DE10153631B4

DE10153631B4 - Method for comparing two protein states

Info

Publication number: DE10153631B4
Application number: DE2001153631
Authority: DE
Inventors: Friedrich Lottspeich; Josef Kellermann
Original assignee: Individual
Current assignee: KELLERMANN, JOSEF, DR., 82152 PLANEGG, DE; LOTTSPEICH, FRIEDRICH, DR., 82131 STOCKDORF, DE
Priority date: 2001-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2021-11-01
Also published as: WO2003038438A1; DE10153631A1

Abstract

Verfahren zum quantitativen Vergleich der jeweiligen Zusammensetzung zweier Protein-Gemische, welches folgende Schritte aufweist:
(a) Versetzen des ersten Protein-Gemischs mit einem ersten Reagens der allgemeinen Formel R-PRG worin PRG eine proteinreaktive Gruppe ist, welche Bindungen mit Aminogruppen der Proteine eingeht, und R ein erster niedermolekularer Rest mit einer Molmasse unter 400 g/mol ist, welcher zur Erhöhung der Löslichkeit in polaren Lösungsmitteln mindestens eine positive oder negative Elementarladung trägt, und weitgehend vollständige Umsetzung des ersten Reagens mit den funktionellen Gruppen der Proteine des ersten Protein-Gemischs (S11a);
(b) Versetzen des zweiten Protein-Gemischs mit einem zweiten Reagens der allgemeinen Formel R*-PRG worin R* ein zweiter niedermolekularer Rest ist, welcher sich von dem ersten niedermolekularen Rest nur dadurch unterscheidet, daß er mittels mindestens eines Isotops markiert ist, und weitgehend quantitative Umsetzung des zweiten Reagens mit den funktionellen Gruppen der Proteine des zweiten Protein-Gemischs (S11b);
(c) Zusammenführen und Mischen des ersten Protein-Gemischs mit...Method for the quantitative comparison of the respective composition of two protein mixtures, which comprises the following steps:
(a) adding the first protein mixture to a first reagent of the general formula R-PRG wherein PRG is a protein-reactive group that binds with amino groups of the proteins, and R is a first low molecular weight moiety having a molecular weight below 400 g / mol which carries at least one positive or negative elemental charge to increase solubility in polar solvents, and substantially complete Reaction of the first reagent with the functional groups of the proteins of the first protein mixture (S11a);
(b) adding the second protein mixture to a second reagent of the general formula R * -Prg wherein R * is a second low molecular weight residue which differs from the first low molecular weight residue only by being labeled by at least one isotope and substantially quantitative reaction of the second reagent with the functional groups of the proteins of the second proteinaceous mixture (S11b) ;
(c) Merging and mixing the first protein mixture with ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vergleich der Zusammensetzung zweier Protein-Gemische.The The present invention relates to a method for comparing the composition two protein mixtures.

Die Problemstellung, komplexe Protein-Gemische bezüglich ihrer Zusammensetzung miteinander zu vergleichen, spielt insbesondere auf dem Gebiet der Proteomanalyse, d.h. der Untersuchung der Gen-Expression auf Proteinebene, eine entscheidende Rolle. Denn die Proteomanalyse umfaßt in der Regel den Vergleich zweier oder mehrerer Zustände eines biologischen Systems oder Teilsystems, um aus den Unterschieden zwischen den Zuständen funktionelle oder diagnostische Schlußfolgerungen zu ziehen. Die allgemeine Zielsetzung ist hierbei eine quantitative Analyse der meisten Proteine unter Einbeziehung der posttranslationalen Modifikationen.The Problem formulation, complex protein mixtures in terms of their composition to compare with each other, plays in particular in the field of Proteome analysis, i. the study of gene expression at the protein level, a crucial role. Because the proteome analysis covers in the Usually the comparison of two or more states of a biological system or subsystem to make the differences between the states functional or diagnostic conclusions to draw. The general objective here is a quantitative one Analysis of most proteins involving posttranslational Modifications.

Als Proteom wird die Gesamtheit der in einer Zelle enthaltenen Proteine verstanden. Mit verstärktem Interesse an der Proteinausstattung von Organismen hat die Proteomanalyse erheblich an Bedeutung gewonnen. Während die Genomanalyse keine Erkenntnisse über die strukturell-funktionale Beziehung von Biomolekülen in den verschiedenen Zellprozessen liefert, ermöglicht es die Proteomanalyse, dynamische Zustände in den Zellen zu verfolgen. Gegenüber der Untersuchung der Gen-Expression auf mRNA-Ebene bietet die Proteomanalyse den Vorteil, daß in die untersuchte Akkumulation eines Polypeptids neben der Transkription auch die Translation sowie die biologischen Halbwertszeiten von mRNA und zugehörigem Polypeptid eingehen.When Proteome becomes the totality of the proteins contained in a cell Understood. With reinforced Interest in the protein endowment of organisms has proteome analysis gained considerable importance. While the genome analysis no findings on the structurally-functional relationship of biomolecules in the different cell processes supplies, allows It allows proteome analysis to track dynamic states in cells. Across from the investigation of gene expression at mRNA level offers proteome analysis the advantage that in the studied accumulation of a polypeptide besides transcription also the translation as well as the biological half-lives of mRNA and related Enter polypeptide.

Wirtschaftliche Anwendungen der Proteomanalyse sind unter anderem in den folgenden Bereichen zu sehen: Bei der Optimierung von Prozeß- und Medienparametern sowie der genetischen Modifikation von Produktionsstämmen zur Ausbeutesteigerungen in Fermentationsprozessen wird man von der direkten analytischen Verfolgung produktionsbegünstigender Proteine bzw. Proteinmuster profitieren können. Bei der gezielten Suche nach technischen Enzymen lassen sich Konzentrationunterschiede an Enzymen unter Produktions- und Nichtproduktionsbedingungen identifizieren. Weiter kann die vergleichende Proteomanalyse zur Charakterisierung der Wirkmechanismen von Pharmaka, Pflanzenschutzmitteln oder Toxinen sowie zum Aufspüren neuer pharmakologischer Targets und diagnostischer Marker genutzt werden. Bei der Herstellung rekombinanter Proteine können bereits kleinste Mengen unerwünschter Produkte frühzeitig detektiert werden. Kontaminationen und somit wertlose Wirkstoffchargen lassen sich mit dieser Art der Qualitätskontrolle wirksam vermeiden.economic Applications of proteome analysis are, inter alia, in the following Areas to see: When optimizing process and media parameters as well as the genetic modification of production strains Yield increases in fermentation processes are one of the direct analytical monitoring of production-promoting proteins or protein patterns can benefit. In the targeted search for technical enzymes concentration differences can be to identify enzymes under production and non-production conditions. Next, the comparative proteome analysis for characterization the mechanisms of action of pharmaceuticals, pesticides or toxins as well as to track down new pharmacological targets and diagnostic markers. In the production of recombinant proteins even the smallest amounts undesirable Products early be detected. Contaminations and thus worthless substance batches can be effectively avoided with this type of quality control.

Allgemein beinhaltet eine Proteomanalyse die folgenden Schritte: Nach einer Probenvorbereitung, bei welcher die Proteine der Analytik zugänglich gemacht werden, erfolgt eine Trennung möglichst aller Proteine, wobei Erhalt und Reproduzierbarkeit der quantitativen Verhältnisse der einzelnen Proteine zueinander von entscheidender Bedeutung sind. Nach der Quantifizierung aller erkennbaren Proteine sind zumindest die in jeweils unterschiedlicher Menge vorhandenen Proteine auf molekularer Eben zu identifizieren. Von den nach heutigen Schätzungen etwa 20 000 bis 50 000 Proteinen einer Zelle sind etwa die Hälfte einer Analytik zugänglich.Generally A proteome analysis involves the following steps: After a Sample preparation, in which the proteins are made accessible to analytics be, a separation is possible of all proteins, whereby preservation and reproducibility of the quantitative conditions of the individual proteins are crucial to each other. After the quantification of all recognizable proteins are at least the present in different amounts of proteins molecular level to identify. From the by today's estimates About 20,000 to 50,000 proteins of a cell are about half of one Analytics accessible.

Bisher wird für die Proteomanalyse verbreitet die zweidimensionale (2D-) Gelelektrophorese eingesetzt. Hierbei erfolgt eine Auftrennung des zu analysierenden Proteingemischs nach Ladung und Molekülmasse in sogenannte Spots, welche mittels Farbstoffreaktionen, oder fluoreszierenden bzw. radioaktiven Markierungen visualisiert werden. Unterschiede zwischen unterschiedlichen Proteinzuständen werden durch Verhältnisse von Spot-Intensitäten quantifiziert. Die bei der geschilderten herkömmlichen Vorgehensweise auftretenden Problem sind vielfältiger Natur. Da die Komplexität der Proteinmischungen dazu führt, daß häufig in der Position eines Spots mehrere Proteine vorhanden sind, können gleichzeitige Intensitätsveränderungen mehrerer Proteine nur schwierig quantifiziert werden. Bei der Verwendung von Farbstoffen korreliert die Färbeintensität nur über einen kleinen Bereich mit der Proteinmenge. Die automatische Auswertung der gefärbten Gele über densitometrische Methoden ist bis heute nicht befriedigend gelöst, so daß personalintensive und daher teure manuelle Nachbearbeitungen der Gelauswertung durchgeführt werden müssen. Beim Einsatz radioaktiver Markierungen werden zusätzlich kostenintensive Sicherheitsmaßnahmen im Laborbetrieb erforderlich. Generell ist bei den genannten herkömmlichen Verfahren der technische Aufwand hoch, die resultierende Reproduzierbarkeit jedoch meist unbefriedigend. Daher wurden verschiedentlich Anstrengungen unternommen, die Gelelektrophorese durch andere Verfahren zur Proteomanalyse zu ersetzen.So far is for Proteome analysis promotes two-dimensional (2D) gel electrophoresis used. This is a separation of the analyzed Protein mixture according to charge and molecular mass in so-called spots, which by means of dye reactions, or fluorescent or radioactive Markings are visualized. Differences between different protein states become by circumstances of spot intensities quantified. The occurring in the described conventional approach Problem are diverse nature. Because the complexity which results in protein mixtures that often in The position of a spot multiple proteins may be present, simultaneous intensity changes multiple proteins are difficult to quantify. When using Dyes correlates the staining intensity only over one small area with the protein amount. The automatic evaluation the dyed Gels over densitometric methods is not solved satisfactorily so far, so that labor-intensive and therefore expensive manual post-processing of the gel evaluation are performed have to. When using radioactive markers are also costly Safety measures required in the laboratory. Generally speaking, in the conventional methods mentioned the technical effort high, the resulting reproducibility but mostly unsatisfactory. Therefore, various efforts Gel electrophoresis by other methods for proteome analysis to replace.

Aus WO 00/11208 A1 sowie Gygi, S.P. et al: "Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags", Nature Biotechnology 17 (1999), S. 994-999 ist ein Verfahren zum Vergleich zweier Proteinzustände für die Proteomanalyse bekannt, dessen Grundzüge in 1 der anhängenden Zeichnungen schematisch dargestellt sind. Die im Rahmen einer Proteomanalyse zu vergleichenden Proteingemische I und II werden mit einem Reduktionsmittel behandelt (Schritt nicht dargestellt), so daß alle Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen der Proteine brechen. Anschließend wird das Proteingemisch I mit einem Reagens versetzt (Schritt S1a), welches ein Affinitätslabel, beispielsweise Biotin, aufweist, das über einen Linker mit einer proteinreaktiven Gruppe verbunden ist. Die proteinreaktive Gruppe reagiert selektiv mit den nunmehr freien Thiolgruppen der Proteine, so daß an jedes Cystein ein Linker mit einem Affinitätslabel gebunden wird. Dem Proteingemisch II wird ein Reagens zugesetzt (Schritt S1b), welches sich von dem vorgenannten Reagens nur durch eine Isotopenmarkierung unterscheidet, ansonsten jedoch mit diesem chemisch identisch ist, so daß die Cysteine des Proteingemischs II entsprechend derivatisiert werden. Bei der Isotopenmarkierung handelt es sich um eine mehrfache Deuterierung des Linkers.From WO 00/11208 A1 as well as Gygi, SP et al: "Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags", Nature Biotechnology 17 (1999), p. 994-999 is a method for comparing two protein states for proteome analysis known, its main features in 1 the accompanying drawings are shown schematically. The protein mixtures I and II to be compared in a proteome analysis are treated with a reducing agent (step not shown) so that all disulphide bridges break between the cysteines of the proteins. Subsequently, the protein mixture I is mixed with a reagent (step S1a) which contains an affinity label, for example Bio tin, which is linked via a linker with a protein-reactive group. The protein-reactive group reacts selectively with the now-free thiol groups of the proteins so that a linker with an affinity label is bound to each cysteine. A reagent is added to the protein mixture II (step S1b), which differs from the abovementioned reagent only by an isotopic labeling, but otherwise is chemically identical to it, so that the cysteines of the protein mixture II are correspondingly derivatized. Isotope labeling is a multiple deuteration of the linker.

Die beiden Proteingemische werden zusammengeführt (Schritt S2), um sicherzustellen, daß alle nachfolgenden Schritte für die aus beiden Proteingemischen stammenden Proteine unter identischen Bedingungen erfolgen. Das entstandene neue Proteingemisch wird enzymatisch hydrolysiert (Schritt S3), um die zur Analyse erforderliche Trennung auf Peptidebene zu verlagern, da aus prinzipiellen Gründen die Trennleistung chromatografischer Methoden für Proteine wesentlich schlechter ist als für kürzerkettige Peptide. Für diese relativ kleinen Proteinfragmente stehen leistungsfähige, gut automatisierbare chromatographische und (kapillar-) elektrophoretische Trennmethoden mit massenspektrometrischer Detektion zur Verfügung.The both protein mixtures are merged (step S2) to ensure that all subsequent ones Steps for the proteins derived from both protein mixtures under identical Conditions are fulfilled. The resulting new protein mixture becomes enzymatic hydrolyzed (step S3) to provide the separation required for analysis to relocate at the peptide level, because of principle reasons the Separation performance of chromatographic methods for proteins much worse is as for shorter Peptides. For These relatively small protein fragments are powerful, good automatable chromatographic and (capillary) electrophoretic separation methods with mass spectrometric detection available.

Das entstandene Peptidgemisch wird einer Affinitätstrennung unterworfen. Dabei werden die Peptide, welche ein Affinitätslabel aufweisen, auf chromatographischem Wege, im Falle des Affinitätslabels Biotin mit einer Streptavidinsäule, isoliert (Schritt S4a), wohingegen alle anderen Peptide verworfen werden. Die so abgetrennten cysteinhaltigen Peptide werden zur qualitativen und quantitativen Analyse einem Massenspektrometer mit vorgeschalteter mikrokapillarer Flüssigchromatographie (LC/MS) zugeführt (Schritt S5). Anhand der detektierten Peptide läßt sich auf die ursprünglich vorhandenen Proteine rückschließen. Dabei unterscheiden sich einander entsprechende Peptide aus den Proteingemischen in ihrer molekularen Masse aufgrund der Isotopenmarkierung und sind daher voneinander unterscheidbar.The resulting peptide mixture is subjected to affinity separation. there For example, the peptides that have an affinity label are chromatographic Ways, in the case of the affinity label Biotin with a streptavidin column, isolated (step S4a), whereas all other peptides are discarded become. The thus separated cysteine-containing peptides become qualitative and quantitative analysis with a mass spectrometer upstream microcapillary liquid chromatography (LC / MS) supplied (Step S5). Based on the detected peptides can be on the original existing Infer proteins. there differ from each other corresponding peptides from the protein mixtures in their molecular mass due to isotope labeling and are therefore distinguishable from each other.

Im resultierenden Massenspektrogramm 1, das in 1 ausschnittsweise, rein schemtisch und stark vereinfacht für ein fiktives Beispiel dargestellt ist, sind einander entsprechende Peptide jeweils als Doppelpeaks 2a/2b, 3a/3b zu erkennen. In der Auftragung relative Intensität n über das Verhältnis aus Masse und Ladung M/z der detektierten Spezies sind die zu aus Proteingemisch II stammenden Peptiden gehörigen Peaks 2b, 3b gegenüber den zu entsprechenden, aus Proteingemisch I stammenden Peptiden gehörigen Peaks 2a, 3a etwas nach rechts verschoben, denn die an Cysteine aus Proteingemisch I gebundenen Linker sind leichter, als die deuterierten, an Cysteine aus Proteingemisch II gebundenen Linker. Aufgrund der Höhe der einander entsprechenden Peaks 2a, 2b bzw. 3a, 3b sind die zugehörigen Peptide relativ zueinander quantifizierbar. Während das Protein, aus welchem die zu den Peaks 2a, 2b gehörigen Peptide hervorgegangen sind, in den beiden Proteingemischen jeweils in gleicher Menge vertreten war, zeigt die unterschiedliche Höhe der Peaks 3a, 3b, daß das entsprechende Protein im Proteingemisch I etwa in doppelter Menge gegenüber Proteingemisch II vorhanden war.In the resulting mass spectrogram 1 , this in 1 FIG. 1 is a fragmentary, purely schematic and greatly simplified representation of a fictitious example, corresponding peptides are each as double peaks 2a / 2 B . 3a / 3b to recognize. In the plot relative intensity n on the ratio of mass and charge M / z of the detected species are the belonging to the protein mixture derived peptides peptides 2 B . 3b opposite to the corresponding peptides derived from protein mixture I 2a . 3a shifted to the right, because the linkers bound to cysteines from protein mixture I are lighter than the deuterated linkers attached to cysteines from protein mixture II. Due to the height of the corresponding peaks 2a . 2 B respectively. 3a . 3b the associated peptides can be quantified relative to each other. While the protein from which the to the peaks 2a . 2 B belonging to corresponding peptides, in both protein mixtures was represented in each case in the same amount, shows the different height of the peaks 3a . 3b in that the corresponding protein in protein mixture I was present in about twice the amount of protein mixture II.

Prinzipielle Limitationen des oben erläuterten Verfahrens bestehen jedoch darin, daß aufgrund der Selektivität der reaktiven Gruppe für die relativ seltene Aminosäure Cystein durch die Affinitätstrennung nur eine kleine Anzahl von Peptiden aus den jeweiligen Proteinen erfaßt werden (im statistischen Mittel befinden sich nur 1,6 Cysteine in einem Protein). Das Erkennen und die Analyse von posttranslationalen Modifikationen, die außerhalb der cysteinhaltigen Peptide liegen, ist so nicht möglich. Auch werden cysteinfreie Proteine generell nicht erfaßt. Ferner ist die Handhabung durch das relativ komplexe und mäßig lösliche Reagens erschwert.principal Limitations of the above However, the method consist in that due to the selectivity of the reactive Group for the relatively rare amino acid Cysteine by the affinity separation only a small number of peptides from the respective proteins detected (statistically, only 1.6 cysteines are present in a protein). The recognition and analysis of post-translational Modifications outside the cysteine-containing peptides are, so is not possible. Also cysteine-free proteins are generally not detected. Furthermore, the handling by the relatively complex and moderately soluble reagent difficult.

Ein weiteres, eine Isotopenmarkierung umfassendes Verfahren zum Vergleich zweier Proteingemische, welches sich ebenfalls auf die Analyse von cysteinhaltigen Peptidspecies beschränkt, ist aus Wang, S. und Regnier, F.E.: "Proteomics Based on Selecting and Quantifying Cysteine Containing Peptides by Covalent Chromatography, J. Chromatography A 924 (2001), S. 345-357 bekannt. Durch die Außerachtlassung cysteinfreier Peptide bestehen die gleichen Einschränkungen, wie oben erläutert.One another isotopic labeling method for comparison two protein mixtures, which also focuses on the analysis of cysteine-containing peptide species, is from Wang, S. and Regnier, F.E .: "Proteomics Based on Selecting and Quantifying Cysteine Containing Peptides by Covalent Chromatography, J. Chromatography A 924 (2001), pp. 345-357 known. By disregarding cysteine-free peptides have the same limitations, as explained above.

In Andersen, J.S. und Mann, M.: "Functional Genomics by Mass Spectrometry", FEBS Letters 480 (2001), S. 25-31 ist der Einsatz von massenspektrometrischen Verfahren im Rahmen der Proteomanalyse beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der massenspektrometrischen Analyse selbst liegt. Der Vergleich zweier unterschiedlicher Proteinzustände wird nur am Rande behandelt.In Andersen, J.S. and Mann, M .: "Functional Genomics by Mass Spectrometry ", FEBS Letters 480 (2001), pp. 25-31 is the use of mass spectrometry Procedures described in the context of proteome analysis, focusing on on the mass spectrometric analysis itself. The comparison two different protein states is treated only marginally.

Aus Ji, J. et al.: "Strategy for Qualitativeand Quantitative Analysis in Proteomics Based on Signature Peptides", J. Chromatography B 749 (2000), S. 197-210 ist ein Verfahren zur Proteomanalyse bekannt, bei welchem zwei zu vergleichende Proteingemische zunächst jeweils einer Trypsinverdauung unterworfen werden, und die entstehenden Peptidgemische eine Isotopenmarkierung erfahren. Die unterschiedlich markierten Peptidgemische werden miteinander vermischt, fraktioniert und anschließend massenspektrometrisch analysiert. Da die tryptische Spaltung für jedes der Proteingemische separat vorgenommen wird, ist nicht gewährleistet, daß für alle beteiligten Proteinspecies die jeweils gleichen Bedingungen während des Aufbereitungsprocederes herrschen. Hierunter leidet die Reproduzierbarkeit der erzielbaren Ergebnisse.Ji, J. et al .: "Strategy for Qualitative and Quantitative Analysis in Proteomics Based on Signature Peptides", J. Chromatography B 749 (2000), pp. 197-210 discloses a method for proteome analysis in which two protein mixtures to be compared each first subjected to a Trypsinverdauung, and the resulting peptide mixtures undergo an isotope labeling. The differently labeled peptide mixtures are mixed together, fractionated and then analyzed by mass spectrometry. Since the tryptic cleavage is done separately for each of the protein mixtures, it is not guaranteed that for all involved protein species which each have the same conditions during the Aufbereitungsprocederes. This suffers from the reproducibility of the achievable results.

Oda, A. et al.: "Accurate Quantitation of Protein Expression and Site-Specific Phosphorylation", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 96 (1999), S. 6591-6596 beschreibt ein Verfahren zum Vergleich von Proteinzuständen zweier Zellkulturen. Eine Isotopenmarkierung wird durchOda, A. et al .: "Accurate Quantitation of Protein Expression and Site-Specific Phosphorylation ", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 96 (1999), pp. 6591-6596 describes a method for comparing protein states of two cell cultures. Isotope labeling is by

Angesichts der geschilderten Probleme, die sich aus dem Stand der Technik ergeben, ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für die Proteomanalyse ein Verfahren zum Vergleich der Zusammensetzung zweier Protein-Gemische verfügbar zu machen, welches gegenüber herkömmlichen gel-elektrophoretischen Methoden eine höhere Reproduzierbarkeit besitzt und dennoch auch posttranslationale Modifikationen mit erfaßt sowie im Labor möglichst gut handhabbar ist.in view of the described problems, which result from the prior art, It is the object of the present invention to provide a method for proteome analysis available for comparison of the composition of two protein mixtures do that opposite usual Gel-electrophoretic methods has a higher reproducibility and yet also post-translational modifications are included as well as good as possible in the lab is manageable.

Diese Aufgabe Wird durch ein Verfahren zum quantitativen Vergleich der jeweiligen Zusammensetzung zweier Protein-Gemische gelöst, welches folgende Schritte aufweist: Das erste Protein-Gemisch wird mit einem ersten Reagens der allgemeinen Formel R-PRG versetzt, worin PRG eine proteinreaktive Gruppe, welche Bindungen mit funktionellen Gruppen der Proteine eingeht, und R ein erster niedermolekularer Rest ist, wobei unter niedermolekular eine Molmasse unter 400 g/mol verstanden wird, die Molmasse des Rests vorzugsweise jedoch unter 300 g/mol, oder gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform unter 200 g/mol liegt. Dabei erfolgt eine weitgehend vollständige Umsetzung des ersten Reagens mit den funktionellen Gruppen der Proteine des ersten Protein-Gemischs. Das zweiten Protein-Gemisch wird mit einem zweiten Reagens der allgemeinen Formel R*-PRG versetzt, worin R* ein zweiter niedermolekularer Rest ist, welcher sich von dem ersten niedermolekularen Rest nur dadurch unterscheidet, daß er mittels mindestens eines Isotops markiert ist, wobei eine ein- oder vorzugsweise mehrfache Deuterierung, jedenfalls aber eine nichtradioaktive Markierung unter Handhabungsgesichtspunkten besonders vorteilhaft sind. Dabei erfolgt auch eine weitgehend vollständige Umsetzung des zweiten Reagens mit den funktionellen Gruppen der Proteine des zweiten Protein-Gemischs. Das erste Protein-Gemisch wird mit dem zweiten Protein-Gemisch zu einem dritten Protein-Gemisch zusammengeführt. Das dritte Protein-Gemisch wird fraktioniert und enzymatisch oder chemisch in. Peptide gespalten, wobei Peptide mit ersten niedermolekularen Resten R und Peptide mit zweiten niedermolekularen Resten R* entstehen. Alle entstandenen Peptide oder einer zumindest einen Großteil der entstandenen Peptidspezies repräsentierenden Probe werden mittels Massenspektrometrie (MS bzw. MS/MS) analysiert, wobei die Peptide der Massenspektrometrie in ihrer Gesamtheit oder in gelelektrophoretisch erzeugten Fraktionen zugeführt werden, und vom Verhältnis von Peptiden mit ersten niedermolekularen Resten R zu den Peptiden gleicher Spezies mit zweiten niedermolekularen Resten R* auf quantitative Unterschiede der Zusammensetzung zwischen dem ersten Protein-Gemisch und dem zweiten Protein-Gemisch rückgeschlossen wird (Identifizierung der Proteine über ihre Sequenz in einer Datenbank). Vorzugsweise ist der Massenspektrometrie ein weiterer Modifikations- und/oder Trennschritt, beispielsweise eine Flüssigchromatographie vorgeschaltet (LC/MS).These Task Will be solved by a quantitative comparison procedure dissolved respective composition of two protein mixtures, which following steps The first protein mixture is reacted with a first reagent the general formula R-PRG, wherein PRG is a protein-reactive group, which bonds with functional groups of the proteins, and R is a first low molecular weight radical, wherein lower molecular weight a molecular weight below 400 g / mol is understood, the molecular weight of Preferably, however, below 300 g / mol, or according to a particularly preferred embodiment less than 200 g / mol. This is a largely complete implementation of the first reagent with the functional groups of the proteins of the first protein mixture. The second protein mixture is mixed with a second reagent of the general formula R * -PRG, wherein R * is a second low molecular weight radical which is different from the first low molecular weight radical only differs in that it means at least one isotope is marked, with one or preferably multiple deuteration, but in any case a non-radioactive label are particularly advantageous from handling points of view. there there is also a largely complete implementation of the second Reagent with the functional groups of proteins of the second protein mixture. The first protein mixture becomes a third protein mixture with the second protein mixture merged. The third protein mixture is fractionated and enzymatically or chemically cleaved in. Peptides, peptides with first low molecular weight Residues R and peptides with second low molecular weight R * arise. All resulting peptides or at least a majority of the resulting peptide species representing Samples are analyzed by mass spectrometry (MS or MS / MS), where the peptides of mass spectrometry in their entirety or in gelelektrophoretisch generated fractions are fed, and the ratio of Peptides with first low molecular weight residues R to the peptides of the same Species with second low molecular weight R * on quantitative Differences in composition between the first protein mixture and the second protein mixture inferred will (identify the proteins about their sequence in a database). Preferably, the mass spectrometry is a further modification and / or Separation step, for example, a liquid chromatography upstream (LC / MS).

Der niedermolekulare Rest R bzw R* enthält kein übliches Affinitätslabel im obenbeschriebenen Sinn, d.h. er wird entgegen dem Stand der Technik nicht als Ansatzpunkt für eine selektive Trennung eingeführt. Eine herkömmliche Affinitätstrennung auf Peptidebene unterbleibt. Dadurch besteht der Vorteil, daß prinzipiell alle Peptide für die weitere Analyse zur Verfügung stehen, so daß auch viele posttranslationale Modifikationen analysierbar werden.Of the Low molecular weight R or R * contains no common affinity label in the sense described above, i. he is not contrary to the prior art as a starting point for introduced a selective separation. A conventional one affinity separation omitted at the peptide level. This has the advantage that in principle all peptides for the further analysis available stand, so that too many post-translational modifications become analyzable.

Das erste und zweite Reagens werden so gewählt, daß deren proteinreaktive Gruppe PRG mit einem möglichst großen Anteil der Aminosäurebausteine der Proteine reagiert. Als vorteilhaft stellt sich demnach überraschenderweise eine möglichst unselektive Reaktion im Sinne einer Reaktion der proteinreaktive Gruppe mit möglichst vielen funktionellen Gruppen der Proteine dar – entgegen dem Stand der Technik, der ein Anbringen der Affinitätslabel an die statistisch seltenen Thiolgruppen favorisiert. Unter Gesichtspunkten der Handhabung, der Häufigkeit von Lysin und der Verfügbarkeit entsprechender Reagenzien bietet der erfindungsgemäße Ansatz, eine proteinreaktive Gruppe einzusetzen, die zur Derivatisierung an freien Aminogruppen (einschließlich der N-terminalen Aminogrupen) angreift, besondere Vorteile. Die primären Aminogruppen des Lysins und des N-Terminus sind auch aufgrund ihrer Reaktivität besonders geeignet für die Derivatisierung. Insbesondere eine Acylierung (also Amidbildung) oder Alkylierung kommt in Betracht. Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die proteinreaktive Gruppe entsprechend

– eine Ester- oder aktivierte Estergruppe (Beispiele sind Tetrafluorophenylester, Pentafluorophenylester, N-Hydroxysuccinimidester),
– Cyanat-, Isocyanat-, Thiocyanat-, oder Isothiocyanatgruppe,
– Carboxylgruppe (Phenoxyessigsäure, Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure)
– Säurehalogenid-, Säureanhydrid-, Sulfonsäurehalogenid- oder Sulfonsäureanhydridgruppe (z.B. Acetylchlorid, Carbonyldichlorid, Methylsulfonsäurechlord)
– Formylgruppe oder
– Thiocarbonylhalogenidgruppe (z.B. Methylthiocarbonylchlorid).

The first and second reagents are chosen so that their protein-reactive group PRG reacts with the largest possible proportion of the amino acid building blocks of the proteins. Surprisingly, therefore, an unselective reaction in the sense of a reaction of the protein-reactive group with as many functional groups of the proteins as possible is advantageous - contrary to the prior art, which favors attachment of the affinity label to the statistically rare thiol groups. From the viewpoint of handling, the frequency of lysine and the availability of corresponding reagents, the approach according to the invention of using a protein-reactive group which attacks for derivatization on free amino groups (including the N-terminal amino groups) offers particular advantages. The primary amino groups of the lysine and the N-terminus are also particularly suitable for the derivatization because of their reactivity. In particular, an acylation (ie amide) or alkylation is considered. According to advantageous embodiments of the present invention, the protein-reactive group is corresponding

An ester or activated ester group (examples are tetrafluorophenyl ester, pentafluorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester),
Cyanate, isocyanate, thiocyanate or isothiocyanate group,
Carboxyl group (phenoxyacetic acid, trichloroacetic acid, trifluoroacetic acid)
Acid halide, acid anhydride, sulfonic acid halide or sulfonic anhydride group (eg acetyl chloride, carbonyl dichloride, methylsulfone acid chlord)
- formyl group or
- Thiocarbonylhalogenidgruppe (eg Methylthiocarbonylchlorid).

Möglich ist auch eine Derivatisierung mehrer unterschiedlicher funktionaler Gruppen mittels mehreren Reagenzien mit verschiedenen proteinreaktiven Gruppen.Is possible also a derivatization of several different functional Groups by means of several reagents with different protein-reactive Groups.

Zur Erhöhung der Löslichkeit weist der niedermolekulare Rest R bzw. R* erfindungsgemäß mindestens eine Ladung auf. Eine fixierte positive Ladung kann beispielsweise durch Alkylierung mit Bromethyltriphenylphosphin eingeführt werden.to increase the solubility has the low molecular weight radical R or R * according to the invention at least a charge on. For example, a fixed positive charge can be be introduced by alkylation with Bromethyltriphenylphosphin.

Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt vor der Spaltung der Proteine in Peptide eine Trennung des aus den zusammengeführten beiden derivatisierten Proteingemischen entstandenen dritten Proteingemischs in Fraktionen. Diese kann vorteilhafterweise flüssigchromatographisch oder elektrophoretisch (ein- oder zweidimensional) vorgenommen werden. Eine solche hochauflösende Trennung auf Proteinebene bietet den Vorteil, daß nach der Proteolyse der einzelnen Fraktionen bzw. Gelspots jeweils nur eine wesentlich geringere Anzahl an Peptiden gleichzeitig der Massenspektroskopie zuzuführen ist, was die Auswertung der erhaltenen Massenspektren wesentlich erleichtert. Die eingangs erwähnte prinzipiell schlechte Reproduzierbarkeit einer solchen Trennung auf Proteinebene, insbesondere bei der 2D-Gelelektrophorese spielt hierbei keine Rolle, da die Trennung für die Proteine aus beiden miteinander zu vergleichenden Zuständen unter identischen Bedingungen im Gemisch durchgeführt wird. Vorteilhaft wirkt sich die oben erläuterte Derivatisierung der freien Aminogruppen aus, da die Basizität hierdurch vermindert wird, was die Trennung im 2D-Gel verbessert. Bei Anwendung eindimensionaler Gelelektrophorese werden auch der zweidimensionalen Gelelektrophorese nur schlecht zugängliche Proteine, wie Membranproteine, sehr große, sehr saure oder sehr basische Proteine erfaßt.According to the present Invention occurs before cleavage of the proteins into peptides Separation of the merged two derivatized protein mixtures resulting third protein mixture in fractions. This can advantageously by liquid chromatography or be made electrophoretically (one or two-dimensional). Such a high-resolution Separation at the protein level offers the advantage that after proteolysis of the individual Fractions or gel spots each only a much smaller number at the same time be supplied to peptides of mass spectroscopy, which greatly facilitates the evaluation of the mass spectra obtained. The initially mentioned in principle poor reproducibility of such a separation at the protein level, especially in 2D gel electrophoresis this does not matter because the separation for the proteins from both together to be compared under identical conditions in a mixture. Advantageously, the above-described derivatization of the free amino groups, since the basicity is thereby reduced, which improves the separation in the 2D gel. When using one-dimensional gel electrophoresis also the two-dimensional gel electrophoresis are only bad accessible proteins, like membrane proteins, very large, very acidic or very basic proteins detected.

Anhand der zugehörigen Zeichnungen werden Beispiele bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung näher erläutert.Based the associated Drawings are examples of preferred embodiments of the present invention Invention closer explained.

1 zeigt schematisch den Ablauf des obenbeschriebenen Verfahrens zum Vergleich zweier Proteinzustände gemäß dem Stand der Technik. 1 schematically shows the sequence of the above-described method for comparing two protein states according to the prior art.

2 zeigt schematisch den Ablauf einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Vergleich zweier Proteingemische gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung. 2 Fig. 3 shows schematically the sequence of a preferred embodiment of the method for comparing two protein mixtures according to one aspect of the present invention.

3 zeigt schematisch den Ablauf einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zum Vergleich zweier Proteingemische gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung. 3 Fig. 3 shows schematically the sequence of a preferred embodiment of the method for comparing two protein mixtures according to another aspect of the present invention.

Im Rahmen des anhand 2 erläuterten erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst die freien Aminogruppen der hinsichtlich Ihrer Zusammensetzung miteinander zu vergleichenden Proteingemische I und II derivatisiert (Schritte S11a, S11b), wobei das hierzu dem Proteingemisch II zugesetzte Reagens mit einem nichtradioaktiven schwereren Isotop markiert, das dem Proteingemisch I zugesetzte, ansonsten chemisch identische Reagens dagegen unmarkiert ist. Möglich ist hier beispielsweise die Acetylierung mittels eines sechsfach deuterierten bzw. nicht deuterierten Essigsäureanhydrids, alternativ mittels eines dreifach deuterierten bzw. nicht deuterierten Acetylchlorids. Der Massenunterschied zwischen an die Proteine gebundene markierte und nicht markierte Reste beträgt somit 3 g/mol. Bei Verwendung anderer geeigneter niedermolekularer Reagenzien können neben Wasserstoff und Deuterium auch andere stabile Isotopenpaare verwendet werden, beispielsweise Brom-79 und Brom-81: aus Bromnikotinsäure oder Brombenzoesäure werden zunächst über N-Hydroxysuccinimid aktivierte Ester gebildet, welche anschließend mit den Proteinen umgesetzt werden.As part of the 2 The process according to the invention is first of all derivatized by the free amino groups of the protein mixtures I and II to be compared with each other (steps S11a, S11b), the reagent added to protein mixture II being labeled with a non-radioactive heavier isotope added to protein mixture I, otherwise chemically identical reagent is unlabeled. For example, acetylation by means of a six-fold deuterated or non-deuterated acetic anhydride is possible, alternatively by means of a triple-deuterated or non-deuterated acetyl chloride. The mass difference between labeled and unlabeled residues bound to the proteins is thus 3 g / mol. When using other suitable low molecular weight reagents in addition to hydrogen and deuterium, other stable isotope pairs can be used, for example, bromine-79 and bromine-81: from Bromnikotinsäure or Brombenzoesäure first N-hydroxysuccinimide activated esters are formed, which are then reacted with the proteins.

Nach möglichst vollständiger Umsetzung mit dem zugesetzten Reagens werden die beiden Proteingemische zusammengeführt (Schritt S12) und gemischt, um sicherzustellen, daß alle nachfolgenden Schritte für die aus beiden Proteingemischen stammenden Proteine unter identischen Bedingungen erfolgen. Aufgrund der Isotopenmarkierung bleiben jedoch aus Proteingemisch II stammende Proteine unterscheidbar von aus Proteingemisch I stammenden Proteinen.To preferably complete Reaction with the added reagent become the two protein mixtures together (Step S12) and mixed to ensure that all subsequent steps for the from both protein mixtures derived proteins under identical Conditions are fulfilled. However, due to the isotope labeling remain Proteins derived from protein mixture II distinguishable from Protein mixture I derived proteins.

Anschließend erfolgt eine Trennung des erhaltenen neuen Proteingemischs in Fraktionen (Schritt S13) mittels ein- oder zweidimensionaler Gelelektrophorese. Wird eine zweidimensionale Gelelektrolyse eingesetzt, so besteht die Möglichkeit, entweder eine Visualisierung der erhaltenen Spots durch Färbung mit Sypro-Ruby vorzunehmen, und die Proteine jedes visulisierten Spots als jeweilige Fraktion den folgenden Schritten zu unterziehen, oder aber das Gel ohne Anfärbung mechanisch zu schneiden, und die in den jeweiligen Gelstücken enthaltenen Proteine als jeweilige Fraktion den folgenden Schritten zu unterziehen. Die letztgenannte Variante bietet den Vorteil, daß auch sehr schwach anfärbende Proteine noch erfaßt werden.Then done a separation of the obtained new protein mixture into fractions (step S13) by means of one- or two-dimensional gel electrophoresis. Becomes a two-dimensional gel electrolysis used, so there is the Possibility, either Visualize the spots obtained by staining with Sypro-Ruby and the proteins of each visualized spot as the respective fraction to undergo the following steps, or the gel without staining mechanically and the proteins contained in the respective gel pieces as each fraction to undergo the following steps. The latter Variant offers the advantage that as well very weakly coloring Proteins still detected become.

Die Proteine jeder Fraktion werden jeweils einer chemischen oder enzymatischen Spaltung in Peptide unterzogen (Schritt S14). Die erhaltenen Peptidfraktionen werden massenspektrometrisch (MS, MS/MS) analysiert (Schritt S15).The proteins of each fraction are each subjected to chemical or enzymatic cleavage into peptides (step S14). The obtained Peptide fractions are analyzed by mass spectrometry (MS, MS / MS) (step S15).

Im resultierenden Massenspektrogramm 11, das in 2 ausschnittsweise, rein schemtisch und stark vereinfacht für ein fiktives Beispiel dargestellt ist, sind einander entsprechende Peptide jeweils als Doppelpeaks, z.B. Doppelpeaks 12a/12b, 13a/13b, zu erkennen. In der Auftragung relative Intensität n über das Verhältnis aus Masse und Ladung M/z der detektierten Spezies sind die zu aus Proteingemisch II stammenden Peptiden gehörigen Peaks 12b, 13b gegenüber den zu entsprechenden, aus Proteingemisch I stammenden Peptiden gehörigen Peaks 12a, 13a etwas nach rechts verschoben, da die bei der Derivatisierung (Schritt S11a) an das Proteingemisch I gebundenen Reste leichter als die markierten, bei der Derivatisierung (Schritt S11a) an des Proteingemisch II gebundenen Reste sind. Aufgrund der Höhe der einander entsprechenden Peaks 12a, 12b bzw. 13a, 13b sind die zugehörigen Peptide relativ zueinander quantifizierbar. Während das Protein, aus welchem die zu den Peaks 12a, 12b gehörigen Peptide hervorgegangen sind, in den beiden Proteingemischen jeweils in gleicher Menge vertreten war, zeigt die unterschiedliche Höhe der Peaks 13a, 13b, daß das entsprechende Protein im Proteingemisch I etwa in doppelter Menge gegenüber Proteingemisch II vorhanden war.In the resulting mass spectrogram 11 , this in 2 FIG. 1 is a fragmentary, purely schematic and greatly simplified representation of a fictitious example, corresponding peptides are each as double peaks, eg double peaks 12a / 12b . 13a / 13b to recognize. In the plot relative intensity n on the ratio of mass and charge M / z of the detected species are the belonging to the protein mixture derived peptides peptides 12b . 13b opposite to the corresponding peptides derived from protein mixture I 12a . 13a shifted slightly to the right, since the residues bound to the protein mixture I in the derivatization (step S11a) are lighter than the labeled residues bound to the protein mixture II in the derivatization (step S11a). Due to the height of the corresponding peaks 12a . 12b respectively. 13a . 13b the associated peptides can be quantified relative to each other. While the protein from which the to the peaks 12a . 12b belonging to corresponding peptides, in both protein mixtures was represented in each case in the same amount, shows the different height of the peaks 13a . 13b in that the corresponding protein in protein mixture I was present in about twice the amount of protein mixture II.

Im Rahmen des anhand 3 erläuterten erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst die hinsichtlich Ihrer Zusammensetzung miteinander zu vergleichenden Proteingemische I und II noch jeweils getrennt voneinander chemisch oder enzymatisch hydrolysiert (Schritte 21a, 21b).As part of the 3 explained method according to the invention initially the protein mixtures I and II to be compared with respect to their composition are each still separately hydrolyzed separately or chemically or enzymatically (steps 21a, 21b).

Die freien Aminogruppen der beiden entstandenen Peptidgemische werden derivatisiert (Schritte S22a, S22b), wobei das hierzu dem aus Proteingemisch II entstandenen Peptidgemisch zugesetzte Reagens mit einem nicht-radioaktiven schwereren Isotop markiert, das dem aus Proteingemisch I entstandenen Peptidgemisch zugesetzte, ansonsten chemisch identische Reagens dagegen unmarkiert ist. Auch hier können die obengenannten Reagentien eingesetzt werden.The free amino groups of the two resulting peptide mixtures derivatized (steps S22a, S22b), the purpose of this from the protein mixture II peptide mixture added reagent with a non-radioactive heavier isotope, which is the result of protein mixture I. Peptide mixture added, otherwise chemically identical reagent on the other hand is unmarked. Again, the above reagents can be used become.

In einem weiteren Schritt (S23) werden die derivatisierten Peptidgemische zusammengeführt und gemischt. Das neu entstandene Peptidgemisch wird in einem Massenspektrometer mit vorgeschalteter Flüssigchromatographie analysiert (Schritt S24). Die Interpretation des in 3 ausschnittsweise, rein schemtisch und stark vereinfacht für ein fiktives Beispiel dargestellten Masssenspektrogramms 21 erfolgt hierbei wie oben erläutert.In a further step (S23), the derivatized peptide mixtures are combined and mixed. The newly formed peptide mixture is analyzed in a mass spectrometer with upstream liquid chromatography (step S24). The interpretation of in 3 fragmentary, purely schematic and greatly simplified mass spectrogram shown for a fictitious example 21 takes place as explained above.

Claims

A method for quantitatively comparing the particular composition of two protein mixtures comprising the steps of: (a) adding the first protein mixture to a first reagent of the general formula R-PRG wherein PRG is a protein-reactive group that binds with amino groups of the proteins, and R is a first low molecular weight moiety having a molecular weight below 400 g / mol which carries at least one positive or negative elemental charge to increase solubility in polar solvents, and substantially complete Reaction of the first reagent with the functional groups of the proteins of the first protein mixture (S11a); (b) adding the second protein mixture to a second reagent of the general formula R * -Prg wherein R * is a second low molecular weight residue which differs from the first low molecular weight residue only by being labeled by at least one isotope and substantially quantitative reaction of the second reagent with the functional groups of the proteins of the second proteinaceous mixture (S11b) ; (c) combining and mixing the first protein mixture with the second protein mixture into a third protein mixture (S12); (d) at least partially separating the third protein mixture into protein fractions (S13) by means of gel electrophoresis, (e) cleaving the proteins of the protein fractions of the third protein mixture into peptides (S14), where peptides having first low-molecular-weight residues R and peptides having second low-molecular residues R * arise; and (f) analysis of all resulting peptides or a sample representing at least a majority of the resulting peptide species by mass spectrometry (S15), leaving affinity separation at the peptide level supplied to the mass spectrometry peptides in their entirety or in fractions, and the ratio of peptides to peptides first low molecular weight residues R to the peptides of the same species with second low molecular weight residues R * quantitative differences in the composition between the first protein mixture and the second protein mixture is inferred.

Method according to claim 1, characterized in that that the at least partial separation of the third protein mixture in protein fractions (S13) by one-dimensional gel electrophoresis.

Process according to Claim 1, characterized in that the at least partial separation of the third protein mixture into protein fractions (S13) is provided by means of two-dimensional gel electrophoresis is taken.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that second low molecular weight residue with at least one non-radioactive Isotope is marked.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that the step of analyzing by mass spectrometry at least one further separation and / or modification step is switched.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that first low molecular weight radical has a molecular weight below 300 g / mol.

Method according to Claim 6, characterized that the first low molecular weight radical has a molecular weight below 200 g / mol.

Method according to one of the preceding claims, characterized characterized in that protein-reactive group an activated ester group, cyanate, isocyanate, Thiocyanate, or isothiocyanato group, acid halide, acid anhydride, Sulfonsäurehalogenid- or sulfonic anhydride group, Formyl group or thiocarbonyl halide group.