DE10157336B4

DE10157336B4 - Method for producing a test system and diagnostic method for detecting pancreatic function disorders

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Publication number: DE10157336B4
Application number: DE10157336A
Authority: DE
Inventors: Hans-Werner Prof. Dr. Heinrich; Rainer Dipl.-Biol. Kleinert; Martin Dr. Holtzhauer
Original assignee: Bioserv Analytik und Medizinprodukte GmbH
Current assignee: R Biopharm AG
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-11-23
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2021-11-24
Also published as: DE10157336A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Testsystems für die Erkennung von Pankreasfunktionsstörungen, mit dem ein breites Spektrum pankreatischer Proteine nachweisbar ist, umfassend die Schritte
– Verdau von humanem Pankreassekret durch chemische oder enzymatische Spaltung der darin enthaltenen Proteine in Oligonukleotide,
– Immunisierung eines Tiers mit dem so verdauten humanen Pankreassekret,
– Gewinnung und Aufreinigung der in dem Tier oder in einem von diesem gelegten Ei gebildeten Antikörper, und
– Bindung einer Kombination der aufgereinigten Antiköper an einen geeigneten Träger.A method of making a pancreatic function disorder detection system capable of detecting a broad spectrum of pancreatic proteins comprising the steps
Digestion of human pancreatic secretase by chemical or enzymatic cleavage of the proteins contained therein into oligonucleotides,
Immunization of an animal with the human pancreatic secretin thus digested,
Recovery and purification of the antibodies produced in the animal or in an egg laid by it, and
Binding of a combination of the purified antibodies to a suitable carrier.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erkennung einer Pankreatitis. Das Ziel wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Untereinheiten aus einer enzymatischen Verdauung oder chemischen Spaltung exokriner Pankreasproteine als Antigene für die Gewinnung spezifischer Antikörper und deren Verwendung in immunchemischen Testverfahren erreicht.The The invention relates to a method for detecting pancreatitis. The goal is achieved by the invention the use of subunits from an enzymatic digestion or chemical cleavage of exocrine pancreatic proteins as antigens for the Obtaining specific antibodies and their use in immunochemical testing procedures.

Die wichtigsten Mechanismen bei der akuten Pankreatitis sind die dystope Proteaseaktivierung in den Azinuszellen, die Blockade der luminalen Sekretion und die Bildung intrazellulärer Vakuolen. Obwohl die Trypsinaktivierung die Aktivierung anderer Proteasen auslöst, führt nicht das Trypsin, sondern die nachfolgend aktivierten Enzyme (z.B. Chymotrypsin, Elastase und Phospholipase) zur Zell- und Gewebeschädigung. Die Mechanismen der frühzeitigen Aktivierung der Pankreasenzyme mit einer nachfolgenden Selbstverdauung des Pankreas sind noch unklar. Die Inzidenz der akuten Pankreatitis liegt bei 50 bis 100 pro 100000 Einwohner. Die Erkrankungsrate ist bei Frauen leicht höher als bei Männern.The main mechanisms in acute pancreatitis are the dystope Protease activation in the acinar cells, the blockade of the luminal Secretion and formation of intracellular vacuoles. Although the trypsin activation Activation of other proteases does not cause trypsin, but rather the subsequently activated enzymes (e.g., chymotrypsin, elastase and phospholipase) for cell and tissue damage. The mechanisms of early Activation of pancreatic enzymes with subsequent self-digestion of the pancreas are still unclear. The incidence of acute pancreatitis is 50 to 100 per 100,000 inhabitants. The morbidity rate is included Women slightly higher as in men.

Das klinische Bild ist gekennzeichnet durch ausgeprägte abdomale Schmerzen und Allgemeinsymptome (Übelkeit, Erbrechen, Kreislaufschock). Die leichte Form, die ödematöse Pankreatitis (etwa 80%), ist durch einen unkomplizierten Verlauf und eine rasche (innerhalb von 72 h) Besserung unter adäquater Therapie gekennzeichnet. Die schwere Form, die hämorrhagisch-nekrotisierende Pankreatitis, wird durch Nekrosebildung und einen protrahierten Verlauf geprägt, wobei es häufig zu systematischen Komplikationen mit Versagen einzelner oder mehrerer Organsysteme kommt.The clinical picture is characterized by pronounced abdominal pain and General symptoms (nausea, Vomiting, circulatory shock). The easy form, edematous pancreatitis (about 80%), is through a straightforward course and a quick (within 72 h) improvement under adequate therapy. The severe form, the hemorrhagic-necrotizing Pancreatitis, is caused by necrosis and a protracted Course shaped, being it frequently to systematic complications with failure of one or more Organ systems comes.

Morphologisch tritt eine Verdickung des exokrinen Pankreas, eine unregelmäßige Begrenzung der Drüse und Flüssigkeit im Pararenalraum auf. Hauptursache der akuten Pankreatitis ist wie bei der chronischen Form der erhöhte Alkoholkonsum Eingeklemmte Gallensteine, die möglicherweise über Relux in den Pankreasgang gelangen, können zur akuten Pankreatitis führen. Der Altersgipfel bei der Choledocholithiasis liegt zwischen 40-60 Jahren, beim Alkoholabusus zwischen 20-40 Jahren. Andere pathogenetische Faktoren sind seltener. Bei einem nicht unerheblichen Prozentsatz der Patienten mit akuter Pankreatitis wird kein Risikofaktor gefunden.morphological There is a thickening of the exocrine pancreas, an irregular limitation of the Gland and liquid in the Pararenal space. The main cause of acute pancreatitis is like in the chronic form of the increased Alcohol Use Pinched gallstones that may be on Relux enter the pancreatic duct lead to acute pancreatitis. The age peak in choledocholithiasis is between 40-60 Years, with alcohol abuse between 20-40 years. Other pathogenetic Factors are rarer. At a not insignificant percentage No risk factor is found in patients with acute pancreatitis.

Diagnoseverfahrendiagnostic procedures

Die Sonographie ist das bildgebende Verfahren der ersten Wahl. Die Sensitivität liegt bei 70-80% bei einer Spezifität von 80-90%. Computertomographie, endoskopisch retrodrade Cholangiopankreatikographie (ERCP) und Endosonographie sind weitere bildgebende Verfahren, die dem diagnostizierenden Arzt zur Verfügung stehen.The Sonography is the imaging method of first choice. The sensitivity lies at 70-80% at a specificity from 80-90%. Computed tomography, endoscopic retrodrade cholangiopancreatography (ERCP) and endosonography are other imaging techniques that be available to the diagnosing physician.

Als so genannter Goldstandard wird der Sekretin-Caerulein bzw. Sekretin-Cholecystokinin-Test bei der Diagnose der akuten Pankreatitis eingesetzt. Dieses Testverfahren zeichnet sich durch eine sehr hohe Spezifität und Sensitivität aus. Das Verfahren ist aber sehr kostenintensiv und erfordert ein sehr hohes diagnostisches Können vom behandelnden Arzt. Für den Patienten ist das Verfahren sehr schmerzhaft und wird deshalb als unangenehm empfunden.When so-called gold standard is the secretin-caerulein or secretin-cholecystokinin test at used the diagnosis of acute pancreatitis. This test procedure is characterized by a very high specificity and sensitivity. The Procedure is very costly and requires a very high diagnostic skills from the attending physician. For The procedure is very painful for the patient and therefore becomes felt uncomfortable.

Als indirekte Verfahren werden zur Zeit die Enzymaktivitätsbestimmungen der Amylase und der Lipase eingesetzt. Diese Methoden sind nur solange sicher, solange die Enzyme im Serum in der aktiven Form vorliegen. Im Elastase-ELISA der Firma ScheBo Tech GmbH Giessen ( EP 0 547 059 B1 ) wird ein definiertes Epitop des Elastase-Moleküls im Serum nachgewiesen. Auf Grund der geringen Halbwertzeit der pankreatischen Elastase im Serum hat der Test nur eine geringe Zuverlässigkeit bei der Diagnose der akuten PankreatitisIndirect methods currently employed are the enzyme activity determinations of amylase and lipase. These methods are safe only as long as the enzymes are present in the serum in the active form. In the elastase ELISA of the company ScheBo Tech GmbH Giessen ( EP 0 547 059 B1 ) a defined epitope of the elastase molecule is detected in the serum. Due to the low half-life of serum pancreatic elastase, the test has little reliability in the diagnosis of acute pancreatitis

Aus dem Dokument DE 19923892 A1 ist außerdem die Verwendung von Elastase-Isoformen und synthetisch hergestellten Fragmenten der Elastase als Antigene zur Gewinnung von Antikörpern, die in der Diagnostik von Pankreasfunktionsstörungen eingesetzt werden, bekannt.From the document DE 19923892 A1 In addition, the use of elastase isoforms and synthetically produced fragments of elastase as antigens for the recovery of antibodies used in the diagnosis of pancreatic disorders is known.

Das Dokument WO 96/17873 A1 beschreibt die Verwendung eines exprimierten oder synthetischen Proteins, z.B. GP2, oder einzelner Spaltfragmente davon, um Tiere zu immunisieren. Dabei werden die später für die Immunisierung verwendeten Proteine kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Auch die eventuell für die Durchführung geeigneten Spaltprodukte können erst in einem der Aufreinigung nachfolgenden Schritt gewonnen werden. Darüber hinaus erfordert auch die in der Druckschrift erwähnte synthetische Darstellung von Peptiden oder Polypeptiden einen enormen Aufwand und ist kostspielig. Die ortsadressierte Immobilisierung der somit gewonnenen Antikörper auf Trägern führt außerdem lediglich zu Flächen, die einzelne Proteine oder ihre Spaltstücke detektierbar machen können.The Document WO 96/17873 A1 describes the use of an expressed or synthetic protein, e.g. GP2, or single fission fragments of it to immunize animals. This will be the later for immunization used proteins cloned, expressed and purified. Also the possibly for the execution suitable cleavage products can only be recovered in a subsequent purification step. Furthermore also requires the synthetic representation mentioned in the document Of peptides or polypeptides a huge effort and is expensive. The location-addressed immobilization of the antibody thus obtained carriers also leads only to surfaces, which can make individual proteins or their cleavage pieces detectable.

Aus dem Dokument WO 99/64461 ist ein Konzept zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch Verwendung eines Gemisches von Antigenen bekannt. Die Antigene werden so gewählt, dass wenigstens eines ein biologisch wichtiges Molekül ist und die therapeutische Verabreichung des für dieses Molekül spezifischen monoklonalen Antikörpers zu einer Linderung von Beschwerden führt. Konkret werden vier verschiedene Apo-2 Rezeptoren kloniert und gentechnisch mit der Fc-Region von humanem IgG1 fusioniert. Nach Transfektion/Expression werden die Fusionsproteine aufgereinigt und als Gemisch für die Immunisierung verwendet. Schließlich werden Zellen aus den Lymphknoten der immunisierten Tiere extrahiert und mittels Hybridoma-Techniken mit Myelom-Zellen fusioniert.From the document WO 99/64461 a concept for the production of monoclonal antibodies by use of a mixture of antigens is known. The antigens are chosen such that at least one is a biologically important molecule and the therapeutic administration of the monoclonal antibody specific for that molecule leads to alleviation of discomfort. Specifically, four different Apo-2 receptors are cloned and fused genetically with the Fc region of human IgG1. After transfection / expression the fusion proteins are purified and used as a mixture for immunization. Finally, cells are extracted from the lymph nodes of the immunized animals and fused with myeloma cells by hybridoma techniques.

In dem Dokument WO 88/01386 A1 werden Hybridomatechniken beschrieben, um Zellen zu gewinnen, die monoklonale Antikörper gegen alpha-Amylase oder ihre Spaltprodukte produzieren. Der Hybridoma-Fusionierung gehen dabei eine gentechnische Herstellung und Aufreinigung des Proteins und anschließende Tier-Immunisierung zur Gewinnung von geeigneten Lymphocyten voraus. Die nachfolgende Immobilisierung der produzierten Antikörper führt zu Trägeroberflächen, die lediglich alpha-Amylase oder ihre Spaltprodukte aus einer Testlösung sichtbar machen können.In Document WO 88/01386 A1 describes hybridoma techniques, to attract cells containing monoclonal antibodies to alpha-amylase or produce their fission products. Go of hybridoma fusion doing a genetic engineering and purification of the protein and subsequent Animal immunization to obtain suitable lymphocytes. The following Immobilization of the antibodies produced leads to carrier surfaces containing only alpha-amylase or make their cleavage products visible from a test solution.

Das Dokument DE 3789584 T2 beschreibt die chemischen Synthese und die Aufreinigung von mehreren Peptiden, die Teilsequenzen von pankreatischen Zymogenen sind, für die Immunisierung. Die Synthese von Peptiden ist allgemein kostspielig, da jede einzelne Aminosäure mit Schutzgruppenchemie in die Sequenz eingefügt werden muß. Darüber hinaus verlangt die nachfolgende Reinigung und der analytische Nachweis des Peptids einen hohen Aufwand. Die Antikörper, die dadurch nach der Immunisierung gewonnen werden und ihre Immobilisierung auf Trägeroberflächen ermöglichen nur den Nachweis der pankreatischen Zymogene, aus denen die Peptidsequenzen abgeleitet wurden.The document DE 3789584 T2 describes the chemical synthesis and purification of several peptides that are partial sequences of pancreatic zymogens for immunization. The synthesis of peptides is generally expensive because each individual amino acid with protecting group chemistry must be inserted into the sequence. In addition, the subsequent purification and the analytical detection of the peptide requires a lot of effort. The antibodies that are obtained after immunization and their immobilization on carrier surfaces only allow the detection of the pancreatic zymogens from which the peptide sequences were derived.

Das Dokument WO 88/03536 beschreibt neben der gentechnischen Herstellung und chemischen Synthese von Pankreastatin die Gewinnung dieses Proteins aus Pankreas. Dazu werden in mehreren Prozessschritten 20 kg Schweinepankreas aufgearbeitet und Pankreastatin isoliert. Für die Herstellung von Spaltfragmenten wird das isolierte Pankreastatin mit Hilfe von Endoproteinase Lys-C verdaut und die Fragmente chromatographisch aufgetrennt. Weiterhin erwähnt wird hierbei die Möglichkeit der Herstellung von Antiköpern gegen Pankreastatin oder seiner Spaltfragmente, die Immobilisierung solcher Antikörper auf Trägermaterialien zum Nachweis von Pankreastatin in einer Testlösung bleibt allerdings unerwähnt.The Document WO 88/03536 describes in addition to the genetic engineering and chemical synthesis of pancreatin in the recovery of this protein from pancreas. For this purpose, 20 kg of pig pancreas are processed in several process steps worked up and isolated Pankreastatin. For the production of fission fragments the isolated pankreastatin is purified by endoproteinase Lys-C digested and the fragments separated by chromatography. Farther mentioned this is the possibility the production of Antiköpern against pankreastatin or its fission fragments, the immobilization such antibodies on carrier materials for the detection of Pankreastatin in a test solution, however, remains unmentioned.

Aus dem Dokument DE 198 02 576 A1 sind Verfahren zur Immunisierung bekannt, bei denen Proteingemische, die aus einer biologischen Quelle stammen, direkt für die Immunisierung verwendet werden. Die Merkmale, dass es sich bei der biologischen Quelle um humanes Pankreassekret handelt, und dieses noch durch proteolytischen Abbau zerlegt wird, sind dort jedoch nicht enthalten.From the document DE 198 02 576 A1 For example, immunization methods are known in which protein mixtures derived from a biological source are used directly for immunization. However, the characteristics that the biological source is human pancreatic secretion and that is still decomposed by proteolytic degradation are not included therein.

Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, ein Testsystems auf der Basis von polyklonalen Antikörpern zu entwickeln, das ein breites Spektrum von pankreatischen Proteinen und deren Untereinheiten im Serum erfasst. Mit diesem Test soll dem diagnostizierendem Arzt eine sichere Diagnose der akuten Pankreatitis bzw. eines akuten Schubes einer chronischen Pankreatitis ermöglicht werden.The The object of the invention was a test system based on of polyclonal antibodies to develop a broad range of pancreatic proteins and their subunits detected in the serum. With this test should the diagnosing physician a safe diagnosis of acute pancreatitis or an acute episode of chronic pancreatitis.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Im Gegensatz zu den bekannten Lösungen, die sich auf den spezifischen Nachweis der Pankreas-Elastase 1 beschränkt, bzw. auf den Nachweis einer spezifischen Enzymaktivität im Plasma/Serum oder Stuhl wurde überraschenderweise gefunden, dass durch den Nachweis von Untereinheiten als Ergebnis eines proteolytischen Abbaus die Aussagefähigkeit im Bezug auf die Pankreasfunktion entscheidend verbessert werden kann. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern auf übliche Weise, das jedoch dadurch gekennzeichnet ist, dass die verwendeten spezifischen Antigene aus einem proteolytischen oder chemischen Abbau exokriner Pankreasproteine stammen.The Invention is realized according to the claims. In contrast to the known solutions, which is limited to the specific detection of pancreatic elastase 1, or on the detection of specific enzyme activity in plasma / serum or stool was surprisingly found that by detecting subunits as a result of a proteolytic degradation the informative value in relation to the pancreatic function can be decisively improved. The invention therefore relates a method of producing antibodies in the usual way, but by doing so is characterized in that the specific antigens used a proteolytic or chemical degradation of exocrine pancreatic proteins come.

Teilstücke werden vorzugsweise durch Verdauung mit Bromcyan oder den proteolytischen Enzymen Trypsin oder Pepsin einzeln oder in Kombination gewonnen. Die entstandenen Untereinheiten reagieren in vitro nicht mehr mit Antikörpern, hergestellt unter Verwendung der unverdauten Ausgangsproteine. Mit den erfindungsgemäßen Peptiden ist es möglich, monoklonale wie polyklonale Antikörper zu erzeugen.Be cuts preferably by digestion with cyanogen bromide or the proteolytic Enzymes trypsin or pepsin obtained individually or in combination. The resulting subunits do not react with in vitro antibodies manufactured using undigested source proteins. With the peptides of the invention Is it possible, to produce monoclonal and polyclonal antibodies.

Für die Herstellung der erfindungsgemäßen polyklonalen Antipeptidantikörper werden Versuchstiere wie Kaninchen, Meerschweinchen, Ziegen, Hühner oder Fische in bekannter Weise mit den Peptiden immunisiert. Für die Herstellung monoklonaler Antikörper werden die Peptide in bekannter Weise für die Induktion spezifischer B-Zellen verwendet, die nach Fusionierung mit Myelomzellen Hybridomzellen generieren, die nach bekannten Klonierungsverfahren in Zellinien kultiviert werden, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren. Die erfindungsgemäßen mono- oder polyklonalen Antikörpern weisen eine hohe Spezifität zu den verwendeten Spaltstücken der exokrinen Proteine. In einer bevorzugten Variante erfolgt die Herstellung der spezifischen Antikörper tierschutzgerecht im Hühnerei.For the production the polyclonal invention Anti-peptide antibodies are experimental animals such as rabbits, guinea pigs, goats, chickens or Fish immunized in a known manner with the peptides. For the production monoclonal antibody For example, the peptides become more specific for induction in a known manner Using B cells that produce hybridoma cells after fusion with myeloma cells, which are cultivated in cell lines according to known cloning methods which secrete specific monoclonal antibodies. The mono- or polyclonal antibodies have a high specificity to the used split pieces of exocrine proteins. In a preferred variant, the Production of the specific antibodies suitable for animal welfare in the chicken egg.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper für den Nachweis und die Quantifizierung exokriner Pankreasproteine in Körperflüssigkeiten und Stuhl. Die Erfindung betrifft daher auch Nachweissysteme, vorzugsweise ein immunchemisches Nachweissystem zur Feststellung der Funktionalität des Pankreas als Hilfsmittel zur Erkennung von Funktionsstörungen dieses Organs. Dazu können die spezifischen Antikörper an jeden geeigneten Träger adsorptiv oder chemisch mit bekannten Kopplungsverfahren gebunden werden. Als Träger eignen sich Membranen oder Partikel. Mit einem erfindungsgemäßen ELISA unter Verwendung von kreuzreaktiven Antikörpern oder einer Kombination unterschiedlicher Herkunft lassen sich schnell und spezifisch exokriner Proteine. in Stuhl und Serum bzw. Plasma nachweisen und quantifizieren.Another object of the invention is the use of the antibodies according to the invention for the detection and quantification of exocrine pancreatic proteins in body fluids and stool. The invention therefore also relates to detection systems, preferably an immunochemical detection system for determining the functionality of the pancreas as an aid to the detection of functional disorders of this organ. These can be the specific ones Antibodies to any suitable carrier are adsorbed or chemically bound by known coupling methods. Suitable supports are membranes or particles. With an ELISA according to the invention using cross-reactive antibodies or a combination of different sources, it is possible to obtain proteins that are fast and specific to exocrine. detect and quantify in stool and serum or plasma.

Er dient zur Diagnose bzw. dem Ausschluss einer Pankreasbeteiligung bei Abdominalbeschwerden und exokriner Pankreasinsuffiziens.He serves to diagnose or exclude pancreatic involvement in abdominal complaints and exocrine pancreatic insufficiency.

Ausführungsbeispielembodiment

Beispiel 1example 1

Herstellung spezifischer Spaltstücke exokriner Pankreasproteine unter Verwendung von Trypsin oder Pepsin.manufacturing specific gap pieces exocrine pancreatic proteins using trypsin or pepsin.

Mittels Zugabe von Trypsin oder Pepsin zum gereinigten und in PBS aufgenommenem humanem Pankreassekret (1 mg Pankreasprotein/10 ml PBS) werden die pankreatischen Proteine innerhalb einer Einwirkzeit von 6 Stunden bei 36,5°C in Oligopeptide zerlegt. Die so hergestellten Spaltstücke der Pankreasproteine werden unter Zusatz von Freundschen Adjuvants für die Immunisierung von Kaninchen, Ziege oder Huhn verwendet. Nach dreimaliger Vakzination werden die Tiere entblutet. Nach Gewinnung der Antikörper (Reinigung über Protein A-Säule bzw. fraktionierte Fällung) wird ihre Spezifität in einem ELISA getestet. Dazu wird das Proteingemisch aus den Verdauungsansätzen an die Oberfläche der Kavitäten von Mikrotiterplatten adsorbiert. Nach Inkubation der Kavitäten mit den homologen bzw. heterologen Antikörpern werden diese gründlich gewaschen. Unter Verwendung von Anti-Kaninchen-, Anti-Ziege bzw. Anti-Huhn-POD-Konjugaten und TMB als Substrat werden in üblicher Weise die Antigen-Antikörper-Reaktionen detektiert. Die Antikörper reagieren nur mit den homologen Oligopeptiden.through Add trypsin or pepsin to the purified and ingested PBS human pancreatic secretions (1 mg pancreatic protein / 10 ml PBS) are administered pancreatic proteins within an exposure time of 6 hours at 36.5 ° C decomposed into oligopeptides. The split pieces produced in this way Pancreatic proteins are added with Freund's adjuvant for immunization used by rabbit, goat or chicken. After three vaccinations the animals are being bled. After obtaining the antibodies (purification via protein A column or fractionated precipitation) becomes their specificity tested in an ELISA. For this purpose, the protein mixture from the digestive approaches the surface the cavities adsorbed by microtiter plates. After incubation of the wells with the homologous or heterologous antibodies are washed thoroughly. Using anti-rabbit, Anti-goat or anti-chicken POD conjugates and TMB as substrate in usual Do the antigen-antibody reactions detected. The antibodies react only with the homologous oligopeptides.

Beispiel 2Example 2

Nachweis der Spezifität der erfindungsgemäßen AntikörperProof of specificity the antibody of the invention

Die Spezifität der Antikörper für verschiedene Spaltungsverfahren kann im Western-Blot nachgewiesen werden. Dazu werden grob gereinigte exokrine Proteine aus Pankreassaft bzw. ihre Untereinheiten nach Proteolyse mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese entsprechend ihrer relativen Molmasse von begleitenden Verunreinigungen getrennt. Die Proteinzonen aus dem Gel werden mit Hilfe einer „semi-dry"-Blottingapparatur auf Nitrozellulose übertragen. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen der Membran mit resuspendierter Trockenmagermilch werden die Membranen mit den jeweiligen vorverdünnten anti-Peptid-Antikörpern alleine oder in unterschiedlicher Kombination inkubiert. Nach intensivem Waschen der Membranen zur Entfernung aller unspezifisch gebundener Antikörper werden die Membranen mit alkalischer Phosphatase-markierten anti-Kaninchen-Antikörpern in einer vorher ermittelten Konzentration inkubiert. Die spezifischen sekundären Antikörper, die nach dem Waschen auf der Membran verbleiben, werden nach Zugabe von Substrat sichtbar gemacht. Dabei zeigte sich, dass in allen Proben mit den Antikörpern gegen homologe oder heterologe Untereinheiten unterschiedliche Spaltstücke detektiert werden können.The specificity the antibody for different Cleavage method can be detected in Western Blot. To are roughly purified exocrine proteins from pancreatic juice or their Subunits after proteolysis by polyacrylamide gel electrophoresis according to their relative molar mass of accompanying impurities separated. The protein zones from the gel are made using a "semi-dry" blotting apparatus transferred to nitrocellulose. After saturation the free binding sites of the membrane with resuspended dry skimmed milk become the membranes with the respective prediluted anti-peptide antibodies alone or incubated in different combinations. After intense Wash the membranes to remove any nonspecifically bound antibody are the membranes with alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit antibodies in incubated at a previously determined concentration. The specific ones secondary Antibody, which remain on the membrane after washing, after addition made visible by substrate. It turned out that in all Samples with the antibodies detected against homologous or heterologous subunits different gap pieces can be.

Beispiel 3Example 3

Bestimmung der Pankreas-Proteine in Stuhl und Serum unter Verwendung der erfindungsgemäßen AntikörperDetermination of pancreatic proteins in stool and serum using the antibodies of the invention

Die Elastase in Serum, Plasma oder Stuhl wird mit einem Festphasen-ELISA, der auf der Sandwichtechnik basiert, bestimmt. Dazu werden einzelne oder ein entsprechendes Gemisch mehrerer der erfindungsgemäßen Antikörper in einem Karbonat/Bikarbonat-Puffergemisch, pH 9,6, gelöst und in die Wells einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach Inkubation bei 36,5 °C werden die nicht gebundenen Antikörper durch Waschen mit PBS entfernt. Die noch freien Bindungsstellen des Trägermaterials werden durch einen 1 %-igen BSA-PBS-Puffer geblockt. Das Blocken findet bei Raumtemperatur über 90 Minuten statt. Nach dem Waschen werden die in PBS verdünnten Serum- bzw. Stuhlproben in die Wells pipettiert. Die 60 minütige Inkubation bei Raumtemperatur wird durch Waschen beendet. Als Detektionsantikörper werden einzelne oder ein entsprechendes Gemisch aus mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern verwendet, die mit Biotin konjugiert wurden. Nach einer Inkubation von 30 Minuten und dem Waschprozeß wird der Biotin-markierte Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin nachgewiesen. Durch den letzten Waschschritt erfolgt die Beseitigung des nicht gebundenen Streptavidins. Anschließend wird mit TMB als Substrat die Peroxidasekonzentration bestimmt. Nach Zugabe von HCl zur Beendigung der Enzymreaktion wird die Änderung der optischen Dichte gemessen. Die Intensität der Farbreaktion ist proportional der Pankreasprotein-Konzentration in der Probe.The Elastase in serum, plasma or stool is treated with a solid phase ELISA, which is based on the sandwich technique, determined. These are single or a corresponding mixture of several of the antibodies according to the invention in a carbonate / bicarbonate buffer mixture, pH 9.6, and dissolved in given the wells of a microtiter plate. After incubation at 36.5 ° C the unbound antibodies removed by washing with PBS. The still free binding sites of the carrier material are blocked by a 1% BSA-PBS buffer. The blocking takes place at room temperature 90 minutes instead. After washing, the serum levels diluted in PBS are or stool samples are pipetted into the wells. The 60 minute incubation at room temperature is stopped by washing. As a detection antibody single or a corresponding mixture of several antibodies according to the invention used, which were conjugated with biotin. After an incubation of 30 minutes and the washing process the biotin-labeled antibody with Peroxidase-conjugated Streptavidin detected. Done by the last washing step the elimination of unbound streptavidin. Subsequently, will determines the peroxidase concentration with TMB as substrate. To Addition of HCl to stop the enzyme reaction will change the measured optical density. The intensity of the color reaction is proportional the pancreatic protein concentration in the sample.

Claims

A method of making a pancreatic function disorder detection system capable of detecting a broad spectrum of pancreatic proteins, comprising the steps of: - digesting human pancreatic secretion by mixing or enzymatically cleaving the proteins contained therein into oligonucleotides, - immunizing an animal with the human pancreatic secretin thus digested, - recovering and purifying the antibodies formed in the animal or in an egg laid therefrom, and - binding a combination of the purified antibodies to one suitable carrier.

Method according to claim 1, characterized in that that for the cleavage of the proteins contained in pancreatic secretion cyanogen bromide or a protease or multiple proteases are used.

Method according to claim 2, characterized in that that used as proteases a combination of trypsin and pepsin becomes.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that a chicken is immunized and the antibodies be cleaned up an egg laid by the chicken.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the antibodies have a Protein-A column or by fractional precipitation be cleaned up.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the purified antibodies are chemically or adsorptively to the carrier be bound.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the carrier as Particle, membrane or as a microtiter plate is formed.

Method according to claim 7, characterized in that that the carrier as a nitrocellulose membrane or as the surface of the cavity Microtiter plate is formed.

Diagnostic method for detecting pancreatic disorders, comprising the steps a) Preparation of a test system according to the claims 1-8 b) Incubation of the carrier with body fluid or chair, c) Detection of the body fluid or the stool the carrier bound proteins using detection antibodies.

Diagnostic method according to Claim 9, characterized that the body fluid Serum, plasma or blood.

Diagnostic method according to one of claims 9-10, characterized in that the detection antibodies than the purified ones antibody according to one of the claims 1-5 and / or formed as a secondary antibody are.

Diagnostic method according to one of claims 9-11, characterized in that cross-reactive antibodies and / or a combination of antibodies of different origin is used.

Diagnostic method according to one of claims 9-12, characterized in that an immunochemical detection method is used.

A diagnostic method according to any one of claims 9-13, characterized in that an ELISA is performed.

A diagnostic method according to any one of claims 9-14 characterized in that the detection antibodies are labeled.

A diagnostic method according to any one of claims 9-15, characterized in that the detection antibodies with biotin or peroxidase are marked.

A diagnostic method according to any one of claims 9-16, characterized in that additionally peroxidase-labeled Streptavidin and / or peroxidase substrate is used.

Diagnostic method according to any one of claims 9-17, characterized in that used as peroxidase substrate TMB is and / or the reaction of the peroxidase substrate by an optically visible Product is detected.