DE10160666A1

DE10160666A1 - Procedure for the specific rapid detection of bacteria relevant to drinking water

Info

Publication number: DE10160666A1
Application number: DE10160666A
Authority: DE
Inventors: Claudia Beimfohr; Jiri Snaidr
Original assignee: Vermicon AG
Current assignee: Vermicon AG
Priority date: 2001-06-19
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2003-01-09

Abstract

The invention relates to a method for detecting bacteria in drinking water and surface water, especially a method for simultaneous specific detection of bacteria from the Legionella species and the Legionella pneumophila species by in situ-hybridisation. The invention also relates to a method for specific detection of faecal streptococci by in situ-hybridisation and a method for simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the Escherichia coli species, in addition to corresponding oligonucleotide probes and kits enabling said inventive method to be carried out.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien in Trink- und Oberflächenwasser, insbesondere ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies Legionella pneumophila durch in situ-Hybridisierung sowie ein Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken mittels in situ- Hybridisierung sowie ein Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli sowie entsprechende Oligonukleotidsonden und Kits, mit denen die erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden können. The invention relates to a method for the detection of bacteria in drinking and Surface water, in particular a method for the simultaneous specific detection of bacteria the genus Legionella and the species Legionella pneumophila by in situ hybridization and a method for the specific detection of faecal streptococci using in situ Hybridization and a method for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli and corresponding Oligonucleotide probes and kits with which the method according to the invention is carried out can be.

Legionellen sind gram-negative, nicht sporenbildende stäbchenförmige Bakterien einer Länge von 0,5-20 µM und einem Durchmesser von 0,3-0,9 µm. Sie sind motil aufgrund ihrer polaren Begeißelung mit ein bis drei Flagellen. Legionellen sind ubiquitäre Bewohner feuchter Böden sowie aller nicht-marinen aquatischen Habitate. Ideale Bedingungen für ihre Vermehrung bestehen bei Temperaturen zwischen 25°C und 55°C. Folglich finden sie sich auch in vom Menschen geschaffenen entsprechenden Lebensräumen, wie z. B. Warm- und Kaltwasseranlagen, Kühltürmen von Klimaanlagen und Wasserverdunstern. Als intrazelluläre Parasiten von Amöben und Ciliaten können sie auch ungünstige Lebensbedingungen wie z. B. extreme Temperaturen und Chlorung von Wasser überleben. Legionella are gram-negative, non-spore-forming rod-shaped bacteria of one length of 0.5-20 µM and a diameter of 0.3-0.9 µm. They are motile because of their polar flagellation with one to three flagella. Legionella are ubiquitous moist soils and all non-marine aquatic habitats. Ideal conditions for your Propagation occurs at temperatures between 25 ° C and 55 ° C. So they find each other also in appropriate human-made habitats, such as. B. Warm and Cold water systems, cooling towers of air conditioning systems and water evaporators. As intracellular Parasites from amoebas and ciliates can also make them difficult living conditions such. B. extreme temperatures and chlorination of water survive.

Legionellen sind Krankheitserreger; sie verursachen beim Menschen eine akute bakterielle Pneumonie mit fakultativ letalem Verlauf, die allgemein unter dem Namen "Legionärskrankheit" bekannt ist. Dieser Name stammt von der Untersuchung einer auffälligen Häufung von Pneumoniefällen (189 Erkrankungen mit 29 Todesfällen) unter den etwa 3000 Delegierten des jährlichen Treffens der "Pennsylvania Division of the American Legion" im Juli 1976. Die Untersuchung führte zur Isolierung eines bis dahin unbekannten Bakteriums, L. pneumophila (McDade et al., 1977. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N. Engl. J. Med. 297(22): 1197-203), das einer neuen Familie, den Legionellaceae, zugeordnet wurde (Brenner, D. J. 1979, Speciation in Yersinia, S. 33-43. In: Carter, P.B., Lafleur, L. und Toma, S. (Hrsg.), Contributions to microbiology and immunology, Vol. 5. Karger, Basel, Switzerland). Als weitere Form der durch Legionellen ausgelösten Erkrankung ist inzwischen das sogenannte Pontiac Fieber bekannt, welches durch grippeähnliche Symptome gekennzeichnet und nicht mit einer Pneumonie verbunden ist. Die Gründe dafür, dass Patienten die eine oder andere Erkrankungsform entwickeln, sind nicht bekannt. Legionella are pathogens; they cause an acute bacterial in humans Pneumonia with an optionally lethal course, commonly known as "Legionnaires' disease" is known. This name comes from the investigation of a conspicuous cluster of pneumonia cases (189 diseases with 29 deaths) among the approximately 3000 Delegates to the annual meeting of the Pennsylvania Division of the American Legion at July 1976. The investigation led to the isolation of a previously unknown bacterium, L. pneumophila (McDade et al., 1977. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. N. Engl. J. Med. 297 (22): 1197-203), the a new family, the Legionellaceae, was assigned (Brenner, D.J. 1979, Speciation in Yersinia, pp. 33-43. In: Carter, P.B., Lafleur, L. and Toma, S. (ed.), Contributions to microbiology and immunology, Vol. 5. Karger, Basel, Switzerland). As another form of The disease caused by Legionella is now the so-called Pontiac fever known, which is characterized by flu-like symptoms and not with a Pneumonia is connected. The reasons that patients have one or the other Developing disease forms are not known.

Die Lebensbedrohlichkeit einer durch Legionellen ausgelösten Erkrankung sowie die Fähigkeit der Legionellen, auch unter ungünstigen Lebensbedingungen lange Zeit zu überdauern, belegen die Notwendigkeit eines schnellen und zuverlässigen Nachweisverfahrens. The life threatening nature of an illness caused by Legionella as well as the Ability of Legionella to survive for a long time even under unfavorable living conditions outlast prove the need for a quick and reliable Detection method.

Der traditionelle Nachweis von Legionellen mittels Kultivierung ist ein äußerst aufwendiges Verfahren, welches erst durch mehrere aufeinanderfolgende Kultivierungsschritte auf verschiedenen Medien innerhalb von sieben bis 14 Tagen zu einem Ergebnis führt. The traditional detection of Legionella using cultivation is extremely complex Process which only occurs through several successive cultivation steps results in different media within seven to 14 days.

Trotz des hohen damit verbundenen Aufwandes ist die Kultivierung bis heute das Mittel der Wahl zum Nachweis von Legionellen, da verschiedene alternative Verfahren die in sie gesetzten Erwartungen nicht erfüllen konnten. Despite the high effort involved, cultivation is still the means of Choice for the detection of Legionella, as different alternative methods are used in it could not meet expectations.

So ist die Analyse verdächtiger Proben anhand biochemischer Parameter, wie der Ermittlung von Quinon-Profilen mittels HPLC oder der Fettsäurezusammensetzung mittels GLC-MS (z. B. Ehret et al., 1987, Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. [A], 266 (1-2), 261-75) für die Routine-Diagnose aufgrund des sehr hohen Geräte- und Zeitaufwandes ungeeignet. Außerdem stellt die sachgerechte Durchführung dieser Analysen höchste Anforderungen an die Qualifikation des ausführenden Personals. This is how the analysis of suspicious samples is based on biochemical parameters, such as the determination of Quinon profiles using HPLC or the fatty acid composition using GLC-MS (e.g. Ehret et al., 1987, Zentralbl. bacteriol. microbiol. hyg. [A], 266 (1-2), 261-75) for the Routine diagnosis unsuitable due to the very high expenditure of equipment and time. In addition, the proper execution of these analyzes places the highest demands on the Qualification of the executing staff.

Die direkte Färbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern (DFA; direct fluorescent antibody staining) liefert Ergebnisse zwar bereits innerhalb weniger Stunden, die Methode ist aber weder ausreichend sensitiv noch ausreichend spezifisch. Nur zwischen 25% und 70% der mittels Kultivierung positiv getesteten Proben waren auch mittels DFA positiv (Zuravleff, J.L., V.L. Yu, J.L. Shonnard, 1983. Diagnosis of Legionnaires' disease and update of laboratory methods with new emphasis on isolation by culture. JAMA, Vol. 250, S. 1981-1985; Buesching, W. J., R.A. Brust, L. W. Ayers, 1983. Enhanced primary isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens by low pH treatment. J. Clin. Microbiol., Vol. 17, S. 153-1155; Edelstein, P.H., 1987. The laboratory diagnosis of Legionnaires' disease. Sem. Respir. Infect., Vol. 2, S. 235-241.). Darüber hinaus sind zahlreiche Spezies bekannt, die durch Legionella DFA-Konjugate fälschlicherweise ebenfalls angefärbt werden, z. B. Pseudornonas fluorescens, P. aeruginosa und P. putida sowie verschiedene Bacteroides Species. Dies führt zwangsläufig immer wieder zu falsch positiven Ergebnissen. Außerdem problematisch bei diesem Testverfahren, ebenso wie bei allen anderen auf Antikörperbindung beruhenden Verfahren (z. B. RIA, ELISA, IFA), ist außerdem die immense Vielzahl unterschiedlicher Legionella-Serotypen. Die große Zahl der zur Detektion aller Serotypen somit erforderlichen Antisera ist kaum mehr zu handhaben, andererseits ist, bei Beschränkung auf einige wenige Antisera, die Aussagekraft eines negativen Testergebnisses unvertretbar gering. Direct staining with fluorescence-labeled antibodies (DFA; direct fluorescent antibody staining) delivers results within a few hours, the method is but neither sufficiently sensitive nor sufficiently specific. Only between 25% and 70% of the samples tested positive by cultivation were also positive by DFA (Zuravleff, J.L., V.L. Yu, J.L. Shonnard, 1983. Diagnosis of Legionnaires' disease and update of laboratory methods with new emphasis on isolation by culture. JAMA, Vol. 250, p. 1981-1985; Buesching, W. J., R.A. Chest, L. W. Ayers, 1983. Enhanced primary isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens by low pH treatment. J. Clin. Microbiol. Vol. 17, pp. 153-1155; Edelstein, P.H., 1987. The laboratory diagnosis of Legionnaires' disease. Sem. Respir. Infect., Vol. 2, pp. 235-241.). In addition, there are numerous species known to be incorrectly stained by Legionella DFA conjugates, z. B. Pseudornonas fluorescens, P. aeruginosa and P. putida as well as various Bacteroides Species. This always leads to false positive results. Moreover problematic with this test procedure, as with all others for antibody binding based methods (e.g. RIA, ELISA, IFA), is also the immense variety different Legionella serotypes. The large number used to detect all serotypes Antisera thus required is hardly manageable anymore, on the other hand it is limited on a few antisera, the validity of a negative test result is unacceptable low.

Auf Escherichia coli und coliforme Bakterien, als sogenannte Markerorganismen, wird bei zahlreichen mikrobiologischen Analysen untersucht. Während beispielsweise bei der Untersuchung von Lebensmitteln, Trink- und Oberflächenwassern E. coli, als sogenannter Indexorganismus, eine potentielle Gesundheitsgefährdung anzeigt, gelten coliforme Bakterien als Indikatoren für eine generell unzureichende Hygiene. Die Untersuchung mikrobiologischer Proben auf Index- und Indikatororganismen ermöglicht es auf die aufwendige Untersuchung derselben Proben auf eine Vielzahl von Krankheitserregern zu verzichten, da die Anwesenheit dieser Bakterien wird allgemein ein Hinweis auf fäkale Verunreinigungen ist. Dadurch ist eine mögliche Anwesenheit anderer pathogener Keime sehr wahrscheinlich. Escherichia coli and coliform bacteria, known as marker organisms, are used in numerous microbiological analyzes. While, for example, at Analysis of food, drinking and surface water E. coli, so-called Index organism, indicating a potential health hazard, apply coliform bacteria as indicators of generally inadequate hygiene. The investigation microbiological samples on index and indicator organisms allow for the elaborate Examination of the same samples to avoid a large number of pathogens, because the presence of these bacteria generally becomes an indication of fecal contamination is. This means that a possible presence of other pathogenic germs is very likely.

Die coliformen Bakterien stellen eine äußerst heterogene Bakteriengruppe dar. Zur Gruppe der Coliformen gehören die Genera Escherichia, Enterobacter, Klebstella und Citrobacter. Die Zugehörigkeit von Bakterien zu dieser Gruppe ist somit nicht durch taxonomische Merkmale definiert, sondern durch das Verhalten der Bakterien in entsprechenden Nachweisverfahren. Insofern werden den Coliformen alle gram-negativen, aeroben, fakultativ anaeroben, Stäbchen zugeordnet, welche Laktose unter Gas- und Säurebildung innerhalb von 48 Stunden bei Temperaturen zwischen 30°C und 37°C fermentieren. Coliforme, die unter höheren Temperaturen, nämlich bei 44°C bis 45,5°C Laktose zu fermentieren vermögen, werden auch als Fäkal-Coliforme, thermotrophe Coliforme oder präsumtive E. coli bezeichnet. The coliform bacteria represent an extremely heterogeneous group of bacteria. About the group The coliforms include the Genera Escherichia, Enterobacter, Klebstella and Citrobacter. The affiliation of bacteria to this group is therefore not taxonomic Characteristics defined, but by the behavior of the bacteria in corresponding Detection methods. In this respect, the coliforms are all gram-negative, aerobic, optional anaerobic, assigned to sticks, which lactose with gas and acid formation within Ferment for 48 hours at temperatures between 30 ° C and 37 ° C. Coliforms under higher temperatures, namely at 44 ° C to 45.5 ° C are able to ferment lactose, are also known as fecal coliforms, thermotrophic coliforms or presumptive E. coli designated.

Während der Sinn des Coliformen-Nachweises inzwischen durchaus umstritten ist (Means, E. G., Olson, B.H., 1981. Coliforms inhibition by bacteriocin-like substances in drinking water distribution systems. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 42, S. 506-512; Burlingame, G.A.; McElhaney, J.; Pipes, W.O., 1984. Bacterial interference with coliform colony sheen production on membrane filters. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 47, S. 56-60; Schmidt- Lorenz et al., 1988, Kritische Überlegungen zum Aussagewert von E. coli, Coliformen und Enterobacteriaceen in Lebensmitteln, Arch. Lebensmittelhyg. 39, 3-15.) steht der Wert des Nachweises von E. coli als Markerorganismus außer Frage. While the sense of coliform detection is now quite controversial (Means, E. G., Olson, B.H., 1981. Coliforms inhibition by bacteriocin-like substances in drinking water distribution systems. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 42, pp. 506-512; Burlingame, G.A .; McElhaney, J .; Pipes, W.O., 1984. Bacterial interference with coliform colony sheen production on membrane filters. Appl. Environ. Microbiol., Vol. 47, pp. 56-60; Schmidt Lorenz et al., 1988, Critical Considerations on the Significance of E. coli, Coliforms and Enterobacteriaceen in Lebensmittel, Arch. Lebensmittelhyg. 39, 3-15.) Stands the value of Detection of E. coli as a marker organism is beyond question.

Darüber hinaus dient E. coli keineswegs nur als Indexbakterium in mikrobiologischen Analysen, sondern es sind eine Reihe pathogener Stämme dieses Organismus bekannt. Diese enterovirulenten Stämme werden in verschieden Subgruppen (Enterotoxinbildner, Enteropathogene, Enterohämorrhagische, Enteroinvasive, Enteroadhärente E. coli) eingeteilt. Alle Bakterien dieser Subgruppen lösen Durchfallerkrankungen unterschiedlicher Schweregrade bis hin zur Lebensbedrohlichkeit aus. In addition, E. coli is by no means only used as an index bacterium in microbiological Analyzes, but there are a number of pathogenic strains of this organism known. This enterovirulent strains are divided into different subgroups (enterotoxin generators, Enteropathogenic, enterohemorrhagic, enteroinvasive, enteroadherent E. coli). All bacteria in these subgroups solve diarrheal diseases in different ways Severity levels up to life threatening.

Standardmäßig erfolgt der Nachweis von E. coli und Coliformen mittels Kultivierung, die durch mehrere aufeinanderfolgende Kultivierungsschritte auf verschiedenen Medien innerhalb von zwei bis vier Tagen zu einem Ergebnis führt. Als alternatives Kultivierungsverfahren bringt die Kultivierung auf Fluorocult LMX-Bouillon bereits nach 30 Stunden ein Ergebnis. Auch das Membranfilterverfahren zum Nachweis von E. coli (der Nachweis von Coliformen ist so nicht möglich) benötigt immer noch 22 bis 32 Stunden bis zum Ergebnis. Hierbei kommt es jedoch nicht selten zu falsch positiven Ergebnissen, da gerade bei Frischfleisch nicht selten Indol-positive Klebstella oxytoca und Providencia-Arten vorkommen. The detection of E. coli and coliforms is carried out by means of cultivation as standard through several successive cultivation steps on different media within leads to a result of two to four days. As an alternative cultivation method the cultivation on Fluorocult LMX broth gives a result after only 30 hours. Also the membrane filter method for the detection of E. coli (the detection of coliforms is not possible that way) still needs 22 to 32 hours to get the result. in this connection However, it is not uncommon for false positive results to occur, especially with fresh meat it is not uncommon for indole-positive Klebstella oxytoca and Providencia species to occur.

Als weitere Indikatoren für Fäkalkontaminationen von Trink- und Oberflächenwasser gelten die sogenannten Fäkalstreptokokken. Ähnlich wie die Coliformen sind auch diese eine uneinheitliche Gruppe. Fäkalstreptokokken werden welche phylogenetisch den Gattungen Streptococcus und Enterococcus zugeordnet. Es handelt sich um Gram-positive Bakterien, welche typischerweise Diplokokken oder kurze Ketten bilden, und im Intestinaltrakt von Warmblütern verbreitet sind. Other indicators for faecal contamination of drinking and surface water are considered the so-called faecal streptococci. Similar to the coliforms, these are also one inconsistent group. Fecal streptococci become phylogenetic to the genera Streptococcus and Enterococcus assigned. It's Gram-positive bacteria, which typically form diplococci or short chains, and in the intestinal tract of Warm-blooded animals are common.

In der im Jahre 2001 gültigen Deutschen Verordnung für Trinkwasser und Wasser für Lebensmittelbetriebe ist auch ein Grenzwert für Fäkalstreptokokken festgelegt. In 100 ml Trinkwasser dürfen keine Fäkalstreptokokken nachweisbar sein, andernfalls hat das untersuchte Wasser keine Trinkwasserqualität mehr. In the German regulation for drinking water and water for Food establishments also set a limit for faecal streptococci. In 100 ml No faecal streptococci can be found in drinking water, otherwise it has examined water no longer drinking water quality.

Die in der Trinkwasserverordnung empfohlenen Nachweisverfahren basieren auf direkter Kultivierung der Wasserprobe oder auf Membranfiltration und anschließendem Einbringen des Filters in 50 ml Azid-Glucose-Bouillon. Die Kultivierung soll für mindestens 24 h, bei negativem Ergebnis für 48 h, bei 36°C erfolgen. Ist auch nach 48 h keine Trübung oder Sedimentbildung der Bouillon feststellbar, gilt die Abwesenheit von Fäkalstreptokokken in der untersuchten Probe als belegt. Im Falle einer Trübung oder Sedimentbildung erfolgt ein Ausstrich der Kultur auf Enterokokken-Selektivagar nach Slanetz-Barthley und die erneute Inkubation bei 36°C für 24 h. Im Falle der Bildung rotbrauner bzw. rosafarbener Kolonien werden diese genauer untersucht. Nach Überführung in ein geeignetes Flüssigmedium und Kultivierung für 24 h bei 36°C, gelten Fäkalstreptokokken als nachgewiesen, wenn eine Vermehrung in Nährbouillon bei pH 9,6 erfolgt und Vermehrung in 6,5% NaCl-Bouillon möglich ist sowie bei Äsculinabbau. Der Äsculinabbau wird durch Zugabe von frisch hergestellter 7%iger wässriger Lösung von Eisen(II)-chlorid zur Äsculinbouillon geprüft. Bei Abbau entsteht eine braun-schwarze Farbe. Häufig wird zusätzlich eine Gramfärbung zur Unterscheidung der Bakterien von Gram-negativen Kokken durchgeführt sowie ein Katalasetest zur Unterscheidung von Staphylokokken durchgeführt. Fäkalstreptokokken reagieren Gram-positiv und Katalase-negativ. Der traditionelle Nachweis stellt sich somit als langwieriges (48-100 h) und im Verdachtfall überaus aufwendiges Verfahren dar. The detection methods recommended in the Drinking Water Ordinance are based on more direct ones Cultivation of the water sample or on membrane filtration and subsequent introduction of the filter in 50 ml azide-glucose broth. The cultivation should last for at least 24 hours negative result for 48 h at 36 ° C. Even after 48 hours there is no clouding or Sedimentation of the broth is noticeable, the absence of faecal streptococci in of the sample examined as proven. In the event of cloudiness or sediment formation, a Streaking of culture on enterococcal selective agar according to Slanetz-Barthley and the renewed Incubation at 36 ° C for 24 h. In the case of the formation of red-brown or pink colonies these are examined in more detail. After transfer to a suitable liquid medium and Cultivation for 24 h at 36 ° C, faecal streptococci are considered to be proven if one Increase in nutrient broth at pH 9.6 and increase in 6.5% NaCl broth is possible as well as with asculin degradation. The asculin degradation is made fresh by adding prepared 7% aqueous solution of iron (II) chloride to the asculin broth tested. at Degradation creates a brown-black color. Often a Gram stain is also used Differentiation of the bacteria from gram-negative cocci is carried out as well Catalase test to differentiate staphylococci. faecal streptococci react gram-positive and catalase-negative. The traditional proof thus turns out to be lengthy (48-100 h) and, if suspected, extremely complex.

Als logische Konsequenz aus den Schwierigkeiten, welche die oben genannten Verfahren beim Nachweis von Legionellen, E. coli und Coliformen sowie Fäkalstreptokokken haben, bieten sich daher Nachweisverfahren auf Nukleinsäurebasis an. As a logical consequence of the difficulties encountered by the above procedures in the detection of Legionella, E. coli and coliforms as well as faecal streptococci, detection methods based on nucleic acids are therefore suitable.

Bei der PCR, der Polymerase-Kettenreaktion wird mit spezifischen Primern ein charakteristisches Stück des jeweiligen Bakteriengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z. B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose- Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Dies ist insbesondere bei der Untersuchung von Proben auf ubiquitäre Keime wie E. coli und Coliforme problematisch. Da die PCR-Reaktion auch bei Anwesenheit eines toten Bakteriums oder nackter DNA positiv ausfällt, kommt es hier häufig zu falsch positiven Ergebnissen. Eine Weiterführung dieser Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Bakterien und der Menge an amplifizierter DNA herzustellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität, leichten Anwendbarkeit und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontaminationen und damit falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden. In PCR, the polymerase chain reaction is carried out using specific primers characteristic piece of the respective bacterial genome amplified. If the primer finds his Target location, so there is a million-fold increase in a piece of the genetic material. In the subsequent analysis, e.g. B. Agarose separating DNA fragments A qualitative assessment can take place. In the simplest case, this leads to the Statement that the target sites for the primers used are present in the sample examined were. No further statements are possible; these destinations can be used by both living bacterium, as well as from a dead bacterium or from naked DNA. A differentiation is not possible here. This is especially true when examining Samples for ubiquitous germs such as E. coli and coliforms are problematic. Because the PCR reaction even if a dead bacterium or naked DNA is present, it happens here often to false positive results. A continuation of this technology is the quantitative PCR that tries to correlate the amount of existing bacteria and the amount of amplified DNA. Advantages of PCR are in their high specificity, easy to use and in little time. The main disadvantages are their high susceptibility to contamination and therefore incorrect positive results as well as the already mentioned lack of possibility between living and to distinguish dead cells or naked DNA.

Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität der molekularbiologischen Methoden wie der PCR mit der Möglichkeit der Bakterienvisualisierung, wie sie die Antikörper-Methoden ermöglichen, zu verbinden, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH; Amann, R.L, W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, -gattungen oder -gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert werden. A unique approach, the specificity of molecular biological methods such as PCR with the possibility of bacterial visualization as the antibody methods enable to connect offers the method of fluorescence in situ hybridization (FISH; Amann, R.L, W. Ludwig and K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, p. 143-169). Bacterial species, genera or groups can be identified in a highly specific manner and be visualized.

Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und funktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271). Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Im Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht. The FISH technique is based on the fact that there are certain molecules in bacterial cells exist, which mutates only slightly due to their vital function in the course of evolution were: The 16S and the 23S ribosomal ribonucleic acid (rRNA). Both are components the ribosomes, the sites of protein biosynthesis, and due to their ubiquitous nature Distribution, their size, and their structural and functional constancy as specific Markers are used (Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, pp. 221-271). Based on a comparative sequence analysis, phylogenetic relationships based solely on this data. To do this, this sequence data must be in a Alignment can be brought. In the alignment, which is based on knowledge of the The secondary structure and tertiary structure of these macromolecules supports the homologous positions the ribosomal nucleic acids brought into harmony.

Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszuführen, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen. Based on this data, phylogenetic calculations can be carried out. The use of the latest computer technology makes it possible, even large-scale ones Execute calculations quickly and effectively, as well as large databases, which the Alignment sequences of the 16S rRNA and 23S rRNA include. By the Quick access to this data material allows newly obtained sequences in a short time be analyzed phylogenetically. These rRNA databases can be used to construct species- and genus-specific gene probes. Here all are available rRNA sequences compared with each other and probes for specific sequence sites designed to specifically capture a bacterial species, genus or group.

Bei der FISH (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i. d. R. kleine, 16-20 Basen lange, einzelsträngige Desoxyribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden. In the FISH (fluorescence in-situ hybridization) technique, these gene probes are used as well a particular region on the target ribosomal sequence are complementary to the cell funneled. The gene probes are i. d. R. small, 16-20 bases long, single-stranded Deoxyribonucleic acid pieces and are directed against a target region, which is typical for a Is a type or group of bacteria. Find the fluorescence-labeled gene probe in one Bacterial cell binds to its target sequence, and the cells can use it because of their Fluorescence can be detected in the fluorescence microscope.

Die FISH-Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgeführt, da bei der Auswertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden. Hierin liegt allerdings einer der Nachteile der klassischen FISH- Analyse: da auf einem Objektträger naturgemäß nur relative kleine Volumina analysiert werden können, kann die Sensitivität der Methode unbefriedigend und für eine verlässliche Analyse nicht ausreichend sein. Mit der vorliegenden Erfindung werden daher die Vorteile der klassischen FISH-Analyse mit denen der Kultivierung verknüpft. Durch einen vergleichsweise kurzen Kultivierungsschritt wird sichergestellt, dass die nachzuweisenden Bakterien in ausreichender Zahl vorliegen, bevor der Nachweis der Bakterien mittels spezifischer FISH durchgeführt wird. The FISH analysis is always carried out on a slide since the Evaluation visualized the bacteria by irradiation with a high-energy light, so be made visible. However, this is one of the disadvantages of classic FISH Analysis: since only relatively small volumes are naturally analyzed on a slide The sensitivity of the method can be unsatisfactory and reliable Analysis may not be sufficient. With the present invention, therefore, the advantages the classic FISH analysis linked to those of cultivation. Through a comparatively short cultivation step ensures that those to be detected Bacteria are available in sufficient numbers before the detection of the bacteria specific FISH is carried out.

Die Durchführung der in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella sowie der Spezies L. pneumophila oder zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken oder zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli umfasst somit die folgenden Schritte:

- Kultivierung der in der untersuchten Probe enthaltenen Bakterien
- Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien
- Inkubation der fixierten Bakterien mit Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
- Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle und
- Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.

The implementation of the methods described in the present application for simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and of the species L. pneumophila or for the specific detection of faecal streptococci or for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species E. coli thus comprises the following steps :

- Cultivation of the bacteria contained in the sample examined
- Fixation of the bacteria contained in the sample
Incubation of the fixed bacteria with nucleic acid probe molecules in order to bring about hybridization,
- Removing or washing off the non-hybridized nucleic acid probe molecules and
- Detection of the bacteria hybridized with the nucleic acid probe molecules.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Kultivieren" die Vermehrung der in der Probe enthaltenen Bakterien in einem geeigneten Kultivierungsmedium verstanden. Die hierzu geeigneten Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. In the context of the present invention, the "cultivation" is the increase in the Sample contained bacteria understood in a suitable cultivation medium. The methods suitable for this are well known to the person skilled in the art.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung, enzymatische Behandlungen oder ähnliches. In the context of the present invention, "fixing" the bacteria is a treatment understood with which the bacterial envelope is made permeable to nucleic acid probes. to Fixation is usually used in ethanol. Can the cell wall with these measures are not penetrated by the nucleic acid probes, the skilled worker is sufficient other measures known to lead to the same result. These include, for example Methanol, mixtures of alcohols, a low-percentage paraformaldehyde solution or a dilute formaldehyde solution, enzymatic treatments or the like.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die "Hybridisierung" die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden inkubiert. Diese Nukleinsäuresonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die der Nukleinsäuresonde entsprechenden Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen. Within the scope of the present invention, the fixed ones are used for the "hybridization" Bacteria incubated with fluorescence-labeled nucleic acid probes. This Nucleic acid probes consisting of an oligonucleotide and a label attached to it can then penetrate the cell envelope and align itself with that corresponding to the nucleic acid probe Bind target sequence inside the cell. The bond is as the formation of hydrogen bonds to understand between complementary pieces of nucleic acid.

Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500-100.000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1.000-50.000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen. The nucleic acid probe can be complementary to a chromosomal or episomal DNA, but also to an mRNA or rRNA of the microorganism to be detected. It is advantageous to choose a nucleic acid probe that is complementary to an area is present in the microorganism to be detected in a copy number of more than 1. The sequence to be detected is preferably 500-100,000 times per cell, particularly preferably 1,000-50,000 times. For this reason, the rRNA is preferred as the target site used because the ribosomes in the cell as sites of protein biosynthesis in thousands of times every active cell.

Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA- Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide, bevorzugt zwischen 12 und 500, bevorzugter zwischen 12 und 200, besonders bevorzugt zwischen 12 und 50 und zwischen 15 und 40, und am meisten bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide umfassen wird. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz, kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakteriengruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuremolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Wie im folgenden noch erläutert, bedeuten stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung bspw. 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer. The nucleic acid probe in the sense of the invention can be a DNA or RNA Act probe that is usually between 12 and 1000 nucleotides, preferably between 12 and 500, more preferably between 12 and 200, particularly preferably between 12 and 50 and between 15 and 40, and most preferably between 17 and 25 nucleotides becomes. The selection of the nucleic acid probes is based on the criteria of whether one complementary sequence is present in the microorganism to be detected. Through this Choosing a defined sequence can result in a bacterial species, a bacterial genus or an entire group of bacteria can be detected. Complementarity should be with a probe of 15 nucleotides can be given over 100% of the sequence. For oligonucleotides with more than 15 One or more mismatch sites are allowed for nucleotides. By complying with stringent hybridization conditions ensure that the nucleic acid molecule actually hybridized with the target sequence. As explained below, mean stringent conditions in the sense of the invention, for example. 20-80% formamide in Hybridization buffer.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren haben die erfindungsgemäßen Nukleinsondenmoleküle die folgenden Längen und Sequenzen. Within the scope of the methods according to the invention, the inventive methods have Nucleic probe molecules the following lengths and sequences.

Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila:

Method for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila:

Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken:

Procedure for the specific detection of faecal streptococci:

Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli:

Method for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli:

Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotidsequenzen, die trotz der Abweichungen in der Sequenz und/oder Länge eine spezifische Hybridisierung mit Ziel-Nukleinsäuresequenzen des jeweiligen Bakteriums zeigen und somit für den Einsatz in einem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind. Hierunter fallen insbesondere

a) Nukleinsäuremoleküle, die (i) mit einer der obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) in mindestens 60%, 65%, bevorzugt in mindestens 70%, 75%, bevorzugter in mindestens 80%, 84%, 87% und besonders bevorzugt in mindestens 90%, 94%, 96% der Basen übereinstimmen (wobei der Sequenzbereich des Nukleinsäuremoleküls zu betrachten ist, der dem Sequenzbereich eines der oben angegebenen Oligonukleotide (SEQ ID No. 1 bis SEQ 113 No. 47) entspricht, und nicht etwa die gesamte Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls, das u. U. im Vergleich zu den oben angegebenen Oligonukleotiden (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) um eine bis zahlreiche Basen verlängert ist) oder (ii) sich von obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47) durch eine oder mehr Deletionen und/oder Additionen unterscheiden und die eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila, von Fäkalstreptokokken oder von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies Escherichia coli ermöglichen. Dabei bedeutet "spezifische Hybridisierung", dass unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-Hybridisierungstechniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel-Organismen, nicht aber die rRNA von Nicht-Ziel-Organismen an das Oligonukleotid bindet.
b) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter a) genannten Nukleinsäuremolekülen oder einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47 komplementär sind oder mit diesen unter stringenten Bedingungen spezifisch hybridisieren.
c) Nukleinsäuremoleküle, die eine Oligonukleotidsequenz von SEQ a No. 1 bis SEQ ID No. 47 oder die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls nach a) oder b) umfassen und zusätzlich zu den genannten Sequenzen bzw. deren Abwandlungen nach a) oder b) mindestens ein weiteres Nukleotid aufweisen, und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von Ziel-Organismen ermöglichen.

The invention also relates to modifications of the above oligonucleotide sequences which, despite the deviations in the sequence and / or length, show a specific hybridization with target nucleic acid sequences of the respective bacterium and are therefore suitable for use in a method according to the invention. This includes in particular

a) Nucleic acid molecules which (i) with one of the above oligonucleotide sequences (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47) in at least 60%, 65%, preferably in at least 70%, 75%, more preferably in at least 80%, 84 %, 87% and particularly preferably in at least 90%, 94%, 96% of the bases (whereby the sequence region of the nucleic acid molecule is to be considered which corresponds to the sequence region of one of the above-mentioned oligonucleotides (SEQ ID No. 1 to SEQ 113 No. 47 ) corresponds to, and not approximately the entire sequence of a nucleic acid molecule which may be extended by one to numerous bases in comparison to the oligonucleotides specified above (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47) or (ii) itself differentiate from the above oligonucleotide sequences (SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47) by one or more deletions and / or additions and which specifically hybridize with nucleic acid sequences of bacteria of the genus Legionella and of the species L. pneumophila, of faecal streptococci or of c enable oliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli. "Specific hybridization" means that under the hybridization conditions described here or known to the person skilled in the art in connection with in situ hybridization techniques, only the ribosomal RNA of the target organisms, but not the rRNA of non-target organisms, binds to the oligonucleotide.
b) Nucleic acid molecules which are compatible with the nucleic acid molecules mentioned under a) or with one of the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47 are complementary or hybridize specifically with them under stringent conditions.
c) Nucleic acid molecules that contain an oligonucleotide sequence of SEQ a No. 1 to SEQ ID No. 47 or comprise the sequence of a nucleic acid molecule according to a) or b) and, in addition to the sequences mentioned or their modifications according to a) or b), have at least one further nucleotide and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of target organisms.

Der Grad der Sequenzidentität eines Nukleinsäuremoleküls mit den Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 47 kann mit üblichen Algorithmen bestimmt werden. Geeignet ist hier beispielsweise das Programm zur Bestimmung der Sequenzidentität, das unter http:/ / www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (auf diese Seite z. B. der Link "Standard nucleotidenucleotide BLAST [blastn]") zugänglich ist. The degree of sequence identity of a nucleic acid molecule with the probes SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 47 can be determined using conventional algorithms. Is suitable here for example the program for determining the sequence identity, which under http: / / www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (on this page e.g. the link "Standard nucleotide nucleotides BLAST [blastn] ") is accessible.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle können im Rahmen des Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0-80% eingesetzt werden. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z. B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer. The nucleic acid probe molecules according to the invention can be used within the Detection method can be used with different hybridization solutions. Various organic solvents can be used in concentrations of 0-80% be used. By adhering to stringent hybridization conditions ensures that the nucleic acid probe molecule actually matches the target sequence hybridized. Moderate conditions in the sense of the invention are e.g. B. 0% formamide in one Hybridization buffer as described below. Stringent conditions in the sense the invention is, for example, 20-80% formamide in the hybridization buffer.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila enthält eine typische Hybridisierungslösung 0%-80% Formamid, bevorzugt 20%-60% Formamid, besonders bevorzugt 35% Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/l-1,5 mol/l, bevorzugt von 0,5 mol/l-1,0 mol/l, bevorzugter von 0,7 mol/l-0,9 mol/l, besonders bevorzugt von 0,9 mol/l, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001%-0,2%, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005-0,05%, bevorzugter von 0,01-0,03%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01%. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/l eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/l, in einem pH-Wert-Bereich von 6,0-9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/l Tris-HCl, pH 8,0. Within the scope of the method according to the invention for simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila contains a typical one Hybridization solution 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, especially preferably 35% formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / l-1.5 mol / l, preferably 0.5 mol / l-1.0 mol / l, more preferably 0.7 mol / l-0.9 mol / l, particularly preferably 0.9 mol / l, the salt preferably being sodium chloride is. Furthermore, the hybridization solution usually comprises a detergent, such as. B. Sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% -0.2%, preferably in a concentration of 0.005-0.05%, more preferably 0.01-0.03%, particularly preferred in a concentration of 0.01%. Can be used to buffer the hybridization solution various compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES are used are used, the concentrations of 0.01-0.1 mol / l are usually preferred from 0.01 to 0.08 mol / l, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0. The contains particularly preferred embodiment of the hybridization solution according to the invention 0.02 mol / l Tris-HCl, pH 8.0.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken enthält eine typische Hybridisierungslösung 0%-80% Formamid, bevorzugt 20%-60% Formamid, besonders bevorzugt 35% Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/l-1,5 mol/l, bevorzugt von 0,5 mol/l-1,0 mol/l, bevorzugt von 0,7 mol/l-0,9 mol/l, besonders bevorzugt von 0,9 mol/l, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001%-0,2%, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005-0,05%, bevorzugter 0,01-0,03%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01%. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/l eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/l, in einem pH-Wert-Bereich von 6,0-9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/l Tris-HCl, pH 8,0. Within the scope of the method according to the invention for the specific detection of Fecal streptococci contains a typical hybridization solution 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 35% formamide. She also has a salt concentration of 0.1 mol / l-1.5 mol / l, preferably of 0.5 mol / l-1.0 mol / l, preferably of 0.7 mol / l-0.9 mol / l, particularly preferably of 0.9 mol / l, which is the Salt is preferably sodium chloride. The hybridization solution also includes usually a detergent, such as. B. sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% -0.2%, preferably in a concentration of 0.005-0.05%, more preferred 0.01-0.03%, particularly preferably in a concentration of 0.01%. To buffer the Hybridization solution can different compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES are used, usually concentrations of 0.01-0.1 mol / l be used, preferably from 0.01 to 0.08 mol / l, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0. The particularly preferred embodiment of the invention Hybridization solution contains 0.02 mol / l Tris-HCl, pH 8.0.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und der Spezies E. coli enthält eine typische Hybridisierungslösung 0%-80% Formamid, bevorzugt 20%-60% Formamid, besonders bevorzugt 50% Formamid. Sie hat außerdem eine Salzkonzentration von 0,1 mol/l-1,5 mol/l, bevorzugt von 0,7 mol/l-0,9 mol/l, besonders bevorzugt von 0,9 mol/l, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001%-0,2%, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,005-0,05%, bevorzugter 0,01-0,03%, besonders bevorzugt in einer Konzentration von 0,01%. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 mol/l eingesetzt werden, bevorzugt von 0,01 bis 0,08 mol/l, in einem pH-Wert-Bereich von 6,0-9,0, bevorzugt 7,0 bis 8,0. Die besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 mol/l Tris-HCl, pH 8,0. Within the scope of the method according to the invention for simultaneous specific detection of coliform bacteria and the species E. coli contains a typical hybridization solution 0% -80% formamide, preferably 20% -60% formamide, particularly preferably 50% Formamide. It also has a salt concentration of 0.1 mol / l-1.5 mol / l, preferably of 0.7 mol / l-0.9 mol / l, particularly preferably from 0.9 mol / l, the salt being preferably sodium chloride. The hybridization solution also includes usually a detergent, such as. B. sodium dodecyl sulfate (SDS), in a concentration of 0.001% -0.2%, preferably in a concentration of 0.005-0.05%, more preferred 0.01-0.03%, particularly preferably in a concentration of 0.01%. To buffer the Hybridization solution can different compounds such as Tris-HCl, sodium citrate, PIPES or HEPES are used, usually concentrations of 0.01-0.1 mol / l be used, preferably from 0.01 to 0.08 mol / l, in a pH range of 6.0-9.0, preferably 7.0 to 8.0. The particularly preferred embodiment of the invention Hybridization solution contains 0.02 mol / l Tris-HCl, pH 8.0.

Es versteht sich, dass der Fachmann die angegebenen Konzentrationen der Bestandteile des Hybridisierungspuffer derart auswählen kann, dass die gewünschte Stringenz der Hybridisierungsreaktion erzielt wird. Besonders bevorzugte Ausführungsformen geben stringente bis besonders stringente Hybrisidierungsbedingungen wieder. Unter Einsatz dieser stringenten Bedingungen kann der Fachmann feststellen, ob ein bestimmtes Nukleinsäuremolekül einen spezifischen Nachweis von Nukleinsäuresequenzen von Ziel- Organismen ermöglicht und somit im Rahmen der Erfindung zuverlässig eingesetzt werden kann. It is understood that the skilled worker the specified concentrations of the constituents of the Hybridization buffer can be selected so that the desired stringency of the Hybridization reaction is achieved. Give particularly preferred embodiments stringent to particularly stringent hybridization conditions again. Using this stringent conditions, the specialist can determine whether a particular Nucleic acid molecule a specific detection of nucleic acid sequences of target Organisms and thus can be used reliably in the context of the invention can.

Die Konzentration der Sonde, kann je nach Markierung und Anzahl der zu erwartenden Zielstruktur stark schwanken. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Sondenmenge die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonde zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Menge an Sonde sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5 ng/µl und 500 ng/µl, bevorzugt zwischen 1,0 ng/µl und 100 ng/µl und besonders bevorzugt bei 1,0-50 ng/µl liegen. The concentration of the probe can vary depending on the marking and the number of expected Target structure fluctuate strongly. To ensure fast and efficient hybridization allow, the amount of probes should increase the number of targets by several orders of magnitude exceed. However, fluorescence in situ hybridization (FISH) is heading towards this make sure that too much fluorescence-labeled hybridization probe is too high Background fluorescence leads. The amount of probe should therefore be in a range between 0.5 ng / µl and 500 ng / µl, preferably between 1.0 ng / µl and 100 ng / µl and especially are preferably 1.0-50 ng / µl.

Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 µl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren beträgt es 40 µl. The volume of the hybridization solution used should be between 8 µl and 100 ml, in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention it 40 µl.

Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen 10 Minuten und 12 Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungstemperatur beträgt bevorzugt zwischen 44°C und 48°C, besonders bevorzugt 46°C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut. The duration of the hybridization is usually between 10 minutes and 12 hours; hybridization is preferably carried out for about 1.5 hours. The hybridization temperature is preferably between 44 ° C and 48 ° C, particularly preferably 46 ° C, the Parameters of the hybridization temperature, as well as the concentration of salts and Detergents in the hybridization solution depending on the nucleic acid probes, in particular their lengths and the degree of complementarity to the target sequence in the cell to be detected can be optimized. The expert is relevant with here Calculations familiar.

Nach erfolgter Hybridisierung sollten die nicht hybridisierten und überschüssigen Nukleinsäuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1% eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01% bevorzugt wird, sowie Tris- HCl in einer Konzentration von 0,001-0,1 mol/l, bevorzugt 0,01-0,05 mol/l, besonders bevorzugt 0,02 mol/l, enthalten, wobei der pH-Wert von Tris-HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 7,0 bis 8,0, besonders bevorzugt bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üblicherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 mol/l bis 0,9 mol/l, bevorzugt von 0,01 mol/l bis 0,9 mol/l, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von 0,07 mol/l (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella der Spezies L. pneumophila) bzw. von 0,07 mol/l (Verfahren zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken) bzw. von 0,018 mol/l (Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli). Des Weiteren kann die Waschlösung EDTA in einer Konzentration bis zu 0,01 mol/l enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 mol/l beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten. After hybridization, the non-hybridized and excess should Nucleic acid probe molecules are removed or washed off, which is usually done using a conventional washing solution. This wash solution can, if desired, 0.001-0.1% a detergent such as SDS, with a concentration of 0.01% being preferred, and tris HCl in a concentration of 0.001-0.1 mol / l, preferably 0.01-0.05 mol / l, particularly preferably 0.02 mol / l, the pH of Tris-HCl being in the range from 6.0 to 9.0, preferably 7.0 to 8.0, particularly preferably 8.0. A detergent can contain be, but is not absolutely necessary. The washing solution usually also contains NaCl, the concentration depending on the stringency required from 0.003 mol / l to 0.9 mol / l, preferably from 0.01 mol / l to 0.9 mol / l. NaCl is particularly preferred. Concentration of 0.07 mol / l (method for the simultaneous specific detection of Bacteria of the genus Legionella of the species L. pneumophila) or 0.07 mol / l (Method for the specific detection of faecal streptococci) or 0.018 mol / l (Method for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and Bacteria of the species E. coli). Furthermore, the washing solution EDTA in a Contain concentration up to 0.01 mol / l, the concentration preferably 0.005 mol / l is. Furthermore, the washing solution can also contain preservatives familiar to the person skilled in the art contain appropriate amounts.

Allgemein kommen bei dem Waschschritt Pufferlösungen zum Einsatz, die prinzipiell sehr ähnlich aussehen können, wie Hybridisierungspuffer (gepufferte Natriumchloridlösung), nur dass der Waschschritt in einem Puffer mit niedrigerer Salzkonzentration, bzw. bei höherer Temperatur durchgeführt wird. In general, buffer solutions are used in the washing step, which in principle are very good may look similar to hybridization buffer (buffered sodium chloride solution), only that the washing step in a buffer with a lower salt concentration, or at a higher one Temperature is carried out.

Zur theoretischen Abschätzung der Hybridisierungsbedingungen kann folgende Formel verwendet werden:

Td = 81,5 + 16,6 lg[Na+] + 0,4 × (% GC) - 820/n - 0,5 × (% FA)

Td = Dissoziationstemperatur in °C
[Na+] = Molarität der Natriumionen
% GC = Anteil der Guanin- und Cytosinnukleotide an der Anzahl der Basen
n = Länge des Hybrids
% FA = Formamidgehalt The following formula can be used to theoretically estimate the hybridization conditions:

Td = 81.5 + 16.6 lg [Na +] + 0.4 × (% GC) - 820 / n - 0.5 × (% FA)

Td = dissociation temperature in ° C
[Na +] = molarity of sodium ions
% GC = percentage of guanine and cytosine nucleotides in the number of bases
n = length of the hybrid
% FA = formamide content

Mit Hilfe dieser Formel kann z. B. der Formamidanteil (der wegen der Toxizität des Formamids möglichst gering sein sollte) des Waschpuffers ersetzt werden durch einen entsprechend niedrigeren Natriumchloridgehalt. Allerdings ist dem Fachmann aus der umfangreichen Literatur zu in situ-Hybridisierungsmethoden bekannt, dass und auf welche Weise die genannten Bestandteile variiert werden können. Bezüglich der Stringenz der Hybrdisierungsbedingungen gilt das oben im Zusammenhang mit dem Hybridisierungspuffer Gesagte. With the help of this formula z. B. the proportion of formamide (due to the toxicity of the Formamids should be as low as possible) of the wash buffer should be replaced by a correspondingly lower sodium chloride content. However, the expert is from the extensive literature on in situ hybridization methods known that and on which How the components mentioned can be varied. Regarding the stringency of the Hybridization conditions apply above in connection with the hybridization buffer Said.

Das "Abwaschen" der nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44°C bis 52°C, bevorzugt von 44°C bis 50°C und besonders bevorzugt bei 46°C für eine Dauer von 10-40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten. The "washing off" of the unbound nucleic acid probe molecules usually takes place at a temperature in the range from 44 ° C to 52 ° C, preferably from 44 ° C to 50 ° C and particularly preferably at 46 ° C. for a period of 10-40 minutes, preferably for 15 Minutes.

In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle im sogenannten Fast-FISH-Verfahren zum spezifischen Nachweis der angegebenen Ziel-Organismen eingesetzt. Das Fast-FISH- Verfahren ist dem Fachmann bekannt und z. B. in der deutschen Patentanmeldung DE 199 36 875.9 und der internationalen Anmeldung WO 99/18234 beschrieben. Auf die in diesen Dokumenten enthaltene Offenbarung zur Durchführung der dort beschriebenen Nachweisverfahren wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. In an alternative embodiment of the method according to the invention, the Nucleic acid probe molecules according to the invention in the so-called Fast-FISH method for specific detection of the specified target organisms. The Fast FISH The method is known to the expert and z. B. in German patent application DE 199 36 875.9 and the international application WO 99/18234. On those in these Disclosure contained in documents for carrying out the described there Proof of verification is hereby expressly referred to.

Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresondenmolekül nachweisbar ist, z. B. dadurch dass das Nukleinsäuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z. B. fluoreszierende Gruppen wie z. B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6-FAM oder FLUOS-PRIME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können. Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben: Tabelle Enzyme Chromogen 1. Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase 4-Methylumbelliferylphosphat (Fluoreszenz), Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), (Fluoreszenz) 3-O-Methylfluoreszein, Flavon-3-Diphosphattriammoniumsalz (Fluoreszenz), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz 2. Peroxidase Tyraminhydrochlorid (Fluoreszenz), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (Fluoreszenz), p-Hydroxyphenethylalkohol(Fluoreszenz), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (Fluoreszenz), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin 3. Meerrettichperoxidase H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H₂O₂ + Tetramethylbenzidin 4. β-D-Galaktosidase o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid 5. Glukoseoxidase ABTS, Glukose und Thiazolylblau The specifically hybridized nucleic acid probe molecules can then be detected in the respective cells. The prerequisite for this is that the nucleic acid probe molecule is detectable, e.g. B. in that the nucleic acid probe molecule is linked to a marker by covalent binding. As detectable markers such. B. fluorescent groups such. B. CY2 (available from Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (also available from Amersham Life Sciences), CY5 (also available from Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA) ), FLUOS (available from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), TRITC (available from Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6-FAM or FLUOS-PRIME, all of which are well known to those skilled in the art. Chemical markers, radioactive markers or enzymatic markers such as horseradish peroxidase, acid phosphatase, alkaline phosphatase, peroxidase can also be used. A number of chromogens are known for each of these enzymes, which can be converted instead of the natural substrate and can be converted into either colored or fluorescent products. Examples of such chromogens are given in the table below: table enzymes chromogen 1. Alkaline phosphatase and acid phosphatase 4-methylumbelliferyl phosphate (fluorescence), bis (4-methylbelliferyl phosphate), (fluorescence) 3-O-methylfluorescein, flavone-3-diphosphate triammonium salt (fluorescence), p-nitrophenyl phosphate disodium salt 2. Peroxidase Tyramine hydrochloride (fluorescence), 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid (fluorescence), p-hydroxyphenethyl alcohol (fluorescence), 2,2'-azino-di-3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid (ABTS), ortho-phenylenediamine dihydrochloride, o-dianisidine, 5 -Aminosalicylic acid, p-Ucresol (fluorescence), 3,3'-dimethyloxybenzidine, 3-methyl-2-benzothiazoline hydrazone, tetramethylbenzidine 3. Horseradish peroxidase H ₂ O ₂ + diammonium benzidine H ₂ O ₂ + tetramethylbenzidine 4. β-D-galactosidase o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, 4-methylumbelliferyl-β-D-galactoside 5. Glucose oxidase ABTS, glucose and thiazolyl blue

Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, dass an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Finally, it is possible to design the nucleic acid probe molecules so that their 5'- or 3 'end there is a further nucleic acid sequence suitable for hybridization.

Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1.000, bevorzugt 15-50 Nukleotide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Nukleinsäuresondenmolekül erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist. This nucleic acid sequence in turn comprises approximately 15 to 1,000, preferably 15-50 Nucleotides. This second nucleic acid region can in turn be from one Nucleic acid probe molecule can be recognized, which can be detected by one of the means mentioned above.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresondenmoleküle mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt. Another possibility is to couple the detectable Nucleic acid probe molecules with a hapten, which then with an antibody recognizing the hapten can be brought into contact. Digoxigenin can be used as an example of such a hapten be cited. The person skilled in the art also knows more than the examples given well known.

Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u. a. The final evaluation depends on the type of marking used Probe possible with a light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, Fluorometer and a.

Ein wichtiger Vorteil der in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies L. pneumophila oder zum spezifischen Nachweis von Fäkalstreptokokken oder Verfahren zum gleichzeitigen spezifischen Nachweis von coliformen Bakterien und Bakterien der Spezies E. coli gegenüber den weiter oben beschriebenen Nachweismethoden ist die Schnelligkeit. Im Vergleich zu herkömmlichen Kultivierungsverfahren, die sieben bis 14 Tage für den Nachweis von Legionellen, 48 bis 100 Stunden für den Nachweis von Fäkalstreptokokken bzw. 30 bis 96 Stunden für den Nachweis von coliformen Bakterien und E. coli benötigen, liegt das Ergebnis bei Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren innerhalb von 24-48 Stunden vor. An important advantage of the simultaneous methods described in this application specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila or for the specific detection of faecal streptococci or methods for simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species E. coli The detection method described above is speed. Compared to conventional cultivation methods, which take seven to 14 days for the detection of Legionella, 48 to 100 hours for the detection of faecal streptococci or 30 to 96 The result is hours for the detection of coliform bacteria and E. coli when using the methods according to the invention within 24-48 hours.

Ein weiterer Vorteil liegt im gleichzeitigen Nachweis von Bakterien der Gattung Legionella und der Spezies Legionella pneumophila. Mit bislang geläufigen Verfahren können lediglich Bakterien der Spezies Legionella pneumophila mit mehr oder weniger großer Zuverlässigkeit nachgewiesen werden. Epidemiologische Untersuchungen haben aber gezeigt, dass neben Legionella pneumophila auch andere Spezies der Gattung Legionella die gefährliche Legionärskrankheit auslösen können, z. B. Legionella micdadei. Der alleinige Nachweis von Legionella pneumophila muss daher nach dem heutigen Kenntnisstand als nicht länger ausreichend angesehen werden. Another advantage is the simultaneous detection of bacteria of the genus Legionella and the species Legionella pneumophila. With procedures that are currently used, only Bacteria of the species Legionella pneumophila with more or less great reliability be detected. However, epidemiological studies have shown that in addition to Legionella pneumophila also other species of the genus Legionella the dangerous Can trigger Legionnaires' disease, e.g. B. Legionella micdadei. The sole evidence of Legionella pneumophila must therefore, as far as we know today, no longer be considered sufficient.

Ein weiterer Vorteil liegt in der Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen Bakterien der Gattung Legionella und denen der Spezies Legionella pneumophila. Diese ist durch die Verwendung unterschiedlich markierter Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich. Another advantage lies in the ability to differentiate between the bacteria Genus Legionella and those of the species Legionella pneumophila. This is through the Use of differently labeled nucleic acid probe molecules easily and reliably possible.

Ein weiterer Vorteil liegt in der Spezifität dieser Verfahren. Durch die verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküle können sowohl spezifisch sämtliche Arten der Gattung Legionella, aber auch hochspezifisch nur die Spezies L. pneumophila nachgewiesen und visualisiert werden. Ebenso zuverlässig werden sämtliche Arten der heterogenen Gruppen der Fäkalstreptokokken und der Coliformen nachgewiesen sowie sämtliche Subgruppen der Spezies E. coli. Durch die Visualisierung der Bakterien kann eine gleichzeitige visuelle Kontrolle stattfinden. Falsch positive Ergebnisse sind somit ausgeschlossen. Another advantage is the specificity of these processes. By the used Nucleic acid probe molecules can both specifically address all types of the genus Legionella, but also highly specific only the species L. pneumophila detected and be visualized. All types of heterogeneous groups of the Fecal streptococci and the coliforms as well as all subgroups of the E. coli species. By visualizing the bacteria, a simultaneous visual Control take place. False positive results are therefore excluded.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren liegt in der leichten Handhabbarkeit. So können durch die Verfahren leicht große Mengen an Proben auf das Vorhandensein der genannten Bakterien getestet werden. Another advantage of the method according to the invention is that it is easy to handle. Thus, the method can easily determine the presence of large quantities of samples mentioned bacteria are tested.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können vielfältig angewendet werden. The methods according to the invention can be used in a variety of ways.

So können beispielsweise Umweltproben auf das Vorhandensein von Legionellen untersucht werden. Diese Proben können hierzu z. B. aus Wasser oder aus dem Boden entnommen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiter zur Untersuchung medizinischer Proben eingesetzt werden. Es ist u. a. für die Untersuchung von Proben aus Sputum, Bronchoalveolärer Lavage oder endotrachialer Absaugung geeignet. Es ist des weiteren für die Untersuchung von Gewebeproben, z. B. Biopsiematerial aus der Lunge, Tumor- oder entzündlichem Gewebe, aus Sekreten wie Schweiß, Speichel, Sperma und Ausfluß aus der Nase, Harnröhre oder Vagina sowie für Urin- oder Stuhlproben geeignet. For example, environmental samples can be checked for the presence of Legionella become. These samples can z. B. be taken from water or from the ground. The method according to the invention can also be used to examine medical samples be used. It is u. a. for the examination of samples from sputum, Bronchoalveolar lavage or endotrachial suction suitable. It is also for the Examination of tissue samples, e.g. B. biopsy material from the lungs, tumor or inflammatory tissue, from secretions such as sweat, saliva, sperm and discharge from the Suitable for nose, urethra or vagina as well as for urine or stool samples.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für das vorliegende Verfahren ist die Untersuchung von Wässern, z. B. Dusch- und Badewässern oder Trinkwasser. Another area of application for the present method is the investigation of Watering e.g. B. shower and bath water or drinking water.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Kontrolle von Lebensmitteln. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Lebensmittelproben aus Milch oder Milchprodukten (Joghurt, Käse, Quark, Butter, Buttermilch), Trinkwasser, Getränken (Limonaden, Bier, Säfte), Backwaren oder Fleischwaren entnommen. Another area of application for the method according to the invention is the control of Food. In preferred embodiments, the food samples are made from milk or milk products (yogurt, cheese, curd cheese, butter, buttermilk), drinking water, drinks (Lemonades, beer, juices), baked goods or meat products.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Untersuchung pharmazeutischer und kosmetischer Produkte, z. B. Salben, Cremes, Tinkturen, Säfte, Lösungen, Tropfen etc. ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich. Another area of application for the method according to the invention is the investigation pharmaceutical and cosmetic products, e.g. B. ointments, creams, tinctures, juices, Solutions, drops etc. are possible with the method according to the invention.

Erfindungsgemäß werden weiterhin drei Kits zur Durchführung der entsprechenden Verfahren zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene Hybridisierungsanordnung ist z. B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ-Hybridisierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen. According to the invention, three kits are also used to carry out the corresponding methods made available. The hybridization arrangement contained in these kits is e.g. B. in the German patent application 100 61 655.0 described. To those in this document contained disclosure regarding the in situ hybridization arrangement is hereby incorporated expressly referred.

Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reactor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die jeweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen (als VIT-Lösung bezeichnet). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisierungspuffer (Solution C) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung (Solution D). Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixierungslösungen (Solution A und Solution B) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u. a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten. In addition to the described hybridization arrangement (referred to as a VIT reactor) the kits as the most important component the respective hybridization solution with the above described specifically for the microorganisms to be detected Nucleic acid probe molecules (called VIT solution). Furthermore is included the corresponding hybridization buffer (Solution C) and a concentrate of the corresponding Wash solution (Solution D). Fixing solutions may also be included (Solution A and Solution B) and, if necessary, a single solution (finisher). Are finishers commercially available, they prevent u. a. the rapid fading of fluorescent probes under the fluorescence microscope. If necessary, solutions for parallel Execution of a positive control and a negative control (Negative Control) included.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken: The following example is intended to explain the invention without restricting it:

example Specific quick detection of drinking water-relevant bacteria in a sample

Eine Probe wird in geeigneter Weise 20-44 h kultiviert. Verschiedene hierzu geeignete Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt. Zu einem Aliquot dieser Kultur wird dasselbe Volumen Fixierungslösung (Solution A, 50% Ethanol) zugegeben. A sample is cultured appropriately for 20-44 hours. Various suitable for this Methods are well known to those skilled in the art. The same becomes an aliquot of this culture Volume of fixative solution (Solution A, 50% ethanol) added.

Zur Durchführung der Hybridisierung wird ein geeignetes Aliquot der fixierten Zellen (bevorzugt 40 µl) auf einen Objektträger aufgebracht und getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken). Anschließend werden die getrockneten Zellen vollständig dehydratisiert durch Zusatz einer weiteren Fixierungslösung (Solution B, Ethanol absolut, bevorzugt 40 µl). Der Objektträger wird erneut getrocknet (Raumtemperatur, 3 min oder bis vollständig trocken). A suitable aliquot of the fixed cells is used to carry out the hybridization (preferably 40 µl) applied to a slide and dried (46 ° C, 30 min or until completely dry). The dried cells are then completely dehydrated by adding another fixation solution (Solution B, absolute ethanol, preferably 40 µl). The slide is dried again (room temperature, 3 min or until complete dry).

Anschließend wird auf die fixierten, dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung (VIT- Lösung) mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen aufgebracht. Das bevorzugte Volumen beträgt 40 µl. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungspuffer (Solution C, entspricht der Hybridisierungslösung ohne Sondenmoleküle) befeuchteten Kammer, bevorzugt dem VIT-Reaktor, inkubiert (46°C, 90 min). The hybridization solution (VIT- Solution) with those described above for the microorganisms to be detected specific nucleic acid probe molecules applied. The preferred volume is 40 ul. The slide is then placed in a hybridization buffer (Solution C, corresponds to the hybridization solution without probe molecules) humidified chamber, preferably the VIT reactor, incubated (46 ° C, 90 min).

Anschließend wird der Objektträger aus der Kammer entnommen, die Kammer mit Waschlösung befüllt (Solution D, 1 : 10 verdünnt in destilliertem Wasser) und der Objektträger in dieser inkubiert (46°C, 15 min). The slide is then removed from the chamber, the chamber with Wash solution filled (Solution D, 1:10 diluted in distilled water) and the slide incubated in this (46 ° C, 15 min).

Anschließend wird die Kammer mit destilliertem Wasser befüllt, der Objektträger kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung luftgetrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken). The chamber is then filled with distilled water, the slide briefly immersed and then air dried in a lateral position (46 ° C, 30 min or until completely dry).

Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Medium (Finisher) eingebettet. The slide is then embedded in a suitable medium (finisher).

Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.

Finally, the sample is analyzed using a fluorescence microscope.

Claims

1. oligonucleotide that identifies a nucleotide sequence selected from the group consisting of (all in the 5 '→ 3' direction)

a) oligonucleotides which correspond to the above oligonucleotides under i) in at least 60%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90, 92, 94, 96% and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of drinking water-relevant bacterial cells,

b) oligonucleotides which differ from the oligonucleotides under i) by a deletion and / or addition and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of drinking water-relevant bacterial cells, and

c) oligonucleotides that hybridize with the aforementioned oligonucleotides under i), ii) and iii) under stringent conditions.

2. A method for the detection of drinking water-relevant bacteria in a sample, comprising the steps

a) cultivating the drinking water-relevant bacteria contained in the sample,

b) fixing the drinking water-relevant bacteria contained in the sample,

c) incubating the fixed bacteria with at least one oligonucleotide selected from the group consisting of

a) the oligonucleotides according to claim 1,

b) oligonucleotides which correspond to the oligonucleotides according to claim 1 in at least 60%, preferably at least 80% and particularly preferably at least 90, 92, 94, 96% and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of drinking water-relevant bacterial cells,

c) oligonucleotides which differ from the oligonucleotides according to claim 1 by deletion and / or addition and enable specific hybridization with nucleic acid sequences of drinking water-relevant bacterial cells, and

d) oligonucleotides which hybridize with the aforementioned oligonucleotides under stringent conditions,

to bring about hybridization,

d) removing non-hybridized oligonucleotides,

e) Detecting and visualizing and, if appropriate, quantifying the drinking water-relevant bacterial cells with the hybridized oligonucleotides.

3. The method of claim 2, wherein the oligonucleotide with a detectable marker selected from the group consisting of

a) fluorescent markers,

b) chemiluminescent markers,

c) radioactive markers,

d) enzymatically active groups,

e) hapten,

f) nucleic acids detectable by hybridization

is coupled.

4. The method according to claim 2 or 3, wherein the sample is a drinking water or Surface water sample is.

5. The method according to any one of claims 2 to 4, wherein the detection means Light microscope, epifluorescence microscope, chemiluminometer, fluorometer Flow cytometer is done.

6. The method according to any one of claims 2 to 5, wherein it is in the bacteria relevant to drinking water around bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila or to fecal streptococci or to coliform bacteria and bacteria of E. coli species.

7. The method according to any one of claims 2 to 6 for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

8. The method according to any one of claims 2 to 6 for the specific detection of faecal streptococci, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

9. The method according to any one of claims 2 to 6 for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

10. Use of an oligonucleotide selected from the group consisting of

a) the oligonucleotides according to claim 1,

d) oligonucleotides that hybridize with the aforementioned oligonucleotides under stringent conditions for the detection of drinking water-relevant bacteria in a sample.

11. Use according to claim 10, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

and the oligonucleotide is used for the simultaneous specific detection of bacteria of the genus Legionella and the species L. pneumophila.

12. Use according to claim 10, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

and the oligonucleotide is used for the detection of faecal streptococci.

13. Use according to claim 10, wherein the oligonucleotide is selected from the group consisting of

and the oligonucleotide is used for the simultaneous specific detection of coliform bacteria and bacteria of the species Escherichia coli.

14. Kit for performing the method according to one of claims 2 to 9, containing at least one oligonucleotide selected from the group consisting of

a) en oligonucleotides according to claim 1,

d) oligonucleotides that hybridize with the aforementioned oligonucleotides under stringent conditions.

15. Kit according to claim 14, in which the at least one oligonucleotide in one Hybridization solution is included.

16. Kit according to claim 14 or 15, further comprising a washing solution and optionally one or several fixation solutions.