completely lit. The use of a separate aperture 42 advantageously prevents the occurrence of unwanted scattered radiation in the area of the scanner 18 ,

Mit der Zoom-Optik 41 wirkt das Zylinderteleskop 37 zusammen, das ebenfalls motorisch betätigbar ist und der Asphäreneinheit 38 vorgeordnet ist. Dies ist in der Ausführungsform der 2 aus Gründen eines kompakten Aufbaus gewählt, muß aber nicht so sein.With the zoom optics 41 acts the cylinder telescope 37 together, which is also motorized and the aspherical unit 38 is upstream. This is in the embodiment of 2 chosen for the sake of a compact structure, but need not be so.

Wird ein Zoom-Faktor kleiner 1,0 gewünscht, wird das Zylinderteleskop 37 automatisch in den optischen Strahlengang eingeschwenkt. Es verhindert, daß die Aperturblende 42 unvollständig ausgeleuchtet ist, wenn das Zoomobjektiv 41 verkleinert ist. Das einschwenkbare Zylinderteleskop 37 gewährleistet somit, daß auch bei Zoom-Faktoren kleiner 1, d. h. unabhängig von der Verstellung der Zoomoptik 41 am Ort der Objektivpupille stets eine Beleuchtungslinie konstanter Länge vorliegt. Im Vergleich zu einem einfachen Sehfeld-Zoom sind somit Laserleistungsverluste in dem Beleuchtungsstrahl vermieden.If a zoom factor smaller than 1.0 is desired, the cylinder telescope becomes 37 automatically swung into the optical path. It prevents the aperture diaphragm 42 is incompletely lit when the zoom lens 41 is reduced. The swiveling cylinder telescope 37 thus ensures that even with zoom factors less than 1, ie regardless of the adjustment of the zoom optics 41 At the location of the objective pupil there is always a line of illumination of constant length. Compared to a simple field of view zoom thus laser power losses are avoided in the illumination beam.

Da beim Einschwenken des Zylinderteleskops 37 ein Bildhelligkeitssprung in der Beleuchtungslinie unvermeidlich ist, ist in der (nicht dargestellten) Steuereinheit vorgesehen, daß die Vorschubgeschwindigkeit des Scanners 18 oder ein Verstärkungsfaktor der Detektoren im Detektormodul 5 bei aktiviertem Zylinderteleskop 37 entsprechend angepaßt ist, um die Bildhelligkeit konstant zu halten.Because when pivoting the cylinder telescope 37 an image brightness jump in the illumination line is unavoidable, is provided in the control unit (not shown) that the feed rate of the scanner 18 or an amplification factor of the detectors in the detector module 5 with activated cylinder telescope 37 is adjusted accordingly to keep the image brightness constant.

Neben der motorisch angetriebenen Zoomoptik 41 sowie dem motorisch aktivierbaren Zylinderteleskop 37 sind auch im Detektormodul 5 des Laserscanningmikroskops der 1 fernsteuerbare Justierelemente vorgesehen. Zur Kompensation von Farblängsfehlern sind beispielsweise vor der Schlitzblende eine Rundoptik 44 sowie eine Zylinderoptik 39 und unmittelbar vor dem Detektor 28 eine Zylinderoptik 39 vorgesehen, die jeweils in axialer Richtung motorisch verschiebbar sind.In addition to the motor-driven zoom optics 41 as well as the motor-activated cylinder telescope 37 are also in the detector module 5 the laser scanning microscope 1 provided remotely controllable adjusting elements. To compensate for longitudinal chromatic aberrations, for example, in front of the slit a round optics 44 as well as a cylindrical look 39 and immediately in front of the detector 28 a cylinder look 39 provided, which are each motor-displaceable in the axial direction.

Zusätzlich ist zur Kompensation eine Korrektureinheit 40 vorgesehen, die nachfolgend kurz beschrieben wird.In addition, a compensation unit for compensation 40 provided, which is briefly described below.

Die Schlitzblende 26 bildet zusammen mit einer vorgeordneten Rundoptik 44 sowie der ebenfalls vorgeordneten ersten Zylinderoptik 39 sowie der nachgeordneten zweiten Zylinderoptik ein Pinhole-Objektiv der Detektoranordnung 5, wobei das Pinhole hier durch die Schlitzblende 26 realisiert ist. Um eine unerwünschte Detektion von im System reflektierter Anregungsstrahlung zu vermeiden, ist der zweiten Zylinderlinse 39 noch das Blockfilter 27 vorgeschaltet, das über geeignete spektrale Eigenschaften verfügt, um lediglich gewünschte Fluoreszenzstrahlung zum Detektor 28, 28a gelangen zu lassen.The slit diaphragm 26 forms together with an upstream circular optics 44 as well as the likewise upstream first cylinder optics 39 and the downstream second cylinder optics, a pinhole lens of the detector array 5 where the pinhole here through the slit 26 is realized. To avoid unwanted detection of excitation radiation reflected in the system, the second cylindrical lens is 39 still the block filter 27 upstream, which has suitable spectral properties to only desired fluorescence radiation to the detector 28 . 28a to get to.

Ein Wechsel des Farbteilers 25 oder des Blockfilters 27 bringt unvermeidlich einen gewissen Kipp- oder Keilfehler bei Einschwenken mit sich. Der Farbteiler kann einen Fehler zwischen Probenbereich und Schlitzblende 26, das Blockfilter 27 einen Fehler zwischen Schlitzblende 26 und Detektor 28 nach sich ziehen. Um zu verhindern, daß dann eine Neujustierung der Lage der Schlitzblende 26 bzw. des Detektors 28 erforderlich ist, ist zwischen der Rundoptik 44 und der Schlitzblende 26, d.h. im Abbildungsstrahlengang zwischen Probe und Detektor 28 eine planparallele Platte 40 angeordnet, die unter Steuerung eines Controllers in verschiedene Kippstellungen gebracht werden kann. Die planparallele Platte 40 ist dazu in einer geeigneten Halterung verstellbar angebracht.A change of the color divider 25 or the block filter 27 inevitably brings a certain tilt or wedge error when swinging with it. The color splitter may be a mistake between sample area and slit 26 , the block filter 27 an error between slit diaphragm 26 and detector 28 entail. In order to prevent then a readjustment of the position of the slit 26 or the detector 28 is required is between the round optics 44 and the slit diaphragm 26 , ie in the imaging beam path between sample and detector 28 a plane-parallel plate 40 arranged, which can be brought under control of a controller in different tilt positions. The plane-parallel plate 40 is adjustably mounted in a suitable holder.

5 zeigt, wie mit Hilfe der Zoom-Optik 41 innerhalb des zur Verfügung stehenden maximalen Scanfeldes SF ein Bereich (region of interest) ROI ausgewählt werden kann. Beläßt man die Ansteuerung des Scanners 18 so, daß die Amplitude sich nicht verändert, wie dies beispielsweise bei Resonanz-Scanner zwingend erforderlich ist, bewirkt eine an der Zoom-Optik eingestellte Vergrößerung größer 1,0 eine Einengung des ausgewählten Bereiches ROI zentriert um die optische Achse des Scanfeldes SF. 5 shows how using the zoom optics 41 within the available maximum scan field SF a region of interest ROI can be selected. Leaving the control of the scanner 18 such that the amplitude does not change, as is absolutely necessary, for example, in the case of a resonance scanner, a magnification of greater than 1.0 set on the zoom lens causes a narrowing of the selected area ROI centered about the optical axis of the scan field SF.

Resonanzscanner sind beispielsweise in Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press 1994, Seite 461ff beschrieben.resonance scanner For example, in Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy, Plenum Press 1994, page 461ff.

Steuert man den Scanner so an, daß er ein Feld asymmetrisch zur optischen Achse, d. h. zur Ruhelage der Scannerspiegel abtastet, so erhält man im Zusammenhang mit einer Zoomwirkung eine Oftsetverschiebung OF des ausgewählten Bereiches ROI. Durch die bereits erwähnte Wirkung des Scanners 18, zu descannen, und durch den nochmaligen Durchlauf durch die Zoom-Optik 41, wird die Auswahl des interessierenden Bereiches ROI im Detektionsstrahlengang wieder in Richtung auf den Detektor hin aufgehoben. Somit kann man eine beliebige innerhalb des Scanbildes SF liegende Auswahl für den Bereich ROI treffen. Zusätzlich kann man für verschiedene Auswahlen des Bereiches ROI Bilder gewinnen und diese dann zu einem hochauflösenden Bild zusammensetzen.If one controls the scanner so that it scans a field asymmetrically to the optical axis, ie to the rest position of the scanner mirror, one obtains in connection with a zooming effect an offset shift OF of the selected region ROI. Due to the already mentioned effect of the scanner 18 , to the scan, and through the loop through the zoom lens 41 , the selection of the region of interest ROI in the detection beam path is canceled again in the direction of the detector. Thus, one can make any selection within the scan image SF for the area ROI. In addition, you can capture images for different selections of the ROI area and then combine them to form a high-resolution image.

Möchte man den ausgewählten Bereich ROI nicht nur um einen Offset OF gegenüber der optischen Achse verschieben, sondern auch zusätzlich drehen, ist eine Ausführungsform zweckmäßig, die in einer Pupille des Strahlenganges zwischen Hauptfarbteiler 17 und Probe 23 ein Abbe-König-Prisma vorsieht, das bekanntermaßen eine Bildfelddrehung zur Folge hat. Auch diese wird in Richtung auf den Detektor hin wieder aufgehoben. Nun kann man Bilder mit verschiedenen Offsetverschiebungen OF und verschiedenen Drehwinkeln messen und anschließend zu einem hochauflösenden Bild verrechnen, beispielsweise gemäß einem Algorithmus, wie er in der Veröffentlichung, Gustafsson, M., „Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination", in „Three-dimensional and multidimensional microscopy: Image acquisition processing VII", Proceedings of SPIE, Vol. 3919 (2000), p 141-150, beschrieben ist.If one does not only want to shift the selected region ROI by an offset OF with respect to the optical axis but also to additionally rotate it, an embodiment which is located in a pupil of the beam path between the main color splitter is expedient 17 and sample 23 provides an Abbe-King prism, which is known to result in a field rotation. This too is canceled out in the direction of the detector. Now you can measure images with different offset offsets OF and different angles of rotation and then calculate a high-resolution image, for example, according to an algorithm as described in the publication, Gustafsson, M., "Doubling the lateral resolution of wide-field fluorescence microscopy using structured illumination in "Three-dimensional and multidimensional microscopy: Image acquisition processing VII", Proceedings of SPIE, Vol. 3919 (2000), p 141-150.

6 zeigt eine weitere mögliche Bauweise für ein Laserscanningmikroskop 1, bei dem ein Nipkowscheiben-Ansatz zur Verwirklichung kommt. Das Lichtquellenmodul 2, das in 6 stark vereinfacht dargestellt ist, beleuchtet über ein Minilinsenarray 65 durch den Hauptfarbteiler 17 hindurch eine Nipkow-Scheibe 64, wie sie beispielsweise in US 6.028.306 , WO 88 07695 oder DE 2360197 A1 beschrieben ist. Die über das Minilinsenarray 65 beleuchteten Pinholes der Nipkow-Scheibe werden in die im Mikroskopmodul 4 befindliche Probe abgebildet. Um auch hier die probenseitige Bildgröße variieren zu können, ist wiederum die Zoom-Optik 41 vorgesehen. 6 shows another possible construction for a laser scanning microscope 1 in which a Nipkowscheiben approach comes to fruition. The light source module 2 , this in 6 is shown in a simplified form, illuminated by a mini-lens array 65 through the main color divider 17 through a Nipkow disk 64 as they are for example in US 6,028,306 , WO 88 07695 or DE 2360197 A1 is described. The over the mini lens array 65 The illuminated pinholes of the Nipkow disc are placed in the microscope module 4 present sample shown. In order to be able to vary the sample-side image size, again, the zoom optics 41 intended.

In Abwandlung zur Bauweise der 4 ist beim Nipkow-Scanner die Beleuchtung im Durchgang durch den Hauptfarbteiler 17 vorgenommen und die zu detektierende Strahlung wird ausgespiegelt.In modification to the construction of the 4 For the Nipkow scanner, the illumination is in the passage through the main color divider 17 made and the radiation to be detected is reflected.

Darüber hinaus der Detektor 28 nun ortsauflösend ausgeführt, damit die mit der Nipkow-Scheibe 64 erreichte Multipunktbeleuchtung auch entsprechend parallel abgetastet wird. Ferner ist zwischen der Nipkow-Scheibe 64 und der Zoom-Optik 41 eine geeignete feststehende Optik 63 mit positiver Brechkraft angeordnet, welche die durch die Pinholes der Nipkow-Scheibe 64 divergent austretende Strahlung in geeignete Bündeldurchmesser umwandelt. Der Hauptfarbteiler 17 ist für den Nipkow-Aufbau der 3 ein klassischer dichroitischer Strahlteiler, d. h. nicht der zuvor erwähnte Strahlteiler mit schlitzförmig oder punktförmig reflektierendem Bereich.In addition, the detector 28 now spatially resolved, so that with the Nipkow disc 64 reached multipoint lighting is also sampled in parallel accordingly. Further, between the Nipkow disk 64 and the zoom optics 41 a suitable fixed appearance 63 arranged with positive refractive power, which through the pinholes of the Nipkow disc 64 divergent emerging radiation into suitable bundle diameter converts. The main color divider 17 is for the Nipkow construction of 3 a classic dichroic beam splitter, ie not the aforementioned beam splitter with slit-shaped or punctiform reflective area.

Die Zoom-Optik 41 entspricht der zuvor erläuterten Bauweise, wobei natürlich der Scanner 18 durch die Nipkow-Scheibe 64 überflüssig wird. Er kann dennoch vorgesehen werden, wenn man die anhand 5 erläuterte Auswahl eines Bereiches ROI vornehmen möchten. Gleiches gilt für das Abbe-König-Prisma.The zoom optics 41 corresponds to the previously explained construction, of course, the scanner 18 through the Nipkow disk 64 becomes unnecessary. Nevertheless, it can be provided if one uses the 5 explained selection of a range ROI. The same applies to the Abbe-King Prism.

Einen alternativen Ansatz mit Multipunktabtastung zeigt in schematischer Darstellung 7, bei der mehrere Lichtquellen schräg in die Scannerpupille einstrahlen. Auch hier läßt sich durch Nutzung der Zoom-Optik 41 zur Abbildung zwischen Hauptfarbteiler 17 und Scanner 18 eine Zoomfunktion wie in 5 dargestellt realisieren. Durch gleichzeitiges Einstrahlen von Lichtbündeln unter verschiedenen Winkeln in einer zur Pupille konjugierten Ebene, werden Lichtpunkte in einer zur Objektebene konjugierten Ebene erzeugt, die vom Scanner 18 gleichzeitig über einen Teilbereich des gesamten Objektfeldes geführt werden. Die Bildinformation entsteht durch Auswertung sämtlicher Teilbilder auf einem ortsauflösenden Matrixdetektor 28.An alternative approach with multipoint sampling shows in a schematic representation 7 in which several light sources radiate obliquely into the scanner pupil. Again, by using the zoom optics 41 to the picture between main color divider 17 and scanners 18 a zoom function like in 5 realized realize. By simultaneously irradiating light bundles at different angles in a plane conjugate to the pupil, light spots are generated in a plane conjugate to the object plane, that of the scanner 18 be performed simultaneously over a partial area of the entire object field. The image information is created by evaluating all partial images on a spatially resolving matrix detector 28 ,

Als weitere Ausführungsform kommt eine Multipunkt-Abtastung, wie in US 6.028.306 beschrieben, in Frage, deren Offenbarung vollumfänglich diesbezüglich hier einbezogen wird. Auch hier istein ortsauflösender Detektor 28 vorzusehen. Die Probe wird dann durch eine Multipunktlichtquelle beleuchtet, die durch einen Strahlexpander mit nachgeordneten Mikrolinsenarray realisiert wird, das eine Multiaperturenplatte so beleuchtet, daß dadurch eine Multipunktlichtquelle realisiert ist.As a further embodiment comes a multipoint sampling, as in US 6,028,306 in question, the disclosure of which is fully incorporated herein. Here, too, is a spatially resolving detector 28 provided. The sample is then illuminated by a multi-point light source realized by a beam expander with a downstream microlens array that illuminates a multi-aperture plate to provide a multi-point light source.

Im folgenden wird ein vorteilhaftes erfindungsgemäßes Verfahren näher erläutert:
Die Implementierung beschreibt eine Methode zur verlustbehafteten Datenkompression von 3D und 4D Daten bei der Abspeicheung der Bilddaten mit einem Mikroskopsystem. Eine Datenkomprimierung von Bildstapeln in den 3 Dimensionen x, y und z wird durch die zwei Schritte der 3D-digitalen Cosinustransformation und der Quantisierung der Ergebnisse der 3D-digitalen Cosinustransformation erreicht.In the following, an advantageous method according to the invention is explained in more detail:
The implementation describes a method for lossy data compression of 3D and 4D data in the storage of image data with a microscope system. Data compression of image stacks in the 3 dimensions x, y, and z is achieved through the two steps of the 3D digital cosine transformation and the quantization of the results of the 3D digital cosine transformation.

Durch die Verwendung einer 3-dimensionalen digitalen Cosiunstransformation und anschließender Quantisierung läßt sich das Verhältnis von Bildqualität zu Datenmege der komprimierten Daten gegenüber dem 2-dimensionalen Verfahen für die einzelnen Ebenen eines Bildstapels wesentlich verbessern.By using a 3-dimensional digital Cosiunstransformation and subsequent Quantization allows the ratio of image quality to data size of the compressed data to be significantly improved over the 2-dimensional process for each level of an image stack.

Der 3D-Bildstapel wird in Kuben von benachbarten Voxeln unterteilt. Ein Kubus hat m-Voxel in x-Richtung, n-Voxel in y-Richtung und o-Voxel in z-Richtung. Dabei können die einzelnen Kuben auch unterschiedliche Anzahl von Voxeln in den entsprechenden Dimensionen haben.Of the 3D image stack is divided into cubes of neighboring voxels. A cube has m-voxels in x-direction, n-voxels in y-direction and o-voxels in the z direction. It can The individual cubes also have different numbers of voxels in the have corresponding dimensions.

Im ersten Schritt werden für jeden Kubus die Werte S(w, v, u) berechnet:

In the first step, the values S (w, v, u) are calculated for each cube:

I(z, y, x) ist die Intensität des Voxels mit den Koordinaten x, y und z relativ zum ersten Voxel des Kubus. Die n·m·o Gleitkommawerte S(w, v, u) werden anschließend mit Quantisierungsfaktoren Q(w, v, u) multipliziert und in ganze Zahlen Z(w, v, u) gewandelt.I (z, y, x) is the intensity of the voxel with the coordinates x, y and z relative to the first voxel of the cube. The n · m · o floating-point values S (w, v, u) will follow multiplied by quantization factors Q (w, v, u) and in whole Numbers Z (w, v, u) changed.

In einem weiteren Schritt werden die Werte Z(w, v, u) in ein Array T(i) = Z(Sw(i), Sv(i), Su(i)) (III) i = 0... n·m·o – 1geschrieben. Die Werte Sw(i), Sv(i) und Su(i) werden so gewählt, dass es zu jedem Element von Z genau ein Element von T gibt. Es ist sinnvoll, Bei der Wahl von Sw(i), Sv(i) und Su(i) für niedrige Werte von i auch niedrige Werte Sw(i), Sv(i) und Su(i) zu verwenden.In a further step, the values Z (w, v, u) become an array T (i) = Z (Sw (i), Sv (i), Su (i)) (III) i = 0 ... n · m · o - 1 written. The values Sw (i), Sv (i) and Su (i) are chosen such that there is exactly one element of T for each element of Z. It makes sense to use Sw (i), Sv (i), and Su (i) for low values of i when choosing Sw (i), Sv (i), and Su (i).

Im letzten Schritt können die Werte T(i) mit verlustlosen Komprimierungsverfahen wie Huffmann-Kodierung, Arithmentische Kodierung und Lauflängenkodierung weiter komprimiert werden.in the last step can the values T (i) with lossless compression methods such as Huffmann coding, Arithmetic coding and run length coding further compressed become.

Bei der Dekomprimierung der Daten wird zunächst die verlustlose Komprimierung rückgängig gemacht. Anschielßend werden die Daten mit der Umkehrfunktion von (II I) wieder in Werte Z(w, v, u) gewandelt.at The decompression of the data is first the lossless compression reversed. Anschielßend the data with the inverse function of (II I) become again in values Z (w, v, u) changed.

Durch Division durch die Quantisierungsfaktoren Q(w, v, u) erhält man die Gelikommawerte S'(w, v, u).By Division by the quantization factors Q (w, v, u) gives the Gelicom values S '(w, v, u).

Die dekomprimierten Daten werden dann über die 3D inverse digitale Cosinustransformation bestimmt:

mitThe decompressed data is then determined via the 3D inverse digital cosine transformation:

With

Die Stärke der Komprimierung kann über die Quantisierungsfaktoren Q(w, v, u) gesteuert werden.The Strength the compression can over the quantization factors Q (w, v, u) are controlled.

Das Verfahren läßt sich auch dann einsetzen, wenn Zeitserien von Bildstapeln komprimiert werden sollen. Dabei ist es auch möglich nur ausgewählte Bildstapel einer Zeitserie zu komprimieren.The Procedure can be also use when compressing time series of image stacks should be. It is also possible only selected image stacks to compress a time series.

Die beschriebene Erfindung stellt eine bedeutende Ausweitung der Anwendungsmöglichkeiten von schnellen konfokalen Laserscanmikroskopen dar. Die Bedeutung einer solchen Weiterentwicklung lässt sich anhand der zellbiologischen Standardliteratur und den dort beschriebenen schnellen zellulären und subzellulären Vorgängen¹ und den eingesetzten Untersuchungsmethoden mit einer Vielzahl von Farbstoffen² ablesen.The invention described represents a significant expansion of the application possibilities of fast confocal laser scanning microscopes. The significance of such a further development can be read off from the standard cell biological literature and the fast cellular and subcellular processes ¹ described therein and the examination methods used with a plurality of dyes ² .

Siehe z.B.:

¹B. Alberts et al. (2002): Molecular Biology of the Cell; Garland Science.
^1,2G. Karp (2002): Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
^1,2R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons – a laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
²P. Haugland (2003): Handbook of fluorescent Probes and research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV.

See for example:

¹ B. Alberts et al. (2002): Molecular Biology of the Cell; Garland Science.
^1,2 G. Karp (2002): Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments; Wiley Text Books.
^1.2 R. Yuste et al. (2000): Imaging neurons - a laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
² P. Haugland (2003): Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 10th Edition; Molecular Probes Inc. and Molecular Probes Europe BV.

De Erfindung hat insbesondere große Bedeutung für die folgenden Prozesse und Vorgange:de Invention has particular great Meaning of the following processes and procedures:

Entwicklung von Organismendevelopment of organisms

Die beschriebene Erfindung ist u.a. für die Untersuchung von Entwicklungsprozessen geeignet, die sich vor allem durch dynamische Prozesse im Zehntelsekunden bis hin zum Stundenbereich auszeichnen. Beispielanwendungen auf der Ebene von Zellverbänden und ganzen Organismen sind z.B. hier beschrieben:

• Abdul-Karim, M.A. et al. beschreiben 2003 in Microvasc. Res., 66:113-125 eine Langzeitanalyse von Blutgefässveränderungen im lebenden Tier, wobei Fluoreszenzbilder in Intervallen über mehrere Tage aufgenommen wurde. Die 3D-Datensätze wurden mit adaptiven Algorithmen ausgewertet, um die Bewegungstrajektorien schematisch darzustellen.
• Soll, D.R. et al. beschreiben 2003 in Scientific World Journ. 3:827-841 eine softwarebasierte Bewegungsanalyse von mikroskopischen Daten von Kernen und Pseudopodien lebender Zellen in allen 3 Raumdimensionen.
• Grossmann, R. et al. beschreiben 2002 in Glia, 37:229-240 eine 3D-Analyse der Bewegungen von Mikrogliazellen der Ratte, wobei die Daten über bis zu 10 Stunden aufgenommen wurden. Gleichzeitig kommen nach traumatischer Schädigung auch schnelle Reaktionen der Glia vor, so dass eine hohe Datenrate und entsprechendes Datenvolumen entsteht.

The invention described is suitable, inter alia, for the investigation of development processes, which are distinguished above all by dynamic processes in tenths of a second up to the hourly range. Example applications at the level of cell aggregates and whole organisms are described, for example:

Abdul-Karim, MA et al. describe 2003 in Microvasc. Res., 66: 113-125 a long-term analysis of vascular changes in the living animal, wherein fluorescence images were taken at intervals over several days. The 3D data sets were evaluated with adaptive algorithms to represent the movement trajectories schematically.
• Soll, DR et al. describe 2003 in Scientific World Journ. 3: 827-841 is a software-based motion analysis of microscopic data from nuclei and pseudopods of living cells in all 3 spatial dimensions.
• Grossmann, R. et al. describe in 2002 in Glia, 37: 229-240 a 3D analysis of the movements of microglial cells of the rat, the data being recorded for up to 10 hours. At the same time, rapid reactions of the glia occur after traumatic injury, resulting in a high data rate and corresponding data volume.

Das betrifft insbesondere folgende Schwerpunkte:

• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung, deren Nachbarzellen empfindlich auf Laserbeleuchtung reagieren und die von der Beleuchtung der 3D-ROI geschützt werden müssen;
• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt durch Laserbeleuchtung in 3D gebleicht werden sollen, z.B. FRET-Experimente;
• Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die gezielt durch Laserbeleuchtung gebleicht und gleichzeitig auch ausserhalb der ROI beobachtet werden sollen, z.B. FRAP- und FLIP-Experimente in 3D;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen und Pharmaka, die manipulationsbedingte Änderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. Aktivierung von Transmittern in 3D;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit Markierungen, die manipulationsbedingte Farbänderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede;
• Gezielte Analyse lebender Zellen in einer 3D Umgebung mit sehr schwachen Markierungen, die z.B. eine optimale Balance von Konfokalität gegen Detektionsempfindlichkeit erfordern.
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit variierenden Mehrfachmarkierungen, z.B. CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed u.ä.
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die funktionsabhängige Farbänderungen aufweisen, z.B. Ca+-Marker
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die entwicklungsbedingte Farbänderungen aufweisen, z.B. transgene Tiere mit GFP
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit Markierungen, die manipulationsbedingte Farbänderungen durch Laserbeleuchtung aufweisen, z.B. paGFP, Kaede
• Lebende Zellen in einem 3D-Gewebeverband mit sehr schwachen Markierungen, die eine Einschränkung der Konfokalität zugunsten der Detektionsempfindlichkeit erfordern.
• Letztgenannter Punkt in Kombination mit den Vorangehenden.

This concerns in particular the following emphases:

• Analysis of living cells in a 3D environment whose neighboring cells are sensitive to laser illumination and need to be protected by 3D ROI lighting;
• Analysis of living cells in a 3D environment with markers to be specifically bleached by laser illumination in 3D, eg FRET experiments;
• Analysis of living cells in a 3D environment with markers that are targeted to be bleached by laser illumination and, at the same time, observed outside the ROI, eg FRAP and FLIP experiments in 3D;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markers and pharmaceuticals that exhibit manipulation-induced changes due to laser illumination, eg activation of transmitters in 3D;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with markings that exhibit manipulation-related color changes through laser illumination, eg paGFP, Kaede;
• Targeted analysis of living cells in a 3D environment with very weak markers that require, for example, an optimal balance of confocality versus detection sensitivity.
• Living cells in a 3D tissue association with varying multiple markers, eg CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed and the like.
• Living cells in a 3D tissue association with markers that have function-dependent color changes, eg Ca + markers
• Living cells in a 3D tissue association with markers showing developmental color changes, eg transgenic animals with GFP
• Living cells in a 3D tissue association with markings that exhibit manipulation-related color changes due to laser illumination, eg paGFP, Kaede
• Living cells in a 3D tissue association with very weak markers that require restriction of confocality in favor of detection sensitivity.
• Last point in combination with the previous ones.

Transportvorgänge in ZellenTransport processes in cells

Die beschriebene Erfindung ist für die Untersuchung von innerzellulären Transportvorgängen exzellent geeignet, da hierbei recht kleine motile Strukturen, z.B. Proteine, mit hoher Geschwindigkeit (meist im Bereich von Hundertstelsekunden) dargestellt werden müssen. Um die Dynamik von komplexen Transportvorgängen zu erfassen, kommen oft auch Anwendungen wie FRAP mit ROI-Bleichen zum Einsatz. Beispiele für solche Studien sind z.B. hier beschrieben:

• Umenishi, F. et al. beschreiben 2000 in Biophys J., 78:1024-1035 eine Analyse der räumlichen Beweglichkeit von Aquaporin in GFP-transfizierten Kulturzellen. Hierzu wurden in den Zellmembranen Punkte gezielt lokal gebleicht und die Diffusion der Fluoreszenz in der Umgebung analysiert.
• Gimpl, G. et al. beschreiben 2002 in Prog. Brain Res., 139:43-55 Experimente mit ROI-Bleichen und Fluoreszenzimaging zur Analyse der Mobilität und Verteilung von GFP-markierten Oxytocin-Rezeptoren in Fibroblasten. Dabei stellen sich hohe Anforderungen an die räumliche Positionierung und Auflösung sowie die direkte zeitliche Folge von Bleichen und Imaging.
• Zhang et al. beschreiben 2001 in Neuron, 31:261-275 live cell Imaging von GFP-transfizierten Nervenzellen, wobei die Bewegung von Granuli durch kombiniertes Bleichen und Fluoreszenzimaging analysiert wurde. Die Dynamik der Nervenzellen stellt dabei hohe Anforderungen an die Geschwindigkeit des Imaging.

The described invention is excellently suitable for the investigation of intracellular transport processes, since in this case quite small motile structures, eg proteins, have to be displayed at high speed (usually in the range of hundredths of a second). In order to capture the dynamics of complex transport processes, applications such as FRAP with ROI bleaching are often used. Examples of such studies are described here, for example:

• Umenishi, F. et al. describe in 2000 in Biophys J., 78: 1024-1035 an analysis of the spatial mobility of aquaporin in GFP-transfected culture cells. For this purpose, points in the cell membranes were locally bleached and the diffusion of fluorescence in the environment was analyzed.
Gimpl, G. et al. Describe 2002 in Prog. Brain Res., 139: 43-55 ROI bleaching and fluorescence imaging experiments to analyze the mobility and distribution of GFP-labeled oxytocin receptors in fibroblasts. This places high demands on the spatial positioning and resolution as well as the direct temporal sequence of bleaching and imaging.
• Zhang et al. describe in 2001 in Neuron, 31: 261-275 live cell imaging of GFP-transfected nerve cells, where the movement of granules was analyzed by combined bleaching and fluorescence imaging. The dynamics of the nerve cells places high demands on the speed of the imaging.

Wechselwirkungen von Moleküleninteractions of molecules

Die beschriebene Erfindung ist insbesondere für die Darstellung molekularer und anderer subzellulärer Wechselwirkungen geeignet. Hierbei müssen sehr kleine Strukturen mit hoher Geschwindigkeit (im Bereich um die Hundertstelsekunde) dargestellt werden. Um die für die Wechselwirkung notwendige räumliche Position der Moleküle aufzulösen, sind auch indirekte Techniken wie z.B. FRET mit ROI-Bleichen einzusetzen. Beispielanwendungen sind z.B. hier beschrieben:

• Petersen, M.A. und Dailey, M.E. beschreiben 2004 in Glia, 46:195-206 eine Zweikanalaufnahme lebender Hippokampuskulturen der Ratte, wobei die zwei Kanäle für die Marker Lectin und Sytox räumlich in 3D und über einen längeren Zeitraum aufgezeichnet werden.
• Yamamoto, N. et al. beschreiben 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20:633-638 ein Zweifarbimaging von humanen fibrosarcoma Zellen, wobei grünes und rotes fluoreszentes Protein (GFP und RFP) simultan in Echtzeit beobachtet wurde.
• Bertera, S. et al. beschreiben 2003 in Biotechniques, 35:718-722 ein Multicolorimaging von transgenen Mäusen markiert mit Timer reporter Protein, welches seine Farbe nach Synthese von grün in rot ändert. Die Bildaufnahme erfolgt als schnelle Serie 3-dimensional im Gewebe am lebenden Tier.

The described invention is particularly suitable for the presentation of molecular and other subcellular interactions. In this case, very small structures must be displayed at high speed (in the range of the hundredth of a second). In order to resolve the spatial position of the molecules necessary for the interaction, indirect techniques such as FRET with ROI bleaching must also be used. Example applications are described here, for example:

• Petersen, MA, and Dailey, ME describe a two-channel record of live rat hippocampus cultures in Glia, 46: 195-206, in which the two channels for marker lectin and sytox are spatially recorded in 3D and over a longer period of time.
Yamamoto, N. et al. describe 2003 in Clin. Exp. Metastasis, 20: 633-638 a two-color imaging of human fibrosarcoma cells, with green and red fluorescent protein (GFP and RFP) simultaneously observed in real time.
Bertera, S. et al. describe in 2003 in Biotechniques, 35: 718-722 a multicolorimaging of transgenic mice labeled with timer reporter protein which changes color from green to red after synthesis. The image acquisition takes place as a rapid series 3-dimensional in the tissue of the living animal.

Signalübertragung zwischen Zellensignal transmission between cells

Die beschriebene Erfindung ist für die Untersuchung von meist extrem schnellen Signalübertragungsvorgängen hervorragend sehr gut geeignet. Diese meist neurophysiologischen Vorgänge stellen höchste Anforderungen an die zeitliche Auflösung, da die durch Ionen vermittelten Aktivitäten sich im Bereich von Hundertstel- bis kleiner als Tausendstelsekunden abspielen. Beispielanwendungen von Untersuchungen im Muskel- oder Nervensystem sind z.B. hier beschrieben:

• Brum G et al. beschreiben 2000 in J Physiol. 528: 419-433 die Lokalisation von schnellen Ca+ Aktivitäten in Muskelzellen des Frosches nach Reizung mit Caffeine als Transmitter. Die Lokalisation und Mikrometer-genaue Auflösung gelang nur durch Einsatz eines schnellen, konfokalen Mikroskopes.
• Schmidt H et al. beschreiben 2003 in J Physiol. 551:13-32 eine Analyse von Ca+ Ionen in Nervenzellfortsätzen von transgenen Mäusen. Die Untersuchung von schnellen Ca+-Transienten in Mäusen mit veränderten Ca+ bindenden Proteinen konnte nur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie durchgeführt werden, da auch die Lokalisation der Ca+ Aktivität innerhalb der Nervenzelle und deren genaue zeitliche Kinetik eine wichtige Rolle spielt.

The invention described is very well suited for the investigation of mostly extremely fast signal transmission processes. These mostly neurophysiological processes place the highest demands on the temporal resolution, since the activities mediated by ions take place in the range of hundredths to less than thousandths of a second. Example applications of examinations in the muscular or nervous system are described, for example:

• Brum G et al. describe 2000 in J Physiol. 528: 419-433 the localization of fast Ca + activities in muscle cells of the frog after stimulation with caffeine as a transmitter. The localization and micrometer-accurate resolution was only possible by using a fast, confocal microscope.
• Schmidt H et al. describe 2003 in J Physiol. 551: 13-32 an analysis of Ca + ions in nerve cell processes of transgenic mice. The investigation of fast Ca + transients in mice with altered Ca + binding proteins could only be performed with high resolution confocal microscopy, as the localization of Ca + activity within the nerve cell and its precise temporal kinetics play an important role.

Claims

Method for acquiring images of a sample with a scanning microscope with moving perforated disc, wherein detected Image data corresponding to three-dimensional sample areas detected and stored, wherein a data compression takes place by on the sample next to each other and on top of each other lying image data are taken into account during compression.

The method of claim 1, wherein a picture stack is recorded is and adjacent images of the image stack for data compression be used.

Method according to one of the preceding claims, wherein temporal and / or spectral detected and stored data used for data compression.

Method according to one of the preceding claims, wherein a previous setting of the volume detected during data compression he follows.

Method for capturing images with a laser Scanning microscope, in particular according to one of the preceding claims, wherein a data compression in dependence from the speed of digit changes and / or the spatial resolution the recorded image is made.

Method according to one of the preceding claims, wherein a Data compression varies in different image areas will be carried out.

Method according to one of the preceding claims, wherein the compression rate based on the recording of image series automatically is created.

Method according to one of the preceding claims, wherein Input means for specifying the degree of compression of image areas and / or temporal Abschnmitten an image series are provided.

Method according to one of the preceding claims, wherein a storage of x, y, z, t records in a data store takes place in different memory areas a different degree of compression has the data storage.

Method according to one of the preceding claims, in a resonance scanner, Nipkowscanner or multipoint scanner.

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for investigating development processes, especially dynamic processes in tenths of a second up to the Hourly range, in particular at the level of cell associations and whole organisms, especially after at least one of the following Points: • Analysis living cells in a 3D environment whose neighboring cells are sensitive to respond to laser illumination and that of the lighting of the 3D ROI protected Need to become; • Analysis live cells in a 3D environment with markers targeted be bleached by laser illumination in 3D, e.g. FRET-experiments; • Analysis live cells in a 3D environment with markers targeted bleached by laser illumination and at the same time outside the ROI should be observed, e.g. FRAP and FLIP experiments in 3D; • Targeted Analysis of live cells in a 3D environment with markers and Pharmaceuticals, the manipulation-related changes due to laser illumination have, e.g. Activation of transmitters in 3D; • Targeted Analysis of living cells in a 3D environment with markings that manipulation-related color changes by laser illumination, e.g. paGFP, • Targeted Analysis of living cells in a very weak 3D environment Markings, e.g. an optimal balance of confocality against Require detection sensitivity. • Living cells in a 3D tissue association with varying multiple markers, e.g. CFP, GFP, YFP, DsRed, HcRed and similar • Living Cells in a 3D tissue association with markings that have function-dependent color changes, e.g. Ca + marker • Living Cells in a 3D Tissue Association with markers that are developmental Have color changes, e.g. transgenic animals with GFP • Living cells in a 3D tissue association with markings, the manipulation-related color changes by laser illumination have, e.g. paGFP, Kaede • Living cells in a 3D tissue association with very weak markings that favor confocality require the detection sensitivity. • Last point in combination with the previous ones.

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for the investigation of intracellular transport processes, in particular for illustration small motile structures, e.g. Proteins, high Speed (usually in the range of hundredths of a second) in particular for applications like FRAP with ROI bleaching

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims for the representation of molecular and other subcellular Interactions, especially the representation of very small structures at high speed, preferably using indirect Techniques such as FRET with ROI bleaching for resolution submolecular structures

Use of arrangements and / or methods according to at least one of the preceding claims fast signal transmission operations, in particular neurophysiological processes with high temporal resolution, since the ion-mediated activities are in the range of hundreds of play to less than thousandths of a second, especially at Investigations in the muscle or nervous system.