DE10157050A1 - Method for surface measurement of biological and chemical samples, whereby detected back-scattered light is maximized by using a sensor with high numerical aperture and high sensitivity, together with optimized signal processing - Google Patents
Method for surface measurement of biological and chemical samples, whereby detected back-scattered light is maximized by using a sensor with high numerical aperture and high sensitivity, together with optimized signal processingInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Messverfahren zur dreidimensionalen Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben. The invention relates to a measuring method for three-dimensional surface measurement of biological and / or chemical samples.
Aufgrund der rasanten Entwicklung der Biotechnologie in den letzten Jahren gewinnt die sogenannte Biosensorik zunehmend an Bedeutung. Unter dem Begriff Biosensorik versteht man die Entwicklung und die Verwendung von Sensoren, mit denen biologische Substanzen detektiert und/oder Eigenschaften von biologischen Substanzen erfasst werden können. Die Biosensorik profitiert dabei von einer Vielzahl von unterschiedlichen physikalischen, chemischen und/oder biochemischen Eigenschaften der zu erfassenden Substanzen. So beruhen beispielsweise viele Biosensoren auf einem für die zu erfassenden biologischen Substanzen charakteristischen Bindungsverhalten an sogenannten Fängermolekülen, welche an festgelegten Stellen des verwendeten Biosensors angeordnet sind. Die an die Fängermoleküle gebundenen Biomoleküle können beispielsweise durch Messung von charakteristischer Fluoreszenzstrahlung, durch Absorption von elektromagnetischer Strahlung oder durch eine Messung der durch das Binden der Biomoleküle verursachten Änderung einer elektrischen Kapazität erfasst werden. Due to the rapid development of biotechnology in the In recent years, so-called biosensor technology has been gaining ground in importance. The term biosensor technology means that Development and use of sensors with which biological substances detected and / or properties of biological substances can be detected. The Biosensor technology benefits from a multitude of different ones physical, chemical and / or biochemical Properties of the substances to be detected. So based, for example many biosensors on one for those to be detected biological substances characteristic binding behavior so-called catcher molecules, which at fixed points of the biosensor used are arranged. The to the Capture molecules can bind biomolecules, for example by measuring characteristic fluorescence radiation, by absorption of electromagnetic radiation or by a measurement of by binding the biomolecules caused change in an electrical capacity can be detected.
Auf dem Gebiet der Optik ist aus der DE 196 08 468 C2 ein optischer Abstandssensor bekannt, welcher auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruht und welcher zur dreidimensionalen Oberflächenvermessung geeignet ist. Ein derartiger optischer Abstandssensor, der beispielsweise in Fig. 7 der DE 196 08 468 C2 dargestellt ist, umfasst eine punktförmige Lichtquelle und einen punktförmigen Empfänger. Die punktförmige Lichtquelle wird auf einer Oberfläche eines Messobjektes abgebildet. Der punktförmige Empfänger ist konfokal zur punktförmigen Lichtquelle im bildseitigen Messbereich angeordnet. Der optische Abstandssensor zeichnet sich ferner durch eine zumindest teilweise koaxiale Führung von Beleuchtungs- und Messstrahl aus, wobei die optische Wegstrecke zwischen dem punktförmigen Empfänger und dem Messobjekt durch den Einsatz eines in Richtung der optischen Achse einer Abbildungsoptik schwingenden Spiegelsystems variierbar ist und mittels eines Peakdetektors maximale Lichtintensitäten auf dem punktförmigen Empfänger feststellbar sind. In the field of optics, DE 196 08 468 C2 discloses an optical distance sensor which is based on the confocal optical imaging principle and which is suitable for three-dimensional surface measurement. Such an optical distance sensor, which is shown, for example, in FIG. 7 of DE 196 08 468 C2, comprises a point-shaped light source and a point-shaped receiver. The point light source is imaged on a surface of a measurement object. The punctiform receiver is arranged confocal to the punctiform light source in the image-side measuring area. The optical distance sensor is also characterized by an at least partially coaxial guidance of the illumination and measurement beam, the optical path between the point-shaped receiver and the measurement object being variable by using a mirror system that vibrates in the direction of the optical axis of an imaging optical system, and maximum using a peak detector Light intensities can be determined on the point receiver.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Messverfahren, zu schaffen, mit dem Oberflächen von biologischen und/oder chemischen Proben schnell und präzise vermessen werden können. The invention is based on the object of a measuring method, to create with the surfaces of biological and / or chemical samples can be measured quickly and precisely can.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Messverfahren zur Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben unter Verwendung eines auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruhenden Abstandssensors gemäß Anspruch 1. Demnach wird die zu untersuchende biologische und/oder chemische Probe relativ zu dem auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahl des Abstandssensors in eine definierte Anfangsposition gebracht, ein Reflektorsystem wird in Richtung der optischen Achse einer Abbildungsoptik bewegt, so dass die optischen Wegstrecken zwischen einer Sendeeinheit und einem Oberflächenpunkt des Messobjekts und zwischen einer Empfangseinheit und dem Oberflächenpunkt des Messobjekts variiert werden, während der Bewegung des Reflektorsystems wird der Verlauf der Lichtintensität auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst und aus dem Verlauf der Lichtintensität wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt ermittelt. This task is solved by a measuring method for Surface measurement of biological and / or chemical samples using one on the confocal optical Imaging principle based distance sensor according to claim 1. Accordingly, the biological and / or chemical sample relative to that striking the measurement object Illumination beam of the distance sensor in a defined Starting position brought, a reflector system is in Moving direction of the optical axis of an imaging optics, so that the optical paths between a transmitter unit and a surface point of the measurement object and between one Receiving unit and the surface point of the measurement object can be varied during the movement of the reflector system is the course of the light intensity on the receiving unit depending on the position of the reflector system and the distance becomes from the course of the light intensity between the distance sensor and the surface point determined.
Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 2 wird nach der Ermittlung des Abstands zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt die zu untersuchende Probe mittels einer definierten Verschiebung in einer Ebene senkrecht zu dem auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahl in eine weitere Position gebracht, das Reflektorsystem in Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik bewegt, so dass die optischen Wegstrecken zwischen Sendeeinheit und einem weiteren Oberflächenpunkt des Messobjekts und zwischen Empfangseinheit und dem weiteren Oberflächenpunkt des Messobjekts variiert werden. Während der Bewegung des Reflektorsystems wird der Verlauf der Lichtintensität auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst und aus dem Verlauf der Lichtintensität wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem weiteren Oberflächenpunkt ermittelt. Damit kann auf vorteilhafte Weise durch das sequentielle Abtasten einer Mehrzahl von Oberflächenpunkten die zu untersuchende dreidimensionale Oberfläche schnell und zuverlässig vermessen werden. According to a development of the invention according to claim 2 after determining the distance between the distance sensor and the surface point by means of the sample to be examined a defined displacement in a plane perpendicular to the illuminating beam striking the measurement object into a brought further position, the reflector system in the direction the optical axis of the imaging optics so that the optical distances between the transmitter unit and one further surface point of the measurement object and between Receiver unit and the further surface point of the measurement object can be varied. During the movement of the reflector system is the course of the light intensity on the receiving unit depending on the position of the reflector system and the distance becomes from the course of the light intensity between the distance sensor and the further surface point determined. This can be done in an advantageous manner by sequential scanning of a plurality of surface points three-dimensional surface to be examined quickly and be measured reliably.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass für eine Vielzahl von Anwendungen auf dem Gebiet der Biotechnologie Biosensoren nützlich sind, mit denen die dreidimensionale Oberfläche einer biologischen und/oder einer chemischen Probe vermessen werden kann. So kann beispielsweise festgestellt werden, ob ein aufgebrachtes Probenmaterial in Form eines Tropfens, als ein Plateau, als weitgehend ebene Fläche oder als eine Struktur mit einzelnen Erhöhungen vorliegt. Ebenso kann untersucht werden, wie sich eine bestimmte Menge einer zu untersuchenden Probe an eine vorgegebene Oberflächenstruktur anpasst, d. h. wie sich die Flächendichte der Probe bei einer bestimmten Oberflächenrelief verhält. Ein weiterer wichtiger Anwendungsfall ist beispielsweise die exakte Bestimmung der Menge einer bestimmten biologischen Substanz, welche in Form eines auf ein Substrat aufgebrachten Tropfens vorliegt. Aus der genauen Tropfenform kann zum Beispiel exakt das Volumen der zu untersuchenden biologischen Probe bestimmt werden, wodurch beispielweise eine genaue Aussage über die integral vorliegende Probenkonzentration möglich wird. Für den Fall, dass die räumliche Verteilung der Probenkonzentration durch Diffusion der Probenmoleküle in eine an einer Grenzfläche anliegende Lösung bestimmt wird, kann die lokale Probenkonzentration insbesondere in den Randbereichen der Lösung von der Größe der Volumina der Randbereiche abhängen und indirekt über eine exakte Oberflächenvermessung der als Tropfen vorliegenden Probe ermittelt werden. The invention is based on the finding that for a Wide range of applications in the field of biotechnology Biosensors are useful with which the three-dimensional Surface of a biological and / or chemical sample can be measured. For example, it can be determined be whether an applied sample material in the form of a Drop, as a plateau, as a largely flat surface or as a structure with single increases. As well can be examined how a certain amount of a sample to be examined to a given Adapts surface structure, d. H. how the areal density of the sample a certain surface relief. Another an important application is, for example, the exact one Determining the amount of a particular biological substance, which is in the form of a drop applied to a substrate is present. For example, the exact drop shape can be exact determines the volume of the biological sample to be examined be, which, for example, a precise statement about the integrally present sample concentration is possible. For the case that the spatial distribution of the Sample concentration by diffusion of the sample molecules into one at a Interface adjacent solution is determined, the local Sample concentration especially in the marginal areas of the Solution depend on the size of the volumes of the edge areas and indirectly via an exact surface measurement of the as Drop present sample can be determined.
Die Erfindung kann auch zur genauen Erfassung der dreidimensionalen Oberfläche von kleineren biologischen Objekten, insbesondere einzelne Zellen oder Proteine verwendet werden, welche häufig an Polystyrolkügelchen gebunden werden. Derartige für die Bindung von einzelnen Zellen oder Proteinen geeigneten Polystyrolkügelchen werden auch als sogenannte Beads bezeichnet. Die genaue Bestimmung der Oberfläche von einzelnen Zellen oder Proteinen ermöglicht somit eine Vermessung des sterischen Aufbaus der einzelnen Zellen oder Proteine. Aus der Kenntnis des sterischen Aufbaus können zum Beispiel wichtige Erkenntnisse über das charakteristische Bindungsverhalten der untersuchten Zellen/Proteine gewonnen werden. The invention can also be used to precisely detect the three-dimensional surface of smaller biological objects, in particular single cells or proteins are used, which are often attached to polystyrene beads. Such for the binding of individual cells or proteins suitable polystyrene beads are also known as so-called Called beads. The exact determination of the surface of individual cells or proteins thus enables Measurement of the steric structure of the individual cells or Proteins. From the knowledge of the steric structure can Example important knowledge about the characteristic Binding behavior of the cells / proteins examined was obtained become.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 3 wird die numerische Apertur des auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahls so groß gewählt, dass durch das Messobjekt von dem Licht des Beleuchtungsstrahls möglichst viel Streulicht in den Raumwinkel des Messstrahls gestreut wird. Bei dem der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden konfokalen optischen Abstandssensor ist die numerische Apertur des Beleuchtungsstrahls gleich der numerischen Apertur des Messstrahls. Eine große numerischen Apertur des Messstrahls bedeutet gleichzeitig aber auch eine große Winkelakzeptanz für das von der Probenoberfläche zurückgestreute Licht. Somit ist eine große numerische Apertur des Beleuchtungsstrahls insbesondere für die Vermessung von Proben mit schwach zurückstreuender Oberfläche vorteilhaft, weil aufgrund einer großen Winkelakzeptanz auch die Lichtintensität erhöht ist, welche auf die Empfangseinheit des Abstandssensors trifft. According to an advantageous development of the invention Claim 3 is the numerical aperture of the target hit the illuminating beam so large that by the measurement object from the light of the illuminating beam as much scattered light as possible in the solid angle of the measuring beam is scattered. In that of the present invention underlying confocal optical distance sensor is the numerical aperture of the illuminating beam equal to the numerical one Aperture of the measuring beam. A large numerical aperture of the Measuring beam also means a large one Angle acceptance for the backscattered from the sample surface Light. Thus, a large numerical aperture of the Illuminating beam especially for the measurement of samples with weakly scattering surface advantageous because due to a large angle acceptance also the light intensity is increased, which on the receiving unit of the Distance sensor hits.
Ein weiterer Vorteil einer großen numerische Apertur besteht ferner darin, dass selbst bei einer im Vergleich zur optischen Achse des auf die Probenoberfläche treffenden Beleuchtungsstrahls schräg angeordneten Probenoberfläche aufgrund der großen Winkelakzeptanz für den Messstrahl in der Regel eine für eine weitere Auswertung brauchbare Lichtintensität auf die Empfangseinheit abgebildet wird. Damit kann der sterische Aufbau einer Vielzahl von komplexen dreidimensionalen Oberflächen vermessen werden. Another advantage of a large numerical aperture is further in that even with a compared to optical axis of the striking the sample surface Illumination beam obliquely arranged sample surface due the large angular acceptance for the measuring beam as a rule a light intensity that can be used for further evaluation is mapped onto the receiving unit. So that the steric structure of a variety of complex three-dimensional surfaces can be measured.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung nach Anspruch 4 wird für die Empfangseinheit zumindest ein Sekundärelektronenvervielfacher, eine Photodiode und/oder eine Avalanche-Photodiode verwendet. Die Verwendung von einem oder von mehreren derartigen hochempfindlichen Detektoren hat den Vorteil, dass der Verlauf der Lichtintensität insbesondere bei der Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben, welche im allgemeinen ein geringes Streuvermögen aufweisen, zuverlässig erfasst werden kann. According to a preferred development of the invention Claim 4 is at least one for the receiving unit Secondary electron multiplier, a photodiode and / or one Avalanche photodiode used. The use of one or of several such highly sensitive detectors Advantage that the course of the light intensity in particular in the surface measurement of biological and / or chemical samples, which are generally minor Show scattering capacity, can be reliably detected.
Gemäß Anspruch 5 wird in einer anderen Ausführungsform der Erfindung für die Ermittlung des Abstandes zumindest ein Messpunkt der Anstiegs- und zumindest ein Messpunkt der Abfallsflanke des Verlaufs der Lichtintensität verwendet. Dies hat den Vorteil, dass der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem aktuell vermessenen Oberflächenpunkt auch dann auf einfache Weise präzise bestimmt werden kann, wenn die auf die Empfangseinheit treffende Lichtintensität so gering ist, dass das Maximum des Intensitätsverlaufs nur mit einer relativ großen Unsicherheit bestimmt werden kann. According to claim 5 in another embodiment of the Invention for determining the distance at least one Measuring point of the rise and at least one measuring point of the Falling edge of the course of the light intensity used. This has the advantage that the distance between the Distance sensor and the currently measured surface point even then can be easily determined precisely when the on light intensity hitting the receiving unit is so low that the maximum of the intensity curve with only one relatively large uncertainty can be determined.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 6 wird für die Ermittlung des Abstands eine Anpassungskurve an den Verlauf der zurückgestreuten Lichtintensität bestimmt. Die Anpassung einer Modellkurve an den Verlauf der Lichtintensität ist ebenfalls insbesondere bei sehr geringer auf die Empfangseinheit treffender Lichtintensität vorteilhaft, da durch Rauschen verursachte Schwankungen in dem gemessenen Verlauf der Lichtintensität durch die Berücksichtigung des gesamten Verlaufs der Lichtintensität zumindest teilweise kompensiert werden können und somit die Genauigkeit der Abstandsermittlung erheblich verbessert wird. Die Abstandsermittlung mittels einer Anpassungskurve eignet sich insbesondere bei der Vermessung von Messobjekten mit gering streuenden Oberflächen, welche dazu führen, dass das von der Empfangseinheit ausgegebene Signal nur wenig aus einem im wesentlich durch die Messelektronik bestimmten Rauschpegel herausragt. According to a further embodiment of the invention Claim 6 is a for determining the distance Adaptation curve to the course of the backscattered Light intensity determined. The adaptation of a model curve to the course the light intensity is also particularly great less light intensity striking the receiving unit advantageous, since fluctuations caused by noise in the measured course of the light intensity by the Taking into account the entire course of light intensity can be at least partially compensated and thus the Accuracy of distance determination is significantly improved. The Distance determination using an adaptation curve is suitable especially when measuring objects with low scattering surfaces, which lead to the fact that the Received signal output little from an im noise level determined essentially by the measuring electronics protrudes.
Es wird darauf hingewiesen, dass für die Ermittlung des Abstands zwischen Abstandssensor und Oberflächenpunkt auch ausschließlich das Maximum der auf die Empfangseinheit zurückgestreuten Lichtintensität verwendet werden kann. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die von der Empfangseinheit erfasst Lichtintensität so groß ist, dass der entsprechende Verlauf der Lichtintensität eine relativ glatte Kurve ohne große statistische Schwankungen ist. In diesem Fall ist die Verwendung des Maximums der zurückgestreuten Lichtintensität die einfachste und schnellste Möglichkeit, den Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Oberflächenpunkt zu bestimmen. It should be noted that for the determination of the Distance between distance sensor and surface point too only the maximum on the receiving unit backscattered light intensity can be used. This is particularly advantageous if the Receiver unit detects light intensity is so great that the corresponding course of light intensity a relatively smooth Curve without large statistical fluctuations. In this Case is the use of the maximum of the backscattered Light intensity the easiest and fastest way the distance between the distance sensor and the To determine surface point.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nach Anspruch 7 wird für die Ermittlung des Abstands nicht das absolute sondern ein relatives Maximum des Verlaufs der Lichtintensität verwendet, wobei die Lichtintensität in dem relativen Maximum einen durch die Reflexionseigenschaften des Messobjekts vorbestimmten Wert unterschreitet. Damit kann insbesondere bei optisch transparenten Proben eine falsche Abstandsmessung verhindert werden, welche beispielweise dann auftreten würde, wenn sich die Probe auf einem reflektierenden Substratträger befindet und die Reflektivität der Grenzschicht Probe-Substrat größer ist als die Reflektivität der Probenoberfläche. According to a preferred embodiment of the invention Claim 7 is not that for the determination of the distance absolute but a relative maximum of the course of the Light intensity used, the light intensity in the relative maximum one by the reflection properties of the Target falls below a predetermined value. So that can a wrong one, especially with optically transparent samples Distance measurement can be prevented, which then, for example would occur if the sample was on a reflective substrate carrier and the reflectivity of the Boundary layer sample-substrate is greater than the reflectivity of the Sample surface.
Da die Reflektivität einer Grenzschicht im wesentlichen durch die Brechungsindizes der an die Grenzschicht angrenzenden Materialien bestimmt ist, kann beispielsweise für den Fall, dass die zu vermessende Probe eine im wesentlichen wässrige Lösung und das angrenzende Medium im wesentlichen Luft mit einem Brechungsindex n von eins ist (die Reflektivität an einer Grenzschicht Luft-Wasser beträgt ungefähr 0,02) ein vorbestimmter Wert von ungefähr 5% gewählt werden, welcher von der Reflektivität in dem relativen Maximum unterschritten werden muss, wenn eine gültige Abstandsbestimmung erfolgen soll. Dabei ist ein im Vergleich zu reinem Wasser höherer Brechungsindex der Probenlösung berücksichtigt. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass aus dem von der Empfangseinheit gemessenen Verlauf der Lichtintensität nicht der Abstand zwischen Abstandssensor und Grenzschicht Substrat-Probe sondern der Abstand zwischen Abstandssensor und Probenoberfläche erfasst wird. Es wird darauf hingewiesen, dass im allgemeinen der vorbestimmte von der Reflektivität in dem relativen Maximum zu unterschreitende Wert von dem Reflexionsverhalten der Probenoberfläche und von dem Reflexionsverhalten der Grenzschicht Substrat-Probe abhängt. Because the reflectivity of a boundary layer is essentially due to the refractive indices of those adjacent to the boundary layer Materials, for example in the event that the sample to be measured is essentially aqueous Solution and the adjacent medium with essentially air a refractive index n of one (the reflectivity at an air-water interface is approximately 0.02) predetermined value of approximately 5% can be selected, which of reflectivity in the relative maximum must be done if a valid distance determination is made should. It is a higher compared to pure water Refractive index of the sample solution taken into account. To this Way it is ensured that from the of the Receiving unit measured course of the light intensity not the distance between distance sensor and interface between substrate and sample but the distance between the distance sensor and Sample surface is captured. It should be noted that in generally the predetermined one of the reflectivity in the relative maximum value to be undercut Reflection behavior of the sample surface and of that Reflection behavior of the interface between substrate and sample depends.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden beispielhaften Beschreibung derzeit bevorzugter Ausführungsformen. Further advantages and features of the present invention result from the following exemplary description currently preferred embodiments.
Fig. 1 illustriert den Einfluss der numerischen Apertur auf das Winkelverhalten. Fig. 1 illustrates the influence of the numerical aperture on the angular behavior.
Fig. 2a illustriert die Abstandsermittlung aus einem Messpunkt der Anstiegs- und einem Messpunkt der Abfallsflanke des Verlaufs der Lichtintensität. FIG. 2a illustrates the determination of distance from a measuring point of the rise and a measuring point of the trailing edge of the profile of the light intensity.
Fig. 2b illustriert eine Abstandsermittlung mittels einer Anpassungskurve an den gemessenen Verlauf der Lichtintensität. Fig. 2b illustrates a distance determination by means of a fit curve to the measured profile of the light intensity.
Fig. 2c illustriert die Abstandsermittlung unter Verwendung des Maximums des gemessenen Verlaufs der Lichtintensität. Fig. 2c illustrates the distance determination using the maximum of the measured curve of the light intensity.
Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist eine zu vermessende biologische Probe 101 auf einem Substrat 102 aufgetragen. Die biologische Probe 101, welche in flüssiger bzw. zähflüssiger Form vorliegt, bildet eine dreidimensionale Oberfläche aus, welche einem Kugelsegment ähnlich ist. As can be seen from FIG. 1, a biological sample 101 to be measured is applied to a substrate 102 . The biological sample 101 , which is in liquid or viscous form, forms a three-dimensional surface which is similar to a spherical segment.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Probe 101 nicht unbedingt in Form eines Kugelsegments vorliegen muss sondern im Prinzip jede mögliche dreidimensionale Form annehmen kann. Ebenso muss die Probe 110 nicht zwingend in flüssiger bzw. zähflüssiger Form vorliegen. So kann beispielsweise eine in einem auskristallisierten oder ausgehärteten Zustand vorliegende Probe untersucht werden, welche beispielsweise nur bei der Aufbringung der Probe auf ein Substrat in einem flüssigen oder zähflüssigen Aggregatzustand vorgelegen hat. It is pointed out that the sample 101 does not necessarily have to be in the form of a spherical segment, but in principle can take on any possible three-dimensional shape. Likewise, the sample 110 does not necessarily have to be in liquid or viscous form. For example, a sample that is present in a crystallized or hardened state can be examined, which, for example, was only present in a liquid or viscous physical state when the sample was applied to a substrate.
Gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird die Oberfläche der biologischen Probe 101 genau erfasst, so dass das Volumen der biologischen Probe 101 präzise bestimmt werden kann. Die biologische Probe 101 wird mit einem Abstandssensor vermessen, der beispielsweise in den Fig. 7 und 8 der deutschen Patentschrift DE 196 08 468 C2 beschrieben ist. Von dem verwendeten Abstandssensor ist in Fig. 1 nur eine Abbildungsoptik 104 dargestellt, welche sich in der Nähe der zu erfassenden biologischen Probe 101 befindet. Die biologische Probe 101 wird von einem Beleuchtungsstrahl 103 beleuchtet, welcher in der zweidimensionalen Darstellung von Fig. 1 durch die beiden Randstrahlen 103a, 103b begrenzt wird. Der Beleuchtungsstrahl 103 wird durch die Abbildungsoptik 104 derart abgebildet, dass in Abhängigkeit von der Stellung eines ebenfalls nicht dargestellten Reflektorsystems der Beleuchtungsstrahl 103 auf einen Punkt fokussiert wird, welcher zumindest in unmittelbarer Nähe der Oberfläche der zu untersuchenden biologischen Probe 101 liegt. Das durch den Beleuchtungsstrahl 103 auf die biologische Probe 101 treffende Licht wird von der Oberfläche der Probe 101 zumindest teilweise zurückgestreut. Fig. 1 illustriert den Fall einer biologischen Probe mit einer rauhen Oberfläche, welche den auftreffenden Beleuchtungsstrahl 103 nicht oder zumindest nur sehr schwach reflektiert. Die Rückstreuung des Beleuchtungslichtes erfolgt in guter Näherung isotrop. Dieses isotrope Streuverhalten ist in Fig. 1 durch die zurückgestreuten Lichtstrahlen 105 dargestellt. Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist der Anteil des zurückgestreuten Lichts 105, welcher durch die Abbildungsoptik 104 und weitere nicht dargestellte Komponenten des verwendeten Abstandssensors auf die ebenfalls nicht dargestellte Empfangseinheit des Abstandssensors abgebildet werden, umso größer, je größer die numerische Apertur (n.sin α) des auf die biologische Probe 101 treffenden Beleuchtungsstrahls 103 ist. Dabei ist n der Brechungsindex des an die biologische Probe 101 grenzenden Mediums. Da das in Fig. 1 dargestellte System ein Trockensystem ist, ist das an die biologische Probe 101 grenzende Medium im wesentlichen Luft, so dass der Brechungsindex n in guter Näherung 1 ist. Der Winkel α, welcher ebenfalls die numerische Apertur des Abstandssensors bestimmt, ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Fig. 1 nicht explizit dargestellt. Er hängt jedoch von dem auf die Probe 101 treffenden Beleuchtungsstrahl 103 derart ab, dass der doppelte Winkel 2α gerade gleich dem Winkel ist, welcher von den beiden auf die Probe 101 treffenden Randstrahlen 103a und 103b eingeschlossen wird. Eine Erhöhung der numerischen Apertur hat neben einer Verbesserung des Winkelverhaltens (ein höherer Anteil des von der Probe 101 zurückgestreuten Lichts wird auf die Empfangseinheit des Abstandssensors abgebildet) den weiteren Vorteil, dass die laterale Auflösung des verwendeten Abstandssensors verbessert wird. According to the exemplary embodiment of the invention described here, the surface of the biological sample 101 is detected precisely, so that the volume of the biological sample 101 can be determined precisely. The biological sample 101 is measured with a distance sensor, which is described, for example, in FIGS. 7 and 8 of the German patent DE 196 08 468 C2. Only one imaging optics 104 of the distance sensor used is shown in FIG. 1, which is located in the vicinity of the biological sample 101 to be detected. The biological sample 101 is illuminated by an illuminating beam 103 , which is limited in the two-dimensional representation of FIG. 1 by the two marginal rays 103 a, 103 b. The illumination beam 103 is imaged by the imaging optics 104 such that, depending on the position of a reflector system, which is also not shown, the illumination beam 103 is focused on a point which is at least in the immediate vicinity of the surface of the biological sample 101 to be examined. The light striking the biological sample 101 through the illumination beam 103 is at least partially scattered back from the surface of the sample 101 . Fig. 1 illustrates the case of a biological sample having a rough surface which does not at least reflects the incident illumination beam 103 or only very weak. The backscattering of the illuminating light is isotropic to a good approximation. This isotropic scattering behavior is shown in FIG. 1 by the backscattered light beams 105 . As can be seen from FIG. 1, the proportion of the backscattered light 105 , which is imaged by the imaging optics 104 and further components of the distance sensor not shown, on the receiving unit of the distance sensor, also not shown, the greater the larger the numerical aperture (n. sin α) of the illumination beam 103 striking the biological sample 101 . Here n is the refractive index of the medium bordering on the biological sample 101 . Since the system shown in FIG. 1 is a dry system, the medium bordering on the biological sample 101 is essentially air, so that the refractive index n is close to 1. The angle α, which also determines the numerical aperture of the distance sensor, is not shown explicitly in FIG. 1 for reasons of clarity. However, it depends on the illuminating beam 103 striking the sample 101 in such a way that the double angle 2α is just equal to the angle which is enclosed by the two marginal rays 103 a and 103 b striking the sample 101 . In addition to an improvement in the angular behavior (a higher proportion of the light scattered back by the sample 101 is imaged on the receiving unit of the distance sensor), an increase in the numerical aperture has the further advantage that the lateral resolution of the distance sensor used is improved.
In den Fig. 2a, 2b und 2c ist illustriert, wie aus dem von der Empfangseinheit erfassten Verlauf der Lichtintensität der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem Punkt der zu vermessenden Oberfläche bestimmt wird, welcher Punkt gerade von dem Beleuchtungsstrahl 103 beleuchtet wird. In FIGS. 2a, 2b and 2c is illustrated as the distance between the distance sensor and the point which is determined surface to be measured from the captured by the receiving unit during the light intensity, which point is being illuminated by the illumination beam 103.
Fig. 2a zeigt, wie aus dem Verlauf der Anstiegsflanke der gemessenen Lichtintensität 200 und dem Verlauf der Abfallsflanke der gemessenen Lichtintensität 200 der Abstand zwischen Abstandssensor und Oberflächenpunkt ermittelt werden kann. Die gemessene Lichtintensität 200 ist in einem Koordinatensystem dargestellt, welches als Abszisse x die Ortskoordinate des Reflektorsystems und als Ordinate I die von der Empfangseinheit erfasste Lichtintensität aufweist. Der Verlauf der Lichtintensität 200 ist zu einem Wert xmax symmetrisch, welcher die Ortskoordinate des Reflektorsystems darstellt, bei der von der Empfangseinheit eine maximale Lichtintensität erfasst wird. Aus dem genauen Wert der Ortskoordinate xmax wird der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Punkt der zu vermessenden Oberfläche bestimmt. Eine präzise Bestimmung der Ortskoordinate xmax erfolgt gemäß dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel der Erfindung dadurch, dass eine Referenzintensität Iref bestimmt wird, welche größer als Null und kleiner als die maximale Lichtintensität Imax ist. Aus der Referenzintensität liegt werden die beiden Ortskoordinaten des Reflektorsystems x1 und x2 bestimmt, für welche die gemessene Lichtintensität gerade gleich der Referenzlichtintensität Iref ist. Mit der Kenntnis der beiden Ortskoordinaten x1 und x2 ist unter der Voraussetzung eines symmetrischen Verlaufs der gemessenen Lichtintensität 200 die Ortskoordinate xmax des Reflektorsystems mit maximaler Lichtintensität bestimmt, welche genau in der Mitte zwischen den beiden Ortskoordinaten x1 und x2 liegt. Die mittige Lage der Ortskoordinate xmax zwischen den beiden Ortskoordinaten x1 und x2 ist in Fig. 2a dadurch angedeutet, dass die Abstände auf der Abszisse x sowohl zwischen x1 und xmax als auch zwischen xmax und x2 jeweils gerade Δ/2 betragen. Die Bestimmung des Abstandes zwischen Abstandssensor und Oberflächenpunkt mittels Anstiegs- und Abfallsflanke ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die gemessene Lichtintensität 200 so schwach ist, dass eine präzise Bestimmung der Ortskoordinate xmax aufgrund des insbesondere in der Nähe der Ortskoordinate xmax flachen Kurvenverlaufs der erfassten Lichtintensität 200 nicht möglich ist. FIG. 2a shows how the distance between the distance sensor and the surface point can be determined from the course of the rising edge of the measured light intensity 200 and the course of the falling edge of the measured light intensity 200 . The measured light intensity 200 is shown in a coordinate system which has the local coordinate of the reflector system as the abscissa x and the light intensity detected by the receiving unit as the ordinate I. The course of the light intensity 200 is symmetrical to a value x max , which represents the position coordinate of the reflector system at which a maximum light intensity is detected by the receiving unit. The distance between the distance sensor and the illuminated point of the surface to be measured is determined from the exact value of the location coordinate x max . According to the exemplary embodiment of the invention described here, the location coordinate x max is determined precisely by determining a reference intensity I ref which is greater than zero and less than the maximum light intensity I max . The two spatial coordinates of the reflector system x 1 and x 2 , for which the measured light intensity is just equal to the reference light intensity I ref , are determined from the reference intensity. With the knowledge of the two location coordinates x 1 and x 2 , the location coordinate x max of the reflector system with maximum light intensity, which lies exactly in the middle between the two location coordinates x 1 and x 2, is determined, provided that the measured light intensity 200 is symmetrical. The central position of the location coordinate x max between the two location coordinates x 1 and x 2 is indicated in FIG. 2a by the fact that the distances on the abscissa x both between x 1 and x max and between x max and x 2 are each even Δ / 2 amount. The determination of the distance between the distance sensor and the surface point by means of a rising and falling flank is particularly advantageous when the measured light intensity 200 is so weak that a precise determination of the location coordinate x max due to the flat course of the detected light intensity, in particular in the vicinity of the location coordinate x max 200 is not possible.
In Fig. 2b ist skizziert, wie der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflächenpunkt mittels einer Anpassungskurve an den Verlauf der erfassten Lichtintensität 210 ermittelt wird. Diese Abstandsermittlung ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die erfasste Lichtintensität I so klein ist, dass der Verlauf der erfassten Lichtintensität I, wie in Fig. 2b dargestellt, von einem starken Rauschen bzw. starken statistischen Schwankungen gekennzeichnet ist. In diesem Fall kann die Ortskoordinate xmax am zuverlässigsten dadurch bestimmt werden, dass der Verlauf der gesamten erfassten Lichtintensität 210 durch eine Anpassungskurve 211 angenähert wird. Eine geeignete Anpassungskurve 211 kann beispielsweise eine Lorenzkurve, eine Gaußkurve oder jede andere symmetrische Kurve sein, welche den allgemeinen Verlauf der gemessenen Lichtintensität 210 zumindest annähernd wiedergibt. Aus den bestimmten Anpassungsparametern der Anpassungskurve 211 ist dann mit hoher Genauigkeit die Ortskoordinate xmax festgelegt. FIG. 2 b shows how the distance between the distance sensor and the illuminated surface point is determined by means of an adaptation curve to the course of the detected light intensity 210 . This distance determination is particularly advantageous when the detected light intensity I is so small that the course of the detected light intensity I, as shown in FIG. 2b, is characterized by strong noise or strong statistical fluctuations. In this case, the location coordinate x max can be determined most reliably by approximating the course of the entire detected light intensity 210 by means of an adaptation curve 211 . A suitable adaptation curve 211 can be, for example, a Lorenz curve, a Gauss curve or any other symmetrical curve which at least approximately reflects the general course of the measured light intensity 210 . The location coordinate x max is then determined with high accuracy from the determined adjustment parameters of the adjustment curve 211 .
Wie aus Fig. 2c ersichtlich, kann die Ortskoordinate xmax und damit der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflächenpunkt bestimmt werden, indem ausschließlich die maximale Lichtintensität Imax bestimmt wird. Die Bestimmung von Imax kann beispielsweise durch einen sogenannten Peakdetektor erfolgen, welcher aus dem Verlauf der gemessenen Lichtintensität 220 die Ortskoordinate xmax bestimmt. Die Abstandsermittlung zwischen dem Abstandssensor und dem beleuchteten Oberflächenpunkt anhand der maximalen Lichtintensität ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die gemessene Lichtintensität 220 so hoch ist, dass das Rauschen oder statistische Schwankungen in guter Näherung vernachlässigt werden können. As can be seen from FIG. 2c, the location coordinate x max and thus the distance between the distance sensor and the illuminated surface point can be determined by only determining the maximum light intensity I max . I max can be determined, for example, by a so-called peak detector, which determines the location coordinate x max from the course of the measured light intensity 220 . The determination of the distance between the distance sensor and the illuminated surface point on the basis of the maximum light intensity is particularly advantageous when the measured light intensity 220 is so high that the noise or statistical fluctuations can be neglected to a good approximation.
Zusammenfassend offenbart die Erfindung ein Messverfahren zur Oberflächenvermessung von biologischen und/oder chemischen Proben unter Verwendung eines auf dem konfokalen optischen Abbildungsprinzip beruhenden Abstandssensors, bei dem durch sequentielle Abtastung einzelner Oberflächenpunkte die Oberfläche der zu untersuchenden Probe vermessen wird. Aufgrund der im allgemeinen geringen Rückstreuung und Reflexion von Oberflächen von biologischen und/oder chemischen Proben wird gemäß zweier Ausführungsbeispiele der Erfindung für den Abstandsensor eine hohe numerische Apertur gewählt und/oder ein empfindlicher Detektor verwendet. Zur Bestimmung der maximal von der zu untersuchenden Probe zurückgestreuten Lichtintensität werden abhängig von dem von dem Detektor erfassten Rückstreusignal verschiedene Auswerteverfahren vorgeschlagen. In summary, the invention discloses a measuring method for Surface measurement of biological and / or chemical Samples using one on the confocal optical Imaging principle based distance sensor, in which by sequential scanning of individual surface points Surface of the sample to be examined is measured. by virtue of the generally low backscatter and reflection of Surfaces of biological and / or chemical samples according to two embodiments of the invention for the Distance sensor selected and / or a high numerical aperture a sensitive detector is used. To determine the maximally scattered back from the sample to be examined Light intensity become dependent on that from the detector detected backscatter signal various evaluation methods proposed.
Claims (7)
einer Sendeeinheit mit mindestens einer annähernd punktförmigen Lichtquelle, die auf eine Oberfläche eines Messobjektes abgebildet wird,
einer Empfangseinheit mit mindestens einem zur der Lichtquelle konfokal im bildseitigen Messbereich angeordneten annähernd punktförmigen Detektor,
einer zumindest teilweise koaxialen Führung von Beleuchtungs- und Messstrahl,
einer Abbildungsoptik, über die der Strahlengang zwischen Sendeeinheit und Messobjekt und der Strahlengang zwischen Messobjekt und Empfangseinheit jeweils zumindest einmal geführt ist, und
einem in Bezug auf den Sendestrahl im Fokusbereich der Abbildungsoptik positionierten Reflektorsystem mit zwei um 90° zueinander geneigten Reflektoren, über welches die beiden Strahlengänge jeweils einmal geführt sind, wobei das Messverfahren folgende Schritte aufweist:
a transmission unit with at least one approximately point-shaped light source, which is imaged on a surface of a measurement object,
a receiving unit with at least one approximately point-shaped detector arranged confocally to the light source in the image-side measuring area,
an at least partially coaxial guidance of the illuminating and measuring beam,
imaging optics via which the beam path between the transmitter unit and the measurement object and the beam path between the measurement object and the receiver unit are guided at least once, and
a reflector system positioned in relation to the transmitted beam in the focus area of the imaging optics with two reflectors inclined at 90 ° to each other, over which the two beam paths are each guided once, the measuring method comprising the following steps:
die zu untersuchende Probe mittels einer definierten Verschiebung in einer Ebene senkrecht zu dem auf das Messobjekt treffenden Beleuchtungsstrahl in eine weitere Position gebracht wird,
das Reflektorsystem in Richtung der optischen Achse der Abbildungsoptik bewegt wird, so dass die optischen Wegstrecken zwischen Sendeeinheit und einem weiteren Oberflächenpunkt des Messobjekts und zwischen Empfangseinheit und dem weiterem Oberflächenpunkt des Messobjekts variiert werden,
während der Bewegung des Reflektorsystems der Verlauf der Lichtintensität auf der Empfangseinheit in Abhängigkeit von der Stellung des Reflektorsystems erfasst wird und
aus dem Verlauf der Lichtintensität der Abstand zwischen dem Abstandssensor und dem weiteren Oberflächenpunkt ermittelt wird. 2. Measuring method according to claim 1, in which after determining the distance between the distance sensor and the surface point
the sample to be examined is brought into a further position by means of a defined displacement in a plane perpendicular to the illumination beam striking the measurement object,
the reflector system is moved in the direction of the optical axis of the imaging optics, so that the optical distances between the transmitter unit and a further surface point of the measurement object and between the receiver unit and the further surface point of the measurement object are varied,
during the movement of the reflector system, the course of the light intensity on the receiving unit is detected as a function of the position of the reflector system and
the distance between the distance sensor and the further surface point is determined from the course of the light intensity.
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