DE10158078A1 - Suizidgensysteme - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Suizidgensysteme mit Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk), Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder der humanen Folylpolyglutamatsynthase (fpgs), insbesondere auch in Kombination derselben sowie entsprechende DNA-Abschnitte, Vektoren, infektöse Partikel, transfizierte Zellen und diese enthaltende Arzneimittel sowie die Verwendung der Gegenstände und Suizidgene auch in Kombination mit aktivierten Wirkstoffen zur Behandlung von Leukämie bzw. Graft-versus-Host-Reaktionen (GvHD) beispielsweise bei Gabe von Spenderlymphozyten. The invention relates to suicide gene systems with herpes simplex virus type 1 Thymidine kinase (HSV-tk), cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs), especially in Combination of these and corresponding DNA segments, vectors, infectious particles, transfected cells and medicines containing them as well as the use of the objects and suicide genes also in Combination with activated agents for the treatment of leukemia or graft-versus-host reactions (GvHD), for example, when Donor lymphocytes.
Die Entwicklung multimodaler Therapiestrategien mit Chemotherapie und Bestrahlung haben die Behandlung von Leukämieerkrankungen im Kindesalter in den letzten vier Jahrzehnten revolutioniert und die vormals düstere Prognose dieser Patienten erheblich verbessert. So können heute z. B. ca. 80% der Kinder mit einer akuten lymphatischen Leukämie durch eine Polychemotherapie dauerhaft geheilt werden (Harms und Janka 2000; Schrappe et al. 2000). Doch gelingt auch mit der Polychemotherapie bei vielen Rezidiv- und bestimmten Hochrisikopatienten der akuten Leukämien sowie bei Patienten mit chronischen Verlaufsformen keine Heilung. Für diese Patienten stellt zur Zeit die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation den einzig möglichen kurativen Behandlungsansatz dar. Dabei hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass weniger die intensive chemo- und strahlentherapeutische Behandlung im Rahmen der Konditionierung als vielmehr die durch die Transplantation induzierten immunologischen Vorgänge die entscheidende Rolle für die Prognose nach allogener Transplantation spielt. Diese als "graft-versus-leukemia" (GvL)-Effekte bezeichneten immunologischen Phänome beruhen in erster Linie auf der Erkennung und Vernichtung der Empfänger-Leukämiezellen durch die transplantierten Spender-T-Zellen. Daneben sind wahrscheinlich auch andere Zellen des Immunsystems, wie z. B. NK-Zellen und Dendritische Zellen, beteiligt. The development of multimodal therapy strategies with chemotherapy and Radiation treatment in leukemia Childhood has revolutionized in the past four decades and the past gloomy prognosis of these patients improved significantly. So today z. B. about 80% of children with acute lymphoblastic leukemia polychemotherapy can be permanently cured (Harms and Janka 2000; Schrappe et al. 2000). But it also works with the Polychemotherapy for many relapses and certain High-risk patients with acute leukemia and in patients with chronic forms no cure. Provides for these patients Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is the only one possible curative treatment approach. In the last Years have shown that less the intensive chemical and radiotherapy treatment as part of conditioning rather the immunological induced by the transplant Operations play the crucial role in forecasting after allogeneic Transplant plays. These as "graft-versus-leukemia" (GvL) effects designated immunological phenomena are based primarily on the Detection and destruction of the recipient leukemia cells by the transplanted donor T cells. Besides that are probably too other immune system cells, such as B. NK cells and dendritic Cells involved.
Der GvL-Effekt steht in einem besonderen Verhältnis zu der sogenannten Spender-gegen-Empfänger-Krankheit ("graft-versus-host disease"; GvHD). Hierbei reagieren die transplantierten reifen Spender T-Zellen auch gegen andere Zellen des Patienten, die vor allem in der Haut, der Leber, dem Gastrointestinaltrakt, in exokrinen Drüsen und im Lungengewebe lokalisiert sind. Dabei kann das Ausmass dieser Reaktion lebensgefährliche Ausmasse annehmen. Auch chronische Verläufe sind nicht selten. Die Entstehung einer schweren akuten oder chronischen GvHD ist für einen grossen Teil der Morbidität und Mortalität nach allogener Stammzelltransplantation verantwortlich. GvHD und GvL-Effekt sind nicht obligat miteinander assoziiert. Viele Untersuchung im Mausmodell und auch in klinischen Studien belegen vielmehr die prinzipielle Möglichkeit einer dissoziierten Induzierbarkeit von GvL-Effekt und GvHD, die auf unterschiedlichen Immunantworten (GvL: Th2/Tc2- Polarisierung; GvHD: Th1/Tc1-Polarisierung; zur Übersicht siehe Fowler und Gress 2000) und Apoptosemechanismen (GvL: Perform-System; GvHD: Fas-System; Schmaltz et al. 2001) zu beruhen scheinen. Die Kontrolle und Stabilisierung der schmalen Balance zwischen GvL-Effekt und GvHD ist heute ein vorrangiges Ziel vieler Forschungsbemühungen im Bereich der hämatologischen Transplantationsimmunologie und - immunpathologie (als Übersichstartikel: Bordignon et al. 1999). The GvL effect has a special relationship to the so-called Graft-versus-host disease; GvHD). The transplanted mature donor T cells react here also against other patient cells, particularly those in the skin that Liver, the gastrointestinal tract, in exocrine glands and in the Lung tissues are localized. The extent of this reaction assume life-threatening proportions. Chronic courses are also not infrequently. The emergence of severe acute or chronic GvHD is after for a large part of the morbidity and mortality allogeneic stem cell transplantation responsible. GvHD and GvL effect are not necessarily associated with each other. Many investigation in Mouse model and also in clinical studies rather prove that principle possibility of a dissociated inducibility of GvL effect and GvHD that respond to different immune responses (GvL: Th2 / Tc2- Polarization; GvHD: Th1 / Tc1 polarization; see Fowler for an overview and Gress 2000) and apoptosis mechanisms (GvL: Perform system; GvHD: Fas system; Schmaltz et al. 2001) seem to be based. The Control and stabilization of the narrow balance between GvL effect and GvHD is now a primary goal of many research efforts in the field of hematological transplantation immunology and immunopathology (as a review: Bordignon et al. 1999).
Eine besondere Nutzung des GvL-Effektes ist der Einsatz von Spenderlymphozyten (donor lymphocyte infusion = DLI) zur Behandlung von Rezidiven einer chronischen myeloischen Leukämie (CML), einer akuten myeloischen Leukämie (AML), eines Multiplen Myeloms und eines NHL-Lymphoms (Kolb et al. 1990, 1995; Porter et al. 1994; Tricot et al. 1996). Die Ansprechrate ist bei der Behandlung eines CML-Rezidives nach allogener Stammzelltransplantation mit einer Komplettremission bei bis zu 70% der mit DLI behandelten Patienten eindrucksvoll (Kolb et al. 1995) und deutlich höher als bei den anderen aufgeführten Anwendungen. Doch scheinen immerhin auch ca. 20-30% der Patienten mit AML-Rezidiv nach allogener Stammzelltransplantation von Spenderlymphozytengaben zu profitieren (Kolb et al. 1995; Mehta et al. 1997). A special use of the GvL effect is the use of Donor lymphocyte infusion (DLI) for treatment recurrences of chronic myeloid leukemia (CML), one acute myeloid leukemia (AML), a multiple myeloma and one NHL lymphoma (Kolb et al. 1990, 1995; Porter et al. 1994; Tricot et al. 1996). The response rate is when treating a CML relapse after allogeneic stem cell transplantation with a complete remission up to 70% of patients treated with DLI are impressive (Kolb et al. 1995) and significantly higher than in the other listed applications. However, at least 20-30% of patients with AML relapse also appear after allogeneic stem cell transplantation of donor lymphocyte doses to benefit (Kolb et al. 1995; Mehta et al. 1997).
Bei der Behandlung von Post-Transplantations-Rezidiven einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL), wie sie vor allem bei Kindern und Jugendlichen zu finden sind, spielen Spenderlymphozytengaben meistens nur in Einzelfallberichten eine positive Rolle (Lawson und Darbyshire 1998; Saw et al. 1997; Atra et al. 1997; Chang et al. 1998). Bei grösseren Fallzahlen scheint sich kein signifikant positiver Therapieeffekt von DLI bei der Behandlung von ALL-Rezidiven nach allogener Knochenmarktransplantation zu zeigen: In der Studie von Kolb et al. (1995) konnten von 12 Patienten mit Post-Transplantations-Rezidiv einer ALL kein einziger durch alleinige Spenderlymphozytengaben in Remission gebracht werden, bei Mehta et al. (1997) war es ebenfalls nur einer von sechs Patienten. Doch scheint ein ALL-Rezidiv bei Kindern nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation durch prophylaktische Spenderlymphozytengaben in einer Vielzahl der Fälle abwendbar zu sein. In einer Pilotstudie (Bader et al. 1999) wurden bei insgesamt 5 Kindern, die nach Transplantation aufgrund eines zunehmenden gemischten hämatologischen Chimärismus ein deutlich erhöhtes ALL-Rezidivrisiko aufwiesen (Bader et al. 2000), durch Reduktion der Immunsuppressiva und/oder Spenderlymphozytengaben erneut ein kompletter hämatologischer Chimärismus induziert. Drei der fünf Kinder blieben dauerhaft in Remission, bei zweien stellte sich mehrere Monate später ein Rezidiv ein. Bei Kindern mit erhöhtem MDS-(myelodysplastischen Syndrom-) und AML-Riskos bei zunehmenden gemischten Chimärismus zeigten sich ähnlich gute Behandlungszahlen. Die Fortführung dieser Pilotstudie als prospektive Multizenterstudie (Beck et al. 2001) bestätigte den therapeutischen Wert der DL1-Therapie zur Prävention eines Rezidives: In einer Gruppe von 43 Kindern mit ALL, AML oder MDS (myelodysplastischem Syndrom) und zunehmenden gemischten Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation wurden 24 Kinder prophylaktisch mit Spenderlymphozytengaben behandelt, 19 Kinder wurden dieser Immuntherapie nicht unterzogen. Elf der 24 prophylaktisch behandelten Kinder blieben in der Nachbeobachtungszeit rezidivfrei, dagegen nur eines der übrigen, nicht spezifisch vorbehandelten 19 Kinder. In the treatment of post-transplant relapse an acute lymphocytic leukemia (ALL), especially in children and Adolescents are usually found playing donor lymphocyte doses only positive in individual reports (Lawson and Darbyshire 1998; Saw et al. 1997; Atra et al. 1997; Chang et al. 1998). With larger ones Case numbers do not appear to have a significantly positive therapeutic effect from DLI the treatment of ALL recurrences after allogeneic To show bone marrow transplantation: In the study by Kolb et al. (1995) could out of 12 patients with post-transplant recurrence one ALL not a single remission from donor lymphocytes alone brought in by Mehta et al. (1997) it was also only one of six patients. However, an ALL recurrence in children seems to be allogeneic hematopoietic stem cell transplantation through prophylactic Donor lymphocytes have been shown to be avertable in a variety of cases. In a pilot study (Bader et al. 1999) a total of 5 children, the post-transplant due to an increasing mixed haematological chimerism a significantly increased risk of ALL recurrence had (Bader et al. 2000), by reducing the immunosuppressive agents and / or donor lymphocytes again gave a complete haematological chimerism induced. Three of the five children stayed permanently in remission, two appeared several months later Recurrence. In children with increased MDS (myelodysplastic Syndrome) and AML risks with increasing mixed chimerism treatment numbers were similarly good. Continuing this Pilot study confirmed as a prospective multi-center study (Beck et al. 2001) the therapeutic value of DL1 therapy for the prevention of a Relapses: In a group of 43 children with ALL, AML or MDS (myelodysplastic syndrome) and increasing mixed Chimerism after allogeneic stem cell transplantation resulted in 24 children treated prophylactically with donor lymphocyte doses, 19 children were not subjected to this immunotherapy. Eleven of the 24 prophylactically treated children remained free of recurrence in the follow-up period, in contrast, only one of the remaining 19 children who were not specifically treated.
Der prophylaktische Wert einer adoptiven Immuntherapie mit Spenderlymphozyten lässt sich eventuell auch auf ALL-Patienten mit einer minimalen Resterkrankung (minimal residual disease = MRD) vor Transplantation ausweiten. Patienten mit MRD haben ein signifikant erhöhtes Rezidivrisiko nach Transplantation (Bader et al. 2001). Gerade in der pädiatrischen Onkologie könnte also durch Monitoring von Prä- und Post-Transplantations-Risikofaktoren für ein ALL-Rezidiv Patientengruppen definiert werden, die von prophylaktischen Spenderlymphozytengaben profitieren würden. The prophylactic value of adoptive immunotherapy with Donor lymphocytes may also be present on ALL patients with a minimal residual disease (MRD) Extend transplant. Patients with MRD have a significant increased risk of recurrence after transplantation (Bader et al. 2001). Currently at Pediatric oncology could thus be monitored by pre- and Post-transplant risk factors for an ALL relapse Patient groups are defined by prophylactic Donor lymphocyte donations would benefit.
Eine wichtige Voraussetzung für den erfolgsversprechenden therapeutischen und auch prophylaktischen Einsatz von Spenderlymphozyten bleibt die Anzahl der applizierten T-Zellen. Hier ist wiederum die Balance zwischen GvL-Effekt und GvHD-Induktion entscheidend. Bei niedrigen T-Zell-Dosen ist der gewünschte Therapie- oder Präventionseffekt nicht sicher gegeben. Bei einer höheren DLI-Dosis steigt dagegen das GvHD-Risko erheblich an. In der Regel erkranken ca. 50% der Patienten nach Spenderlymphozytengaben an einer mässiggradigen bis schweren GvHD (GvHD II0-IV0; Kolb et al. 1995; Collins et al. 1997). Das Vorliegen einer schweren GvHD zieht in der Regel eine erneute Erhöhung der Immunsuppression mit sich. Das wiederum kann, wie von Bader et al. (1999) bei einem Einzelpatienten beschrieben, den präventiven Wert einer Spenderlymphozytengabe aufheben und damit das Auftreten eines Rezidivs erneut begünstigen. The number of T cells applied remains an important prerequisite for the promising therapeutic and prophylactic use of donor lymphocytes. Here again the balance between GvL effect and GvHD induction is crucial. At low T cell doses, the desired therapeutic or preventive effect is not certain. With a higher DLI dose, however, the GvHD risk increases significantly. As a rule, approx. 50% of the patients develop moderate to severe GvHD after donor lymphocyte administration (GvHD II 0 -IV 0 ; Kolb et al. 1995; Collins et al. 1997). The presence of severe GvHD usually entails a further increase in immunosuppression. This in turn can, as described by Bader et al. (1999) described in a single patient, abolish the preventive value of donor lymphocyte administration and thus further promote the occurrence of a relapse.
Um eine möglichst grosse Zahl an Spenderlymphozyten für einen kurativen GvL-Effekt applizieren zu können, ohne dabei das Leben des Patienten durch eine nicht mehr kontrollierbare GvHD zu gefährden, wurden von einigen Arbeitsgruppen die Spender-T-Zellen mit Suizidgenen transduziert. Suizidgene kodieren für Enzyme pro- oder eukaryontischen Ursprungs, die eine inerte Substanz ("prodrug") in eine zytotoxische Substanz bzw. einen aktiven Metaboliten überführen können. Die toxischen Metaboliten werden nur in den transduzierten Zellen gebildet und führen spezifisch zum Absterben dieser Zellen. Das bislang beim Menschen ausschliesslich verwandte Suizidgen ist das Gen für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk), die Nukleosidanaloga wie Ganciclovir und Acyclovir in zytotoxische Metabolite umwandeln kann (s. z. B. US 6,048,525). Durch den in vitro-Gentransfer können mit den heutigen Vektorsystemen unter Anwendung spezifischer Transduktions- und Selektionsverfahren mehr als 99% aller Spenderlymphozyten mit HSV-tk erfolgreich transduziert werden. Sollte bei einem Patienten nach Transfusion solcher genetisch manipulierter Spenderlymphozyten eine schwere GvHD auftreten, so sollten die HSV-tk-positiven Effektorzellen der GvHD-Induktion durch eine Ganciclovir (GCV)-Behandlung abgetötet werden (s. z. B. US 6,048,525). Das Prinzip dieses Verfahrens ist in einigen klinischen Studien erfolgreich aufgezeigt worden (Bordignon et al. 1995; Bonini et al. 1997; Verzeletti et al. 1998; Tiberghien et al. 2001). The largest possible number of donor lymphocytes for one to be able to apply the curative GvL effect without losing the life of the Endangering patients with uncontrollable GvHD, were the donor T cells with suicide genes by some working groups transduced. Suicide genes code for pro- or eukaryotic enzymes Origin, which is an inert substance ("prodrug") into a cytotoxic Can transfer substance or an active metabolite. The Toxic metabolites are only formed in the transduced cells and specifically lead to the death of these cells. So far at Exclusively related suicide gene is the gene for herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk), which like nucleoside analogues Can convert ganciclovir and acyclovir into cytotoxic metabolites (see e.g. US 6,048,525). Through in vitro gene transfer, the today's vector systems using specific transduction and selection procedures using more than 99% of all donor lymphocytes HSV-tk can be successfully transduced. Should follow up on a patient Transfusion of such genetically engineered donor lymphocytes severe GvHD occur, so should the HSV-tk positive effector cells GvHD induction killed by ganciclovir (GCV) treatment (see e.g. US 6,048,525). The principle of this procedure is in have been successfully demonstrated in some clinical studies (Bordignon et al. 1995; Bonini et al. 1997; Verzeletti et al. 1998; Tiberghien et al. 2001).
Doch nicht bei allen Patienten konnte eine GvHD erfolgreich behandelt werden. Dies wurde vor allem auf eine Vernichtung der genetisch modifizierten Lymphozyten durch eine Immunreaktion zurückgeführt, die wahrscheinlich gegen das nicht-humane Genprodukt, das HSV-TK- Protein, gerichtet ist (Verzeletti et al. 1998). Tiberghien und Mitarbeiter (2001) wollten in ihrer klinischen Studie diese Immunreaktion dadurch verhindern, dass die HSV-tk-transduzierten Spenderlymphozyten nicht erst einige Wochen nach Stammzelltransplantation (z. B. im Rezidivfall einer CML), sondern prophylaktisch parallel mit der Gabe von T-Zell- depletierten Transplantaten infundiert wurden. Hierdurch sollte eine Toleranz der neugebildeten T-Zellen gegenüber dem HSV-TK Protein induziert werden. Tatsächlich lag trotz der vorliegenden in vitro- Manipulation der T-Zellen die GvHD-Rate mit ca. 25% in der Grössenordnung, wie sie auch bei Gabe von nichtmanipulierten Spenderlymphozyten zu erwarten ist. Ob jedoch nicht trotzdem eine partielle Inaktivierung der Spenderlymphozyten durch zytotoxische Immunreaktionen gegen die HSV-Thymidinkinase stattfand, kann nicht ausgeschlossen werden. Zumindestens konnte auch in der Studie von Tiberghien et al. (2001) in einem Patienten die durch DLI induzierte GvHD nicht allein durch Ganciclovir-Gaben eingedämmt werden. Erst die zusätzliche Corticosteroidgabe brachte den gewünschten klinischen Erfolg. However, GvHD was not successfully treated in all patients become. This was mostly due to an annihilation of the genetics modified lymphocytes returned by an immune response that probably against the non-human gene product, the HSV-TK- Protein, is directed (Verzeletti et al. 1998). Tiberghien and co-workers (2001) wanted this immune response in their clinical study prevent the HSV-tk-transduced donor lymphocytes from failing only a few weeks after stem cell transplantation (e.g. in case of relapse a CML), but prophylactically in parallel with the administration of T cell depleted grafts were infused. This should make one Tolerance of the newly formed T cells to the HSV-TK protein be induced. In fact, despite the in vitro Manipulation of the T cells caused the GvHD rate to be around 25% in the Order of magnitude, as is the case with the administration of non-manipulated drugs Donor lymphocytes are expected. But not one anyway partial inactivation of donor lymphocytes by cytotoxic Immune responses to the HSV thymidine kinase did not take place be excluded. At least in the study by Tiberghien et al. (2001) in one patient the GvHD induced by DLI should not be contained by ganciclovir alone. First the additional corticosteroid administration brought the desired clinical Success.
Eine offensichtliche Ganciclovir-Resistenz der genetisch modifizierten Lymphozyten ist ebenfalls schon in Vorläuferstudien beobachtet worden (Bonini und Bordignon 1997). Neben der immunologischen Inaktivierung wird auch ein genetisch bedingter Funktionsverlust des HSV-tk-Genes angenommen. Garin et al. (2001) konnten nachweisen, dass Spenderlymphozyten nicht selten aufgrund bestimmter Splice-Varianten mit einem fünktionsuntüchtigen HSV-tk-Gen transduziert werden, das eine 200 Basenpaare umfassende Deletion zeigt. An obvious ganciclovir resistance of the genetically modified Lymphocytes have also been observed in preliminary studies (Bonini and Bordignon 1997). In addition to immunological inactivation is also a genetic loss of function of the HSV-tk gene accepted. Garin et al. (2001) were able to demonstrate that Donor lymphocytes are not uncommon due to certain splice variants can be transduced with a non-functional HSV-tk gene, the one Deletion comprising 200 base pairs.
Weiterhin ist es durchaus auch möglich, dass durch Abschalten der viralen Promotoren ("silencing"), die die HSV-tk-Expression steuern, Ganciclovir- Resistenzen entstehen. Man weiss aus Langzeitexpressionsstudien, dass der 5 LTR-Promotor retroviraler Vektoren in Säugetierzellen sehr oft inaktiviert wird (Hoeben et al. 1991). Furthermore, it is also quite possible that by switching off the viral Promoters ("silencing") that control HSV-tk expression, ganciclovir Resistance arises. Long term expression studies have shown that the 5 LTR promoter of retroviral vectors very often in mammalian cells is inactivated (Hoeben et al. 1991).
Eine partielle Ganciclovirresistenz bei der Behandlung einer chronischen GvHD wurde von Verzeletti et al. (1998) auch auf die proliferationsabhängige Wirkunsgweise des HSV-tk/Ganciclovir-Systems zurückgeführt. Eine geringe Proliferationsaktivität der T-Zellen, wie sie bei einer chronischen GvHD vorliegen kann, reicht eventuell nicht aus, um eine effektive Zytotoxizität mit GCV auszulösen. Partial ganciclovir resistance in the treatment of chronic GvHD was developed by Verzeletti et al. (1998) also on the proliferation-dependent mode of action of the HSV-tk / ganciclovir system recycled. A low proliferation activity of the T cells, as in chronic GvHD may not be enough to trigger an effective cytotoxicity with GCV.
Zuguterletzt können natürlich auch rein pharmakologisch bedingte Resistenzen gegenüber Ganciclovir zu einer Abschwächung des Zytotoxizitätseffekts führen. Hier ist z. B. an Inaktivierungsereignisse in nachgeschalteten Signalkaskaden des Zytotoxizitäts- bzw. Apoptosemechanismus zu denken. Finally, of course, purely pharmacological ones Resistance to ganciclovir to weaken the Cytotoxicity effect. Here is z. B. inactivation events in downstream signal cascades of the cytotoxicity or Think apoptosis mechanism.
Zusammengefasst ergeben sich also die folgenden nachgewiesenen und
vermuteten Inaktivierungsmechanismen des HSV-tk/Ganciclovirsystems in
Spenderlymphozyten:
- 1. Immunologische Eliminierung der T-Zellen durch Immunisierung gegenüber dem HSV-TK-Protein
- 2. Genetische Inaktivierung durch Mutation/Deletion im HSV-tk-Gen
- 3. Genetische Inaktivierung durch Promotor-Silencing
- 4. Funktionelle Ineffektivität durch unzureichende Zellzyklusprogression
- 5. Pharmakologische Resistenz durch Inaktivierung auf der Ebene nachgeschalteter Zytotoxizitätsmechanismen
- 1. Immunological elimination of the T cells by immunization against the HSV-TK protein
- 2. Genetic inactivation by mutation / deletion in the HSV-tk gene
- 3. Genetic inactivation through promoter silencing
- 4. Functional ineffectiveness due to insufficient cell cycle progression
- 5. Pharmacological resistance through inactivation at the level of downstream cytotoxicity mechanisms
Diese Inaktivierungsmechanismen stellen einen deutlichen Nachteil des
HSV-tk/Ganciclovirsystems, also des Standes der Technik, dar, so daß die
notwendige biologische Sicherheit bei Anwendung von
Spenderlymphozyten nicht zufriedenstellend gewährleistet ist. Somit
besteht ein Bedarf nach Alternativen und Verbesserungen. Es ist daher
Aufgabe der im folgenden beschriebenen Erfindung, neue
Suizidgenstrategien zu entwickeln, die den unterschiedlichen Nachteilen
des HSV-tk/GCV-Systems bei der Anwendung in Spender-T-Zellen
Rechnung tragen sollen. Die möglichen Einschränkungen 1, 4 und 5, wie
sie der obigen Liste vermuteter Inaktivierungsmechanismen des HSV-
tk/Ganciclovirsystems in Spenderlymphozyten zu entnehmen sind, sollen
durch die Wahl alternativer Suizidgensysteme überwunden werden.
Zusätzlich wird auch den Einschränkungen 2 und 3 durch ein verändertes
Vektordesign möglichst überwunden. Dabei wurden die folgenen
Anforderungen der Lösungssuche zugrundegelegt:
- 1. Zur schnellen und effektiven Verhinderung und Behandlung einer lebensgefährlichen GvHD müssen die Spenderlymphozyten durch das Suizidgensystem zuverlässig und schnell abgetötet werden.
- 2. Die Substanz, die verwendet wird, soll wenig toxisch sein für die übrigen Körperzellen.
- 3. Das Suizidgensystem soll eine möglichst geringe Eigenimmunität aufweisen.
- 1. For the rapid and effective prevention and treatment of life-threatening GvHD, the donor lymphocytes must be killed reliably and quickly by the suicide gene system.
- 2. The substance that is used is said to be little toxic to the rest of the body cells.
- 3. The suicide system should have the lowest possible immunity.
Daher ist Gegenstand der Erfindung ein DNA-Abschnitt enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert. The invention therefore relates to a DNA section containing a first sequence for the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk), and a second sequence for the cytochrome P450 Isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs) encoded.
Ebenso ist Gegenstand der Erfindung ein viraler Vektor enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert. The invention also relates to a viral vector containing a first sequence for the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk), and a second sequence for the cytochrome P450 Isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs) encoded.
Auch ist Gegenstand der Erfindung ein retroviraler Vektor enthaltend eine erste Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und eine zweite Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert. The invention also relates to a retroviral vector containing one first sequence for the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk), and a second sequence for the cytochrome P450 Isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs) encoded.
Für alle diese Gegenstände der Erfindung, den erfindungsgemäßen DNA- Abschnitt, den erfindungsgemäßen viralen Vektor oder den erfindungsgemäßen retroviralen Vektor gilt, daß dieser mindestens zwei Promotoren, von denen vorzugsweise einer, insbesondere beide, eukaryontischen Ursprungs ist/sind, und/oder mindestens ein Selektions- oder Reportergen bzw. selektierbares Markergen enthält, und/oder die zweite Sequenz für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert. For all of these objects of the invention, the DNA Section, the viral vector according to the invention or the retroviral vector according to the invention applies that this at least two Promoters, preferably one, especially both, is / are of eukaryotic origin, and / or at least one selection or contains reporter gene or selectable marker gene, and / or the second sequence encoded for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1).
Die zentrale Lösung dieser Erfindung ist die Wahl des cyp4B1 als Element hier günstiger Suizidgensysteme, insbesondere in Kombination mit dem bereits bekannten HSV-tk/Ganciclovir(GCV)-System. Als Alternativen lagen neben dem HSV-tk/GCV-System noch mindestens 12 weitere Enzymgensysteme mit ihren Substraten vor (Aghi et al. 2000). Als einziges System neben HSV-tk/GCV ist das E. coli Cytosindeaminase (cd)/5-Fluorcytosin (5FC)-System (Mullen et al. 1994) bereits in klinischen Tumorgentherapiestudien erprobt (Crystal et al. 1997; Pandha et al. 1999; Harvey et al. 1999). Das hätte dieses System empfohlen. Es stellte sich aber überraschend heraus, daß das aus dem Kaninchen stammende Cytochrom P450 4B1 (cyp4B1)-System (Rainov et al. 1998a) wie auch das System mit menschlicher Folylpolyglutamatsynthetase (fpgs) (Aghi et al. 1999a, b) hier am geeignetsten war. The central solution of this invention is the choice of the cyp4B1 as an element cheaper suicide systems here, especially in combination with the already known HSV-tk / ganciclovir (GCV) system. As alternatives there were at least 12 more besides the HSV-tk / GCV system Enzyme gene systems with their substrates (Aghi et al. 2000). As the only system besides HSV-tk / GCV is the E. coli cytosine deaminase (cd) / 5-fluorocytosine (5FC) system (Mullen et al. 1994) already in clinical Tumor therapy studies tested (Crystal et al. 1997; Pandha et al. 1999; Harvey et al. 1999). That would have recommended this system. It turned out but surprisingly it turns out that the rabbit Cytochrome P450 4B1 (cyp4B1) system (Rainov et al. 1998a) as well the system with human folyl polyglutamate synthetase (fpgs) (Aghi et al. 1999a, b) was the most suitable here.
Das cyp4B1-System kann zwei chemisch verschiedene Substanzen aktivieren, 4-Ipomeanol (4IPO) und 2-Aminoanthracen (2AA). 4IPO ist, in höherer Dosierung eingesetzt, ein in klinischen Phase I-Studien getestetes Chemotherapeutikum (Rowinsky et al. 1993; Kastun et al. 1998). Die cyp4B1/4IPO- und cyp4B1/2AA-Systeme sind bereits als eine Möglichkeit der Krebstherapie beschrieben (s. z. B. WO 99/05299 der University of Boston, USA). Die cyp4B1/4IPO- und cyp4B1/2AA-Systeme wurden in bezug auf Toxizitätsprofil und -kinetik und auf den "Bystander effect" hin in Rattengliomzellen näher charakterisiert. Hierbei zeigte sich überraschenderweise, dass cyp4B1-transduzierte Zellen sowohl mit 2AA als auch 4IPO wesentlich schneller abgetötet werden als HSV-tk- exprimierende Zellen, die mit GCV inkubiert werden. Schon kurze Inkubationszeiten von 15-30 min Behandlung mit 2AA oder 4IPO bewirken eine signifikante Zytotoxizität im cyp4B1-System. Nach Behandlung von infizierten Lymphozyten mit unterschiedlichen Wirkkonzentrationen von 4IPO zeigt sich, dass mit höheren Dosen von 4IPO bereits nach eintägiger Behandlung nur noch 20-30% der ursprünglich über 80% cyp4B1/egfp- transduzierten Zellen leben. The cyp4B1 system can have two chemically different substances activate, 4-ipomeanol (4IPO) and 2-aminoanthracene (2AA). 4IPO is in higher doses used, a tested in phase I clinical trials Chemotherapy drug (Rowinsky et al. 1993; Kastun et al. 1998). The cyp4B1 / 4IPO and cyp4B1 / 2AA systems are already one possibility cancer therapy (see e.g. WO 99/05299 from the University of Boston, USA). The cyp4B1 / 4IPO and cyp4B1 / 2AA systems were developed in with regard to toxicity profile and kinetics and to the "bystander effect" in Rat glioma cells characterized in more detail. This showed up Surprisingly, that cyp4B1-transduced cells with both 2AA as well as 4IPO are killed much faster than HSV-tk- expressing cells that are incubated with GCV. Already short Incubate 15-30 minutes of treatment with 2AA or 4IPO significant cytotoxicity in the cyp4B1 system. After treatment of infected lymphocytes with different effective concentrations of 4IPO shows that with higher doses of 4IPO after only one day Treatment only 20-30% of the originally over 80% cyp4B1 / egfp- transduced cells live.
Dabei ist der auch bei grosser Zelldichte minimale oder gar fehlende "Bystander effect" ein großer Vorteil des Suizidgensystems mit cyp4B1. Dieser stark ausgeprägte "Bystander effect", also das Phänomen, dass auch nichttransduzierte Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft der transduzierten Zellen von den toxischen Metaboliten der aktivierten Prodrug geschädigten werden (Moolten und Wells 1990), ist hingegen eine deutliche Limitierung des HSV-tk-Systems. So sind in der Zellkultur nur 10% HSV-tk-positive Zellen notwendig, um die gesamte Zellpopulation durch eine für nichttransduzierte Zellen untoxische Ganciclovirbehandlung abzutöten. Voraussetzung hierfür ist aber ein enger Zell-zu-Zell-Kontakt. This is the minimum or even missing, even with high cell density "Bystander effect" is a great advantage of the suicide gene system with cyp4B1. This strong "bystander effect", the phenomenon that also nontransduced cells in the immediate vicinity of the transduced cells from the toxic metabolites of the activated ones Prodrug damage (Moolten and Wells 1990), however, is a clear limitation of the HSV-tk system. So are in cell culture only 10% HSV-tk positive cells necessary to cover the entire cell population by a ganciclovir treatment which is non-toxic for non-transducted cells kill. However, this requires close cell-to-cell contact.
Unter ähnlichen Zellkulturbedingungen mit engen interzellulären Kontakten zeigte sich dagegen im cyp4B1-System unter 2-AA nur ein schwacher, unter 4IPO sogar gar kein "Bystander effect". Eine Behandlung mit dem cyp4B1/4IPO-System zeigt ein großes therapeutisches Fenster in menschlichen Lymphozyten. Während unter Behandlung mit 50 µg/ml 4IPO die transduzierten Zellen innerhalb der ersten zwei Tage absterben, weisen die nichtinfizierten und die infizierten, aber nichttransduzierten Zellen keine signifikante Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten auf. Under similar cell culture conditions with tight intercellular In contrast, contacts were only found in the cyp4B1 system under 2-AA weaker, under 4IPO even no "bystander effect". A treatment with the cyp4B1 / 4IPO system shows a large therapeutic window in human lymphocytes. While under treatment with 50 µg / ml 4IPO the transduced cells die within the first two days, indicate the uninfected and the infected but not transducted Cells no significant cytotoxicity compared to untreated Lymphocytes.
Insgesamt erfüllt also das cyp4B1/IPO-System wesentliche Anforderungen für die Verwendung in Spenderlymphozyten: die schnelle Wirksamkeit und eine geringe Toxizität auf nichttransduzierte Zellen, erkennbar an dem geringen bzw. fehlenden "Bystander effect". Dazu kommt die eukaryontische Herkunft mit einer daraus folgenden geringeren Immunität als bei den Suizidgensystem viraler oder bakterieller Herkunft. Overall, the cyp4B1 / IPO system fulfills essential requirements for use in donor lymphocytes: the rapid effectiveness and low toxicity to untransduced cells, recognizable by the little or no "bystander effect". Add to that the eukaryotic origin with a consequent lower immunity than in the suicide system of viral or bacterial origin.
Es liegen außerdem erste vorläufige Ergebnisse mit menschlichen T- Lymphozyten vor, die zu beweisen scheinen, daß die in Rattengliomzellen gefundenen Ergebnisse auf humane Lymphozyten übertragen werden können (s. Beispiele). There are also preliminary results with human T- Lymphocytes that appear to prove that in rat glioma cells found results are transferred to human lymphocytes can (see examples).
Bezüglich der Transfektionrate konnten nach retroviraler Infektion auf Fibronectin mit einem Transduktionsprotokoll gemäß Hanenberg et al. 1996; Hanenberg et al. 1997 und Pollok et al. 1998 in initialen Versuchen auch ohne weitere Selektion mehr als 80% der menschlichen T-Zellen mit einem cyp4B1-egfp-Fusionsgen transduziert werden. Damit liegt das erreichte Transduktionsergebnis deutlich über den in der Literatur vorbeschriebenen Transduktionseffizienzen ohne Selektionsverfahren von 10-50% (Di lanni et al. 1999; Movassagh et al. 2000; Maddens et al. 2000). Durch dieses gute Ergebnis nach alleiniger Infektion ergibt sich eine gute Ausgangssituation, um durch anschliessende Selektion die Gesamttransduktionsrate auf nahezu 100% zu steigern und damit das Risiko einer unkontrollierten GvHD durch initial nichttransduzierte Lymphozyten nahezu auszuschliessen. Regarding the transfection rate after retroviral infection, Fibronectin with a transduction protocol according to Hanenberg et al. 1996; Hanenberg et al. 1997 and Pollok et al. 1998 in initial trials even without further selection using more than 80% of human T cells a cyp4B1-egfp fusion gene can be transduced. So that's it transduction result achieved significantly above that in literature transduction efficiencies described above without selection process of 10-50% (Di lanni et al. 1999; Movassagh et al. 2000; Maddens et al. 2000). This good result after infection alone results in a good starting point for the selection To increase the overall transduction rate to almost 100% and with that Risk of uncontrolled GvHD from initially non-transduced Almost exclude lymphocytes.
Das zweite neue System, das fpgs-System, ist kein Suizidgensystem im eigentlichen Sinne. Es aktiviert nämlich keine unwirksame Vorläufersubstanz. Vielmehr verstärkt dieses Gen die Wirkung des an sich schon potenten Chemotherapeutikums Methotrexat (MTX), indem es seine intrazelluläre Verweildauer verlängert. So konnte durch Transfer des fpgs- Genes im Rattenhirntumormodell die tumorwirksame Methotrexatdosis abgesenkt und damit die Nebenwirkungsrate auf normale Körperzellen verringert werden (Aghi et al. 1999a). Auch das fpgs/MTX-System zeigt keinen "Bystander effect" und verspricht aufgrund seiner menschlichen Herkunft deutlich verringerte Eigenimmunität. Niedrigdosiertes MTX wird bereits in der klinischen Routine zur GvHD-Prophylaxe nach allogener Stammzelltransplantation eingesetzt. Die Wirksamkeit von MTX auf T- Zellen zur Unterdrückung einer GvHD ist damit erwiesen. The second new system, the fpgs system, is not a suicide system in the proper sense. It does not activate any ineffective ones Precursor substance. Rather, this gene enhances the effect of the already potent chemotherapy drug methotrexate (MTX) by taking its intracellular length of stay prolonged. By transferring the fpgs- Genes in the rat brain tumor model the tumor effective methotrexate dose lowered and thus the side effect rate on normal body cells can be reduced (Aghi et al. 1999a). The fpgs / MTX system also shows no "bystander effect" and promises due to its human Origin significantly reduced immunity. Low dose MTX will already in the clinical routine for GvHD prophylaxis after allogeneic Stem cell transplantation used. The effectiveness of MTX on T- This has proven cells to suppress GvHD.
Besonders bevorzugt und daher im Zentrum dieser Erfindung stehend ist die Kombination von zwei Suizidgensystemen. Diese Kombination mehrerer Suizidgensysteme, also des bekannten HSV-tk-Systems mit dem cyp4B1- oder fpgs-System, hat sich als vorteilhaft für die biologische Sicherung von Spenderlymphozyten herausgestellt, da sie dem bereits beschriebenen genetischen Mechanismen der Systeminaktivierung effektiv entgegenwirken kann. Durch die Verwendung von zwei Suizidgenen, insbesondere solcher, die unter der Kontrolle von unabhängigen Promotoren stehen, wird das Risiko einer Inaktivierung durch Mutation/Deletion des Suizidgens oder durch Abschalten der Promotoraktivität erheblich reduziert: Bei Inaktivierung des einen Suizidgenes greift nämlich immer noch das zweite Gen. Die gleichzeitige Inaktivierung beider Systeme kann in diesem Zusammenhang als relativ unwahrscheinliches Ereignis angesehen werden, zumindestens um ein Vielfaches unwahrscheinlicher als die Inaktivierung eines Einzelsystems. Die Kombination unterschiedlicher Suizidgensysteme wirkt zusätzlich auch der Entwicklung pharmakologischer Resistenzen entgegen. Is particularly preferred and is therefore at the center of this invention the combination of two suicide systems. That combination several suicide systems, i.e. the well-known HSV-tk system the cyp4B1 or fpgs system, has proven beneficial to the biological Backup of donor lymphocytes was exposed as it already did described genetic mechanisms of system inactivation can counteract effectively. By using two Suicide genes, especially those under the control of independent promoters, the risk of inactivation by mutation / deletion of the suicide gene or by switching off the Promoter activity significantly reduced: when one is inactivated Suicide genes still attack the second gene. The simultaneous Deactivating both systems can be relative in this context unlikely event to be viewed, at least by one Much less likely than inactivating a single system. The combination of different suicide systems also works the development of pharmacological resistance.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen retroviralen Vektors gilt daher, daß der Promotor, unter dessen Kontrolle die Expression der ersten Sequenz erfolgt, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, sich von dem Promotor unterscheidet unter dessen Kontrolle die Expression der zweiten Sequenz erfolgt, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert. In a preferred embodiment of the invention retroviral vector therefore applies to the promoter, under its control the expression of the first sequence is carried out for the herpes simplex Virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) encodes itself from the promoter under his control distinguishes the expression of the second sequence done for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or the encoded human folyl polyglutamate synthase (fpgs).
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
retroviralen Vektors gilt, daß der Vektor neben der ersten Sequenz, die für
die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und der
zweiten Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1)
oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs) kodiert, folgende
Funktonselemente enthält:
- a) einen 5'-LTR und einen 3'-LTR vorzugsweise von einem Retrovirus,
- b) mindestens einen, vorzugsweise zwei, Promotoren, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SV40-Promotor, 5'- LTR mit Promotor-Funktion, CD25-Promotor und CD69-Promotor, vorzugsweise 5'-LTR mit Promotor-Funktion, CD25-Promotor und CD69-Promotor;
- c) mindestens ein Selektions- oder Reportergen, bzw. selektierbares Markergen ausgewählt aus: dem vorzugsweise trunkierten Gen für den humanen "low affinity NGF Rezeptor" (LNGFR) und/oder dem vorzugsweise trunkierten humanen CD34-Gen (CD34),
- d) mindestens ein retrovirales Verpackungssignal (ψ) und
- e) gegebenfalls ein IRES-Element (IRES) mit dem die Expression des Selektions- oder Reportergens, bzw. selektierbares Markergens an die Expression der ersten oder zweiten Sequenz gekoppelt ist.
- a) a 5'-LTR and a 3'-LTR, preferably from a retrovirus,
- b) at least one, preferably two, promoters, in particular selected from the group consisting of: SV40 promoter, 5'-LTR with promoter function, CD25 promoter and CD69 promoter, preferably 5'-LTR with promoter function, CD25 Promoter and CD69 promoter;
- c) at least one selection or reporter gene or selectable marker gene selected from: the preferably truncated gene for the human "low affinity NGF receptor" (LNGFR) and / or the preferably truncated human CD34 gene (CD34),
- d) at least one retroviral packaging signal (ψ) and
- e) if appropriate, an IRES element (IRES) with which the expression of the selection or reporter gene or selectable marker gene is coupled to the expression of the first or second sequence.
Gerade die CD25- und CD69-Promotoren bieten sich zur möglichen Verminderung der Immunogenität an, da sie spezifisch für aktivierte T- Zellen sind, z. B. der CD69-Promotor der Promotor für das T-Zell- Aktivierungsantigen CD69 ist oder der CD25-Promotor der Promotor für die kurze Kette des IL-2-Rezeptors ist. Bei Verwendung solcher Promotoren z. B. zur HSV-tk-Expression wäre die Expression des Suizidgenes mit der T-Zell-Aktivierung assoziiert. Eine verminderte Expression des Fremdproteins im nichtaktivierten Zustand der T-Zellen senkt so die Wahrscheinlichkeit einer Immunisierung. Ausserdem wird so ein viraler Promotor durch einen humanen Promotor ersetzt, was das Risiko einer Promotorinaktivierung reduziert. The CD25 and CD69 promoters in particular are possible Decrease in immunogenicity since it is specific for activated T- Cells are e.g. B. the CD69 promoter the promoter for the T cell Activation antigen CD69 or the CD25 promoter is the promoter for is the short chain of the IL-2 receptor. When using such Promoters e.g. B. for HSV-tk expression would be the expression of Suicide genes associated with T cell activation. A diminished one Expression of the foreign protein in the unactivated state of the T cells this reduces the likelihood of immunization. It will also be like this a viral promoter is replaced by a human promoter, which is the Reduced risk of promoter inactivation.
Weiter ist es günstig, die Expression eines der Suizidgene über ein IRES- Element mit der Expression des trunkierten humanen CD34-Gens gekoppelt. Diese Koppelung bietet Vorteile. Das CD34-Antigen ist humanen Ursprungs und markiert hämatopoetische Progenitorzellen, aber keine reifen T-Zellen. Es existieren klinisch zugelassene, kommerziell erhältliche Selektionskits (z. B. von Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach), über die CD-34-positive Zellen mittels Microbeads selektioniert und angereichert werden können. Das gilt auch für an sich CD-34-negative reife T-Zellen, die durch retrovirale Transduktion das CD34-Antigen exprimieren. Der humane Ursprung dieses Selektions- und Reportergens schliesst eine Immunisierung gegen dieses zusätzliche genetische Material weitgehend aus. Außerdem ist die cDNA für das humane CD34- Antigen z. B. von ATCC, Manassas, USA, kommerziell erhältlich. Das zweite neben CD34 günstige Selektions- und Reportergen ist das trunkierte Gen für den humanen low affinity NGF Rezeptor (= LNGFR). Dieses Gen wurde bereits als Selektionsmarker in den klinischen Studien der Gruppe um Claudio Bordignon, Mailand, Italien, mit dem HSV-tk/GCV- System in DLIs erfolgreich eingesetzt. Die Selektion erfolgt wie bei CD34 über das MACS-System unter Vermittlung eines spezifischen Antikörpers. It is also advantageous to express the expression of one of the suicide genes via an IRES Element with the expression of the truncated human CD34 gene coupled. This coupling offers advantages. The CD34 antigen is of human origin and labeled hematopoietic progenitor cells, however no mature T cells. Clinically approved, commercially exist available selection kits (e.g. from Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach), selected via the CD-34 positive cells using microbeads and can be enriched. This also applies to CD-34 negatives mature T-cells by retroviral transduction of the CD34 antigen express. The human origin of this selection and reporter gene concludes immunization against this additional genetic Material largely from. In addition, the cDNA for human CD34 Antigen e.g. B. commercially available from ATCC, Manassas, USA. The the second selection and reporter gene besides CD34 is this truncated gene for the human low affinity NGF receptor (= LNGFR). This gene has been used as a selection marker in clinical trials the group around Claudio Bordignon, Milan, Italy, with the HSV-tk / GCV- System successfully used in DLIs. The selection is made as for CD34 via the MACS system with the mediation of a specific antibody.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des
erfindungsgemäßen retroviralen Vektors gilt, daß es sich um einen Maus
Leukämie Virus-(murine leucemia virus/MuLV)-Vektor handelt,
vorzugsweise mit einer der folgenden Abfolgen der Funktionselemente:
5'-LTR-ψ-cyp4B1-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-fpgs-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-fpgs-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-cyp4B1-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR
oder
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR.
In a particularly preferred embodiment of the retroviral vector according to the invention, it is a mouse leukemia virus (murine leucemia virus / MuLV) vector, preferably with one of the following sequences of the functional elements:
5'LTR ψ-cyp4B1-IRES-CD34-CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-FPGS-IRES-CD34-CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-FPGS-IRES-LNGFR CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-cyp4B1-IRES-LNGFR CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-LTR promoter cyp4B1-3'-,
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69 promoter FPGS-3'-LTR,
5'LTR ψ HSV-tk-IRES-CD69 LNGFR promoter cyp4B1-3' LTR
or
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR CD69 promoter FPGS-3'-LTR.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines infektiösen Retroviruspartikels, in dem
- a) eine Retrovirus-Verpackungszelle mit einem erfindungsgemäßen retroviralen Plasmid-Vektor transfiziert wird,
- b) die Retrovirus-Verpackungszelle in einem geeigneten Medium in vitro und/oder in vivo so kultiviert wird, daß infektiöse Retroviruspartikel gebildet werden.
- a) a retrovirus packaging cell is transfected with a retroviral plasmid vector according to the invention,
- b) the retrovirus packaging cell is cultivated in a suitable medium in vitro and / or in vivo in such a way that infectious retrovirus particles are formed.
Unter infektiösen Partikeln sind insbesondere verpackte retrovirale Vektoren in Envelope-Proteinen zu verstehen. Es bieten sich hier die Verpackungszellinien PA3 17 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env- Protein und pgl3 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus)-env-Protein an. Diese Verpackungszellinien werden alle für die Herstellung klinischer Vektoren genutzt. Among the infectious particles are, in particular, packaged retrovirals Understand vectors in envelope proteins. Here are the Packaging cell lines PA3 17 and AMIZ with the amphotropic MuLV-env- Protein and pgl3 with the GALV (gibbon ape leukemia virus) -env protein on. These packaging cell lines are all becoming clinical for manufacturing Vectors used.
Daher ist es besonders bevorzugt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Retrovirus-Verpackungszelle einer Zellinie ausgewählt aus den Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV- env-Protein und pg13 mit dem GALV (gibbon ape leukemia virus)-env- Protein entstammt. It is therefore particularly preferred if in the invention Method the retrovirus packaging cell of a cell line selected from the packaging cell lines PA317 and AMIZ with the amphotropic MuLV env protein and pg13 with the GALV (gibbon ape leukemia virus) -env- Protein comes from.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein infektiöses Partikel, das durch das voranstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Another object of the invention is an infectious particle that by the inventive method described above is available.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Wirtszelle enthaltend mindestens einen erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt, erfindungsgemäßen viralen Vektor, erfindungsgemäßen retroviralen Vektor und/oder erfindungsgemäßes infektiöses Partikel. Another object of the invention is a host cell containing at least one DNA section according to the invention, viral vector according to the invention, retroviral according to the invention Vector and / or infectious particle according to the invention.
Dabei kann es sich prinzipiell um jede Art von pro- oder eukaryontischer Zelle handeln. Bevorzugt ist allerdings eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle. Es ist besonders bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße Wirtszelle eine - vorzugsweise humane - Lymphozytenzelle ist. In principle, this can be any type of pro- or eukaryotic Act cell. However, a mammalian cell is preferred, in particular a human cell. It is particularly preferred if the host cell according to the invention a - preferably human - Lymphocyte cell.
Ein weiterer Gegenstand der Anmeldung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, worin die Zelle mit einem ersten und einem zweiten erfindungsgemäßen retroviralen Vektor in Form eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei der erste und der zweite erfindungsgemäße retrovirale Vektor gleich oder unterschiedlich sein können, wobei gilt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedliche Zellinien mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden. Another object of the application is a method for manufacturing a host cell according to the invention, wherein the cell with a first and a second retroviral vector according to the invention in the form of a infectious particle according to the invention is transfected, the first and the second retroviral vector according to the invention is equal to or can be different, with the fact that in the invention Process for the preparation of the infectious particles according to the invention Retrovirus packaging cells with different cell lines different packaging proteins can be used.
Die simultane Infektion (Kotransduktion) mit zwei verschiedenen oder gleichen (Kombinations)vektoren hat bedeutende Vorteile. Die Verwendung von zwei gleichen Kombinationsvektoren hat den Vorteil, dass durch die Doppelinfektion eine höhere Expression der jeweiligen Suizidgene erreicht werden kann und eine stärkere Suizidgenexpression bedeutet auch eine höhere Wirksamkeit der biologischen Sicherungssysteme. Die Kotransduktion von Lymphozyten mit unterschiedlichen Kombinationsvektoren eröffnet wiederum die Möglichkeit, dass statt einer einzelnen Zweier-Suizidgenkombination zwei verschiedene Suizidgenkombinationen parallel eingesetzt werden können. So kann bei nicht ansprechender Behandlung einer floriden GvHD mit der ersten Suizidgenkombination in einfacher Weise auf die zweite Kombination gewechselt werden, um doch noch eine wirksame GvHD- Kontrolle zu erreichen. Simultaneous infection (cotransduction) with two different or same (combination) vectors has significant advantages. The Using two identical combination vectors has the advantage that by the double infection a higher expression of the respective Suicide genes can be achieved and stronger suicide gene expression also means a higher effectiveness of biological Security systems. Co-transduction of lymphocytes with different combination vectors in turn opens the Possibility of two instead of a single combination of two suicides different combinations of suicides can be used in parallel. For example, if the GvHD is not treated properly, it can be treated with the first combination of suicides in a simple manner to the second Combination can be changed to still be an effective GvHD To achieve control.
Grundvoraussetzung für die Simultaninfektion von Lymphozyten mit zwei retroviralen Vektoren ist jedoch, dass beide retroviralen Vektoren von unterschiedlichen Verpackungzellinien mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen generiert und verpackt werden. In einer früheren Arbeit (MacNeill et al. 1999) wurde gezeigt, dass bei Verpackung von verschiedenen retroviralen Vektoren mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen keine negativen Interferenzen bei der Transduktion der gleichen Zellpopulation auftreten. Es bieten sich für die hier vorgestellten Kombinationsvektoren die klinisch genutzten Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env-Protein und pg13 mit dem GALV(gibbon ape leukemia virus)-env-Protein an. Basic requirement for the simultaneous infection of lymphocytes with two retroviral vectors, however, is that both retroviral vectors are of different packaging cell lines with different envelope Proteins are generated and packaged. In an earlier work (MacNeill et al. 1999) has been shown that when packaging different retroviral vectors with different envelope Proteins have no negative interference when transducing the same Cell population occur. It lends itself to those presented here Combination vectors the clinically used packaging cell lines PA317 and AMIZ with the amphotropic MuLV env protein and pg13 with the GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus) -env protein.
Weiterhin bietet sich an, dass die beiden verschiedenen Kombinationsvektoren mit unterschiedlichen Selektions- bzw. Reportergenen ausgestattet werden. So kann bei Kotransduktion auf zweifache Weise selektioniert werden, was der Gesamttransduktionseffizienz sicherlich zugute kommt. Ausserdem kann die Verteilung der Vektoren in der transduzierten Lymphozytenpopulation für jeden Einzelvektor getrennt, aber auch in Kombination per FACS visualisiert werden. Neben CD34 kommt das LNGFR in Frage. It also lends itself to the two different Combination vectors with different selection or Reporter genes are equipped. So can with cotransduction be selected in two ways, what the Overall transduction efficiency certainly benefits. Also can the distribution of the vectors in the transduced lymphocyte population for each individual vector, but also in combination via FACS be visualized. In addition to CD34, the LNGFR comes into question.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine doppeltmarkierte Zelle enthaltend eine erste DNA-Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und in einem separaten Molekül eine zweite DNA-Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs), vorzugsweise cyp4B1, kodiert, jeweils in Form eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikels und/oder enthaltend zum einen rekombinant exprimierte HSV-tk und zum anderen rekombinant exprimierte/s cyp4B1 oder fpgs, vorzugsweise cyp4B1. Another object of the invention is a double-labeled cell containing a first DNA sequence for the herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) encoded, and one in a separate molecule second DNA sequence for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs), preferably cyp4B1, encoded, each in the form of a DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or one infectious particle and or containing on the one hand recombinantly expressed HSV-tk and on the other recombinantly expressed cyp4B1 or fpgs, preferably cyp4B1.
Dabei kann es sich prinzipiell um jede Art von pro- oder eukaryontischer Zelle handeln. Bevorzugt ist allerdings eine Säugetierzelle, insbesondere eine humane Zelle. Es ist besonders bevorzugt, wenn die erfindungsgemäße doppeltmarkierte Zelle eine - vorzugsweise humane - Lymphozytenzelle ist. In principle, this can be any type of pro- or eukaryotic Act cell. However, a mammalian cell is preferred, in particular a human cell. It is particularly preferred if the double-labeled cell according to the invention a - preferably human - Lymphocyte cell.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, worin die Zelle mit einem ersten und einem zweiten erfindungsgemäßen retroviralen Vektor in Form eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei der erste und der zweite erfindungsgemäße retrovirale Vektor gleich oder unterschiedlich sein können, wobei gilt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedliche Zellinien mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden, oder die Zelle mit einem ersten retroviralen Vektor enthaltend eine erste DNA- Sequenz, die für die Herpes simplex Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-tk) kodiert, und mit einem zweiten retroviralen Vektor enthaltend eine zweite DNA-Sequenz, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) oder die humane Folylpolyglutamatsynthase (fpgs), vorzugsweise cyp4B1, kodiert, jeweils in Form eines infektiösen Partikels transfiziert wird, wobei gilt, daß beim Verfahren zur Herstellung der infektiösen Partikel Retrovirus-Verpackungszellen unterschiedlicher Zellinien mit unterschiedlichen Verpackungsproteinen verwendet werden. Another object of the invention is a method for manufacturing a double-labeled cell according to the invention, wherein the cell with a first and a second retroviral vector according to the invention is transfected in the form of an infectious particle according to the invention, wherein the first and the second retroviral vector according to the invention are the same or can be different, with the proviso that at Process according to the invention for the production of the invention infectious particles retrovirus packaging cells different Cell lines with different packaging proteins are used, or the cell with a first retroviral vector containing a first DNA Sequence for herpes simplex virus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) encoded, and with a second retroviral vector containing a second DNA sequence necessary for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1) or human folyl polyglutamate synthase (fpgs), preferably cyp4B1, encoded, in each case in the form of an infectious particle, where applies that in the process for producing the infectious particles Retrovirus packaging cells with different cell lines different packaging proteins can be used.
Die simultane Infektion (Kotransduktion) mit zwei verschiedenen oder gleichen Vektoren hat bedeutende Vorteile. Die Verwendung von zwei gleichen Kombinationsvektoren hat den Vorteil, dass durch die Doppelinfektion eine höhere Expression der jeweiligen Suizidgene erreicht werden kann und eine stärkere Suizidgenexpression bedeutet auch eine höhere Wirksamkeit der biologischen Sicherungssysteme. Die Kotransduktion von Lymphozyten mit unterschiedlichen Kombinationsvektoren eröffnet wiederum die Möglichkeit, dass statt einer einzelnen Zweier-Suizidgenkombination zwei verschiedene Suizidgenkombinationen parallel eingesetzt werden können. So kann bei nicht ansprechender Behandlung einer floriden GvHD mit der ersten Suizidgenkombination in einfacher Weise auf die zweite Kombination gewechselt werden, um doch noch eine wirksame GvHD-Kontrolle zu erreichen. Simultaneous infection (cotransduction) with two different or same vectors has significant advantages. The use of two same combination vectors has the advantage that by the Double infection achieved a higher expression of the respective suicide genes and a stronger suicide gene expression also means higher effectiveness of the biological safety systems. The Co-transduction of lymphocytes with different Combination vectors in turn open the possibility that instead of one individual two-suicide gene combination two different Suicide combinations can be used in parallel. So at inadequate treatment of a florid GvHD with the first Suicide combination in a simple way on the second combination be changed to still have an effective GvHD control to reach.
Grundvoraussetzung für die Simultaninfektion von Lymphozyten mit zwei retroviralen Vektoren ist jedoch, dass beide retroviralen Vektoren von unterschiedlichen Verpackungzellinien mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen generiert und verpackt werden. In einer früheren Arbeit (MacNeill et al. 1999) wurde gezeigt, dass bei Verpackung von verschiedenen retroviralen Vektoren mit unterschiedlichen Envelope- Proteinen keine negativen Interferenzen bei der Transduktion der gleichen Zellpopulation auftreten. Es bieten sich für die hier vorgestellten Kombinationsvektoren die klinisch genutzten Verpackungszellinien PA317 und AMIZ mit dem amphotropen MuLV-env-Protein und pg13 mit dem GALV(gibbon ape leukemia virus)-env-Protein an. Basic requirement for the simultaneous infection of lymphocytes with two retroviral vectors, however, is that both retroviral vectors are of different packaging cell lines with different envelope Proteins are generated and packaged. In an earlier work (MacNeill et al. 1999) has been shown that when packaging different retroviral vectors with different envelope Proteins have no negative interference when transducing the same Cell population occur. It lends itself to those presented here Combination vectors the clinically used packaging cell lines PA317 and AMIZ with the amphotropic MuLV env protein and pg13 with the GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus) -env protein.
Weiterhin bietet sich an, dass die beiden verschiedenen Kombinationsvektoren mit unterschiedlichen Selektions- bzw. Reportergenen ausgestattet werden. So kann bei Kotransduktion auf zweifache Weise selektioniert werden, was der Gesamttransduktionseffizienz zugute kommt. Ausserdem kann die Verteilung der Vektoren in der transduzierten Lymphozytenpopulation für jeden Einzelvektor getrennt, aber auch in Kombination per FACS visualisiert werden. Neben CD34 kommt das LNGFR in Frage. It also lends itself to the two different Combination vectors with different selection or Reporter genes are equipped. So can with cotransduction be selected in two ways, what the Overall transduction efficiency benefits. In addition, the Distribution of the vectors in the transduced lymphocyte population for each individual vector separately, but also in combination via FACS be visualized. In addition to CD34, the LNGFR comes into question.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein humaner Lymphozyt enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert, und/oder enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1. Another object of the invention is a human lymphocyte containing at least one DNA section, a viral vector, one retroviral vector and / or an infectious particle, the or each contains a DNA sequence which is isoenzyme 4B1 for the cytochrome P450 (cyp4B1) encoded, and / or containing recombinantly expressed cyp4B1.
Gerade dieser Lymphozyt ist ein Kern dieser Erfindung, da dieser durch den geringen "Bystander-Effekt" kombiniert mit der Effektivität des Cyp4B1 der ideale, sichere Spenderlymphozyt für eine DLI ist mit geeignetem Suizidgensystem ist, da notfalls 4IPO und 2AA eingesetzt werden können. This lymphocyte in particular is at the core of this invention because it the low "bystander effect" combined with the effectiveness of the Cyp4B1 the ideal, safe donor lymphocyte for a DLI is with a suitable one Suicide system is because 4IPO and 2AA can be used if necessary.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Arzneimittel enthaltend mindestens ein/einen/eine erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt, erfindungsgemäßen viralen Vektor, erfindungsgemäßen retroviralen Vektor, erfindungsgemäßes infektiöses Partikel, erfindungsgemäße Wirtszelle, erfindungsgemäße doppeltmarkierte Zelle und/oder erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch kompatiblen Hilfs- und/oder Trägerstoff. The invention further relates to medicaments containing at least one DNA section according to the invention, viral vector according to the invention, retroviral according to the invention Vector, infectious particle according to the invention, according to the invention Host cell, double-labeled cell according to the invention and / or human lymphocytes according to the invention and optionally at least one pharmaceutically compatible auxiliary and / or carrier.
Prinzipiell können die erfindungsgemäßen Arzneimittel als flüssige oder feste Arzneiformen insbesondere in Form von Injektionslösungen Tabletten, Kapseln oder Dragees verabreicht werden. Bevorzugt ist aber entweder der Einsatz als Therapeutikum in der Gentherapie, insbesondere der In-vitro Gentherapie, bei der Zellen außerhalb des Körpers vor dem therapeutischen Einsatz transfiziert werden, oder der Einsatz in geeigneter Form pharmzeutisch zubereiteter erfindungsgemäßer Zellen, die implantiert oder in anderer Form appliziert werden. Geeignete Hilfs- und/oder Trägerstoffe sind z. B. Lösungs- oder Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Suspensionsvermittler, Nährlösungen oder -stoffe, Transfektionshilfsmittel, Salze, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, sowie Farbstoffe, Füllstoffe, und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel parenteral, intravasal, intravenös, intraperitoneal oder intramuskulär appliziert werden soll. Für alle parenteralen Applikationen eignen sich Zubereitungen in Form von Suspensionen und Lösungen sowie leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen. In principle, the pharmaceuticals according to the invention can be in the form of liquid or solid dosage forms, in particular in the form of injection solutions Tablets, capsules or coated tablets can be administered. But is preferred either use as a therapeutic in gene therapy, in particular in vitro gene therapy, in which cells outside the body before the therapeutic use can be transfected, or use in suitable Form of pharmaceutically prepared cells according to the invention, the implanted or applied in another form. Suitable auxiliary and / or carriers are e.g. B. solvents or diluents, Stabilizers, suspending agents, nutrient solutions or nutrients, Transfection aids, salts, buffer substances, preservatives, as well as dyes, fillers and / or binders. The selection of the Auxiliaries and the amounts to be used depend on whether the drug is parenteral, intravascular, intravenous, intraperitoneal or to be applied intramuscularly. For all parenteral applications Preparations in the form of suspensions and solutions are suitable as well as easily reconstitutable dry preparations.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a) eines erfindungsgemäßen DNA Abschnitts, eines erfindungsgemäßen viralen Vektors, eines erfindungsgemäßen retroviralen Vektors, eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und/oder eines erfindungsgemäßen Arzneimittels,
- b) eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikels, der oder das jeweils eine DNA Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert; einer Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA- Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert; einer Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1; und/oder des Enzyms cyp4B1,
- c) von 4-Ipomeanol (4IPO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat (MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (4IPO), 2- Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir (GCV), vorzugsweise zusammen mit einem Gegenstand aus den Gruppen a) und/oder b),
- a) a DNA section according to the invention, a viral vector according to the invention, a retroviral vector according to the invention, an infectious particle according to the invention, a host cell according to the invention, a double-labeled cell according to the invention, a human lymphocyte according to the invention and / or a medicament according to the invention,
- b) a DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or an infectious particle which each contains a DNA sequence which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1); a cell containing at least one DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or an infectious particle, each of which contains a DNA sequence which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1); a cell containing recombinantly expressed cyp4B1; and / or the enzyme cyp4B1,
- c) of 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA), methotrexate (MTX) and / or a combination of 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA) or methotrexate (MTX) with ganciclovir (GCV) , preferably together with an object from groups a) and / or b),
Generell gilt im Rahmen dieser Erfindung, daß die Verwendung eines Gegenstands zur Behandlung einer Krankheit oder Prophylaxe gegen diese Krankheit auch als Verwendung dieses Gegenstands zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung dieser Krankheit oder Prophylaxe gegen diese Krankheit verstanden werden kann. In general, it is within the scope of this invention that the use of a Object for the treatment of a disease or prophylaxis against this disease also as a use of this item for Manufacture of a medicine to treat this disease or Prophylaxis against this disease can be understood.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a) eines DNA-Abschnitts, eines viralen Vektors, eines retroviralen Vektors und/oder eines infektiösen Partikels, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert; einer Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor, einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das jeweils eine DNA- Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert; einer Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes cyp4B1; und/oder des Enzyms cyp4B1,
- b) von 4-Ipomeanol (4IPO) und/oder von 2-Aminoanthracen (2AA), vorzugsweise zusammen mit einem Gegenstand aus der Gruppe a) in Kombination mit Reportergenen für klinische Genmarkierungsexperimente, in Kombination mit therapeutischen Genen in therapeutischen Gen-Ersatz-Ansätzen, zur Umwandlung von Donor-Lymphozyten für die Leukämie Rezidiv-Prophylaxe und zur Behandlung nach allogenetischer Knochenmarkstransplantation (allo-BMT).
- a) a DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or an infectious particle, each of which contains a DNA sequence which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1); a cell containing at least one DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or an infectious particle, each of which contains a DNA sequence which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1); a cell containing recombinantly expressed cyp4B1; and / or the enzyme cyp4B1,
- b) of 4-ipomeanol (4IPO) and / or of 2-aminoanthracene (2AA), preferably together with an object from group a) in combination with reporter genes for clinical gene labeling experiments, in combination with therapeutic genes in therapeutic gene replacement approaches , for converting donor lymphocytes for leukemia relapse prevention and for treatment after allogenetic bone marrow transplantation (allo-BMT).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung
- a) eines erfindungsgemäßen DNA-Abschnitts, eines erfindungsgemäßen viralen Vektors, eines erfindungsgemäßen retroviralen Vektors, eines erfindungsgemäßen infektiösen Partikels, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, einer erfindungsgemäßen doppeltmarkierten Zelle, eines erfindungsgemäßen humanen Lymphozyten und/oder eines erfindungsgemäßen Arzneimittels oder
- b) von 4-Ipomeanol (4IPO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat (MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (4IPO), 2- Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir (GCV) zusammen mit einem Gegenstand aus der Gruppe a)
- a) a DNA section according to the invention, a viral vector according to the invention, a retroviral vector according to the invention, an infectious particle according to the invention, a host cell according to the invention, a double-labeled cell according to the invention, a human lymphocyte according to the invention and / or a medicament according to the invention or
- b) of 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA), methotrexate (MTX) and / or a combination of 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA) or methotrexate (MTX) with ganciclovir (GCV) together with an object from group a)
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Behandlungsverfahren, bei dem einem Menschen oder Tier, das eine solche Behandlung benötigt, in geeigneter Form ein erfindungsgemäßes Arzneimittel appliziert wird. Another object of the invention is a treatment method in to a person or animal in need of such treatment in a suitable form, a medicament according to the invention is applied.
Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein
Behandlungsverfahren zur Behandlung von Leukämie, insbesondere der
chronischen oder akuten myeloischen Leukämie (CML oder AML) sowie
der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) wie auch des
myelodysplastischen Syndroms (MDS), des Multiplen Myeloms und des
NHL-Lymphoms, und/oder zur Behandlung von oder Prophylaxe gegen
Graft versus Host-Reaktionen, insbesondere nach Applikation von
Spenderlymphozyten, bei dem in einem ersten Schritt
a) entweder eine erfindungsgemäßen Wirtszelle, eine erfindungsgemäße
doppeltmarkierte Zelle, ein erfindungsgemäßer humaner Lymphozyt, eine
Zelle enthaltend mindestens einen DNA-Abschnitt, einen viralen Vektor,
einen retroviralen Vektor und/oder ein infektiöses Partikel, der oder das
jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die für das Cytochrom P450 Isoenzym
4B1 (cyp4B1) kodiert; oder eine Zelle enthaltend rekombinant exprimiertes
cyp4B1 nach den üblichen Methoden hergestellt werden,
oder Spenderlymphozyten mit einem erfindungsgemäßen DNA-Abschnitt,
einem erfindungsgemäßen viralen Vektor, einem erfindungsgemäßen
retroviralen Vektor, einem erfindungsgemäßen infektiösen Partikel oder
mit einem DNA-Abschnitt, viralen Vektor, retroviralen Vektor und/oder
infektiösen Partikel, der oder das jeweils eine DNA-Sequenz enthält, die
für das Cytochrom P450 Isoenzym 4B1 (cyp4B1) kodiert, (möglichst
vollständig) transfiziert werden,
diese dann dem Patienten in einem zweiten Schritt b) appliziert werden,
und gegebenenfalls in einem dritten Schritt c), falls schwerwiegende Graft
versus Host-Reaktionen dies notwendig erscheinen lassen, dem
Patienten 4-Ipomeanol (4IPO), 2-Aminoanthracen (2AA), Methotrexat
(MTX) und/oder einer Kombination von 4-Ipomeanol (4IPO), 2-
Aminoanthracen (2AA) oder Methotrexat (MTX) mit Ganciclovir (GCV), in
geeigneter pharmazeutischer Zubereitung und geeigneter Dosis und Form
appliziert werden, um die in Schritt b) applizierten Zellen wieder abzutöten.
Another preferred subject of the invention is a treatment method for the treatment of leukemia, in particular chronic or acute myeloid leukemia (CML or AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL) as well as myelodysplastic syndrome (MDS), multiple myeloma and NHL- Lymphoma, and / or for the treatment of or prophylaxis against graft versus host reactions, in particular after application of donor lymphocytes, in the first step
a) either a host cell according to the invention, a double-labeled cell according to the invention, a human lymphocyte according to the invention, a cell containing at least one DNA segment, a viral vector, a retroviral vector and / or an infectious particle, each of which contains a DNA sequence, which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1); or a cell containing recombinantly expressed cyp4B1 can be produced by the customary methods,
or donor lymphocytes with a DNA section according to the invention, a viral vector according to the invention, a retroviral vector according to the invention, an infectious particle according to the invention or with a DNA section, viral vector, retroviral vector and / or infectious particles which each contain a DNA sequence , which codes for the cytochrome P450 isoenzyme 4B1 (cyp4B1), are (if possible completely) transfected,
these are then applied to the patient in a second step b),
and if necessary in a third step c), if serious graft versus host reactions make this appear necessary, the patient 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA), methotrexate (MTX) and / or a combination of 4-ipomeanol (4IPO), 2-aminoanthracene (2AA) or methotrexate (MTX) with ganciclovir (GCV), in a suitable pharmaceutical preparation and in a suitable dose and form, in order to kill the cells applied in step b) again.
Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn das verwendete Suizidgensystem mindestens Cyp4B1 umfaßt bzw. Zellen eingesetzt werden, die mit Sequenzen transfiziert wurden, die für Cyp4B1 kodieren, oder rekombinant exprimiertes Cyp4B1 enthalten. Ebenfalls vorteilhaft ist dann der differenzierte Einsatz der zu aktivierenden Wirkstoffe 4IPO und 2AA in einem Therapieschema, das ihre Wirkungsunterschiede und Vorteile berücksichtigt, also die schnellere und stärkere Wirkung von 2AA auf der einen und der fehlende Bystander-Effekt von 4IPO auf der anderen Seite. Ein Beispiel wäre bei einer starken Graft-versus-Host-Reaktionen nach Applikation von mit Cyp4B1 transfizierten Spenderlymphozyten der sofortige Einsatz von 2AA, um möglichst effektiv und schnell die Symptome zu bekämpfen, gefolgt von einer langfristigeren Behandlung mit 4IPO, um eine vollständige Abtötung der Spenderlymphozyten zu erreichen, - aber ohne Schädigung des restlichen Gewebes. It is particularly preferred if the suicide gene system used comprises at least Cyp4B1 or cells are used which are associated with Sequences encoding Cyp4B1, or contain recombinantly expressed Cyp4B1. It is then also advantageous the differentiated use of the active ingredients to be activated 4IPO and 2AA in a therapy regimen that shows their differences in effects and benefits takes into account, i.e. the faster and stronger effect of 2AA on the one and 4IPO's missing bystander effect on the other. An example would be after a strong graft versus host response Application of donor lymphocytes transfected with Cyp4B1 Immediate use of 2AA to get the most effective and fast Combat symptoms followed by longer-term treatment with 4IPO to completely kill donor lymphocytes reach - but without damaging the remaining tissue.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Behandlungsmethode mittels eines Suizidgensystems mit Cyp4B1 zur Behandlung von Krebsarten, bei denen ein "Bystander Effekt" langfristig nicht erwünscht ist, in denen explizit cyp4B1 in Kombination mit 2AA und insbesondere mit 4IPO eingesetzt wird. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die zu aktivierenden Wirkstoffe 4IPO und 2AA differenziert in einem Therapieschema eingesetzt werden, das ihre Wirkungsunterschiede und Vorteile berücksichtigt, also die schnellere und stärkere Wirkung von 2AA auf der einen und der fehlende Bystander-Effekt von 4IPO auf der anderen Seite. Ein Beispiel wäre der frühe Einsatz von 2AA, um möglichst effektiv und schnell die Krebszellen zu bekämpfen, gefolgt von einer langfristigeren Behandlung mit 4IPO, um eine vollständige Abtötung der Krebszellen ohne Schädigung des restlichen Gewebes zu erreichen. Another object of the invention is a treatment method using a suicide gene system with Cyp4B1 for the treatment of Cancers in which a "bystander effect" is not desired in the long term in which explicitly cyp4B1 in combination with 2AA and in particular with 4IPO is used. It is particularly preferred if the activating active ingredients 4IPO and 2AA differentiated in one Therapy scheme can be used that their differences in effects and Benefits taken into account, i.e. the faster and stronger effect of 2AA on the one hand and 4IPO's missing bystander effect on the other side. An example would be the early use of 2AA, to the extent possible fight cancer cells effectively and quickly, followed by one long-term treatment with 4IPO to completely kill the Reach cancer cells without damaging the remaining tissue.
Im folgenden Abschnitt wird die Erfindung weiter durch Beispiele erläutert, ohne sie darauf zu beschränken. In the following section, the invention is further illustrated by examples, without limiting it to that.
Abb. 1 zeigt die retroviral vermittelte Transduktion von menschlichen Lymphozyten mit dem cyp4B1-egfp Fusionsgen. Fig. 1 shows the retrovirally mediated transduction of human lymphocytes with the cyp4B1-egfp fusion gene.
Abb. 2 Persistenz vitaler transduzierter Lymphozyten unter 1-8 tägiger Behandlung mit unterschiedlichen Dosen von 4IPO. Fig. 2 Persistence of vital transduced lymphocytes under 1-8 days of treatment with different doses of 4IPO.
Abb. 3 Abtötungskinetik menschlicher Lymphozyten unter Behandlung mit 4IPO [µg/ml] in Abhängigkeit vom Infektions- und Transduktionsstatus. Fig. 3 Kinetics of killing human lymphocytes under treatment with 4IPO [µg / ml] depending on the infection and transduction status.
Abb. 4 zeigt die Zytotoxizität von 2AA und 4IPO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9L-Zellen (9I-tk). Die Überlebenrate wurde nach einem Tag im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (= 100%) errechnet. Es werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt. Fig. 4 shows the cytotoxicity of 2AA and 4IPO in 9L cells (9L-4B1) transduced with cyp4B1 and of GCV in 9L cells (9I-tk) transduced with HSV-tk. The survival rate was calculated after one day in relation to the untreated cells (= 100%). The average percentage results of up to 5 different experiments are shown.
Abb. 5 zeigt die Zytotoxizität von 2AA und 4IPO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9L-Zellen (9I-tk). Die Überlebenrate wurde nach zwei Tagen im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (= 100%) errechnet. Es werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt. Fig. 5 shows the cytotoxicity of 2AA and 4IPO in 9L cells (9L-4B1) transduced with cyp4B1 and of GCV in 9L cells (9I-tk) transduced with HSV-tk. The survival rate was calculated after two days in relation to the untreated cells (= 100%). The average percentage results of up to 5 different experiments are shown.
Abb. 6 zeigt den "Bystander effect" in verschiedenen Cokulturen nach Behandlung mit 4IPO (A) und 2AA (B). Die "Bystander" Abtötungsrate wurde in Cokulturen mit verschiedenen Verhältnissen zwischen untransduzierten und transduzierten 9L-Zellen (9L/9L-4B1) in Gegenwart von 5 µg/ml 4IPO oder 2AA gemessen. Die Überlebensrate wurde nach 1 und 2 Tagen Wirkstoffbehandlung bestimmt. Die gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt aus wenigstens 2 unabhängigen Expperimenten. Fig. 6 shows the "bystander effect" in different cocultures after treatment with 4IPO (A) and 2AA (B). The "bystander" kill rate was measured in cocultures with different ratios between untransduced and transduced 9L cells (9L / 9L-4B1) in the presence of 5 µg / ml 4IPO or 2AA. The survival rate was determined after 1 and 2 days of drug treatment. The results shown are the average of at least 2 independent experiments.
Es ist anzumerken, daß der Inhalt der zitierten Literatur vollinhaltlich Teil der vorliegenden Beschreibung ist. Insbesondere bezüglich experimenteller Bedingungen sind diese Literaturstellen als Teil der Offenbarung dieser Erfindung zu betrachten. It should be noted that the full content of the literature cited of the present description. Especially regarding experimental conditions, these references are part of the Consider disclosure of this invention.
Für die Transduktion von T-Zellen wurde das cyp4B1-egfp-Fusionsgen (Rainov et al. 1998 b; Steffens et al. 2000) in einen retroviralen Vektor eingebaut, so dass die Identifizierung erfolgreich transduzierter Zellen im FACS (fluorescence-activating cell sorting) über die Eigenfluoreszenz der egfp-Komponente (egfp = enhanced green fluorescence protein) sehr einfach ist. Dabei wurde bereits in früheren Arbeiten (Steffens et al. 2000) nachgewiesen, dass die Zytotoxizität des Suizidgens und die Eigenfluoreszenz des egfp im Fusionsgen erhalten bleibt und eng miteinander korreliert sind. Nach retroviraler Infektion auf Fibronectin mit einem Transduktionsprotokoll nach Hanenberg et al. 1996; Hanenberg et al. 1997 und Pollok et al. 1998 konnten in initialen Versuchen, wie in Abb. 1 gezeigt, auch ohne weitere Selektion mehr als 80% der menschlichen T-Zellen mit dem cyp4B1-egfp-Fusionsgen transduziert werden. Damit liegt das erreichte Transduktionsergebnis deutlich über den in der Literatur vorbeschriebenen Transduktionseffizienzen ohne Selektionsverfahren von 10-50% (Di lanni et al. 1999; Movassagh et al. 2000; Maddens et al. 2000). Durch dieses gute Ergebnis nach alleiniger Infektion ergibt sich eine gute Ausgangssituation, um durch anschliessende Selektion die Gesamttransduktionsrate auf nahezu 100% zu steigern und damit das Risiko einer unkontrollierten GvHD (Graft- versus-Host-Disease) durch initial nichttransduzierte Lymphozyten nahezu auszuschliessen. For the transduction of T cells, the cyp4B1-egfp fusion gene (Rainov et al. 1998 b; Steffens et al. 2000) was inserted into a retroviral vector, so that the identification of successfully transduced cells in FACS (fluorescence-activating cell sorting) is very simple via the inherent fluorescence of the egfp component (egfp = enhanced green fluorescence protein). It has already been demonstrated in previous work (Steffens et al. 2000) that the cytotoxicity of the suicide gene and the intrinsic fluorescence of the egfp are retained in the fusion gene and are closely correlated with one another. After retroviral infection with fibronectin using a transduction protocol according to Hanenberg et al. 1996; Hanenberg et al. 1997 and Pollok et al. In 1998, in initial experiments, as shown in Fig. 1, more than 80% of human T cells could be transduced with the cyp4B1-egfp fusion gene without further selection. The transduction result achieved is thus significantly above the transduction efficiencies of 10-50% described in the literature without a selection process (Di lanni et al. 1999; Movassagh et al. 2000; Maddens et al. 2000). This good result after infection alone results in a good starting situation in order to increase the overall transduction rate to almost 100% by subsequent selection and thus to virtually exclude the risk of uncontrolled GvHD (graft versus host disease) from initially untransduced lymphocytes.
9L Ratten Glioma Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 in RPMI-Medium ergänzt mit 1 mM Natrium-Pyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum kultiviert. Es wurden 9L-Zellen hergestellt, die stabil cyp4B1 (9L-4B1), HSV-tk (9L-tk) und egfp (enhanced green fluorescent protein) der Fusionsgene (cyp4B1/EGFP (9L-4B1/EGFP) und egfp/HSV-tk (9L- tk/EGFP) exprimieren. Die Zellinie 9L-4B1/EGFP wurde durch liposomale Transfektion von 9L-Zellen mit dem Plasmid p4b1-egfp, das das cyp4b1/egfp Fusionsgen und das Neomycinresistenz vermittelnde Gen enthält, hergestellt, gefolgt von einer Selektion einzelner Zellklone durch G4I8 Behandlung [1 mg/ml]. 9L rat glioma cells were cultured at 37 ° C and 5% CO 2 in RPMI medium supplemented with 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin and 10% heat-inactivated fetal calf serum , 9L cells were produced which stably contain cyp4B1 (9L-4B1), HSV-tk (9L-tk) and egfp (enhanced green fluorescent protein) of the fusion genes (cyp4B1 / EGFP (9L-4B1 / EGFP) and egfp / HSV- tk (9L-tk / EGFP) The cell line 9L-4B1 / EGFP was prepared by liposomal transfection of 9L cells with the plasmid p4b1-egfp containing the cyp4b1 / egfp fusion gene and the neomycin resistance-mediating gene, followed by one Selection of individual cell clones by G4I8 treatment [1 mg / ml].
Zu Feststellung zytotoxischer Effekte wurden die Zellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro Well ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 2AA, 4IPO und CGV behandelt, wobei die Behandlung vorzugsweise mit 5 µg/ml [25 µM] 2AA, 5 µg/ml [30 µM] 4IPO oder 10 µg/ml [39 µM] CGV erfolgte. Das Prodrug enthaltende Medium wurde nach definierten Zeiträumen zwischen 15 Minuten und 8 Stunden entfernt und die Zellen weiter 1 oder 2 Tage auf Medium belassen, das keine Prodrugs enthielt. Als Kontrollen wurden Zellen durchgehend 1 oder 2 Tage in Prodrug (oder kein Prodrug) enthaltendem Medium belassen. In jedem Falle wurden die Zellen nach jeweils 1 oder 2 Tagen trypsinisiert und über einen Coulter Counter Z1 gezählt. Es wurde das Verhältnis überlebender Zellen zur Anzahl unbehandelter Kontrollzellen (100%) bestimmt. Die Zellzahlen von bis zu 5 unabhängigen Experimenten wurden statistisch ausgewertet, wobei der Student-t-Test zur Bestimmung signifikanter Differenzen zwischen den verschiedenen Suizidgen- Therapie-Systemen verwendet wurde. Die Signifikanzbewertung wurde für jeden Zeitmeßpunkt der Prodrugbehandlung vorgenommen und die statistische Signifikanz auf p < 0,05 festgelegt. To determine cytotoxic effects, the cells were plated in 6-well plates at a density of 4 × 10 5 cells per well. After 24 hours, the cells were treated with 2AA, 4IPO and CGV, the treatment preferably being carried out with 5 µg / ml [25 µM] 2AA, 5 µg / ml [30 µM] 4IPO or 10 µg / ml [39 µM] CGV. The medium containing the prodrug was removed after defined periods of between 15 minutes and 8 hours and the cells were left for a further 1 or 2 days on medium which did not contain any prodrugs. As controls, cells were left in medium containing prodrug (or no prodrug) for 1 or 2 days. In each case, the cells were trypsinized after 1 or 2 days and counted using a Coulter Counter Z1. The ratio of surviving cells to the number of untreated control cells (100%) was determined. The cell counts from up to 5 independent experiments were statistically evaluated, using the Student's t-test to determine significant differences between the different suicide gene therapy systems. The significance assessment was carried out for each time measurement point of the prodrug treatment and the statistical significance was set to p <0.05.
Zur Abgrenzung cytotoxischer Effekte von cytostatischen in Abhängigkeit von der Länge der Prodrugbehandlung wurden 9L-4B1 und 9L-tk-Zellen wie oben beschrieben behandelt. Nach einem Tag wurden die überlebenden Zelle trypsinisiert, gezählt und wieder auf 100 mm Petrischalen mit einer Dicht von 103 Zellen pro Schale in einem kein Prodrug enthaltenden Medium ausplattiert. 9 Tage später wurden nach Fixierung mit 80% Ethanol und Anfärbung mit Grams Kristallviolett Kolonien mit einem Duchmesser < 1 mm gezählt. To differentiate cytotoxic effects from cytostatic depending on the length of the prodrug treatment, 9L-4B1 and 9L-tk cells were treated as described above. After one day the surviving cells were trypsinized, counted and plated again on 100 mm Petri dishes with a density of 10 3 cells per dish in a medium containing no prodrug. 9 days later, after fixation with 80% ethanol and staining with Grams crystal violet, colonies were counted with a diameter of <1 mm.
Nach Behandlung der nach Beispiel 1 infizierten Lymphozyten mit unterschiedlichen Wirkkonzentrationen von 4IPO zeigt sich, dass mit höheren Dosen von 4IPO (25-50 mg/ml) bereits nach eintägiger Behandlung nur noch 20-30% der ursprünglich über 80% cyp4B1/egfp- transduzierten Zellen leben. Auch mit geringeren Dosen von 5-10 µg/ml 4IPO sind nach ca. 4tägiger Behandlungsdauer weniger als 10% vitale transduzierte Lymphozyten nachweisbar (Abb. 2). After treatment of the lymphocytes infected according to Example 1 with different active concentrations of 4IPO, it can be seen that with higher doses of 4IPO (25-50 mg / ml) only 20-30% of the originally over 80% cyp4B1 / egfp-transduced after one day of treatment Cells live. Even with lower doses of 5-10 µg / ml 4IPO, less than 10% vital transduced lymphocytes can be detected after about 4 days of treatment ( Fig. 2).
Abb. 3 dokumentiert das therapeutische Fenster einer 4IPO- Behandlung in menschlichen gemäß Beispiel 1 behandelten Lymphozyten. Während unter Behandlung mit 50 µg/ml 4IPO die transduzierten Zellen innerhalb der ersten zwei Tage absterben, weisen die nichtinfizierten und die infizierten, aber nichttransduzierten Zellen keine signifikante Zytotoxizität im Vergleich zu unbehandelten Lymphozyten auf. Die Versuche mit infizierten, aber nichttransduzierten Lymphozyten bestätigen damit nachdrücklich die Abwesenheit eines "Bystander effects" unter Behandlung mit dem cyp4B1/4IPO-Suizidgensystems. Fig. 3 documents the therapeutic window of a 4IPO treatment in human lymphocytes treated according to Example 1. While the transduced cells die within the first two days under treatment with 50 µg / ml 4IPO, the uninfected and the infected, but non-transduced cells show no significant cytotoxicity compared to untreated lymphocytes. The experiments with infected but non-transducted lymphocytes thus confirm the absence of a "bystander effect" when treated with the cyp4B1 / 4IPO suicide gene system.
Hier wird die Zytotoxizität von 2AA und 4IPO in mit cyp4B1 transduzierten 9L-Zellen (9L-4B1) und von GCV in mit HSV-tk transduzierten 9L-Zellen (9L-tk) gezeigt, wobei die Transduktion gemäß Beispiel 2 erfolgte. 9L-4B1- Zellen wurden mit 5 µg/ml 2AA [25 µM] oder 4IPO [30 µM] über die angegebene Zeit behandelt, wobei eine Inkubation in regulärem Medium folgte. Die Parallelexperimente wurden mit 9L-tk-Zellen durchgeführt, die mit 10 µg/ml GCV [39 µM] behandelt waren. Für Kontrollexperimente wurden 9L-, 9L-4B1-, 9L4B1-/EGFP-, 9L-tk- und 9L-tk/EGFP-Zellen ohne Wirkstoffbehandlung kultiviert. Here the cytotoxicity of 2AA and 4IPO is transduced with cyp4B1 9L cells (9L-4B1) and by GCV in 9L cells transduced with HSV-tk (9L-tk), the transduction taking place according to Example 2. 9L 4B1- Cells were treated with 5 µg / ml 2AA [25 µM] or 4IPO [30 µM] given time treated, incubation in regular medium followed. The parallel experiments were carried out with 9L-tk cells that were treated with 10 µg / ml GCV [39 µM]. For control experiments 9L, 9L-4B1, 9L4B1 / EGFP, 9L-tk and 9L-tk / EGFP cells were without Cultivated drug treatment.
Die Überlebenrate wurde nach einem Tag (Abb. 4) und zwei Tagen (Abb. 5) im Verhältnis zu den unbehandelten Zellen (= 100%) errechnet. Es werden die durchschnittlichen prozentualen Ergebnisse von bis zu 5 unterschiedlichen Experimenten gezeigt. The survival rate was calculated after one day ( Fig. 4) and two days ( Fig. 5) in relation to the untreated cells (= 100%). The average percentage results of up to 5 different experiments are shown.
2AA zeigte den schnellsten und stärksten Effekt, während 4IPO ähnliche Effektivität wie CGV zeigte. 2AA showed the fastest and strongest effect, while 4IPO showed similar effects Effectiveness as shown by CGV.
Der "Bystander effect" in verschiedenen Cokulturen nach Behandlung mit 4IPO (A) und 2AA (B) wurde untersucht. Um den "Bystander effect zu untersuchen wurde eine Cokultivierung mit transduzierten (9L-4B1) und nativen 9L-Zellen durchgeführt, wobei die Transduktion gemäß Beispiel 2 erfolgte. Verschiedene Verhältnisse von 9U9L-4B1 Zellen wurden in 6 Well-Platten in einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro Well ausplattiert und anschließend für 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden mit 5 µg/ml 2AA [25 µM] oder 4IPO [30 µM] für 1 bis 6 Tage gefolgt von der Bestimmung der Zellüberlebensrate behandelt. The "bystander effect" in different cocultures after treatment with 4IPO (A) and 2AA (B) was investigated. In order to investigate the bystander effect, cocultivation was carried out with transduced (9L-4B1) and native 9L cells, the transduction taking place according to Example 2. Different ratios of 9U9L-4B1 cells were in 6-well plates with a density of 4 × 10 5 cells were plated out per well and then incubated for 24 hours The cells were treated with 5 µg / ml 2AA [25 µM] or 4IPO [30 µM] for 1 to 6 days followed by the determination of the cell survival rate.
Es zeigte sich (s. Abb. 6), daß 2AA nur einen moderaten bis
geringen "Bystander effect" zeigte (geringer als bei GCV), während er bei
4IPO völlig fehlte. Die gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt aus
wenigstens 2 unabhängigen Experimenten.
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Claims (20)
5'-LTR-ψ-cyp4B1-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-fpgs-IRES-CD34-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-fpgs-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-cyp4B1-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-HSV-tk-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR,
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-cyp4B1-3'-LTR
oder
5'-LTR-ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR-CD69-Promotor-fpgs-3'-LTR. 7. Retroviral vector according to one of claims 3 to 6, characterized in that it is a mouse leukemia virus (murine leucemia virus / MuLV) vector, preferably with one of the following sequences of the functional elements:
5'LTR ψ-cyp4B1-IRES-CD34-CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-FPGS-IRES-CD34-CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-FPGS-IRES-LNGFR CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-cyp4B1-IRES-LNGFR CD69 promoter HSV-tk-3'-LTR,
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69-LTR promoter cyp4B1-3'-,
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-CD34-CD69 promoter FPGS-3'-LTR,
5'LTR ψ HSV-tk-IRES-CD69 LNGFR promoter cyp4B1-3' LTR
or
5'LTR ψ-HSV-tk-IRES-LNGFR CD69 promoter FPGS-3'-LTR.
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