DE10156679A1

DE10156679A1 - Genetic vaccine against Leishmania major

Info

Publication number: DE10156679A1
Application number: DE10156679A
Authority: DE
Inventors: Marcos Timon Jimenez; Laura Lopez Fuertes
Original assignee: MOLOGEN FORSCHUNGS ENTWICKLUNG
Current assignee: MOLOGEN FORSCHUNGS ENTWICKLUNG
Priority date: 2001-10-02
Filing date: 2001-11-12
Publication date: 2003-04-30
Also published as: DE50203158D1

Abstract

The invention relates to a DNA-expression construct for treatment of infections with leishmaniasis and a corresponding vaccine. The above serves for immunization against leishmaniasis, whereby the immunogene p36/LACK antigen is used to generate an immunoresponse. A linear double-stranded covalently closed expression cassette is used as gene transport. According to the invention, the gene expression construct can be covalently bonded to an oligopeptide to increase the transfection efficiency.

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Immunisierung gegen Leishmaniose auf DNA-Basis. The invention relates to a medicament for immunization against leishmaniasis DNA-based.

Leishmanien sind trypanosomatide Flagellaten aus der Ordnung Kinetoplastida, die durch weibliche blutsaugende Sandmücken der Gattung Phlebotomus und Lutzomyia auf verschiedene Säugetierspezies und auf den Menschen übertragen werden. Leishmaniosen sind Erkrankungen mit verschiedenen klinischen Krankheitsbildern, die ein bedeutendes Gesundheitsproblem darstellen. Die WHO schätzt, dass weltweit ca. 12 Millionen Menschen von der Krankheit betroffen sind. Ca. 2 bis 9% aller HIV-Patienten erkranken an viceraler Leishmaniose, damit ist dies die dritt häufigste parasitäre Krankheit, an der HIV-positive Personen erkranken. Leishmanias are trypanosomatide flagellates of the Kinetoplastida order by female blood-sucking sand flies of the genus Phlebotomus and Lutzomyia to various mammalian species and to humans. Leishmaniases are diseases with different clinical pictures, which are a major health problem. The WHO estimates that around 12 million people worldwide are affected by the disease. Approximately 2 to 9% of all HIV patients develop viceral leishmaniasis, making it the third most common Parasitic disease that affects HIV-positive people.

Chemotherapie als Behandlungsmethode zeigt nur einen geringen Effekt. Chemotherapy as a treatment method has only a minor effect.

Da Personen, die die Infektion überstanden haben, eine starke Immunität gegen eine spätere Infektion entwickeln, sollte die Entwicklung eines wirksamen Impfschutzes möglich sein. Because people who have survived the infection have strong immunity to it A later infection should develop an effective one Vaccination protection may be possible.

Das Prinzip der Immunisierung beruht auf der Wiedererkennung von Strukturen bereits erfolgreich bekämpfter Erreger. Zwei Hauptarme der Immunabwehr können dabei unterschieden werden: der humorale, welcher auf der Synthese von Antikörpern beruht, die in der Lage sind, im extrazellulären Raum befindliche Bakterien zu bekämpfen und der zelluläre, der im Wesentlichen auf der Aktivität von T-Lymphozyten des Immunsystems beruht. T-Lymphozyten sind in der Lage, mit Viren infizierte Zellen zu erkennen. Die humorale Immunabwehr wird auch als Th2 pathway und die zelluläre Immunabwehr als Th1 pathway bezeichnet. Die Impfung bzw. Immuntherapie von Leishmaniose, deren Ursache intrazelluläre Parasiten sind, sollte durch die Erzeugung einer Th1 typischen Immunreaktion möglich sein. Im Stand der Technik wird vielfach auf die Bedeutung der Erzeugung einer Th1 Antwort in der Therapie oder Prävention von Leishmaniose hingewiesen. (Handman et al., J. Immunol 160: 3949-57, Gurunathan et al., Nature Med: 4 (12): 1409-15). Zur Förderung der Auslösung einer Th1-typischen Immunantwort wird auf das kostimulatorische Zytokin IL-12 als unerläßliches Adjuvanz verwiesen (Parker et al., J. Immunol. 140: 896-902). The principle of immunization is based on the recognition of structures pathogen already successfully fought. Two main arms of the immune system can A distinction is made here: the humoral, which is based on the synthesis of Antibodies based, which are able to bacteria in the extracellular space combat and the cellular, which is essentially based on the activity of T lymphocytes based on the immune system. T lymphocytes are able to deal with viruses to recognize infected cells. The humoral immune defense is also called Th2 pathway and the cellular immune defense is referred to as Th1 pathway. Vaccination or immunotherapy of leishmaniasis, the cause of which are intracellular parasites, should be possible by generating a Th1 typical immune response. in the State of the art is often on the importance of generating a Th1 response noted in the therapy or prevention of leishmaniasis. (Handman et al., J. Immunol 160: 3949-57, Gurunathan et al., Nature Med: 4 (12): 1409-15). to Promotion of the triggering of a Th1-typical immune response to the Costimulatory cytokine IL-12 referred to as indispensable adjuvant (Parker et al., J. Immunol. 140: 896-902).

Verschiedene Antigene wurden in experimentellen Impfprotokollen in Mäusen getestet. BALB/c Mäuse sind ein gutes Modell zum Studium der Leishmaniose. Es bestehen im Infektionsverlauf und der Läsionsentwicklung sehr große Ähnlichkeiten zum Menschen. Die immunologische Reaktion in Mäusen auf diese Infektion, scheint der im Menschen und wahrscheinlich auch der in Hunden zu gleichen (Cox, Int. J. Parasitol. 263: 1147-1157). Verwendete Antigene waren das gp 63 (Scott et al., J. Exp Med. 168: 1675-1684), gp 46 (McMahon-Pratt et al., Infection and Immunity 61: 3351-3359), p-4 und p-8 (Scott et al., Immunology 99: 615-624) sowie das p36 oder auch als LACK bezeichnete Antigen (Gonzales-Aseguinolaza et al., Eur. J. Biochem. 259: 909-916). LACK ist ein 36 kDa Antigen von Leishmanien, das hochkonserviert ist und in allen verwandten Leishmaniaarten zu finden ist. Exprimiert wird es sowohl in der parasitären Promastigote und Amastigote, den beiden Stadien des parasitären Zyklus im Wirt. Um die Verschiebung der Immunantwort in Richtung Th1 zu fördern, setzten Gonzalo et al. Vaccinia Virus als virale Genfähre und IL-12 als Adjuvanz ein. Als Immunogen wurde p36/LACK Antigen benutzt. Verschiedene Impfregime wurden zusammengestellt. Das erfolgreichste Impfregime, Erstimmunisation mit p36 Protein, Zweitimmunisation mit Vaccinia Virus, kodierend für p36 und IL-12, führte zu einer durchschnittlichen Verkleinerung der Läsionen um 52% im Vergleich zu ungeimpften Mäusen. Den größten Infektionsschutz wiesen die Tiere auf, die den höchsten IgG2a Antikörpertiter hatten (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9): 701-711). Various antigens were found in experimental vaccination protocols in mice tested. BALB / c mice are a good model for studying leishmaniasis. It there are very similarities in the course of infection and lesion development to People. The immunological response in mice to this infection appears to be in humans and probably also in dogs (Cox, Int. J. Parasitol. 263: 1147-1157). Antigens used were gp 63 (Scott et al., J. Exp Med. 168: 1675-1684), gp 46 (McMahon-Pratt et al., Infection and Immunity 61: 3351-3359), p-4 and p-8 (Scott et al., Immunology 99: 615-624) and the p36 or also referred to as LACK antigen (Gonzales-Aseguinolaza et al., Eur. J. Biochem. 259: 909-916). LACK is a 36 kDa antigen from Leishmania, the is highly preserved and can be found in all related Leishmania species. It is expressed in both the parasitic Promastigote and Amastigote, the two stages of parasitic cycle in the host. To shift the immune response towards Th1 to promote, Gonzalo et al. Vaccinia virus as a viral gene ferry and IL-12 as Adjuvant. P36 / LACK antigen was used as the immunogen. Various Vaccination regimes have been put together. The most successful vaccination regime, First immunization with p36 protein, second immunization with vaccinia virus, coding for p36 and IL-12, resulted in an average reduction of 52% in lesions Compared to unvaccinated mice. The animals showed the greatest protection against infection who had the highest IgG2a antibody titer (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9): 701-711).

Zum Einschleusen der die immunogenen Antigene oder Teile davon kodierenden DNA sind verschiedene chemische, physikalische und biologische Transfektionsmethoden bekannt. For introducing the coding for the immunogenic antigens or parts thereof DNA is different chemical, physical and biological Transfection methods known.

Biologische Mittel zur Transfektion, sog. Genfähren, sind virale Vektoren, Plasmide oder kovalent geschlossene minimalistische DNA-Konstrukte, die im folgenden MIDGE® genannt werden (MINIMALISTIC IMMUNOLOGICALLY DEFINED GENE EXPRESSION VECTORS, vgl. EP 0914 318 B1). Biological means for transfection, so-called gene ferries, are viral vectors, plasmids or covalently closed minimalistic DNA constructs, which follow MIDGE® (MINIMALISTIC IMMUNOLOGICALLY DEFINED GENE EXPRESSION VECTORS, cf. EP 0914 318 B1).

Plasmide werden durch bakterielle Fermentation gewonnen. Sie enthalten neben dem gewünschten Gen auch die für ihre Vervielfältigung und Selektion notwendige DNA, üblicherweise Resistenzgene gegen bei der Fermentation verwendete Antibiotika. Diese bakterielle DNA hat den Nachteil, dass sie immunstimulatorische Sequenzen ("ISS", z. B. nichtmethylierte Cytosin-Guanin Dinukleotide, "CpG") enthalten kann. Bei Immunsuppression ist genau diese Wirkung nicht erwünscht (ausführlich beschrieben in DE 199 35 756). Bei der Verwendung von Genexpressionskonstrukten auf Basis von Plasmid-DNA besteht zudem das inhärente Risiko der Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen, welches insbesondere bei Schutzimpfungskampagnen nicht vertretbar ist. Plasmids are obtained by bacterial fermentation. They contain alongside the desired gene also the one necessary for its duplication and selection DNA, usually resistance genes used in fermentation Antibiotics. This bacterial DNA has the disadvantage of being immunostimulatory Sequences ("ISS", eg unmethylated cytosine guanine dinucleotides, "CpG") contain can. This effect is not desirable in immunosuppression (detailed described in DE 199 35 756). When using Gene expression constructs based on plasmid DNA also pose an inherent risk of spread of antibiotic resistance genes, which in particular in Vaccination campaigns are not justifiable.

Die auf Grund ihrer hohen Transfektionseffizienz am häufigsten eingesetzten Genfähren sind virale Vektoren. Jedoch stehen die mit deren Einsatz verbundenen Sicherheitsrisiken einer breiten Anwendung in erheblichem Maße entgegen. Es ist bekannt, dass ein hohes Risiko einer cytotoxischen Reaktion des Wirtsorganismus auf die transfizierten Zellen besteht. So führte die Anwendung einer hohen Dosis eines Adenovirus bei einem klinischen Versuch zum Tod des Patienten; offensichtlich war die Ursache dafür eine starke Überreaktion des Immunsystems (Lehrman, 1999, Nature 401: 517-518). Weiterhin ist durch Instabilität des attenuierten Impfstammes die Rückverwandlung in einen virulenten Stamm nicht auszuschließen. Außerdem können die viralen Bestandteile selbst immunogen wirken, was zu einer Herabsetzung ihrer Wirksamkeit durch das Immunsystems des Patienten führt. The most commonly used due to their high transfection efficiency Geneva ferries are viral vectors. However, the associated with their use Security risks to a large extent counter a wide application. It is known to be at high risk of a cytotoxic response by the host organism insists on the transfected cells. So the application of a high dose resulted an adenovirus in a clinical trial for patient death; the reason for this was obviously a strong overreaction of the immune system (Lehrman, 1999, Nature 401: 517-518). Furthermore, due to instability of the attenuated Vaccine strain cannot exclude the conversion back into a virulent strain. In addition, the viral components themselves can have an immunogenic effect, resulting in a Decreases their effectiveness due to the patient's immune system.

Neben diesen Nachteilen, die durch die bisherigen Gentransfermethoden bedingt sind, ist es bisher trotz aller Bemühungen noch nicht gelungen, einen effektiven und sicheren Impfschutz gegen Leishmaniose zu entwickeln. In addition to these disadvantages caused by the previous gene transfer methods are, so far despite all efforts, an effective and to develop safe vaccination protection against leishmaniasis.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, welches ein sicheres, effektives und schützendes Impfen gegen Leishmaniose ermöglicht. The object of the invention is therefore to provide a means which a enables safe, effective and protective vaccination against leishmaniasis.

Die Aufgabe wird durch die Merkmale des unabhängigen Anspruchs gelöst, insbesondere indem das immunogene p36 LACK Antigen zur Erzeugung einer Immunantwort benutzt wird. Als Genfähre wird eine linear-doppelsträngige kovalent geschlossene Expressionskassette verwendet. Diese besteht aus der kodierenden Sequenz, dem Promotor und gegebenenfalls Terminationssequenzen, so dass das Konstrukt nur die für die Expression des gewünschten Gens notwendige Information enthält (vgl. EP 0 941 318 B1). Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass das Genexpressionskonstrukt zur Steigerung der Transfektionseffiziens mit einem Oligopeptid kovalent verbunden ist, welches vorzugsweise eine Länge von fünf bis 25 Aminosäuren hat und mindestens die Hälfte der Aminosäuren zu der Gruppe Lysin oder Arginin gehören. Besonders bevorzugt ist eine Kernlokalisationssequenz, insbesondere

- Die ein Kern-Lokalisierungssignal (Nuclear Localization Signal = NLS) darstellende Peptidsequenz PKKKRKV (Prolin-Lysin-Lysin-Lysin-Arginin-Lysin- Valin = Seq ID 3) aus dem Simian Virus SV-40. Speziell für das SV-40-NLS wurde gezeigt, dass Proteine bis zu 465 kDa zum Zellkern gesteuert werden (Lanford et al. 1986, Cell 15; 46 (4): 575-82). Diese Fähigkeit des Peptids wurde hier durch Kopplung an DNA für die Verbesserung des Gentransfers genutzt.
- oder das elf Aminosäuren lange T-Peptidfragment (YGRKKRRQRRR = Seq ID 2) des HIV-1 Genprodukts TAT.

The object is achieved by the features of the independent claim, in particular by using the immunogenic p36 LACK antigen to generate an immune response. A linear double-stranded covalently closed expression cassette is used as the gene ferry. This consists of the coding sequence, the promoter and possibly termination sequences, so that the construct contains only the information necessary for the expression of the desired gene (cf. EP 0 941 318 B1). According to the invention, it is provided that the gene expression construct is covalently linked to increase the transfection efficiency with an oligopeptide which preferably has a length of five to 25 amino acids and at least half of the amino acids belong to the group lysine or arginine. A core localization sequence is particularly preferred, in particular

- The PKKKRKV (proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine = Seq ID 3) peptide sequence from the Simian virus SV-40, which represents a nuclear localization signal (NLS). Especially for the SV-40-NLS it has been shown that proteins up to 465 kDa are directed to the cell nucleus (Lanford et al. 1986, Cell 15; 46 (4): 575-82). This ability of the peptide was used here by coupling to DNA to improve gene transfer.
- or the eleven amino acid T-peptide fragment (YGRKKRRQRRR = Seq ID 2) of the HIV-1 gene product TAT.

Weitere vorteilhafte Maßnahmen sind in den übrigen Unteransprüchen enthalten. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren näher beschrieben und diskutiert. Further advantageous measures are contained in the remaining subclaims. The invention is described below using exemplary embodiments and figures described and discussed in more detail.

Die überraschende Wirkung des erfindungsgemäßen Arzneimittels wird anhand der Darstellungen gem. der Figuren deutlich. Dabei bedeuten:
pMOK p36: Plasmid kodierend für p36 Antigen
Mp36-NLS: MIDGE kodierend für p36 Antigen mit NLS Peptid gekoppelt
pMOK ctr: Kontrollplasmid kodierend für HBsAg
rVVp36: rekombinanter Vaccinia Virus kodierend für p36
Phosphat: Phosphatpuffer als Kontrolle
Kontrolle +: Positivkontrolle, mit L. major infizierte Seren von Mäusen
Kontrolle -: Negativkontrolle, Seren unbehandelter Mäuse The surprising effect of the medicament according to the invention is shown in the illustrations according to of the figures clearly. Mean:
pMOK p36: plasmid coding for p36 antigen
Mp36-NLS: MIDGE coding for p36 antigen coupled with NLS peptide
pMOK ctr: control plasmid coding for HBsAg
rVVp36: recombinant vaccinia virus coding for p36
Phosphate: phosphate buffer as a control
Control +: positive control, sera from mice infected with L. major
Control -: negative control, sera from untreated mice

Es zeigt: It shows:

Fig. 1 die Bestimmung des Gesamt IgG Titer vor Belastungsinfektion mit Leishmania major Promastigoten. Nur die Impfregime, die eine Zweitimmunisierung mit rekombinantem Vaccinia Virus beinhalten, zeigen einen messbaren Antikörpertiter. Fig. 1 the determination of the total IgG titer before exposure infection with Leishmania major promastigotes. Only the vaccination regimes, which contain a second immunization with recombinant vaccinia virus, show a measurable antibody titer.

Fig. 2 Bestimmung des Gesamt IgG Titer nach Belastungsinfektion. Alle Impfprotokolle zeigen eine meßbare Antikörperantwort, wobei der höchste Titer an zirkulierenden Antikörpern von MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS ausgelöst wird. Fig. 2 Determination of the total IgG titer after exposure infection. All vaccination protocols show a measurable antibody response, with the highest titer of circulating antibodies being triggered by MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS.

Fig. 3 das Verhältnis der Antikörper-Isotypen IgG 2a und IgG 1 nach Zweitimmunisierung und Belastungsinfektion mit L. major Promastigoten. Überraschenderweise lösen die mit dem NLS-Peptid gekoppelten MIDGE eine nach der Antikörper-Isotypenverteilung zytotoxische Immunantwort (Th1) aus, die sich von der durch das Regime pMOK p36/rVV p36 ausgelösten nur gering unterscheidet. Fig. 3, the ratio of the antibody isotypes IgG 2a and IgG 1 after secondary immunization and challenge infection with L. major promastigotes. Surprisingly, the MIDGE coupled with the NLS peptide trigger a cytotoxic immune response (Th1) according to the antibody isotype distribution, which differs only slightly from that triggered by the pMOK p36 / rVV p36 regime.

Fig. 4 die Entwicklung der Läsionen in einem Zeitraum von 8 Wochen nach der Belastungsinfektion. Dabei bewirken die Impfprotokolle basierend auf MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS und pMOK p36/rVV p36 den längsten Schutz gegen eine Infektion mit Leishmania major. Die Schutzwirkung wird durch eine deutlich verzögerte Läsionsentwicklung sichtbar. Der wirksamste und langanhaltenste Schutz wird jedoch durch MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS erreicht. Fig. 4 shows the development of the lesions in a period of 8 weeks after the stress infection. The vaccination protocols based on MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS and pMOK p36 / rVV p36 provide the longest protection against infection with Leishmania major. The protective effect is visible through a significantly delayed lesion development. However, the most effective and long-lasting protection is achieved with MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS.

Fig. 5 die Größe der Läsionen nach Woche 8. In der achten Woche nach der Belastungsinfektion ist die Läsionsgröße bei den mit MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS geimpften Tieren um 80% kleiner als bei der ungeimpften Kontrollgruppe. Es konnte sogar eine 11prozentige Steigerung des Schutzes vor L. major im Vergleich mit der mit pMOK p36/rVV p36 geimpften Gruppe festgestellt werden. Fig. 5 the size of lesions after week 8. In the eighth week after challenge the lesion is in vaccinated with MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS animals by 80% smaller than in the unvaccinated control group. There was even an 11 percent increase in protection against L. major compared to the group vaccinated with pMOK p36 / rVV p36.

Im einzelnen: In detail:

Es wurde untersucht, ob die Modifikation der minimalistischen Expressionskassetten mit Peptiden eine Änderung der Stärke oder Ausrichtung der Immunantwort zu erreichen vermag. Zur Erhöhung der Transfektionseffizienz wurde versucht, verschiedene Peptide und andere organische Moleküle an die MIDGE kovalent zu koppeln. It was examined whether the modification of the minimalistic expression cassettes a change in the strength or orientation of the immune response with peptides can achieve. To increase the transfection efficiency, attempts were made to to covalently couple different peptides and other organic molecules to the MIDGE.

So ist es gelungen durch kovalente Kopplung des Kernlokalisationssignals (NLS) aus dem SV 40 Virus an für HBsAg kodierende MIDGE, einen 10- bis 15-fach erhöhten Antikörpertiter nach intramuskulärer Applikation nachzuweisen (Schirmbeck et al., J. Mol Med. 2001 Jun. 79 (5-6): 343-50). How it succeeded through covalent coupling of the nuclear localization signal (NLS) from the SV 40 virus to MIDGE coding for HBsAg, a 10- to 15-fold Evidence of increased antibody titer after intramuscular administration (Schirmbeck et al., J. Mol Med. 2001 Jun. 79 (5-6): 343-50).

In einem Impfversuch in Mäusen wurden verschiedene Genexpressionskonstrukte, die für das Antigen p36 LACK kodierten, getestet. So wurden mit NLS Peptid gekoppelte MIDGE (MIDGE p36-NLS), Plasmid (pMOKp36) und rekombinanter Vaccinia Virus (rVVp36) eingesetzt. Um einen möglichst hohen Immunschutz zu erreichen, wurden verschiedene Impfregime formuliert. Parameter waren die Stärke des Th2/Th1 shifts und die erreichte Schutzwirkung, die anhand der Größe der Läsionen nach der Belastungsinfektion mit Leishmania major Promastigoten ermittelt wurde. Neben der aus dem Stand der Technik bekannten Methode der Erstimmunisierung mit Plasmid und der Zweitimmunisierung mit rekombinantem Vaccinia Virus (rVV), sollte getestet werden, ob ein ähnlicher Immunschutz auch mit dem erfindungsgemäßen Arzneimittel erreicht werden kann. In a vaccination trial in mice, various gene expression constructs, which coded for the antigen p36 LACK. So with NLS peptide coupled MIDGE (MIDGE p36-NLS), plasmid (pMOKp36) and recombinant Vaccinia virus (rVVp36) used. To get the highest possible immune protection different vaccination regimes have been formulated. Parameters were the strength of the Th2 / Th1 shifts and the protective effect achieved based on the size of the lesions after the stress infection with Leishmania major promastigotes was determined. In addition to the method of primary immunization known from the prior art with plasmid and secondary immunization with recombinant vaccinia virus (rVV), should be tested whether similar immune protection can also be Medicament according to the invention can be achieved.

Die Antikörpertiter für Gesamt IgG als Maß für die Auslösung einer Immunantwort wurden mittels ELISA bestimmt. Dabei konnten vor der Belastungsinfektion mit Leishmania major Promastigoten nur durch zwei Impfregime meßbare Antikörper erzeugt werden (s. Fig. 1). In beiden Fällen wurde rekombinanter Vaccinia Virus als Zweitimmunistaion (Boost) verwendet. Verschiedene Studien beweisen, dass zirkulierende Antikörper allein noch nichts über eine vermeintliche Schutzwirkung aussagen. Ein Zusammenhang zwischen zirkulierenden Antikörpern und Schutz vor Infektion kann erst nach der Belastungsinfektion gesehen werden. In Fig. 2 sind die Antikörpertiter nach der Belastungsinfektion mit L. major dargestellt. Alle Impfregime zeigen meßbare Antikörpertiter, wobei der höchste mit MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS erreicht werden konnte. The antibody titers for total IgG as a measure of the triggering of an immune response were determined by means of ELISA. Before the strain infection with Leishmania major promastigotes, only measurable antibodies could be generated by two vaccination regimes (see FIG. 1). In both cases, recombinant vaccinia virus was used as a second immune boost. Various studies have shown that circulating antibodies alone do not say anything about an alleged protective effect. A connection between circulating antibodies and protection against infection can only be seen after the stress infection. In FIG. 2, the antibody titers are shown after challenge infection with L. major. All vaccination regimes show measurable antibody titers, the highest being achieved with MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS.

Die Antikörperisotypen IgG1 und IgG2a wurden bestimmt, um einen möglichen Th2/Th1 shift in der Immunantwort nachzuweisen. Die Isotopenverteilung von Immunglobin gamma (IgG) für ein bestimmtes Antigen spiegelt die Ausprägung der gesamten Immunantwort gegen dieses Antigen wider. Dabei sind IgG-1 Subtypen charakteristisch für eine humorale Antwort, begleitet von einer verstärkten Ausschüttung von Interleukinen IL-4 und IL-10 durch aktivierte Lymphozyten, ein erhöhter Spiegel von Subtyp IgG 2a ist typisch für eine zelluläre Th1-Antwort, begleitet von erhöhter Ausschüttung von IFNγ und IL-12. Das Auftreten der Isotypen ist dabei nicht exklusiv, die relativen Titer können jedoch als Indikator für die dominante Art der entstandenen Immunantwort gewertet werden. The antibody isotypes IgG1 and IgG2a were determined to identify a possible one Detect Th2 / Th1 shift in the immune response. The isotope distribution of Immunoglobin gamma (IgG) for a specific antigen reflects the expression of the entire immune response against this antigen. IgG-1 are subtypes characteristic of a humoral response, accompanied by an amplified one Release of interleukins IL-4 and IL-10 by activated lymphocytes, an increased IgG 2a subtype levels are typical of a cellular Th1 response accompanied by increased release of IFNγ and IL-12. The appearance of the isotypes is included not exclusive, but the relative titers can be used as an indicator of the dominant species the resulting immune response can be evaluated.

Gemäß Fig. 3 sind mit dem NLS Peptid gekoppelte MIDGE Vektoren in der Lage, eine zelluläre (Th1) Immunantwort auszulösen. Wie dargestellt, ist der zelluläre Arm der Immunantwort entscheidend in der Bekämpfung intrazellulärer Parasiten. Die von MIDGE p36-NLS ausgelöste Verschiebung der Th2 in Richtung Th1 Antwort, unterscheidet sich nur gering von der durch pMOKp36/rVVp36 ausgelösten. According to FIG. 3, MIDGE vectors coupled to the NLS peptide are able to trigger a cellular (Th1) immune response. As shown, the cellular arm of the immune response is crucial in the fight against intracellular parasites. The shift of the Th2 towards Th1 response triggered by MIDGE p36-NLS differs only slightly from that triggered by pMOKp36 / rVVp36.

Zur Beurteilung der erreichten Schutzwirkung wurde eine Belastungsinfektion mit Leishmania major Promastigoten durchgeführt. Anhand des Größenwachstums der Läsionen in Abhängigkeit von der Zeit in Wochen wurde der Impferfolg bewertet. Dabei zeigte sich, daß die mit MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS behandelten Mäuse die vom Durchmesser kleinsten Läsionen aufwiesen, also MIDGE p36-NLS im Impfregime MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS den längsten Impfschutz bewirkt (s. Fig. 4 u. 5). A stress infection with Leishmania major Promastigoten was carried out to assess the protective effect achieved. The success of vaccination was assessed based on the size of the lesions as a function of time in weeks. It was found that the mice treated with MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS had the smallest lesions in diameter, i.e. MIDGE p36-NLS in the MIDGE p36-NLS / MIDGE p36-NLS vaccination regimen provides the longest vaccination protection (see Fig. 4 and 5).

Diese Ergebnisse sind insofern sehr überraschend, da das erfindungsgemäße Arzneimittel in seiner Wirkung das derzeit im Stand der Technik als "bestes" bezeichnete Impfregime der Zweitimmunisierung (Boost) mit rekombinanten Vaccinia Virus übertrifft, und die möglichen Nebenwirkungen, die von Plasmiden und attenuierten Viren ausgehen, vermeidet (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9): 701-711). Gleichzeitig ist das erfindungsgemäße Arzneimittel vergleichbar bis besser, in seiner Schutzwirkung. Die Vermeidung von potentiellen Nebenwirkungen durch Plasmide und rekombinanten Viren, ist der entscheidende Vorteil des erfindungsgemäßen Arzneimittels, die Herstellung ist einfacher und kostensparender, zudem ist das erfindungsgemäße Mittel wesentlich sicherer. These results are very surprising in that the invention Medicament in its effect that is currently "best" in the state of the art designated vaccination regimens for secondary immunization (boost) with recombinant vaccinia virus surpasses, and the possible side effects of plasmids and attenuated Avoid viruses, avoided (Gonzalo et al., Microbes and Infection: 3 (9): 701-711). At the same time, the medicament according to the invention is comparable to better, in its Protection. Avoiding potential side effects from plasmids and recombinant viruses, is the decisive advantage of the invention Drug, the production is easier and cheaper, moreover it is Means according to the invention much safer.

embodiments Example 1.1 Cloning of the plasmid pMOKp36

Vom Ausgangsplasmid pSCp36 wurden 2 Fragmente mittels PCR amplifiziert:
1. PCR ca. 800 bp;
Primer: links 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 6),
Primer: rechts 5'-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG (= Seq ID 7)
2. PCR ca. 950 bp;
Primer: links 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 8),
Primer: rechts 5'-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG (= Seq ID 9) Two fragments of the starting plasmid pSCp36 were amplified by PCR:
1. PCR approx. 800 bp;
Primer: left 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 6),
Primer: right 5'-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG (= Seq ID 7)
2. PCR approx. 950 bp;
Primer: left 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 8),
Primer: right 5'-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG (= Seq ID 9)

Das PCR-Produkt aus der 2. PCR wurde mit Eco31l geschnitten und das kleinere Fragment (ca. 200 bp) isoliert. The PCR product from the 2nd PCR was cut with Eco31l and the smaller one Fragment (approx. 200 bp) isolated.

Das PCR-Produkt aus der 1. PCR wurde mit Bpil geschnitten. The PCR product from the 1st PCR was cut with Bpil.

Das 200 bp Fragment und das geschnittene Fragment aus der 1. PCR wurden zusammenligiert und anschließend mit Kpnl und Sacl geschnitten und in den mit Kpnl und Sacl geschnittenen pMOK-Vektor ligiert. Das entstandene Plasmid erhielt den Namen pMOKp36 (= Seq ID 1). The 200 bp fragment and the cut fragment from the 1st PCR were ligated together and then cut with Kpnl and Sacl and into the with Kpnl and Sacl cut pMOK vector ligated. The resulting plasmid received the Names pMOKp36 (= Seq ID 1).

Example 1.2 Coupling of the NLS sequence to oligonucleotides

Die NLS Kopplung wurden wie folgt vorgenommen: das NLS Peptid mit der Sequenz PKKKRKV wurde in zwei Schritten an die ODN's gekoppelt. Zuerst wurde das modifizierte Oligonukleotid 5'-PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC (wobei xT für aminomodifizierte Thyminbase mit C₂ - Amminolinker steht, = ODN 1 = Seq ID 4) (0,1 mM) mit sulfo-KMUS (5 mM) in PBS bei Raumtemperatur (RT) aktiviert. Nach 120 min. wurde die Reaktion mit 50 mM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethane gestoppt und das aktivierte ODN nach Ethanolpräzipation (300 mM NaOAc pH 5.2, 5.5 mM MgCl₂, 70% Ethanol), Zentrifugation und einmaligem Waschen mit 70% Ethanol erhalten. Das so erhaltene ODN (0,1 mM) wurde in PBS gelöst und reagierte mit dem Peptid (0,2 mM) für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Reaktion wurde durch Gelektrophorese (3%) und Ethidiumbromidfärbung überprüft. Das entstandene NLS gekoppelte ODN wurde durch HPLC aufgereinigt und zur Synthese der MIDGE p36-NLS Konstrukte verwendet. The NLS coupling was carried out as follows: the NLS peptide with the sequence PKKKRKV was coupled to the ODN's in two steps. First, the modified oligonucleotide 5'-PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC (where xT stands for amino-modified thymine base with C ₂ - amino linker = ODN 1 = Seq ID 4) (0.1 mM) with sulfo-KMUS ( 5 mM) in PBS at room temperature (RT) activated. After 120 min. the reaction was stopped with 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane and the activated ODN was obtained after ethanol precipitation (300 mM NaOAc pH 5.2, 5.5 mM MgCl ₂ , 70% ethanol), centrifugation and washing once with 70% ethanol. The ODN (0.1 mM) thus obtained was dissolved in PBS and reacted with the peptide (0.2 mM) for one hour at room temperature. The reaction was checked by gel electrophoresis (3%) and ethidium bromide staining. The resulting NLS-linked ODN was purified by HPLC and used to synthesize the MIDGE p36-NLS constructs.

Example 1.3 Manufacture of the MIDGE p36-NLS

MIDGE sind lineare, kovalent geschlossene Expressionskassetten, die lediglich aus dem CMV Promotor, einem Intron, der entsprechenden Gensequenz und einer Polyadenylierungssequenz bestehen (vgl. EP 0 941 318 B1). Die Konstrukte wurden wie folgt erhalten: das unter Beispiel 1.1 beschriebene Plasmid pMOKp36 wurde mit Eco31l vollständig verdaut. Die Ligation mit 5' phosphorylierten haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotiden (ODN) 5'-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC (= ODN 1 = Seq ID 4) und 5'-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC-3' (= ODN 2 = Seq ID 5) durch T4 DNA Ligase in Anwesenheit von Eco 31l wurde durch Erhitzen auf 70°C gestoppt. Das resultierende Gemisch wurde konzentriert und mit Eco 31l und T7 DNA Ligase in Abwesenheit von Deoxyribonukleotid-Triphosphaten behandelt. Die Aufreinigung erfolgte durch Anionenaustauschchromatographie. MIDGE are linear, covalently closed expression cassettes that only consist of the CMV promoter, an intron, the corresponding gene sequence and one There is a polyadenylation sequence (cf. EP 0 941 318 B1). The constructs were obtained as follows: the plasmid pMOKp36 described in Example 1.1 was also used Eco31l completely digested. The ligation with 5 'phosphorylated hairpin-shaped Oligodeoxynucleotides (ODN) 5'-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC (= ODN 1 = Seq ID 4) and 5'-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC-3 '(= ODN 2 = Seq ID 5) by T4 DNA ligase in the presence of Eco 31l was by heating to 70 ° C stopped. The resulting mixture was concentrated and with Eco 31l and T7 DNA ligase treated in the absence of deoxyribonucleotide triphosphates. The Purification was carried out by anion exchange chromatography.

Example 1.4

p36 Antikörperbestimmung in Mäusenp36 Antibody determination in mice

MIDGE p36-NLS, pMOKp36 und rekombinanter Vaccinia Virus p36 (rVV) wurden in weibliche (Balb/c) Mäuse nach folgendem Impfregime injiziert. Tabelle 1

MIDGE p36-NLS, pMOKp36 and recombinant vaccinia virus p36 (rVV) were injected into female (Balb / c) mice according to the following vaccination regimen. Table 1

Je Gruppe wurden 10 Mäuse eingesetzt. 10 mice were used in each group.

Die verwendeten DNA Mengen betrugen für:
pMOKp36: 100 µg, i.d.
MIDGE p36-NLS: 54,8 µg, i.d.
rVV p36: 5 × 107 pfu/Maus, i.p.
und wurden in Natriumphosphatpuffer pH 7,2 gelöst, injiziert. The amounts of DNA used were:
pMOKp36: 100 µg, id
MIDGE p36-NLS: 54.8 µg, id
rVV p36: 5 × 107 pfu / mouse, ip
and were dissolved in pH 7.2 sodium phosphate buffer, injected.

Nach 2 Wochen erfolgte die Zweitimmunisierung (boost) mit den entsprechenden (s. Tab. 1) DNA Konstrukten. Drei Wochen nach dem Boost erfolgte die Belastungsinfektion mit 5 × 10⁴ Leishmania major Promastigoten. Diese wurden den Mäusen in die rechte Hinterpfote s.c. injiziert. Der Stand der Infektion wurde wöchentlich verfolgt. Die Größe der Läsionen wurde mit einer elektronischen Schiebelehre durch Vergleich mit der linken unbehandelten Hinterpfote bestimmt. After 2 weeks, the second immunization (boost) was carried out with the corresponding (see Table 1) DNA constructs. Three weeks after the boost, 5 × 10 ⁴ Leishmania major promastigotes were infected. These were injected into the right hind paw of the mice. The status of the infection was monitored weekly. The size of the lesions was determined with an electronic caliper by comparison with the left untreated hind paw.

Acht Wochen nach der Belastungsinfektion wurden von allen Mäusen die Seren gewonnen. Der Gesamt IgG Antikörpertiter gegen das p36 Antigen und die Bestimmung der IgG 2a und IgG 1 Antikörper, erfolgte mittels ELISA, wobei die Absorption in OD (Optische Dichte) bei einer Wellenlänge von λ = 406 nm bestimmt wurde.
SEQUENCE LISTING

Sera were obtained from all mice eight weeks after the challenge infection. The total IgG antibody titer against the p36 antigen and the determination of the IgG 2a and IgG 1 antibodies was carried out by means of ELISA, the absorption in OD (optical density) at a wavelength of λ = 406 nm being determined.
SEQUENCE LISTING

Claims

1. Medicament for the treatment of leishmaniasis infections, characterized in that the agent contains a gene expression construct which is operable in eukaryotic cells and which codes for the immunogenic p36 LACK antigen under the control of a promoter sequence.

2. Medicament according to claim 1, wherein the gene expression construct for Increase in transfection efficiency covalently linked to an oligopeptide is.

3. Medicament according to claim 2, wherein the oligopeptide has a length of five to Has 25 amino acids and at least half of the amino acids to the Group include lysine or arginine.

4. Medicament according to claim 2, wherein the oligopeptide Core localization sequence carries.

5. Medicament according to claims 2 to 4, wherein the oligopeptide Sequence PKKKRKV (proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine) contains.

6. Medicament according to claims 2 to 4, wherein the oligopeptide Contains sequence YGRKKRRQRRR.

7. Medicament according to one or more of the preceding claims, where the gene expression construct is a linear double-stranded Deoxyribonucleic acid molecule is located on both ends of the double strand through a short loop of single-stranded nucleoside residues closed is.

8. Use of the medicament according to claim 1 to 7 for immunization against leishmaniasis.