DE10162960A1 - Melanocyte culture medium, useful for growing melanocytes for transplantation in treatment of pigmentation disorders, comprises basal medium with specific supplements - Google Patents

Melanocyte culture medium, useful for growing melanocytes for transplantation in treatment of pigmentation disorders, comprises basal medium with specific supplements

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Abstract

A melanocyte culture medium (A), comprising: (a) basal medium for culture of primary human cells, containing not less than 0.6 mM calcium ions and supplemented with transferrin, albumin and glutamine; (b) 0.5-10 mM cyclic adenosine triphosphate (cAMP); (c) 0.5-50 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF); (d) 0.1-100 nM alpha-melanocyte stimulating hormone (aMSH); and (e) 0.1-100 nM endothelin-1 (E1), is new. An Independent claim is also included for a suspension of melanocytes in (A).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein für Melanozyten geeignetes und vorzugweise für Melanozyten selektives Kulturmedium. The present invention relates to a suitable for melanocytes and preferably for Melanocyte selective culture medium.

Hintergrund der ErfindungBackground of the Invention

Die Melanozyten sind Zellen, die für die Pigmentierung der Haut verantwortlich sind. Sie sind die Orte der Pigmentbildung und Lagerung. Störungen der Pigmentbildung und/oder Lagerung führen entweder zu einer Überpigmentierung beispielsweise in Form von Pigmentflecken, dem Cloasma, Muttermalen, Leberflecken und anderem, oder der Unterpigmentierung, was z. B. im Falle der Vitiligo oder den sogenannten "Altersflecken" zu einem gänzlichen Fehlen von Pigmenten und daher weißen Flecken auf der Haut führen kann. Beide Arten Pigmentierungsstörungen können kosmetisch unerwünscht sein. Melanocytes are cells that are responsible for skin pigmentation. she are the places of pigment formation and storage. Disorders of pigment formation and / or Storage either lead to overpigmentation, for example in the form of Pigment spots, the cloasma, birthmarks, liver spots and others, or the underpigmentation, what z. B. in the case of vitiligo or the so-called "age spots" to a complete Lack of pigments and therefore white spots on the skin can result. Both types Pigmentation disorders can be cosmetically undesirable.

Zur Behandlung von Altersflecken wurde in der Vergangenheit versucht, die umgebende Haut im Farbton an die Flecken anzupassen, also die Haut zu bleichen. Ebenso ist versucht worden, Überpigmentierungen durch Bleichen der betroffenen Hautpartien zu beseitigen. Das Bleichen ist zum einen ein für die gesunde Haut fragwürdiges, da potentiell schädigendes Verfahren. Zum anderen wird das gewünschte Ergebnis oft nicht in zufriedenstellendem Umfang erzielt. In the past, the surrounding skin has been tried to treat age spots to adapt in color to the spots, i.e. to bleach the skin. Attempts have also been made to Eliminate over-pigmentation by bleaching the affected skin areas. The On the one hand, bleaching is questionable for healthy skin because it is potentially damaging Method. Secondly, the desired result is often not satisfactory achieved.

In jüngerer Zeit mit der Entwicklung der modernen Biotechnologie ist man in schwerwiegenden Fällen der Vitiligo dazu übergegangen, die von der Störung befallenen Hautpartien abzutragen und durch gesunde, d. h. ausreichend pigmentierte Transplantate, vorzugsweise Eigentransplantate zu ersetzen. Hierzu werden dem Spender, bei Eigentransplantaten also dem Patienten, an einer normal pigmentierten Stelle Hautteile entnommen. Aus diesem Biopsat werden selektiv die Melanozyten gezüchtet und vermehrt. Stehen ausreichend Zellen zur Verfügung, werden an der betroffenen Stelle die oberen Hautschichten entfernt und eine die kultivierten Zellen enthaltende Lösung aufgetragen. Die gesunden Melanozyten wachsen an und können nach der Abheilung eine ausreichend pigmentierte Hautpartie bilden. Dies hat die kosmetisch gewünschte Wirkung, dass eine normale Pigmentierung erzielt und gleichzeitig das umgebende Gewebe weitgehend geschont werden kann. Recently, with the development of modern biotechnology, one is in serious cases of vitiligo have passed to the skin affected by the disorder remove and by healthy, d. H. adequately pigmented grafts, preferably To replace self-grafts. For this, the donor, in the case of self-transplants, the Patients, skin parts removed from a normally pigmented area. From this biopsy the melanocytes are selectively grown and multiplied. Are there enough cells available Available, the upper layers of skin are removed at the affected area and one solution containing cultured cells. The healthy melanocytes grow and can form a sufficiently pigmented area of skin after healing. This has the cosmetically desired effect that achieves normal pigmentation and at the same time the surrounding tissue can be largely spared.

Da Melanozyten nur einen untergeordneten Prozentsatz der vorhandenen Hautzellen darstellen, wird jedes Spenderbiopsat, aus dem die Melanozyten gezüchtet werden sollen, überwiegend andere Zelltypen, vor allem Fibroblasten und Keratinozyten, enthalten. Jedes für die Züchtung der Melanozyten verwendete Kulturmedium muss daher folgendes leisten: Ersten muss es auf die Melanozyten proliferationsfördernd wirken. Zweitens muss es die Differenzierung des gewünschten Zelltyps fördern oder zumindest stabilisieren. Da Proliferation und terminale Differenzierung oft entgegengesetzte und einander ausschließende Entwicklungsrichtungen sind, die eine Zelle einschlagen kann, sind Kompromißlösung zwischen beiden für Kulturmedien oft schwer zu finden. Because melanocytes only a minor percentage of the skin cells available each donor biopsy from which the melanocytes are to be grown, predominantly contain other cell types, especially fibroblasts and keratinocytes. Each for the Culturing the culture medium used in melanocytes must therefore do the following: first it must have a proliferation-promoting effect on the melanocytes. Second, it has to be Promote or at least stabilize differentiation of the desired cell type. Because proliferation and Terminal differentiation is often opposite and mutually exclusive Development directions that a cell can take are a compromise solution between the two Cultural media is often difficult to find.

Drittens sollte ein geeignetes Kulturmedium das Wachstum unerwünschter Zellen, die die Kultur verunreinigen wie beispielsweise Fibroblasten hemmen. Da gerade Fibroblasten die Mehrheit der Hautzellen darstellen und daher zu Melanozyten stets im Überschuß vorhanden sind und andererseits nur sehr geringe Anforderungen an ein Kulturmedium stellen, ist diese Anforderung schwer zu erfüllen und bedarf einer spezifischen Wachstumshemmung dieses Zelltyps. Third, a suitable culture medium should allow the growth of unwanted cells that affect the Contaminate culture such as inhibiting fibroblasts. Because fibroblasts Represent the majority of skin cells and are therefore always present in excess of melanocytes and, on the other hand, place very few demands on a culture medium, this is Difficult to meet the requirement and requires a specific growth inhibition Cell type.

Schließlich muss ein Kulturmedium von für die Transplantation bestimmten Zellen mit dieser Endbestimmung kompatibel sein. Das bedeutet, dass das Medium ausschließlich nach dem Arzneimittelgesetz zulässige und verträgliche sowie unter der "good medical practice" tolerierbare Bestandteile enthalten sollte und vorzugsweise enthält. Finally, a culture medium of cells intended for transplantation must be used with this Final destination be compatible. That means that the medium only after the Medicinal Products Act admissible and compatible as well as under "good medical practice" should contain and preferably contains tolerable constituents.

Für wissenschaftliche Melanozytenkulturen verwendete Medien erreichen die oben unter erstens bis drittens genannten Ziele üblicherweise durch Zusatz von Phorbolestern wie 12-ortho- Tetradecanoylphorbolacetat (TPA) oder Phorbolmyristinacetat. Alle Phorbolester sind Karzinogene, die unter anderem die Entstehung von Hautkrebs fördern. Eine Retransplantation von potentiell mit Karzinogenen behandelten Zellen verbietet sich jedoch von alleine. Andere, üblicherweise verwendete Bestandteile sind das mitogene Choleratoxin oder fötales Kälberserum (FCS), das ein starkes Antigen darstellt und aus diesem Grunde nicht geeignet ist. Media used for scientific melanocyte cultures reach the above under first to third mentioned goals usually by adding phorbol esters such as 12-ortho- Tetradecanoylphorbol acetate (TPA) or phorbol myristine acetate. All are phorbol esters Carcinogens, which among other things promote the development of skin cancer. A retransplant from cells that have been treated with carcinogens, however, do not work on their own. Other, Commonly used ingredients are mitogenic cholera toxin or fetal Calf serum (FCS), which is a strong antigen and is therefore unsuitable.

Kommerziell für medizinische Zwecke werden derzeit zwei Medien der Firma Promocell GmbH (Heidelberg, Deutschland) verwendet, von denen eines den oben genannten Phorbolester TPA sowie einen Rinderhypophysenextrakt enthält (Handelsname: Melanocyte Growth Medium, Kat.-Nr. C-24010). Das TPA-freie Medium der Firma Promocell (Handelsname: Melanocyte Growth Medium M2, Kat.-Nr. C-24300) weist demgegenüber den Nachteil einer zu geringen Vermehrungsrate der Melanozyten auf. Two media from Promocell are currently being commercialized for medical purposes GmbH (Heidelberg, Germany) used, one of which is the above Phorbol ester TPA and a bovine pituitary extract contains (trade name: Melanocyte Growth Medium, cat.no. C-24010). The TPA-free medium from Promocell (trade name: Melanocyte Growth Medium M2, Cat.No. C-24300) has the disadvantage of a too low rate of proliferation of melanocytes.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Melanozyten-Kulturmedium bereitzustellen, welches die oben genannten Kriterien erfüllt. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Melanozyten-Kulturmedium bereitzustellen, das den Anforderungen des AMG wie auch der GMP-Richtlinie genügt. It is therefore an object of the present invention to develop a melanocyte culture medium to provide, which meets the above criteria. It is still the job of present invention to provide a melanocyte culture medium which meets the requirements of the AMG and the GMP directive are sufficient.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Die genannten Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst durch ein Melanozyten-Kulturmedium, enthaltend ein für die Kultur von primären human Zellen geeignetes Basismedium, das einen Gehalt an Ca2+ von nicht unter 0,6 mM aufweist und mit Transferrin, Albumin und Glutamin supplementiert ist, wobei das Melanozyten-Kulturmedium zusätzlich enthält: 0,05 bis 10,0 mM cAMP, 0,5 bis 50 ng/ml bFGF, 0,1 bis 100 nM α-MSH und 0,1 bis 100 nM Endothelin-1 sowie wahlweise 0,1 bis 50 ng/ml EGF und/oder 0,1 bis 50 µg/ml Insulin. The stated objects are achieved according to the invention by a melanocyte culture medium containing a base medium suitable for the culture of primary human cells, which has a Ca 2+ content of not less than 0.6 mM and is supplemented with transferrin, albumin and glutamine, where the melanocyte culture medium additionally contains: 0.05 to 10.0 mM cAMP, 0.5 to 50 ng / ml bFGF, 0.1 to 100 nM α-MSH and 0.1 to 100 nM endothelin-1 and optionally 0, 1 to 50 ng / ml EGF and / or 0.1 to 50 µg / ml insulin.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines wie oben definierten Melanozyten-Kulturmediums zur Züchtung von Melanozyten. In a second aspect, the invention relates to the use of one as defined above Melanocyte culture medium for growing melanocytes.

Genaue Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

Wie oben beschrieben, betrifft die Erfindung ein spezielles Melanozyten-Kulturmedium. Dieses Melanozyten-Kulturmedium ist frei von jeglichen Karzinogenen. Darüber hinaus enthält es vorzugsweise ausschließlich nach dem AMG sowie nach den GMP-Richtlinien der EU zur Verwendung am Menschen zugelassene Substanzen. Die aus der Kultur gewonnenen Melanozyten können damit ohne Bedenken hinsichtlich des Kulturmediums als Transplantat verwendet werden. As described above, the invention relates to a specific melanocyte culture medium. This melanocyte culture medium is free of any carcinogens. Furthermore it preferably contains only according to the AMG and the GMP guidelines of the EU approved substances for human use. The ones derived from culture Melanocytes can thus be used as a graft without any concerns regarding the culture medium be used.

Das erfindungsgemäße Melanozyten-Kulturmedium enthält ein für die Kultur von primären human Zellen geeignetes, vorzugsweise reichhaltiges Basismedium, das einen Gehalt an Ca2+ von nicht unter 0,6 mM, vorzugsweise nicht unter 0,8 mM, aufweist und mit Transferrin, Albumin und Glutamin supplementiert ist. Das Melanozyten-Kulturmedium enthält zusätzlich: 0,05 bis 10,0 mM cAMP, sowie die Kombination aus 0,5 bis 50 ng/ml bFGF, 0,1 bis 100 nM α-MSH und 0,1 bis 100 nM Endothelin-1. Vorzugsweise enthält das Melanozyten-Kulturmedium 0,1 bis 1,0 mM cAMP, 1,0 bis 15,0 ng/ml bFGF, 5,0 bis 50 nM α- MSH und 5,0 bis 50 nM Endothelin-1 und noch stärker bevorzugt 0,4-0,6 mM cAMP, 2,5 bis 7,5 ng/ml bFGF, 5,0 bis 15,0 nM α-MSH und 5,0 bis 15,0 nM Endothelin-1. The melanocyte culture medium according to the invention contains a, preferably rich, base medium suitable for the culture of primary human cells, which has a Ca 2+ content of not less than 0.6 mM, preferably not less than 0.8 mM, and with transferrin, albumin and Glutamine is supplemented. The melanocyte culture medium additionally contains: 0.05 to 10.0 mM cAMP, and the combination of 0.5 to 50 ng / ml bFGF, 0.1 to 100 nM α-MSH and 0.1 to 100 nM endothelin-1 , Preferably, the melanocyte culture medium contains 0.1 to 1.0 mM cAMP, 1.0 to 15.0 ng / ml bFGF, 5.0 to 50 nM α-MSH and 5.0 to 50 nM endothelin-1 and even more preferably 0.4-0.6 mM cAMP, 2.5 to 7.5 ng / ml bFGF, 5.0 to 15.0 nM α-MSH and 5.0 to 15.0 nM endothelin-1.

Erfindungsgemäß kann grundsätzlich jedes bekannte und für die Kultivierung von primären human Zellen geeignete Basismedium verwendet werden. Bevorzugt handelt es sich um ein relativ reichhaltiges Medium (kein Mangelmedium). Das Basismedium kann jede geeignete Kohlenstoff- und/ oder Stickstoffquelle verwendet werden. Vorzugsweise werden Kohlenstoff und Stickstoffquellen verwendet, die den Vorgaben des AMG und der GMP-Richtlinie entsprechen. Das Medium weist in jedem Fall eine Ca2+-Gehalt von nicht unter 0,6 mM, vorzugsweise nicht unter 0,8 mM auf. Weiterhin ist das Medium mit geeigneten Mengen an Transferrin, Albumin und Glutamin supplementiert. Die Konzentrationen sind hier variabel und können vom Fachmann anhand von Routineversuchen bestimmt und optimiert werden. In principle, any known base medium suitable for the cultivation of primary human cells can be used according to the invention. It is preferably a relatively rich medium (no deficient medium). The base medium can be any suitable source of carbon and / or nitrogen. Carbon and nitrogen sources that comply with the requirements of the AMG and the GMP directive are preferably used. In any case, the medium has a Ca 2+ content of not less than 0.6 mM, preferably not less than 0.8 mM. Furthermore, the medium is supplemented with suitable amounts of transferrin, albumin and glutamine. The concentrations here are variable and can be determined and optimized by a person skilled in the art using routine tests.

Ein geeignetes und für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugtes Medium ist das PC-1 Basalmedium, das von der Firma Bio Whittaker, Verviers, BE (Kat.-Nr. 77232) ergänzt durch das entsprechende Supplement Bio Whittaker, Verviers, BE (Kat.-Nr. 344022). A suitable and preferred medium for the purposes of the present invention is that PC-1 basal medium supplemented by Bio Whittaker, Verviers, BE (Cat. No. 77232) through the corresponding supplement Bio Whittaker, Verviers, BE (cat. no. 344022).

Der erste erfindungswesentliche Zusatz des erfindungsgemäßen Melanozyten-Kulturmediums ist cAMP (cyclisches Adenosin-Monophosphat). Das cAMP wirkt als Proliferations- und Differenzierungsfaktor für Melanozyten. Gleichzeitig hemmt es das Wachstum von Fibroblasten, die für Melanozyten-Kulturen üblicherweise die problematische Verunreinigungen darstellen. Die cAMP-Konzentration liegt im allgemeinen zwischen 0,05 und 10,0 mM, vorzugsweise 0,1 bis 1,0 mM und am meisten bevorzugt 0,4 bis 0,6 mM, wobei eine Konzentration von 0,5 mM das Optimum für das Wachstum der Melanozyten zu sein scheint. The first addition of the invention essential to the invention Melanocyte culture medium is cAMP (cyclic adenosine monophosphate). The cAMP acts as a proliferation and differentiation factor for melanocytes. At the same time, it inhibits the growth of Fibroblasts, which are usually the most problematic for melanocyte cultures Represent impurities. The cAMP concentration is generally between 0.05 and 10.0 mM, preferably 0.1 to 1.0 mM and most preferably 0.4 to 0.6 mM, one Concentration of 0.5 mM to be the optimum for the growth of melanocytes seems.

Der zweite erfindungswesentliche Zusatz zum Melanozyten-Kulturmedium ist die Kombination aus bFGF (basic Fibroblast-like Growth Factor), α-MSH (α-Melanotropin oder auch Melanozyten stimulierendes Hormon (MSH) genannt) und Endothelin-1. Die Kombination aller drei Zusätze hemmt synergistisch das Fibroblastenwachstum und fördert, vermutlich ebenfalls in synergistischer Weise, das Melanozytenwachstum. Alle drei Proteine sind an sich bekannt und werden vorzugsweise in der humanen Form verwendet. The second essential addition to the melanocyte culture medium is the Combination of bFGF (basic fibroblast-like growth factor), α-MSH (α-melanotropin or also Melanocyte stimulating hormone (MSH) and Endothelin-1. The combination of all three additives synergistically inhibits and promotes fibroblast growth also in a synergistic way, melanocyte growth. All three proteins are on are known and are preferably used in human form.

Der bFGF ist erfindungsgemäß ein einer Konzentration von 0,5 bis 50 ng/ml, vorzugsweise 1,0 bis 15,0 ng/ml und am meisten bevorzugt 2,5 bis 7,5 ng/ml enthalten. Mit steigender Konzentration steigt auch die Zellausbeute an Melanozyten bis zu einem Sättigungswert an. Die Minimalmengen erscheinen insbesondere für die Kultivierung von Melanozyten aus Vitiligo-Patienten kritisch und sollten daher vorzugsweise nicht unterschritten werden. According to the invention, the bFGF is a concentration of 0.5 to 50 ng / ml, preferably 1.0 to 15.0 ng / ml and most preferably 2.5 to 7.5 ng / ml. With increasing Concentration also increases the cell yield on melanocytes up to a saturation value. The minimum amounts appear especially for the cultivation of melanocytes Vitiligo patients are critical and should therefore preferably not be undercut.

Das α-MSH ist erfindungsgemäß ein einer Konzentration von 0,1 bis 100 nM, vorzugsweise 5,0 bis 50,0 nM und am meisten bevorzugt 5,0 bis 15,0 nM enthalten. Die Konzentrationen an Endothelin-1 betragen erfindungsgemäß von 0,1 bis 100 nM, vorzugsweise 5,0 bis 50,0 nM und am meisten bevorzugt 5,0 bis 15,0 nM. Die angegebenen Konzentrationen sind jedoch insbesondere hinsichtlich der Obergrenzen nicht kritisch, jedoch aus Kostengründen zu bevorzugen. According to the invention, the α-MSH is preferably at a concentration of 0.1 to 100 nM 5.0 to 50.0 nM and most preferably contain 5.0 to 15.0 nM. The concentrations of endothelin-1 according to the invention are from 0.1 to 100 nM, preferably 5.0 to 50.0 nM and most preferably 5.0 to 15.0 nM. The concentrations given are however, not critical in particular with regard to the upper limits, but for reasons of cost to prefer.

Das erfindungsgemäße Melanozyten-Kulturmedium kann zusätzlich 0,1 bis 50 ng/ml EFG (Epidermal Growth Factor) und/oder 0,1 bis 50 µg/ml Insulin enthalten. Bei beiden Proteinen handelt es sich um generelle Wachstumsfaktoren für Hautzellen, die vorzugsweise in der humanen Form verwendet werden. Da EGF auch das Wachstum von Fibroblasten fördert, ist seine Konzentration möglichst im unteren angegebenen Bereich anzusiedeln, obwohl auch höhere Konzentrationen verwendet werden können. Dies kann allerdings zum Verlust der Selektivität für Melanozyten führen. Bei dem hier genannten. Vorzugsweise enthält das Melanozyten-Kulturmedium 0,1 bis 50 ng/ml EFG und 0,1 bis 50 µg/ml Insulin, noch stärker bevorzugt 1 bis 10 ng/ml EFG und 1 bis 10 µg/ml Insulin. The melanocyte culture medium according to the invention can additionally 0.1 to 50 ng / ml EFG (Epidermal Growth Factor) and / or 0.1 to 50 µg / ml insulin. By both Proteins are general growth factors for skin cells that are preferred in the human form can be used. Because EGF also the growth of fibroblasts promotes, its concentration is to be located in the lower range, if possible, although higher concentrations can also be used. However, this can lead to Loss of selectivity for melanocytes. With the mentioned here. Preferably contains the melanocyte culture medium 0.1 to 50 ng / ml EFG and 0.1 to 50 µg / ml insulin, even more preferably 1 to 10 ng / ml EFG and 1 to 10 µg / ml insulin.

In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des oben beschriebenen Melanozyten-Kulturmediums zur Züchtung von Melanozyten, insbesondere zur selektiven Züchtung. Die Kulturbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können anhand von Routineexperimenten optimiert werden. In a second aspect, the present invention relates to the use of the above described melanocyte culture medium for the cultivation of melanocytes, in particular for selective breeding. The culture conditions are known to the person skilled in the art and can be optimized based on routine experiments.

Die Züchtung der Melanozyten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums erfolgt ausgehend von Gewebebiopsien eines Spenders und vorzugsweise des zu behandelnden Patienten selbst. Vorzugsweise sind die erhaltenen Melanozyten zur Reimplantation in den Menschen, insbesondere den Spender bestimmt. Sind Spender und Empfänger identisch, ist eine Transplantatabstoßung nicht zu befürchten, sofern nicht das Kulturmedium antigene Substanzen enthält. Letzteres entspricht nicht dem AMG und ist daher nicht erwünscht. The melanocytes are grown using the medium according to the invention based on tissue biopsies from a donor and preferably the one to be treated Patients themselves. The melanocytes obtained are preferably for reimplantation in the People, especially the donor. Are the donor and recipient identical? There is no fear of graft rejection unless the culture medium is antigenic Contains substances. The latter does not correspond to the AMG and is therefore not desirable.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Mediums ist die selektive Inhibition des Fibroblastenwachstums bei gleichzeitig hohen Vermehrungsraten der Melanozyten. In entsprechenden Vergleichsversuchen mit den kommerziell von der Firma Promocell vertriebenen Melanozyten-Kulturmedien (TPA-Medium und TPA-freies Medium) hat die Anmelderin gefunden, dass das erfindungsgemäße Melanozyten-Kulturmedium den mit diesen genannten Medien erzielten Ergebnissen mindestens vergleichbare Ergebnisse liefert, wenn nicht bessere. Another advantage of the medium according to the invention is the selective inhibition of Fibroblast growth with high multiplication rates of the melanocytes. In Corresponding comparison tests with those commercially sold by Promocell The applicant has melanocyte culture media (TPA medium and TPA-free medium) found that the melanocyte culture medium according to the invention with those mentioned Results achieved by the media will at least provide comparable results if not better.

BeispieleExamples

Für Vergleichsversuche mit den oben genannten Medien der Firma Promocell wurde folgendes Medium hergestellt und eingesetzt. For comparative experiments with the above-mentioned media from Promocell manufactured and used the following medium.

Tabelle 1Table 1 Verwendetes MediumMedium used

PC-1 Basalmedium (Bio Whittaker, Verviers, BE; Kat.-Nr. 77232) Supplement: (Bio Whittaker, Verviers, BE; Kat.-Nr. 344022)
+0,5 mM cAMP
+5 ng/ml bFGF
+10 nM α-MSH
+10 nM Endothelin-1
+5 ng/ml EGF
+5 pg/ml Insulin (entspricht 0,125 I. E./ml) PC-1 basal medium (Bio Whittaker, Verviers, BE; Cat.No. 77232) Supplement: (Bio Whittaker, Verviers, BE; Cat.No. 344022)
+0.5 mM cAMP
+5 ng / ml bFGF
+10 nM α-MSH
+10 nM endothelin-1
+5 ng / ml EGF
+5 pg / ml insulin (corresponds to 0.125 IU / ml)

Zum direkten Vergleich wurden parallele Zellkulturen aus Biopsaten derselben Testpersonen mit den genannten Medien etabliert und nach gängigen Verfahren geführt. Im Ergebnis entspricht das Wachstum und die Morphlogie von etablierten Melanozyten-Kulturen mit dem erfindungsgemäßen Medium etwa denjenigen des TPA-Mediums. Allerdings bietet das erfindungsgemäße Medium Vorteile bei der Etablierung der Kultur, dahingehend, dass die Zellausbeute durchschnittlich 5 bis 10-mal höher liegt. Diese höhere Zellausbeute könnte am Wachstum von ebenfalls im Biopsat vorhandenen Keratinozyten liegen, die wiederum das Wachstum der Melanozyten fördern. Ein Wachstum von Keratinozyten wurde dagegen im TPA-Medium der Fa. Promocell nicht beobachtet. For direct comparison, parallel cell cultures were made from the same biopsies Test persons established with the media mentioned and managed according to common procedures. As a result corresponds to the growth and morphology of established melanocyte cultures the medium according to the invention, for example, that of the TPA medium. However, that offers Medium of the invention advantages in establishing the culture in that the Cell yield is 5 to 10 times higher on average. This higher cell yield could are due to the growth of keratinocytes also present in the biopsy, which in turn promote the growth of melanocytes. Growth of keratinocytes was opposed not observed in the Promocell TPA medium.

Das TPA-freie Medium der Fa. Promocell, das ebenfals als Vergleich genutzt wurde, weist vergleichbare Nachteile bezüglich der Primärkultur (Zellausbeuten) auf und liefert darüber hinaus wesentlich geringere Vermehrungsraten. So betrug in Vergleichsmessungen die Verdopplungsgeschwindigkeit mit dem TPA-freien Medium ca. 7 Tagen, während sie für das erfindungsgemäße Medium aus Tabelle 13 bis 5 Tage betrug. The TPA-free medium from Promocell, which was also used as a comparison, shows comparable disadvantages with regard to the primary culture (cell yields) and delivers about it in addition, significantly lower propagation rates. So in comparative measurements the Doubling rate with the TPA-free medium is approximately 7 days while it is for that medium according to the invention from Table 13 to 5 days.

Hinsichtlich Morphologie, Qualität der Zellen, Melaninsynthese oder maximaler Kulturdauer (d. h. Zahl der Passagen) entsprach oder übertraf das erfindungsgemäße Medium das jeweils bessere der beiden Vergleichsmedien in jedem Experiment. Regarding morphology, quality of cells, melanin synthesis or maximum Culture duration (i.e. number of passages) corresponded to or exceeded that of the medium according to the invention better of the two comparison media in each experiment.

Claims (11)

1. Melanozyten-Kulturmedium, enthaltend ein für die Kultur von primären human Zellen geeignetes Basismedium, das einen Gehalt an Ca2+ von nicht unter 0,6 mM aufweist und mit Transferrin, Albumin und Glutamin supplementiert ist, welches Melanozyten-Kulturmedium zusätzlich enthält: 0,05-10,0 mM cAMP, 0,5-50 ng/ml bFGF, 0,1-100 nM α-MSH und 0,1-100 nM Endothelin-1. 1. Melanocyte culture medium containing a base medium suitable for the culture of primary human cells, which has a Ca 2+ content of not less than 0.6 mM and is supplemented with transferrin, albumin and glutamine, which additionally contains melanocyte culture medium: 0.05-10.0 mM cAMP, 0.5-50 ng / ml bFGF, 0.1-100 nM α-MSH and 0.1-100 nM endothelin-1. 2. Melanozyten-Kulturmedium nach Anspruch 1, enthaltend: 0,1-1,0 mM cAMP, 1,0-15 ng/ml bFGF, 5,0-50 nM α-MSH und 5,0-50 nM Endothelin-1. 2. Melanocyte culture medium according to claim 1, containing: 0.1-1.0 mM cAMP, 1.0-15ng / ml bFGF, 5.0-50nM α-MSH and 5.0-50nM Endothelin-1. 3. Melanozyten-Kulturmedium nach Anspruch 1, enthaltend: 0,4-0,6 mM cAMP, 2,5-7,5 ng/ml bFGF, 5,0-15,0 nM α-MSH und 5,0-15,0 nM Endothelin-1. 3. Melanocyte culture medium according to claim 1, containing: 0.4-0.6 mM cAMP, 2.5-7.5 ng / ml bFGF, 5.0-15.0 nM α-MSH and 5.0-15.0 nM endothelin-1. 4. Melanozyten-Kulturmedium nach einem der vorstehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend 0,1-50 ng/ml EFG und/oder 0,1-50 µg/ml Insulin. 4. Melanocyte culture medium according to one of the preceding claims, additionally containing 0.1-50 ng / ml EFG and / or 0.1-50 µg / ml insulin. 5. Melanozyten-Kulturmedium nach einem der vorstehenden Ansprüche, zusätzlich enthaltend 0,1-50 ng/ml EFG und 0,1-50 µg/ml Insulin. 5. Melanocyte culture medium according to one of the preceding claims, additionally containing 0.1-50 ng / ml EFG and 0.1-50 µg / ml insulin. 6. Melanozyten-Kulturmedium nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zusätzlich enthaltend 1-10 ng/ml EFG und 1-10 µg/ml Insulin. 6. Melanocyte culture medium according to one of claims 1 to 3, additionally containing 1-10 ng / ml EFG and 1-10 µg / ml insulin. 7. Verwendung eines Melanozyten-Kulturmedium gemäß einem der vorstehenden Ansprüche zur Züchtung von Melanozyten. 7. Use of a melanocyte culture medium according to one of the preceding Claims for the cultivation of melanocytes. 8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Züchtung ausgehend von Gewebebiopsien eines Patienten erfolgt. 8. Use according to claim 7, wherein the cultivation is based on tissue biopsies of a patient. 9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, worin die Melanozyten zur Reimplantation in den Menschen bestimmt sind. 9. Use according to claim 7 or 8, wherein the melanocytes for reimplantation in are intended for people. 10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, worin das Wachstum von konkurrierenden Fibroblasten selektiv inhibiert wird. 10. Use according to any one of claims 7 to 10, wherein the growth of competing fibroblasts is selectively inhibited. 11. Melanozytensuspension in einem Medium gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6. 11. Melanocyte suspension in a medium according to one of claims 1 to 6.
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