DE10152376A1

DE10152376A1 - New substrates for phospholipase, useful e.g. for diagnosis and drug screening, contain two fluorophores that make a fluorescent energy-transfer pair

Info

Publication number: DE10152376A1
Application number: DE2001152376
Authority: DE
Inventors: Carsten Schultz; Oliver Wichmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-10-27
Filing date: 2001-10-27
Publication date: 2003-05-15
Anticipated expiration: 2021-10-28
Also published as: DE10152376B4

Abstract

Phospholipase substrates (I) containing two fluorophores are new. Phospholipase substrates of formula (I) are new. A = 1-20C alkylene or alkenylene; B = NH, NHCO, CONH, NHCONH, NHCSNH, oxygen or sulfur, or a bond; R<1>, R<2> = different fluorophores, one a donor and the other an acceptor of a fluorescent energy-transfer pair; X = CH2,oxygen or sulfur; Y = oxygen or sulfur; Z = SO2OR<3> or -P(Y)(O<->)OR<3>; R<3> = H, (CH2)nN(R<4>)3, inositol, optionally modified serine or optionally modified glycerol; n = 2-4; R<4> = H, Me or Et. Independent claims are also included for: (1) Membrane-permeable phospholipase substrates of formula (II); and (2) Reagents (IV)-(VI) for introducing a phosphite group during preparation of (membrane-permeable) phosphoethanolamine- or phosphocholine-containing lipids. A<1>, A<2> = A; M = -(CH2)2SCOV or -CH2OCOV; N = -(CH2)2NHCOOCH2(p-phenylene)-COV, -(CH2)2NHCOO(CH2)-2SCOV or -(CH2)2N<+>Me3; V = 1-4C alkyl; D, E = 1-8C alkyl or alkenyl; Anion = (pseudo)halide, (halo)acetate or tosylate.

Description

Background of the Invention

Phospholipasen (PL) katalysieren die Hydrolyse von Estergruppen der sn-3- Phosphoglyceride. Die Enzyme wirken an der Lipid-Wasser-Grenzfläche. Die human- physiologisch bedeutenden Phospholipasen sind die Phospholipase A₂ (PLA₂) und die Phosphatidylinosit-spezifische Phospholipase C (PI-PLC). Die für diese Erfindung relevante PLA₂ hydrolysiert Ester an der sn-2-Position von Phospholipiden mit, je nach Kopfgruppe und sn-2-Seitenkette, unterschiedlicher Spezifität. Folgende biochemische Funktionen der PLA₂ sind bisher bekannt: a) PLA₂ ist in verschiedenen Giften von Schlangen, Bienen, etc. enthalten. Hohe Dosen sind letal; b) PLA₂ gehört zu den Verdauungsenzymen im gastrointestinalen Trakt. Die Aktivitätsbestimmung ist daher von klinischer Bedeutung; c) bei einigen Krankheiten, wie Pankreatitis, Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und Allergien ist die PLA₂- Konzentration im Blut und anderen Körperflüssigkeiten erhöht, woraus die erhebliche diagnostische Bedeutung der PLA₂-Bestimmung resultiert; d) im Gegensatz zu den zuvor beschrieben sekretorischen Enzymen mit ihrer geringen Grösse (~15 kDa), kommt innerhalb der Zellen eine 85 kDa grosse Enzymform (cPLA₂) vor, die ein wesentliches Glied in der intrazellulären Signalübertragung darstellt und insbesondere Arachidonsäure freisetzt. Letztere dient als biochemische Vorstufe bei der Bildung von Prostaglandinen und Leukotrienen, wichtigen Botenstoffen bei Infektionen und der Schmerzentwicklung. Die Identifizierung spezifischer Inhibitoren der PLA₂ sind deswegen von pharmazeutischer Bedeutung und Methoden, die das Auffinden geeigneter Substanzen erlauben sind dafür essentiell. Phospholipases (PL) catalyze the hydrolysis of ester groups of the sn-3 phosphoglycerides. The enzymes work at the lipid-water interface. The human physiologically significant phospholipases are phospholipase A ₂ (PLA ₂ ) and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC). The PLA ₂ relevant for this invention hydrolyzes esters at the sn-2 position of phospholipids with different specificities depending on the head group and sn-2 side chain. The following biochemical functions of PLA ₂ are known to date: a) PLA ₂ is contained in various poisons of snakes, bees, etc. High doses are lethal; b) PLA ₂ is one of the digestive enzymes in the gastrointestinal tract. The activity determination is therefore of clinical importance; c) in some diseases, such as pancreatitis, infectious diseases, autoimmune diseases and allergies, the PLA ₂ concentration in the blood and other body fluids is increased, which results in the considerable diagnostic importance of the PLA ₂ determination; d) In contrast to the previously described secretory enzymes with their small size (~ 15 kDa), an 85 kDa enzyme form (cPLA ₂ ) occurs within the cells, which is an essential link in intracellular signal transmission and in particular releases arachidonic acid. The latter serves as a biochemical precursor in the formation of prostaglandins and leukotrienes, important messengers for infections and the development of pain. The identification of specific inhibitors of PLA ₂ are therefore of pharmaceutical importance and methods that allow the detection of suitable substances are essential.

Die Bestimmung der PLA₂-Aktivität ist also sowohl ausserhalb als auch innerhalb lebender Zellen eine bedeutende diagnostische Aufgabe. The determination of the PLA ₂ activity is therefore an important diagnostic task both outside and inside living cells.

Existing measurement methods

Herkömmliche Messmethoden zur Bestimmung der PLA₂-Aktivität im extrazellulären Medium oder aus Zelllysaten verwenden titrimetrische Verfahren (Frigaralla et al., 1971), radioaktive Markierungen (Shakir et al., 1981), photometrische Verfahren (Hendrickson et al., 1983; Hoffmann, 1986), und Radio- (Nishijima et al., 1981) oder Fluoreszenzimmunoassays (Eskola et al., 1983). Auch die Verwendung von Fluorophoren ist bekannt (Thuren et al., 1985). Es wurden entweder zwei Bodipyfarbstoffe an den Enden zweier Fettsäuren einer Probe verwendet, so dass ein sich selbst quenchender Komplex entstand, der nach der Spaltung durch PLA₂ einen Anstieg der Fluoreszenz zeigte (Farber et al., 1999). In diesem Fall kann die Änderung der Emission nur bei einer Wellenlänge gemessen werden, so dass die Messung grundsätzlich abhängig von der Konzentration des Farbstoffes ist und somit zu großen Fehlern führt. Anderenfalls wurden zwei Pyren-Fluorophore, die im intakten Molekül Excimere bilden, eingesetzt (Fernández & Júarez, 1994; Burack et al., 1993). Letztere erlauben eine Ratiomessung, weil sich bei der Spaltung der Probe die Emissionwellenlänge verschiebt. Allerdings liegen die Anregungs- und Emissionswellenlängen im ultravioletten Bereich und sind daher für automatisierte Messungen unter Standardbedingungen kaum verwendbar. Conventional measurement methods for determining the PLA ₂ activity in the extracellular medium or from cell lysates use titrimetric methods (Frigaralla et al., 1971), radioactive labeling (Shakir et al., 1981), photometric methods (Hendrickson et al., 1983; Hoffmann, 1986), and radio (Nishijima et al., 1981) or fluorescence immunoassays (Eskola et al., 1983). The use of fluorophores is also known (Thuren et al., 1985). Either two bodipy dyes were used at the ends of two fatty acids in a sample, so that a self-quenching complex was formed, which showed an increase in fluorescence after cleavage by PLA ₂ (Farber et al., 1999). In this case, the change in emission can only be measured at one wavelength, so that the measurement is fundamentally dependent on the concentration of the dye and thus leads to large errors. Otherwise, two pyrene fluorophores which form excimers in the intact molecule were used (Fernández & Júarez, 1994; Burack et al., 1993). The latter allow a ratio measurement because the emission wavelength shifts when the sample is split. However, the excitation and emission wavelengths are in the ultraviolet range and can therefore hardly be used for automated measurements under standard conditions.

description

Für die Messung extrazellulärer PLA₂-Aktivitäten besteht Bedarf an Testsystemen, die einzeln oder in Automaten, z. B. in einer 96-well-Platte durchgeführt werden können, deren Anregungswellenlänge der Fluorophore im Bereich einer Laserbande liegt, deren zwei Emissionswellenlängen mit den Zuständen "PLA₂ aktiv" und "PLA₂ inaktiv" korreliert und deren Messung der Fluoreszenz als Bruch der Intensitäten eine genaue Pipettierung überflüssig macht. Geleistet werden diese Anforderungen erfindungsgemäß von Verbindungen mit der Formel (I),

worin
jedes A unabhängig voneinander eine Alkylen- oder Alkenylengruppe, verzweigt oder unverzweigt, mit 1 bis 20 C-Atomen,
jedes B unabhängig voneinander eine -NH-, -NHC(O)-, -CONH-, -NHC(O)NH-, - NHC(S)NH-, -O- oder -S- Gruppe oder keine Gruppe,
R¹ und R² jeweils ein unterschiedlicher Fluorophor, wobei die chromophoren Eigenschaften des einen Fluorophor die eines Donors, des Fluorophor die eines Akzeptors eines Paares von Farbstoffen sind, die Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer erlauben,
X eine -CH₂-, -O- oder -S-Gruppe, jedes Y unabhängig voneinander eine -O- oder - S-Gruppe, Z eine Phosphat, Sulfat- oder Thiophosphatgruppe bedeuten, wobei R³ = H oder -(CH₂)_nNR⁴ ₃, in der n eine Zahl von 2 bis 4 und R⁴ H, CH₃ oder C₂H₅ bedeuten oder R³ Inosit, modifiziert oder unmodifiziert oder Serin, modifiziert oder unmodifiziert oder Glycerin, modifiziert oder unmodifiziert, bedeuten, sowie ihre Salze und ihre Verwendung. For the measurement of extracellular PLA ₂ activities, there is a need for test systems that are used individually or in machines, e.g. B. can be carried out in a 96-well plate, the excitation wavelength of the fluorophore is in the range of a laser band, the two emission wavelengths correlated with the states "PLA ₂ active" and "PLA ₂ inactive" and their measurement of fluorescence as a break in the intensities no need for precise pipetting. According to the invention, these requirements are met by compounds of the formula (I)

wherein
each A independently of one another is an alkylene or alkenylene group, branched or unbranched, having 1 to 20 C atoms,
each B independently of one another has an -NH-, -NHC (O) -, -CONH-, -NHC (O) NH-, - NHC (S) NH-, -O- or -S- group or no group,
R ¹ and R ^{2 are} each a different fluorophore, the chromophoric properties of the one fluorophore being that of a donor, the fluorophore being that of an acceptor of a pair of dyes, which allow fluorescence resonance energy transfer,
X is a -CH ₂ -, -O- or -S group, each Y is independently an -O- or - S group, Z is a phosphate, sulfate or thiophosphate group, where R ³ = H or - (CH ₂ ) _n NR ⁴ ₃ , in which n is a number from 2 to 4 and R ^{4 is} H, CH ₃ or C ₂ H ₅ or R ^{3 is} inositol, modified or unmodified or serine, modified or unmodified or glycerol, modified or unmodified , as well as their salts and their use.

Für die Messung intrazellulärer PLA₂-Aktivitäten besteht Bedarf an Testsystemen, die den obigen Bedingungen entsprechen. Darüber hinaus müssen diese Verbindungen in der Lage sein, per Diffusion die Plasmamembran lebender Zellen zu überwinden. Zu diesem Zweck müssen die geladenen Gruppen der Substanzen mit außerhalb der Zelle stabilen, innerhalb der Zelle enzymatisch spaltbaren Gruppen versehen werden, so dass die Verbindungen in die Zelle gelangen, diese aber nicht wieder verlassen können. Bioaktivierbare Schutzgruppen dieser Art fuer Phosphate sind bekannt (Farquhar & Srivastva, 1984; Thompson et al., 1993; Schultz et al., 1993; Valette et al., 1996; Meier, 1997). Allerdings sind S-Acetylthioethylgruppen als bioaktivierbare Schutzgruppen für Aminogruppen bisher nicht eingesetzt worden. Nach Abspaltung der temporären Schutzgruppen ist die Verbindung als intrazelluläre Messsonde aktiv und kann die Calcium-stimulierte Aktivierung der cPLA₂ nach Stimulation der Zellen mit einem geeigneten Agonisten messen. Alternativ erhält man so auch ein indirektes Signal für die Öffnung der Calciumkanäle in der Plasmamembran. Inhibitoren der PLA₂-Aktivierung und besagter Calciumkanäle können so ebenfalls direkt gemessen werden. Geleistet werden diese Anforderungen von Verbindungen mit der Formel (II),

worin
jedes A¹ und A² eine Alkylen- oder Alkenylengruppe, verzweigt oder unverzweigt, mit 1 bis 20 C-Atomen,
jedes B unabhängig voneinander eine -NH-, -NHC(O)-, -CONH-, -NHC(O)NH-, - NHC(S)NH-, -O- oder -S- Gruppe oder keine Gruppe,
R¹ und R² jeweils ein unterschiedlicher Fluorophor, wobei die chromophoren Eigenschaften des einen Fluorophor die eines Donors, des anderen Fluorophor die eines Akzeptors eines Paares von Farbstoffen sind, die Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfer erlauben,
X eine -CH₂-, -O- oder -S-Gruppe, jedes Y unabhängig voneinander eine -O- oder - S-Gruppe, Z eine Phosphat- oder Thiophosphatgruppe, versehen mit den Gruppen M und N, bedeutet, wobei V eine Alkylgruppe C₁ bis C₄, verzweigt oder unverzweigt, darstellt.

For the measurement of intracellular PLA ₂ activities, there is a need for test systems that meet the above conditions. In addition, these compounds must be able to diffuse across the plasma membrane of living cells. For this purpose, the charged groups of substances must be provided with groups that are stable outside the cell and that can be enzymatically split inside the cell, so that the compounds get into the cell but cannot leave it again. Bioactivatable protective groups of this type for phosphates are known (Farquhar & Srivastva, 1984; Thompson et al., 1993; Schultz et al., 1993; Valette et al., 1996; Meier, 1997). However, S-acetylthioethyl groups have so far not been used as bioactivatable protective groups for amino groups. After the temporary protective groups have been split off, the compound is active as an intracellular measuring probe and can measure the calcium-stimulated activation of the cPLA ₂ after stimulation of the cells with a suitable agonist. Alternatively, an indirect signal for opening the calcium channels in the plasma membrane is obtained. Inhibitors of PLA ₂ activation and said calcium channels can also be measured directly. These requirements are met by compounds with the formula (II),

wherein
each A ¹ and A ^{2 is} an alkylene or alkenylene group, branched or unbranched, having 1 to 20 C atoms,
each B independently of one another has an -NH-, -NHC (O) -, -CONH-, -NHC (O) NH-, - NHC (S) NH-, -O- or -S- group or no group,
R ¹ and R ^{2 are} each a different fluorophore, the chromophoric properties of one fluorophore being that of a donor and the other fluorophore being that of an acceptor of a pair of dyes which permit fluorescence resonance energy transfer,
X is a -CH ₂ -, -O- or -S group, each Y is independently an -O- or - S group, Z is a phosphate or thiophosphate group provided with the groups M and N, where V is a Alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched.

Unter der Einwirkung von Phospholipase A₂ wird das Lipasesubstrat mit der Formel I unter Freisetzung der fluoreszent markierten Säure HOOC-A-B-X² gespalten. Durch die dadurch auftretende räumliche Trennung der Fluorophore R¹ und R² kann der zuvor intakte Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer nicht mehr stattfinden (Abb. 1). Under the action of phospholipase A ₂ , the lipase substrate with the formula I is cleaved to release the fluorescently labeled acid HOOC-ABX ² . Due to the resulting spatial separation of the fluorophores R ¹ and R ² , the previously intact fluorescence resonance energy transfer can no longer take place ( Fig. 1).

Fig. 1

Schematische Darstellung der Funktionsweise der FRET-Proben anhand eines Beispieles. Durch die Einwirkung des Enzymes ändert sich der Abstand der Fluorophore und FRET kann nicht mehr effizient stattfinden. Die damit einhergehende Änderung des Emissionsspektrums (Abb. 2) erlaubt so, die Enzymaktivität kontinuierlich zu messen.

Schematic representation of how the FRET samples work using an example. The action of the enzyme changes the distance between the fluorophores and FRET can no longer take place efficiently. The associated change in the emission spectrum ( Fig. 2) allows the enzyme activity to be measured continuously.

Dadurch wird die Fluoreszenz des Donorfarbstoffes verstärkt, während gleichzeitig die Fluoreszenz des Akzeptorfarbstoffes abnimmt (Abb. 2). This increases the fluorescence of the donor dye, while at the same time the fluorescence of the acceptor dye decreases ( Fig. 2).

Fig. 2

Emissionsspektren der Probe 1 nach Zugabe von PLA₂ der Honigbiene gemessen nach den angegebenen Zeitintervallen. Die Anregung erfolgte bei 458 nm (Seitenbande des Argonlasers).

Emission spectra of sample 1 after adding PLA _{2 of} the honeybee measured according to the specified time intervals. The excitation took place at 458 nm (sideband of the argon laser).

Die Veränderung des Emissionsratios I_EmDonor/I_EmAkzeptor ist so ein direktes Maß für die Enzymaktivität (Abb. 3). The change in the emission _ratio I _EmDonor / I _EmAceptor is a direct measure of the enzyme activity ( Fig. 3).

Fig. 3

Veränderung des Emissionsratios I_{EmDonor510 nm}/I_{EmAkzeptor620 nm} mit der Zeit nach Zugabe von PLA₂, dargestellt für vier Proben 1 (geschlossene Linie), 2 (Punkt-Strich Linie), 3 (Punktlinie) und 4 (Strichlinie). (n = 3)

Change in the emission _ratio I _{EmDonor510 nm} / I _{EmAkzeptor620 nm} with the time after adding PLA ₂ , shown for four samples 1 (closed line), 2 (dash-dash line), 3 (dash line) and 4 (dash line). (n = 3)

Für Strukturen der Formel I weist A vorzugsweise 6 bis 12 C-Atome auf, besonders bevorzugt sind 10 bis 12 C-Atome. Für Strukturen der Formel II weist A1 vorzugsweise 6 bis 12 C-Atome auf, besonders bevorzugt sind 10 bis 12 C-Atome, während A2 vorzugsweise 3 bis 5 C-Atome, besonders bevorzugt 4 C-Atome aufweist. For structures of the formula I, A preferably has 6 to 12 carbon atoms, particularly 10 to 12 carbon atoms are preferred. For structures of formula II A1 has preferably 6 to 12 carbon atoms, particularly preferred are 10 to 12 carbon atoms, while A2 preferably has 3 to 5 carbon atoms, particularly preferably 4 carbon atoms having.

Das erfindungsgemässe Phospholipasesubstrat kann mit weiteren Paare von Fluorophoren, die als Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Donor und -Akzeptor fungieren, dargestellt werden. Vorzugsweise werden folgende Donoren und Akzeptoren, dargestellt in beispielhaften Kombinationen, verwendet:
Donor Akceptor NBD Rhodamin, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY Dansyl Rhodamin, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY Fluorescein Rhodamin, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY Coumarin NBD, Fluorescein, Oregon Green Oregon Green Rhodamin, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY Pyren Coumarin IAEDANS NBD, Fluorescein, Oregon Green Rhodamin Green Rhodamin, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY The phospholipase substrate according to the invention can be produced with further pairs of fluorophores, which act as fluorescence resonance energy transfer donor and acceptor. The following donors and acceptors, shown in exemplary combinations, are preferably used:
donor Akceptor NBD Rhodamine, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY dansyl Rhodamine, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY fluorescein Rhodamine, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY coumarin NBD, Fluorescein, Oregon Green Oregon Green Rhodamine, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY pyrene coumarin IAEDANS NBD, Fluorescein, Oregon Green Rhodamine Green Rhodamine, Nilrot, Resorufin, Ethidium, Eosin, BODIPY

Die Verknüpfung der Fluorophore erfolgt über die Gruppe B, die für bestimmte Fluorophore bevorzugt eine -NH-, -NHC(O)-, -CONH-, -NHC(O)NH-, -NHC(S)NH-, - O- oder -S-Gruppe oder keine Gruppe ist. Bevorzugt sind Fluorophore, die eine geringe Polarität aufweisen, d. h. möglichst lipophil sind. Der lipophile Charakter der o. g. Fluorophore kann durch geeignete Substitutionen, wie z. B. mit Alkylgruppen oder Halogenatomen positiv beeinflusst werden. The fluorophores are linked via group B, which is intended for certain Fluorophores prefer a -NH-, -NHC (O) -, -CONH-, -NHC (O) NH-, -NHC (S) NH-, - O or S group or no group. Preferred are fluorophores, the one have low polarity, d. H. are as lipophilic as possible. The lipophilic character of o. g. Fluorophores can be replaced by suitable substitutions, such as. B. with alkyl groups or halogen atoms can be positively influenced.

Die für Proben der Formel I geladenen Kopfgruppen Z sind für Anwendungen im sekretorischen Bereich bevorzugt Phosphat, Sulfat, Phosphoethanolamin oder Phosphocholin, Phosphoserin, Phosphoinosit oder Phosphoglycerin. The head groups Z loaded for samples of the formula I are for applications in secretory area preferably phosphate, sulfate, phosphoethanolamine or Phosphocholine, phosphoserine, phosphoinosit or phosphoglycerin.

Die für Proben der Formel II ungeladenen Kopfgruppen sind für Anwendungen im intrazellulären Bereich bevorzugt und tragen am Phosphat und am Ethanolamin unabhängig voneinander die bioaktivierbaren Gruppen M und N, bevorzugt S- Acyloxythioethyl- oder Acyloxymethyl-Gruppen oder eine (nichtbioaktivierbare) Cholingruppe. The head groups that are not charged for samples of the formula II are for applications in preferred intracellular area and contribute to phosphate and ethanolamine independently of one another the bioactivatable groups M and N, preferably S- Acyloxythioethyl or acyloxymethyl groups or a (non-bioactivatable) Choline.

Alle erfindungsgemäss beschriebenen Verbindungen sind neu. Sie besitzen ein Asymmetriezentrum und sind daher optisch aktiv. Als Phospholipasesubstrat können sowohl Racemate als auch die optisch aktiven Enantiomeren verwendet werden. Bevorzugt sind die reinen Enantiomeren mit der r-Konfiguration. All of the compounds described according to the invention are new. You own one Asymmetry center and are therefore optically active. Can be used as a phospholipase substrate Both racemates and the optically active enantiomers can be used. The pure enantiomers with the r configuration are preferred.

Substanzen der Formel I werden erfindungsgemäß zur optischen Bestimmung von Phospholipaseaktivitäten eingesetzt, indem man die Substanz der Einwirkung der phospholipasehaltigen Probe unterwirft, und die Enyzmaktivität direkt aus dem Bruch der Emissionsintensitäten der beiden Fluorophore optisch bestimmt. According to the invention, substances of the formula I are used for the optical determination of Phospholipase activities used by exposure to the substance subject to phospholipase-containing sample, and the enzyme activity directly from the break the emission intensities of the two fluorophores optically determined.

Substanzen der Formel II werden erfindungsgemäß in Verfahren zur optischen Bestimmung der Phospholipasen in lebenden Zellen eingesetzt. Dazu führt man die membranpermeablen Substanzen der Formel II lebenden Zellen zu. Die Zellen nehmen das Substrat auf, befreien es von den bioaktivierbaren Gruppen mittels endogener Esterasen, und das so intrazellulär freigesetzte Phospholipasesubstrat wird dann zur optischen Bestimmung der intrazellulären Enyzmaktivität durch Messung der Emissionsintensitäten der beiden Fluorophore und der Bildung des Bruchs dieser Intensitäten eingesetzt. According to the invention, substances of the formula II are used in optical processes Determination of phospholipases used in living cells. To do this, lead the membrane permeable substances of formula II to living cells. The cells take up the substrate, free it from the bioactivatable groups endogenous esterases, and the phospholipase substrate thus released intracellularly is then used for the optical determination of the intracellular enzyme activity Measurement of the emission intensities of the two fluorophores and the formation of the Breaks of these intensities used.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Phospholipasesubstrate der Formel I kann nach folgenden Methoden erfolgen:
Ausgehend von dem kommerziell erhältlichen 2,3-Isopropyliden-sn-glycerin 1 (Schema 1) oder 2,3-Isopropyliden-1-mercapto-sn-glycerin wird zunächst die Hydroxylgruppe bzw. Thiolgruppe mit Dibromalkanen oder amino-geschützten ω- Amino-1-bromalkanen in Gegenwart von NaH bzw K₂CO₃ in DMF alkyliert. Nach Abspaltung des Ketals unter sauren Bedingungen und ggf der Abspaltung der Aminoschutzgruppe entsteht das Diol 2. The phospholipase substrates of the formula I according to the invention can be prepared by the following methods:
Starting from the commercially available 2,3-isopropylidene-sn-glycerol 1 (Scheme 1) or 2,3-isopropylidene-1-mercapto-sn-glycerol, the hydroxyl group or thiol group is firstly treated with dibromoalkanes or amino-protected ω-amino 1-Bromoalkanes in the presence of NaH or K ₂ CO ₃ alkylated in DMF. After cleavage of the ketal under acidic conditions and, if necessary, cleavage of the amino protecting group, diol 2 is formed.

Die Einführung des Fluorophors R¹ über die Verknüpfungsgruppe B erfolgt unter Standardbedingungen, z. B. über die Alkylierung einer phenolischen oder einer Thiolgruppe oder durch die Umsetzung der Aminogruppe mit einem Isothiocyanat oder aktivierten Ester. The introduction of the fluorophore R ¹ via the linking group B takes place under standard conditions, e.g. B. on the alkylation of a phenolic or a thiol group or by the reaction of the amino group with an isothiocyanate or activated ester.

Die primäre Hydroxylgruppe des Glycerins wird dann regioselektiv geschützt, beispielsweise durch raumerfassende Silylschutzgruppen oder durch Tritylschutzgruppen, modifiziert oder unmodifiziert. The primary hydroxyl group of the glycerol is then protected regioselectively, for example by space-covering silyl protective groups or by Trityl protecting groups, modified or unmodified.

Die verbleibende Hydroxylgruppe bzw. Thiogruppe an der sn-2-Position wird dann mit einem Reagenz der Struktur HOOC-A-B-R² verestert. Die Reaktion kann in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels wie Dicyclocarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid, bevorzugt jedoch durch die Aktivierung der Säure mittels Triisopropylphenylsulfonylnitrotriazol (TPSNT) in Gegenwart von drei Äquivalenten Methylimidazol in Dichlormethan durchgeführt werden. Alternativ zur Carbonsäure können auch aktivierte Ester der Carbonsäure wie Hydroxysuccinimidester oder Imidazolide verwendet werden, um vollständig geschützte Glycerinderivate wie 3 zu erhalten. The remaining hydroxyl group or thio group at the sn-2 position is then esterified with a reagent of the structure HOOC-ABR ² . The reaction can be carried out in the presence of a dehydrating agent such as dicyclocarbodiimide or diisopropylcarbodiimide, but preferably by activating the acid using triisopropylphenylsulfonylnitrotriazole (TPSNT) in the presence of three equivalents of methylimidazole in dichloromethane. As an alternative to carboxylic acid, activated esters of carboxylic acid such as hydroxysuccinimide esters or imidazolides can also be used to obtain fully protected glycerol derivatives such as 3.

Die Abspaltung der Schutzgruppe an der sn-3-Position von Verbindungen wie 3 kann im Sauren oder im Falle der Silylschutzgruppen unter Verwendung von Fluoridionenhaltigen Reagenzien wie KF, Tetrabutylammoniumfluorid oder HF-Addukten an organischen Basen erfolgen und liefert Glycerinderivate wie 4. The deprotection at the sn-3 position of compounds like 3 can in the acid or in the case of the silyl protecting groups using Reagents containing fluoride ions such as KF, tetrabutylammonium fluoride or HF adducts organic bases and provides glycerol derivatives such as 4.

Die sn-3-OH-Position von 4 ist dann zu phosphorylieren oder zu sulfatieren. Die Herstellung von Sulfaten ist in Beil 2, EII, 356 beschrieben. The sn-3-OH position of 4 is then to be phosphorylated or sulfated. The Preparation of sulfates is described in Beil 2, EII, 356.

Die Phosphorylierung zu vollstaendig geschützten Phospholipidderivaten wie 5 kann über einschlägige Phosphor(III)- bzw. Phosphor(V)-Phosphorylierungsreagentien erfolgen. Die Abspaltung der Schutzgruppen an der Kopfgruppe liefert die geladenen erfindungsgemaessen Phospholipidderivate der Formel I (6). Phosphorylation to fully protected phospholipid derivatives such as 5 can via relevant phosphorus (III) or phosphorus (V) phosphorylation reagents respectively. Splitting off the protective groups on the head group provides the loaded ones Phospholipid derivatives of the formula I (6) according to the invention.

Ein Gegenstand der Erfindung sind neue Phosphor(III)amidit-Reagentien der Formel III (7), die gleichzeitig spaltbare Schutzgruppen für die Phosphorsäurefunktion und die Ethylaminofunktion besitzen und zur Herstellung von Ethanolamin-haltigen Phospholipiden geeignet sind. Die Schutzgruppen sollen vorzugsweise im Sauren oder katalytisch spaltbar sein. Geeignete und bevorzugte Schutzgruppenfunktionen sind eine Kombination aus t-Butyloxygruppe am Phosphor und t- Butyloxycarbonylgruppe an der Aminogruppe [E = C(CH₃)₃]. Die entsprechenden Phosphor(III)-Reagenzien der Formel III (7) haben folgende Struktur: The invention relates to novel phosphorus (III) amidite reagents of the formula III (7) which at the same time have cleavable protective groups for the phosphoric acid function and the ethylamino function and are suitable for the production of ethanolamine-containing phospholipids. The protecting groups should preferably be acidic or catalytically cleavable. Suitable and preferred protective group functions are a combination of t-butyloxy group on the phosphorus and t-butyloxycarbonyl group on the amino group [E = C (CH ₃ ) ₃ ]. The corresponding phosphorus (III) reagents of the formula III (7) have the following structure:

Fig. 4

Phosphoramiditreagenzien vom Typ III und IV, zur Herstellung von Ethanolamin-haltigen bzw. Cholin-haltigen Phospholipiden eingesetzt werden können.

Phosphoramidite reagents of types III and IV can be used for the production of ethanolamine-containing or choline-containing phospholipids.

Die Reste D in Reagenyien der Formel III und IV können bevorzugt Alkyl- oder Alkenylgruppen, ggf. verzweigt oder unverzweigt, mit C₁ bis C₈ sein; besonders bevorzugt sind Isopropylgruppen. Eine weitere bevorzugte Kombination von Schutzgruppen besteht aus einer Allyloxygruppen am Phosphor und einer Allyloxycarbonylgruppe an der Aminogruppe (E = CH₂CH=CH₂). The radicals D in reagents of the formula III and IV can preferably be alkyl or alkenyl groups, optionally branched or unbranched, with C ₁ to C ₈ ; isopropyl groups are particularly preferred. Another preferred combination of protecting groups consists of an allyloxy group on the phosphorus and an allyloxycarbonyl group on the amino group (E = CH ₂ CH = CH ₂ ).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind ferner neue Phosphor(III)amidit- Reagentien der Formel IV (8), die spaltbare Schutzgruppen für die Phosphorsäurefunktion besitzen und zur Herstellung von Cholin-haltigen Phospholipiden geeignet sind. Die Schutzgruppe soll vorzugsweise im Sauren oder katalytisch spaltbar sein. Geeignete und bevorzugte Schutzgruppenfunktionen sind die t-Butyloxygruppe und die Allyloxygruppe. Als Gegenion ist Tosylat bevorzugt. Die Phosphitylierung der Verbindung 4 mit Reagentien wie C gelingt bevorzugt unter Verwendung von Tetrazol in Acetonitril oder DMF, gefolgt von der Oxidation des entstandenen Phosphits mit Peroxiden wie t-Butylperoxid, Peroxyessigsäure oder Wasserstoffperoxid. Another object of the invention are new phosphorus (III) amidite Reagents of formula IV (8), the cleavable protective groups for the Have phosphoric acid function and for the production of choline-containing Phospholipids are suitable. The protective group should preferably be in acid or be catalytically fissile. Suitable and preferred protecting group functions are the t-butyloxy group and the allyloxy group. Tosylate is preferred as the counter ion. The phosphitylation of compound 4 with reagents such as C is preferably accomplished under Use of tetrazole in acetonitrile or DMF followed by oxidation of the resulting phosphites with peroxides such as t-butyl peroxide, peroxyacetic acid or Hydrogen peroxide.

Die Abspaltung der Schutzgruppen zu den Produkten 6 ist literaturbekannt. So werden die tert-Butyloxygruppen mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgespalten, und die Allyloxygruppen am Palladium(0)-Katalysator. The removal of the protective groups to give products 6 is known from the literature. So the tert-butyloxy groups with trifluoroacetic acid in dichloromethane cleaved, and the allyloxy groups on the palladium (0) catalyst.

Die Herstellung der erfindungsgemässen Phospholipasesubstrate der Formel II kann nach folgenden Methoden erfolgen:
Freie Phosphorsäurefunktionen werden wie in der Literatur beschrieben mit Acyloxymethylhalogeniden in Anwesenheit von gehinderten organischen Basen, vorzugsweise Diisopropylethylamin (DIPEA), in die ungeladenen Phosphorsäuretriester überführt (Schultz et al. 1993; Srivastva & Farquhar, 1984). Alternativ werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vom Typ 5 mit Bis(S- acylthioethyloxy)-N,N-dialkylaminophosphin (9) (Valette et al. 1996) in Gegenwart von Tetrazol in aprotischen Lösungsmitteln wie DMF oder Acetonitril umgesetzt und anschließend mit Peroxiden wie t-Butylperoxid, Peroxyessigsäure oder Wasserstoffperoxid zu den korrespondierenden Phosphorsäuretriestern oxidiert. Im Falle der Ethanolaminderivate werden bevorzugt Reagentien der Formel V mit bioaktivierbaren Gruppen wie bei 10 und 11 eingesetzt, bei denen eine S- Acylthioethyloxygruppe am Phosphor und eine S-Acylthioethyloxycarbonylgruppe oder eine 4-Acetoxybenzylgruppe an der Aminogruppe zum Einsatz kommen. Im Falle der Cholinderivate werden bevorzugt Reagentien der Formel VI mit bioaktivierbaren Gruppen am Phosphor wie bei 12 eingesetzt. Bevorzugt sind S- Acylthioethyloxy- und Aczloxzmethylgruppen. Bioaktivierbare Gruppen für Phosphatidylethanolamine und Phosphatidylcholine wie hier beschrieben sind neu und daher find die neuen Reagentien 10 bis 12 Gegenstand der Erfindung (Abb. 5). Die Reste D können bevorzugt Alkyl- oder Alkenylgruppen, ggf. verzweigt oder unverzweigt, mit C₁ bis C₈ sein. The phospholipase substrates of the formula II according to the invention can be produced by the following methods:
As described in the literature, free phosphoric acid functions are converted into the uncharged phosphoric triesters using acyloxymethyl halides in the presence of hindered organic bases, preferably diisopropylethylamine (DIPEA) (Schultz et al. 1993; Srivastva & Farquhar, 1984). Alternatively, the type 5 compounds according to the invention are reacted with bis (S-acylthioethyloxy) -N, N-dialkylaminophosphine (9) (Valette et al. 1996) in the presence of tetrazole in aprotic solvents such as DMF or acetonitrile and then with peroxides such as t- Butyl peroxide, peroxyacetic acid or hydrogen peroxide oxidized to the corresponding phosphoric acid triesters. In the case of the ethanolamine derivatives, reagents of the formula V with bioactivatable groups such as 10 and 11 are preferably used, in which an S-acylthioethyloxy group on the phosphorus and an S-acylthioethyloxycarbonyl group or a 4-acetoxybenzyl group on the amino group are used. In the case of the choline derivatives, reagents of the formula VI with bioactivatable groups on the phosphorus, as in 12, are preferably used. S-Acylthioethyloxy and Aczloxzmethylgruppen are preferred. Bioactivatable groups for phosphatidylethanolamines and phosphatidylcholines as described here are new and therefore the new reagents 10 to 12 are the subject of the invention ( Fig. 5). The radicals D can preferably be alkyl or alkenyl groups, optionally branched or unbranched, with C ₁ to C ₈ .

Fig. 5

Phosphorylierungsreagentien der Formel V und VI, die bioaktivierbare Schutzgruppen tragen. Die Reste D sind bevorzugt Alkyl- oder Alkenylgruppen, verzweigt oder unverzweigt, mit C₁ bis C₈. Reagentien der Struktur 9 sind bekannt.

Phosphorylation reagents of the formulas V and VI which carry bioactivatable protective groups. The radicals D are preferably alkyl or alkenyl groups, branched or unbranched, with C ₁ to C ₈ . Structure 9 reagents are known.

Die oben beschriebene Herstellung der erfindungsgemässen Substrate ist nicht erschöpfend und dem Fachmann stehen eine Reihe weiterer an sich bekannter Methoden zur Verfügung, die es ihm ermöglichen, jede der erfindungsmässigen Verbindungen herzustellen. Die nach den, oben erläuterten Verfahren erhaltenen optisch aktiven Produkte lassen sich auch als Racemate ausgehend von racemischen Vorstufen darstellen. The above-described production of the substrates according to the invention is not a number of other known ones are exhaustive and the person skilled in the art Methods are available that allow him to do any of the inventive Make connections. Those obtained by the methods explained above optically active products can also be started as racemates from represent racemic precursors.

Die Bestimmung der Phospholipase A₂-Aktivität kann sowohl als Endpunktbestimmung als auch kinetisch durchgeführt werden. Gegenüber vielen bekannten Verfahren liegt in der kontinuierlichen kinetischen Durchführung und der Beobachtbarkeit des Reaktionsfortganges in Echtzeit der Vorteil dieser Erfindung. Es ist keine Behandlung der Analysenproben chemischer oder physikalischer Natur notwendig. Vielmehr können mit den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verbindungen erstmals solche enzymkatalysierten Reaktion konzentrationsunabhängig in Echtzeit in lebenden Zellen beobachtet werden. Dadurch können die erfindungsgemäßen Proben, ob in Zellen oder in zellfreien Präparationen in Analysenautomaten z. B. zum Hochdurchsatzscreening bei der Suche nach Inhibitoren oder in der klinischen Analytik eingesetzt werden. The determination of the phospholipase A ₂ activity can be carried out both as an end point determination and kinetically. Compared to many known methods, the advantage of this invention lies in the continuous kinetic implementation and the observability of the reaction progress in real time. There is no need to treat chemical or physical analysis samples. Rather, with the compounds according to the invention described here, such enzyme-catalyzed reaction can be observed for the first time in real time in living cells, regardless of the concentration. As a result, the samples according to the invention, whether in cells or in cell-free preparations in automatic analyzers, e.g. B. for high-throughput screening in the search for inhibitors or in clinical analysis.

Folgende Beispiele erläutern die Erfindung weiter. The following examples further illustrate the invention.

example 1 Synthesis of 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] - dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn glycero-3-phosphoethanolamine

Kurz: [1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11-NBD-aminoundecanoyl)-sn-glycero-3- phosphoethanolamin] In short: [1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11-NBD-aminoundecanoyl) -sn-glycero-3- phosphoethanolamine]

Abkürzungen: NR = Nilrot; NBD = 7-Nitro-benzo[1,2,5]oxadiazol)-ylamino, TBDMS = tert.- Butyldimethylsilyl, TFA = Trifluoressigsäure, DMF = Dimethylformamid Abbreviations: NR = Nilrot; NBD = 7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole) -ylamino, TBDMS = tert.- Butyldimethylsilyl, TFA = trifluoroacetic acid, DMF = dimethylformamide

a) Introduction of the sn1 chain - preparation of 1-O- (12-bromo-dodecyl) -sn-2,3-O- isopropylidene-glycerol

20 mmol sn-2,3-Isopropylidenglycerin (2,64 g) werden in 70 ml trockenem DMF aufgenommen. Es werden 2,5 Äquivalente 1,12-Dibromdodecan (16,4 g) zugegeben. Anschließend werden im Argonstrom Portionsweise 1,5 Äquivalente Natriumhydrid über 10 min zu der Lösung gegeben. Es wird über Nacht unter Argon gerührt (16 h). Die Reaktionsmischung wird im Anschluss in einen Scheidetrichter mit Eiswasser überführt und mit Cyclohexan extrahiert (3×). Die organischen Phasen werden vereinigt, über heiße Watte filtriert und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Es resultieren 16 g eines braunen Öls, welches ohne weitere Aufarbeitung weiter umgesetzt wird. 20 mmol sn-2,3-isopropylidene glycerol (2.64 g) are in 70 ml dry DMF added. 2.5 equivalents of 1,12-dibromo dodecane (16.4 g) are added. Then 1.5 equivalents of sodium hydride are added in portions in the argon stream added to the solution over 10 min. The mixture is stirred under argon overnight (16 h). The reaction mixture is then placed in a separatory funnel with ice water transferred and extracted with cyclohexane (3 ×). The organic phases are combined, filtered over hot cotton wool and freed from solvent in vacuo. The result is 16 g of a brown oil, which continues without further processing is implemented.

b) Elimination of the acetonide - preparation of 1-O- (12-bromo-dodecyl) -sn-glycerol

Das in a) erhaltene Rohprodukt wird in 60 ml Dichlormethan gelöst. Es werden 1,5 ml TFA (20 mmol) und 1,5 ml Wasser zugegeben und für 30 min gerührt. Die flüchtigen Bestandteile werden unter reduziertem Druck entfernt und diese Prozedur noch zweimal wiederholt, bis die Reaktionskontrolle (DC; Cyclohexan/Ethylacetat 3 : 2) das komplette Verschwinden des Eduktes anzeigt. The crude product obtained in a) is dissolved in 60 ml of dichloromethane. It becomes 1.5 ml TFA (20 mmol) and 1.5 ml of water were added and the mixture was stirred for 30 min. The fleeting Components are removed under reduced pressure and this procedure still Repeated twice until the reaction control (TLC; cyclohexane / ethyl acetate 3: 2) indicates complete disappearance of the educt.

Nach Entfernen aller flüchtigen Bestandteile im Vakuum wird die Mischung in Dichlormethan aufgenommen und über ca. 100 g Kieselgel filtriert. Es wird so lange mit reinem Dichormethan eluiert, bis alles 1,12-Dibromdodecan heruntergewaschen ist. Anschließend wird mit Dichlormethan/Methanol 95 : 5 das gewünschte Diol eluiert. Nach Entfernen der Lösungsmittel im Vakuum werden 4,9 g Diol (14,4 mmol, 72% d. Th. bezogen auf 2,3-Isopropylidenglycerin) als farbloses Öl erhalten. Das so erhaltene Produkt ist rein genug für die nächste Reaktion, kann aber noch durch Umkristallisation weiter gereinigt werden. Nach Kristallisation aus Methanol/Wasser und anschließend aus Diethylether wird ein weißes Pulver erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 1.15 (s, 7 CH₂ [Kette]), 1.30 (qi, J = 7.1 Hz, CH₂), 1.45 (qi, J = 6.7 Hz, CH₂), 1.72 (qi, J = 7.4 Hz, CH₂), 3.28 (t, J = 6.9 Hz, CH₂Br), 3.25-3.40 (m, sn-1-CH₂, OCH₂), 3.48 (dd, J = 11.5 Hz, 5.8 Hz, sn3-CH₂), 3.74 (m, sn2-CH). After removing all volatile constituents in vacuo, the mixture is taken up in dichloromethane and filtered through about 100 g of silica gel. It is eluted with pure dichormethane until all 1,12-dibromododecane has been washed off. The desired diol is then eluted with dichloromethane / methanol 95: 5. After removing the solvents in vacuo, 4.9 g of diol (14.4 mmol, 72% of theory based on 2,3-isopropylidene glycerol) are obtained as a colorless oil. The product obtained in this way is pure enough for the next reaction, but can still be purified further by recrystallization. After crystallization from methanol / water and then from diethyl ether, a white powder is obtained.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 1.15 (s, 7 CH ₂ [chain]), 1.30 (qi, J = 7.1 Hz, CH ₂ ), 1.45 (qi, J = 6.7 Hz, CH ₂ ), 1.72 (qi, J = 7.4 Hz, CH ₂ ), 3.28 (t, J = 6.9 Hz, CH ₂ Br), 3.25-3.40 (m, sn-1-CH ₂ , OCH ₂ ), 3.48 (dd, J = 11.5 Hz, 5.8 Hz, sn3-CH ₂ ), 3.74 (m, sn2-CH).

c) Introduction of the acceptor fluorophore - preparation of 1-O- [12- (9-diethylamino) - 5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-sn-glycerol (2)

Kurz: 1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-sn-glycerin. In short: 1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-sn-glycerin.

2,15 mmol 2-Hydroxynilrot (720 mg) werden in 15 ml trockenem DMF gelöst. Es werden 1,2 Äquivalente K₂CO₃ zugegeben und unter Argon für 15 min bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird ein Äquivalent (720 mg) des in b) erhaltenen Diols zugegeben und die Mischung für 3 Stunden bei 65°C gerührt. Die Reaktionsmischung wird in einen Scheidetrichter mit 60 ml Phosphatpuffer (pH 7) überführt und mit Dichlormethan erschöpfend extrahiert, bis die organische Phase farblos wird. Nach dem Entfernen der Lösungsmittel unter reduziertem Druck wird das erhaltene tiefrote Öl in Diethylether/Dichlormethan aufgenommen und umkristallisiert. Es wird 0,89 g (69,8% d. Th.) eines schwarzen Pulvers erhalten. Aus der Mutterlauge wird durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent: Dichlormethan/Methanol 97 : 3) weiterhin 70 mg Produkt 2 erhalten, mithin eine Gesamtausbeute von 960 mg (1,62 mmol, 75,3% d. Th.)
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 0.04 (s, 2 SiCH₃), 0.87 (s, 3 CH₃ TBDMS), 1.20-1.40 (m, 7 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 1.44-1.57 (m, 2 CH₂), 1.79-1.86 (m, CH₂), 3.37-3.48 (m, sn3- CH₂, OCH₂, 2 NCH₂), 3.61 (d, J = 5.4 Hz, sn1-CH₂), 3.77 (m, sn2-CH), 4.14 (t, J = 6.3 Hz. ArOCH₂), 6.27 (s, 6-NR), 6.43 (d, J = 2.8 Hz, 8-NR), 6.62 (dd, J = 9.0 Hz, 2.8 Hz, 10-NR), 7.13 (dd, J = 8.9 Hz, 2.6 Hz, 3-NR), 7.57 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 8.02 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR) 2.15 mmol of 2-hydroxynil red (720 mg) are dissolved in 15 ml of dry DMF. 1.2 equivalents of K ₂ CO _{3 are} added and the mixture is stirred under argon for 15 min at room temperature. Then an equivalent (720 mg) of the diol obtained in b) is added and the mixture is stirred at 65 ° C. for 3 hours. The reaction mixture is transferred to a separatory funnel with 60 ml of phosphate buffer (pH 7) and exhaustively extracted with dichloromethane until the organic phase becomes colorless. After removing the solvents under reduced pressure, the deep red oil obtained is taken up in diethyl ether / dichloromethane and recrystallized. 0.89 g (69.8% of theory) of a black powder is obtained. From the mother liquor, 70 mg of product 2 is still obtained by chromatography on silica gel (eluent: dichloromethane / methanol 97: 3), thus a total yield of 960 mg (1.62 mmol, 75.3% of theory).
¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 0.04 (s, 2 SiCH ₃ ), 0.87 (s, 3 CH ₃ TBDMS), 1.20-1.40 (m, 7 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 1.44 -1.57 (m, 2 CH ₂ ), 1.79-1.86 (m, CH ₂ ), 3.37-3.48 (m, sn3- CH ₂ , OCH ₂ , 2 NCH ₂ ), 3.61 (d, J = 5.4 Hz, sn1- CH ₂ ), 3.77 (m, sn2-CH), 4.14 (t, J = 6.3 Hz. ArOCH ₂ ), 6.27 (s, 6-NR), 6.43 (d, J = 2.8 Hz, 8-NR), 6.62 (dd, J = 9.0 Hz, 2.8 Hz, 10-NR), 7.13 (dd, J = 8.9 Hz, 2.6 Hz, 3-NR), 7.57 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 8.02 (d , J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.18 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR)

d) Silylation of the sn3 position - preparation of 3-O-t-butyldimethylsilyl-O- [12- (9- diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-sn-glycerol

Kurz: 3-O-t-Butyldimethylsilyl-1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-sn-glycerin. In short: 3-O-t-butyldimethylsilyl-1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-sn-glycerin.

792 mg des aus c) gewonnen Diols 2 (1,34 mmol) werden in 15 ml trockenem DMF gelöst. Es werden 1,3 Äquivalente TBDMS-Cl und 2,3 Äquivalente Imidazol zugegeben und für drei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Der Reaktionsansatz wird mit Diethylether verdünnt, in einen Scheidetrichter überführt und mit Wasser und ges. NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über heiße Watte filtriert und unter reduziertem Druck vom Lösungsmittel befreit. 792 mg of the diol 2 (1.34 mmol) obtained from c) are in 15 ml of dry DMF solved. There will be 1.3 equivalents of TBDMS-Cl and 2.3 equivalents of imidazole added and stirred for three hours at room temperature under argon. The reaction mixture is diluted with diethyl ether in a separatory funnel transferred and mixed with water and sat. NaCl solution shaken out. The organic Phase is filtered over hot cotton wool and under reduced pressure from the solvent freed.

Das so erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent Dichlormethan/Aceton 97 : 3 → 95 : 5) aufgereinigt. Es werden 630 mg eines roten Öls erhalten (0,89 mmol; 66,5% d. Th.).
NMR (CDCl₃, 400 MHz): 0,04 (s, 2 SiCH₃), 0,87 (s, 3 CH₃ TBDMS), 1,20-1,40 (m, 7 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 1,44-1,57 (m, 2 CH₂), 1,79-1,86 (m, CH₂), 3,37-3,48 (m, sn3- CH₂, OCH₂, 2 NCH₂), 3,61 (d, J = 5,40 Hz, sn1-CH₂), 3,77 (m, sn2-CH), 4,14 (t, J = 6,25 Hz, ArOCH₂), 6,27 (s, 6NR), 6,43 (d, J = 2,76 Hz, 8NR), 6,62 (dd, J = 9,03 Hz 2,76 Hz, 10NR), 7,13 (dd, J = 8,90 Hz 2,63 Hz, 3NR), 7,57 (d, J = 9,03 Hz, 11NR), 8,02 (d, J = 2,51 Hz, 1NR), 8,18 (d, J = 8,78 Hz, 4NR) The crude product thus obtained is purified by chromatography on silica gel (eluent dichloromethane / acetone 97: 3 → 95: 5). 630 mg of a red oil are obtained (0.89 mmol; 66.5% of theory).
NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 0.04 (s, 2 SiCH ₃ ), 0.87 (s, 3 CH ₃ TBDMS), 1.20-1.40 (m, 7 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 1.44-1.57 (m, 2 CH ₂ ), 1.79-1.86 (m, CH ₂ ), 3.37-3.48 (m, sn3-CH ₂ , OCH ₂ , 2 NCH ₂ ), 3.61 (d, J = 5.40 Hz, sn1-CH ₂ ), 3.77 (m, sn2-CH), 4.14 (t, J = 6.25 Hz, ArOCH ₂ ), 6.27 (s, 6NR), 6.43 (d, J = 2.76 Hz, 8NR), 6.62 (dd, J = 9.03 Hz 2.76 Hz, 10NR), 7, 13 (dd, J = 8.90 Hz 2.63 Hz, 3NR), 7.57 (d, J = 9.03 Hz, 11NR), 8.02 (d, J = 2.51 Hz, 1NR), 8.18 (d, J = 8.78 Hz, 4NR)

e) Acylation of the sn2 position - preparation of 3-O-t-butyldimethylsilyl-1-O- [12- (9- diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro- benzo [1,2,5] oxadiazole) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycerol (3)

Kurz: Darstellung von 3-O-t-Butyldimethylsilyl-1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11- NBD-aminoundecanoyl)-sn-glycerin Briefly: preparation of 3-O-t-butyldimethylsilyl-1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11- NBD aminoundecanoyl) sn-glycerol

1.06 mmol 11-NBD-Aminoundecansäure (386 mg) werden in 10 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Es werden 2 Äquivalente Methylimidazol (165 µl) zugegeben und dieses Gemisch mit Hilfe einer Spritze in einen Kolben mit einem Äquivalent 1- (2,4,6-Triisopropylbenzosulfonyl)-3-nitro-1,2,4-1H-triazol (TPSNT, 403 mg) gegeben. Diese Mischung wird sofort, wiederum mit einer Spritze, in einen Kolben mit 708 µmol des aus d) erhaltenen Alkohols in 10 ml trockenem Dichlormethan gegeben und für sieben Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. 1.06 mmol of 11-NBD-aminoundecanoic acid (386 mg) are dried in 10 ml Dichloromethane dissolved. 2 equivalents of methylimidazole (165 µl) are added and this mixture using a syringe into a flask with an equivalent of 1- (2,4,6-Triisopropylbenzosulfonyl) -3-nitro-1,2,4-1H-triazole (TPSNT, 403 mg). This mixture is immediately, again with a syringe, into a flask with 708 µmol of the alcohol obtained from d) in 10 ml of dry dichloromethane and stirred for seven hours at room temperature under argon.

Der Ansatz wird mit Dichlormethan verdünnt und mit Wasser, Phosphatpuffer, ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über heiße Watte filtriert und alle flüchtigen Bestandteile unter reduziertem Druck entfernt. The mixture is diluted with dichloromethane and saturated with water, phosphate buffer. Washed NaCl solution. The organic phase is filtered over hot cotton wool and all volatiles removed under reduced pressure.

Das so erhaltene Rohprodukt wird durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent 100% Dichlormethan → Dichlormethan/Methanol 99,5 : 0,5) weiter aufgereinigt. Es werden 634 mg 3 in Form eines roten Öls erhalten (0,60 mmol, 86,2% d. Th.).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 0.00 (s, 2 SiCH₃), 0.83 (s, 3 CH₃ TBDMS), 1.18-1.42 (m, 14 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 1.46-1.62 (m, 2 CH₂), 1.68-1.86 (m, 2 CH₂), 2.27 (t, J = 7.7 Hz, O₂CCH₂), 3.30-3.52 (m, sn3-CH₂, OCH₂, 3 NCH₂), 3.67 (m, sn1-CH₂), 4.12 (t, J = 6.4 Hz, ArOCH₂), 4.97 (qi, J = 5.0 Hz, sn2-CH), 6.09 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H), 6.26 (s, 6-NR), 6.41 (m, 8-NR, ArNH), 6.62 (dd, J = 8.8 Hz, 1.8 Hz, 10-NR), 7.11 (dd, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz, 3-NR), 7.54 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 7.98 (d, J = 2.3 Hz, 1-NR), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR), 8.41 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H) The crude product thus obtained is further purified by chromatography on silica gel (eluent 100% dichloromethane → dichloromethane / methanol 99.5: 0.5). 634 mg 3 are obtained in the form of a red oil (0.60 mmol, 86.2% of theory).
¹ H NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 0.00 (s, 2 SiCH ₃ ), 0.83 (s, 3 CH ₃ TBDMS), 1.18-1.42 (m, 14 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 1.46 -1.62 (m, 2 CH ₂ ), 1.68-1.86 (m, 2 CH ₂ ), 2.27 (t, J = 7.7 Hz, O ₂ CCH ₂ ), 3.30-3.52 (m, sn3-CH ₂ , OCH ₂ , 3 NCH ₂ ), 3.67 (m, sn1-CH ₂ ), 4.12 (t, J = 6.4 Hz, ArOCH ₂ ), 4.97 (qi, J = 5.0 Hz, sn2-CH), 6.09 (d, J = 8.5 Hz , NBD-H), 6.26 (s, 6-NR), 6.41 (m, 8-NR, ArNH), 6.62 (dd, J = 8.8 Hz, 1.8 Hz, 10-NR), 7.11 (dd, J = 8.7 Hz, 2.4 Hz, 3-NR), 7.54 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 7.98 (d, J = 2.3 Hz, 1-NR), 8.16 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR ), 8.41 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H)

f) Elimination of the silyl protective group - preparation of 1-O- [12- (9-diethylamino) -5- oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) - ylamino] -undecanoyl-sn-glycerin (4)

Kurz: Darstellung von 1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11-NBD-aminoundecanoyl)-sn- glycerin Briefly: preparation of 1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11-NBD-aminoundecanoyl) -sn- glycerol

110 mg des vollständig geschützten Glycerin-Derivates (105 µmol) werden in einer Mischung aus 1 ml Dichlormethan und 5 ml Ethanol gelöst. Es werden 100 µl einer 10%igen HCl-Lösung zugegeben und für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 110 mg of the fully protected glycerol derivative (105 µmol) are in one Mixture of 1 ml dichloromethane and 5 ml ethanol dissolved. 100 µl of one 10% HCl solution added and stirred for 3 hours at room temperature.

Der Ansatz wird mit Dichlormethan verdünnt und anschließend mit Phosphatpuffer und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über heiße Watte filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das so erhaltene rot Öl wird durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent Dichlormethan/Methanol 99,5 : 0,54 → 99,2 : 0,8) weiter aufgereinigt. Es werden 76 mg (81 µmol; 77,5% d. Th) 4 in Form eines roten Öls erhalten.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 1.12-1.82 (m, 18 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 2.27 (t, J = 7.7 Hz, O₂CCH₂), 2.54 (t, J = 6.1 Hz, OH), 3.30-3.48 (m, OCH₂, 3 NCH₂), 3.55 (m, sn1-CH₂), 3.74 (m, sn3-CH₂), 4.06 (t, J = 6.4 Hz, ArOCH₂), 4.94 (qi, J = 4.6 Hz, sn2-CH), 6.03 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H), 6.17 (s, 6-NR), 6.31 (d, J = 2.8 Hz, 8-NR), 6.53 (dd, J = 9.2 Hz, 2.6 Hz, 10-NR), 6.63 (s, Ar-NH), 7.05 (dd, J = 8.8 Hz, 2.5 Hz, 3-NR), 7.45 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 7.90 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.10 (d, J = 8.5 Hz, 4-NR), 8.35 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H) The mixture is diluted with dichloromethane and then with phosphate buffer and sat. Washed NaCl solution. The organic phase is filtered through hot cotton wool and the solvent is removed in vacuo. The red oil thus obtained is further purified by chromatography on silica gel (eluent dichloromethane / methanol 99.5: 0.54 → 99.2: 0.8). 76 mg (81 μmol; 77.5% of theory) 4 are obtained in the form of a red oil.
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 1.12-1.82 (m, 18 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 2.27 (t, J = 7.7 Hz, O ₂ CCH ₂ ), 2.54 (t, J = 6.1 Hz, OH), 3.30-3.48 (m, OCH ₂ , 3 NCH ₂ ), 3.55 (m, sn1-CH ₂ ), 3.74 (m, sn3-CH ₂ ), 4.06 (t, J = 6.4 Hz, ArOCH ₂ ), 4.94 (qi, J = 4.6 Hz, sn2-CH), 6.03 (d, J = 8.5 Hz, NBD-H), 6.17 (s, 6-NR), 6.31 (d, J = 2.8 Hz, 8-NR), 6.53 (dd, J = 9.2 Hz, 2.6 Hz, 10-NR), 6.63 (s, Ar-NH), 7.05 (dd, J = 8.8 Hz, 2.5 Hz, 3-NR), 7.45 ( d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 7.90 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.10 (d, J = 8.5 Hz, 4-NR), 8.35 (d, J = 8.5 Hz, NBD -H)

g) Phosphorylation to the ethanolamine derivative - preparation of 1-O- [12- (9- Diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro- benzo [1,2,5] oxadiazole) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (6)

Kurz: Darstellung von 1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11-NBD-aminoundecanoyl)-sn- glycero-3-phosphoethanolamin Briefly: preparation of 1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11-NBD-aminoundecanoyl) -sn- glycero-3-phosphoethanolamine

40 mg des freien Lipides (37,5 µmol) und eine Mikrospatelspitze Tetrazol werden mit trockenem Acetonitril versetzt und im Hochvakuum zur Trockene gebracht. Anschliessend wird der Ansatz in 3 ml trockenem DMF aufgenommen und mit 3 Äquivalenten (41 mg, 113 µmol) 2-Amino-(N-t-butoxycarbonyl)ethoxy-t-butoxy-N,N- diisopropyl-aminophosphin (vgl. 7) versetzt. Es wird für 13 Stunden unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird der Ansatz mit 0,2 ml tert- Butylhydroperoxid-Lösung versetzt und weitere zwei Stunden gerührt. Alle flüchtigen Bestandteile werden im Hochvakuum entfernt. Das so erhaltene rote Öl wird in 5% Trifluoressigsäure/Dichlormethan (95 : 5 v/v) aufgenommen und für 90 min gerührt. Nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter reduziertem Druck wird das so erhaltene Produktgemisch durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent Dichlormethan/Methanol/Wasser; Gradient 90 : 10 : 0 → 80 : 20 : 2) aufgereinigt. Das Produkt 6 wird als rotes Öl erhalten. Ausbeute: 16,7 mg (15,75 µmol, 42% d. Th.).
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 1.13-1.83 (m, 18 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 2.26 (t, J = 7.1 Hz, O₂CCH₂), 3.15 (s [b], ⁺NH₃), 3.30-3.48 (m, OCH₂, 4 NCH₂), 3.51 (m, sn1-CH₂), 3.91 (m [b], sn3-CH₂), 4.06 (m, ArOCH₂, CH₂OP [Ethanolamin]), 4.94 (s [b], sn2-CH), 6.01 (d, J = 7.8 Hz, NBD-H), 6.16 (s, 6-NR), 6.30 (d, J = 2.7 Hz, 8-NR), 6.53 (dd, J = 9.2 Hz, 2.7 Hz, 10-NR), 7.05 (dd, J = 8.8 Hz, 2.5 Hz, 3-NR), 7.42 (d, J = 9.0 Hz, 11-NR), 7.88 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.10 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR), 8.32 (d, J = 8.6 Hz, NBD-H) 40 mg of the free lipid (37.5 µmol) and a micro spatula tip of tetrazole are mixed with dry acetonitrile and brought to dryness in a high vacuum. The mixture is then taken up in 3 ml of dry DMF and 3 equivalents (41 mg, 113 μmol) of 2-amino- (Nt-butoxycarbonyl) ethoxy-t-butoxy-N, N-diisopropyl-aminophosphine (see FIG. 7) are added. It is stirred for 13 hours under argon at room temperature. The mixture is then mixed with 0.2 ml of tert-butyl hydroperoxide solution and stirred for a further two hours. All volatile components are removed in a high vacuum. The red oil thus obtained is taken up in 5% trifluoroacetic acid / dichloromethane (95: 5 v / v) and stirred for 90 min. After removal of the volatile constituents under reduced pressure, the product mixture thus obtained is purified by chromatography on silica gel (eluent dichloromethane / methanol / water; gradient 90: 10: 0 → 80: 20: 2). Product 6 is obtained as a red oil. Yield: 16.7 mg (15.75 µmol, 42% of theory).
¹ H-NMR (CDCl ₃ , 400 MHz): 1.13-1.83 (m, 18 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 2.26 (t, J = 7.1 Hz, O ₂ CCH ₂ ), 3.15 (s [b ], ⁺ NH ₃ ), 3.30-3.48 (m, OCH ₂ , 4 NCH ₂ ), 3.51 (m, sn1-CH ₂ ), 3.91 (m [b], sn3-CH ₂ ), 4.06 (m, ArOCH ₂ , CH ₂ OP [ethanolamine]), 4.94 (s [b], sn2-CH), 6.01 (d, J = 7.8 Hz, NBD-H), 6.16 (s, 6-NR), 6.30 (d, J = 2.7 Hz, 8-NR), 6.53 (dd, J = 9.2 Hz, 2.7 Hz, 10-NR), 7.05 (dd, J = 8.8 Hz, 2.5 Hz, 3-NR), 7.42 (d, J = 9.0 Hz , 11-NR), 7.88 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.10 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR), 8.32 (d, J = 8.6 Hz, NBD-H)

Example 2 Synthesis of 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] - dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn glycero-3-phosphocholine

Kurz: 1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11-NBD-aminoundecanoyl)-sn-glycero-3- phosphocholin In short: 1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11-NBD-aminoundecanoyl) -sn-glycero-3- phosphocholine

a) Phosphorylation to the choline derivative - preparation of 1-O- [12- (9-diethylamino) - 5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro- benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

Kurz: Darstellung von 1-O-(12-O-Nilrot)dodecyl-2-O-(11-NBD-aminoundecanoyl)-sn- glycero-3-phosphocholin Briefly: preparation of 1-O- (12-O-Nilrot) dodecyl-2-O- (11-NBD-aminoundecanoyl) -sn- glycero-3-phosphocholine

30 mg des freien Alkohols (28 µmol) und eine Mikrospatelspitze Tetrazol werden mit trockenem Acetonitril versetzt und im Hochvakuum zur Trockene gebracht. Anschliessend wird der Ansatz in 3 ml trockenem DMF aufgenommen und mit 3 Äquivalenten t-Butoxy-N,N-diisopropylamino-2-trimethylaminoethoxy-phosphin (vgl. 8, 84 µmol, 67 mg, 60%iges Edukt) versetzt. Es wird für 13 Stunden unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Anschliessend wird der Ansatz mit tert.-Butylhydroperoxid versetzt und weitere zwei Stunden gerührt. Alle flüchtigen Bestandteile werden im Hochvakuum entfernt. Das so erhaltene rote Öl wird in 5% Trifluoressigsäure/Dichlormethan (95 : 5 v/v) aufgenommen und für 90 min gerührt. Nach Entfernen der flüchtigen Bestandteile unter reduziertem Druck wird das so erhaltene Produktgemisch durch Chromatographie über Kieselgel (Eluent Dichlormethan/Methanol/Wasser; Gradient 90 : 10 : 1 → 65 : 35 : 3) aufgereinigt. Das Produkt wurde als rotes Öl erhalten. Ausbeute: 11 mg (10 µmol, 33% d. Th.).
¹H-NMR (CDCl₃, CD₃OD 1 : 1 (v/v); 400 MHz): 1.13-1.83 (m, 18 CH₂ [Kette], 2 CH₃), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, O₂CCH₂), 3.16 (s, 3 NCH₃), 3.30-3.48 (m, sn1-CH₂, OCH₂, 4 NCH₂), 3.88-4.00 (m, sn3-CH₂), 4.06 (m, ArOCH₂, CH₂OP [Cholin]), 4.22 (s [b], POCH₂), 5.06 (qi, J = 4.7 Hz, sn2-CH), 6.07 (d, J = 9.0 Hz, NBD-H), 6.26 (s, 6-NR), 6.44 (d, J = 2.5 Hz, 8-NR), 6.67 (dd, J = 9.2 Hz, 2.9 Hz, 10-NR), 7.11 (dd, J = 9.2 Hz, 2.2 Hz, 3-NR), 7.57 (d, J = 9.2 Hz, 11-NR), 7.99 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR), 8.38 (d, J = 8.8 Hz, NBD-H) 30 mg of the free alcohol (28 µmol) and a micropatula tip of tetrazole are mixed with dry acetonitrile and brought to dryness in a high vacuum. The mixture is then taken up in 3 ml of dry DMF and mixed with 3 equivalents of t-butoxy-N, N-diisopropylamino-2-trimethylaminoethoxy-phosphine (cf. 8, 84 μmol, 67 mg, 60% educt). It is stirred for 13 hours under argon at room temperature. The mixture is then mixed with tert-butyl hydroperoxide and stirred for a further two hours. All volatile components are removed in a high vacuum. The red oil thus obtained is taken up in 5% trifluoroacetic acid / dichloromethane (95: 5 v / v) and stirred for 90 min. After removal of the volatile constituents under reduced pressure, the product mixture thus obtained is purified by chromatography on silica gel (eluent dichloromethane / methanol / water; gradient 90: 10: 1 → 65: 35: 3). The product was obtained as a red oil. Yield: 11 mg (10 µmol, 33% of theory).
¹ H-NMR (CDCl ₃ , CD ₃ OD 1: 1 (v / v); 400 MHz): 1.13-1.83 (m, 18 CH ₂ [chain], 2 CH ₃ ), 2.24 (t, J = 7.2 Hz , O ₂ CCH ₂ ), 3.16 (s, 3 NCH ₃ ), 3.30-3.48 (m, sn1-CH ₂ , OCH ₂ , 4 NCH ₂ ), 3.88-4.00 (m, sn3-CH ₂ ), 4.06 (m , ArOCH ₂ , CH ₂ OP [choline]), 4.22 (s [b], POCH ₂ ), 5.06 (qi, J = 4.7 Hz, sn2-CH), 6.07 (d, J = 9.0 Hz, NBD-H) , 6.26 (s, 6-NR), 6.44 (d, J = 2.5 Hz, 8-NR), 6.67 (dd, J = 9.2 Hz, 2.9 Hz, 10-NR), 7.11 (dd, J = 9.2 Hz, 2.2 Hz, 3-NR), 7.57 (d, J = 9.2 Hz, 11-NR), 7.99 (d, J = 2.5 Hz, 1-NR), 8.11 (d, J = 8.8 Hz, 4-NR), 8.38 (d, J = 8.8 Hz, NBD-H)

Preparation of the phosphitylating agent 7-2-amino- (N-t-butoxycarbonyl) ethoxy-t- butoxy-N, N-diisopropyl-aminophosphine

6 mmol N,N-Bis(diisopropyl)amino-tert.-butoxyphosphin (1,83 g) werden in 30 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Es wird ein halbes Äquivalent Diisopropylamoniumtetrazolid (428 mg) zugegeben. Der Kolben wird mit einem Septum verschlossen und 5 mmol NH-Boc-geschütztes Ethanolamin (0,81 g, 774 µl) in 15 ml trockenem Dichlormethan werden über eine Spritze langsam zugetropft. Der Ansatz wird unter Argon für zwei Stunden bei 0°C und anschliessend für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird mit 50 ml Dichlormethan verdünnt, in einen Scheidetrichter mit ges. NaHCO₃ Lösung überführt und ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über heisse Watte filtriert und unter reduziertem Druck wird das Lösungsmittel abdestilliert. Das so erhaltene farblose Öl wird durch Chromatographie über eine kurze Kieselgelsäule (Eluent Cyclohexan/EtOAc/Triethylamin; 80 : 20 : 1) gereinigt. Es werden 1,13 g (3,1 mmol, 62 % d. Th.) eines farblosen Öls erhalten.
¹H-NMR (C₆D₆, 400 MHz): 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 2 CH₃ [i-Pr]), 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 2 CH₃ [i-Pr]), 1.28 (s, 3 CH₃ [t-Bu]), 1.40 (s, 3 CH₃ [t-Bu]), 3.25 (m, CH₂N), 3.39-3.49 (m, CH₂OP), 3.52 (sep, J = 6.7 Hz, N(CH)₂), 3.55 (sep, J = 6.8 Hz, NCH).
³¹P{¹H}-NMR (C₆D₆, 160 MHz): 139.31 ppm (s) 6 mmol of N, N-bis (diisopropyl) amino-tert-butoxyphosphine (1.83 g) are dissolved in 30 ml of dry dichloromethane. Half an equivalent of diisopropylamonium tetrazolide (428 mg) is added. The flask is closed with a septum and 5 mmol NH-Boc-protected ethanolamine (0.81 g, 774 μl) in 15 ml dry dichloromethane are slowly added dropwise via a syringe. The mixture is stirred under argon for two hours at 0 ° C. and then for 12 hours at room temperature. Then it is diluted with 50 ml dichloromethane, in a separatory funnel with sat. NaHCO ₃ solution transferred and shaken. The organic phase is filtered over hot cotton wool and the solvent is distilled off under reduced pressure. The colorless oil thus obtained is purified by chromatography on a short silica gel column (eluent cyclohexane / EtOAc / triethylamine; 80: 20: 1). 1.13 g (3.1 mmol, 62% of theory) of a colorless oil are obtained.
¹ H-NMR (C ₆ D ₆ , 400 MHz): 1.09 (d, J = 6.8 Hz, 2 CH ₃ [i-Pr]), 1.12 (d, J = 6.9 Hz, 2 CH ₃ [i-Pr] ), 1.28 (s, 3 CH ₃ [t-Bu]), 1.40 (s, 3 CH ₃ [t-Bu]), 3.25 (m, CH ₂ N), 3.39-3.49 (m, CH ₂ OP), 3.52 (sep, J = 6.7 Hz, N (CH) ₂ ), 3.55 (sep, J = 6.8 Hz, NCH).
³¹ P { ¹ H} -NMR (C ₆ D ₆ , 160 MHz): 139.31 ppm (s)

Preparation of the phosphitylating agent 8 - tert-butoxy-N, N-diisopropylamino-2- trimethylaminoethoxy phosphine tosylate

6 mmol N,N-Bis(diisopropyl)amino-tert.-butoxyphosphin (1,83 g) werden in 30 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Es wird ein halbes Äquivalent Diisopropylamoniumtetrazolid (428 mg) zugegeben. Der Kolben wird mit einem Septum verschlossen und 1,38 g (5 mmol) Cholintosylat, gelöst in 10 ml trockenem Acetonitril, werden über eine Spritze langsam zugetropft. Der Ansatz wird unter Argon für zwei Stunden bei 0 °C und anschliessend für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile werden im Hochvakuum entfernt. Der Rückstand wird mit n-Hexan extrahiert, um überschüssiges Phosphordiamidit zu entfernen und dann ggf. umkristallisiert. 6 mmol of N, N-bis (diisopropyl) amino-tert-butoxyphosphine (1.83 g) are dissolved in 30 ml dry dichloromethane dissolved. It's going to be half an equivalent Diisopropylamonium tetrazolide (428 mg) added. The flask is closed with a septum and 1.38 g (5 mmol) choline tosylate, dissolved in 10 ml dry acetonitrile, are over slowly dropped a syringe. The batch is made under argon for two hours at 0 ° C and then stirred for 12 hours at room temperature. The fleeting Components are removed in a high vacuum. The residue is mixed with n-hexane extracted to remove excess phosphorodiamidite and then optionally recrystallized.

Es werden 1,91 g eines farblosen, gummiartigen Feststoffs erhalten, der zu 60% produkthaltig ist (nach ³¹P-NMR), entsprechend einer Ausbeute von 2,4 mmol (40% d. Th.).
¹H-NMR (CD₃CN, 400 MHz): 1.17 (d, J = 6.8 Hz, 2 CH₃ [i-Pr]), 1.20 (d, J = 6.9 Hz, 2 CH₃ [1-Pr]), 1.37 (s, 3 CH₃ [t-Bu]), 2.35 (s, CH₃ Tosylat), 3.16 (s, 3 N⁺CH₃), 3.32 (m, N(CH)₂), 3.50 (m, N⁺CH₂), 3.89 (m, OCH₂), 7.18 (d, J = 7.8 Hz, CH Tosylat), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, CH Tosylat)
³¹P{¹H}-NMR (CD₃CN, 160 MHz): 139.84 ppm (s) 1.91 g of a colorless, rubber-like solid are obtained, which contains 60% of the product (according to ³¹ P-NMR), corresponding to a yield of 2.4 mmol (40% of theory).
¹ H-NMR (CD ₃ CN, 400 MHz): 1.17 (d, J = 6.8 Hz, 2 CH ₃ [i-Pr]), 1.20 (d, J = 6.9 Hz, 2 CH ₃ [1-Pr]) , 1.37 (s, 3 CH ₃ [t-Bu]), 2.35 (s, CH ₃ tosylate), 3.16 (s, 3 N ⁺ CH ₃ ), 3.32 (m, N (CH) ₂ ), 3.50 (m, N ⁺ CH ₂ ), 3.89 (m, OCH ₂ ), 7.18 (d, J = 7.8 Hz, CH tosylate), 7.63 (d, J = 8.4 Hz, CH tosylate)
³¹ P { ¹ H} -NMR (CD ₃ CN, 160 MHz): 139.84 ppm (s)

Scheme 1

Beispielsynthese zu einem Phospholipasesubstrat des Typ I: Reagentien and Bedingungen (Raumtemperatur, falls nicht anders angegeben): (a) (i) NaH, DMF, 1,12-Dibromododecan, 1d, (ii) TFA, MeOH, 72% von 1; (b), 2-Hydroxynilrot, DMF, K₂CO₃, 65°C, 3 h, 81%; (c) TBDMS-CI, Imidazol, DMF, 12 h, 66%; (d) 11-NBD- Aminoundecansäure, 1.5 Äq. TPSNT, 3 Äq. Methylimidazol, CH₂Cl₂, 7 h, 86%; (e) 10% aq. HCl, CH₂Cl₂/EtOH 1 : 1 (v/v), 3 h, 78%; (f) (i) 7, Tetrazol, DMF, 12 h; (ii) t- BuOOH, 0.5 h; (g) 5% TFA, CH₂Cl₂, 0.5 h, 55% von 4. Die Synthese des 2-O- verknüpften Derivates ist gezeigt.

Example synthesis to a Type I phospholipase substrate: reagents and conditions (room temperature unless otherwise noted): (a) (i) NaH, DMF, 1,12-dibromododecane, 1d, (ii) TFA, MeOH, 72% of 1; (b), 2-hydroxynil red, DMF, K ₂ CO ₃ , 65 ° C, 3 h, 81%; (c) TBDMS-CI, imidazole, DMF, 12 h, 66%; (d) 11-NBD-aminoundecanoic acid, 1.5 eq. TPSNT, 3 eq. Methylimidazole, CH ₂ Cl ₂ , 7 h, 86%; (e) 10% aq. HCl, CH ₂ Cl ₂ / EtOH 1: 1 (v / v), 3 h, 78%; (f) (i) 7, tetrazole, DMF, 12 h; (ii) t-BuOOH, 0.5 h; (g) 5% TFA, CH ₂ Cl ₂ , 0.5 h, 55% of 4. The synthesis of the 2-O-linked derivative is shown.

Claims

1. Phospholipase substrate of the general formula

wherein
each A is independently an alkylene or alkenylene group, branched or unbranched, having 1 to 20 C atoms,
each B is independently an -NH-, -NHC (O) -, -CONH-, -NHC (O) NH-, - NHC (S) NH-, -O- or -S- group or no group,
R ¹ and R ^{2 are} each a different fluorophore, the chromophoric properties of one fluorophore being that of a donor and that of the other fluorophore being that of an acceptor of a pair of dyes which permit fluorescence resonance energy transfer,
X is a -CH ₂ -, -O- or -S group, each Y is independently an -O- or - S group, Z is a phosphate, sulfate or thiophosphate group, where R ³ = H or - (CH ₂ ) _n NR ⁴ ₃ , in which n is a number from 2 to 4 and R ^{4 is} H, CH ₃ or C ₂ H ₅ or R ^{3 is} inositol, modified or unmodified or serine, modified or unmodified or glycerol, modified or unmodified.

2. Phospholipase substrate according to claim 1, characterized in that A 10 to Has 12 carbon atoms.

3. phospholipase substrate according to claim 1 or 2, characterized in that B is an NH group, an -NHC (S) NH group or an oxygen.

4. phospholipase substrate according to claim 1, 2 or 3, characterized in that X is oxygen or sulfur.

5. Phospholipase substrate according to claim 1, 2, 3 or 4, characterized in that R ¹ and R ² independently of one another an optionally substituted NBD, a Nilrot, Dansyl, Fluorescein, Coumarin, Oregongruen, IAEDANS, Rhodaminruen -, Rhodamine, Resurofin, Ethidium, Eosin or Bodipyrest is.

6. phospholipase substrate according to claim 1, 2, 3, 4 or 5, characterized in that Y is oxygen or sulfur.

7. phospholipase substrate according to claim 1, 2, 3, 4, 5 or 6, characterized characterized in that Z is a substituted or unsubstituted phosphate or Sulphate is, optionally as sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, Ammonium or as mono-, di- or trialkylammonium salt present.

8. phospholipase substrate according to claim 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7, characterized characterized in that Z is phosphoethanolamine or phosphocholine.

9. 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine

10. 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

11. 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-3-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine

12. 1-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-3-yloxy] dodecyl-2-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] -undecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

13. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] -undecanoyl-1- O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine

14. 2-O- [12- (9-Diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] -undecanoyl-1- O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphocholine

15. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-3-yloxy] -undecanoyl-1- O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine

16. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-3-yloxy] -undecanoyl-1- O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphocholine.

17. Membrane permeable phospholipase substrate of the general formula

wherein
each A ¹ and A ² independently of one another are an alkylene or alkenylene group, branched or unbranched, having 1 to 20 C atoms,
each B independently of one another has an -NH-, -NHC (O) -, -CONH-, -NHC (O) NH-, - NHC (S) NH-, -O- or -S- group or no group,
R ¹ and R ^{2 are} each a different fluorophore, the chromophoric properties of the one fluorophore being that of a donor, the fluorophore being that of an acceptor of a pair of dyes, which allow fluorescence resonance energy transfer,

X is a -CH ₂ -, -O- or -S group, each Y is independently an -O- or -S group, Z is a phosphate or thiophosphate group provided with the groups M and N, where V is a Alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched.

18. Phospholipase substrate according to claim 17, characterized in that A ¹ and A ² independently of one another have 10 to 12 C atoms.

19. Phospholipase substrate according to claim 17 or 18, characterized in that A ^{1 has} 10 to 12 C atoms and that A ^{2 has} 3 to 5 C atoms.

20. phospholipase substrate according to claim 17, 18 or 19, characterized in that that B is an NH group, an -NHC (S) NH group or an oxygen.

21. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19 or 20, characterized characterized in that X is an oxygen or a sulfur.

22. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19, 20 or 21, characterized in that R ¹ and R ² independently of one another an optionally substituted NBD-, a Nilrot-, Dansyl-, Fluorescein-, Coumarin, Oregongruen-, IAEDANS- , Rhodaminruen, Rhodamine, Resurofin, Ethidium, Eosin or Bodipyrest is.

23. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19, 20, 21 or 22, thereby characterized in that Y is independently oxygen or sulfur.

24. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23, characterized in that M and N bioactivatable groups of the following type

are, wherein V represents an alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched.

25. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23, characterized in that M is a bioactivatable group of the following type

where V is an alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched, and N is a bioactivatable protected ethanolamine of the following type

represents, wherein V is an alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched.

26. Phospholipase substrate according to claim 17, 18, 19, 20, 21, 22 or 23, characterized in that M is a bioactivatable group of the following type

where V is an alkyl group C ₁ to C ₄ , branched or unbranched, and N is a trimethylammoniumethyl group.

27. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazole) -ylamino] -dodecyl-sn-glycero-3-phosphate bis (S- acetylthioethyl) ester.

28. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphate bis (acetoxymethyl) ester.

29. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphate (2- [S- acetylthioethyloxycarbonyl] aminoethyl) ester (S-acetylthioethyl) ester.

30. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphate (2- [S- acetylthioethyloxycarbonyl] aminoethyl) ester (acetoxymethyl) ester.

31. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (S- acetylthioethyl) ester.

32. 2-O- [12- (9-diethylamino) -5-oxo-5H-benzo [a] phenoxazin-2-yloxy] pentanoyl-1-O- [1- (7-nitro-benzo [1,2,5] oxadiazol) -ylamino] dodecyl-sn-glycero-3-phosphocholine (Acetoxymethyl) ester.

33. A reagent of the general formula III for the introduction of a phosphite group in the production of phosphoethanolamine-containing lipids

wherein each D is independently an alkyl or alkenyl group, branched or unbranched, having 1 to 8 C atoms and E is independently an alkyl or alkenyl group, branched or unbranched, having 1 to 8 C atoms.

34. A reagent according to claim 33, characterized in that D is independent from each other is an alkyl group, branched or unbranched, having 1 to 4 carbon atoms.

35. A reagent according to claim 33 or 34, characterized in that E is a is tert-butyl group.

36. A reagent according to claim 33 or 34, characterized in that E is a Allyl group, substituted or unsubstituted.

37. 2-Amino (N-t-butoxycarbonyl) ethoxy-t-butoxy-N, N-diisopropyl aminophosphine.

38. 2-Amino (N-allyloxycarbonyl) ethoxy-allyloxy-N, N-diisopropyl aminophosphine.

39. A reagent of general formula IV for the introduction of a phosphite group in the production of phosphocholine-containing lipids

wherein each D and E is independently an alkyl or alkenyl group, branched or unbranched, having 1 to 8 carbon atoms and the anion is a halide, pseudohalide, acetate, haloacetate or tosylation.

40. A reagent according to claim 39, characterized in that D is independent from each other is an alkyl group, branched or unbranched, having 1 to 4 carbon atoms.

41. A reagent according to claim 39 or 40, characterized in that E is a is tert-butyl group.

42. A reagent according to claim 39 or 40, characterized in that E is a Allyl group, substituted or unsubstituted.

43. tert-Butoxy-N, N-diisopropylamino (trimethylammonium) ethoxy-phosphine tosylate.

44. Allyloxy-N, N-diisopropylamino (trimethylammonium) ethoxyphosphine tosylate.

45. A reagent of the general formula V for introducing a phosphite group in the production of membrane-permeable phosphoethanolamine-containing lipid derivatives

wherein each D is independently an alkyl or alkenyl group, branched or unbranched, having 1 to 8 carbon atoms.

46. A reagent according to claim 45, characterized in that D is independent from each other is an alkyl group, branched or unbranched, having 1 to 4 carbon atoms.

47th S-Acetylthioethoxy-2-amino- (S-acetylthioethoxycarbonyl) ethoxy-N, N-diisopropylaminophosphine.

48. A reagent of the general formula VI for introducing a phosphite group in the production of membrane-permeable derivatives of phosphocholine-containing lipid derivatives

wherein each D is independently an alkyl or alkenyl group, branched or unbranched, having 1 to 8 carbon atoms and the anion is a halide, pseudohalide, acetate, haloacetate or tosylation.

49. A reagent according to claim 45, characterized in that D is independent from each other is an alkyl group, branched or unbranched, having 1 to 4 carbon atoms.

50. S-acetylthioethoxy-N, N-diisopropylamino (trimethylammonium) ethoxyphosphine Tosylate.

51. Method for the optical determination of the phospholipases, thereby characterized in that a substrate according to claim 1 is exposed to the subject to phospholipase-containing sample, and the enzyme activity directly from the break the emission intensities of the two fluorophores optically determined.

52. The method according to claim 51, characterized in that the Determination of enzyme activity at a calcium concentration in the test from 0.5 to 10 mM.

53. The method according to claim 51 and 52, characterized in that the Substance as a reagent that contains detergents, calcium ions and buffer substances contains, is present impregnated on a carrier material.

54. The method according to claim 51, 52 or 53, characterized in that the substances are used in high-throughput screening to find activators or inhibitors of phospholipase A ₂ .

55. method for the optical determination of phospholipases in living cells, characterized in that a substrate according to claim 17 in its Membrane permeable form supplies living cells, the cells the substrate absorb, free of the bioactivatable groups, and so intracellularly Released phospholipase substrate for the optical determination of the intracellular Enzyme activity by measuring the emission intensities of the two fluorophores and the breaking of these intensities is used.

56. The method according to claim 55, characterized in that the substances in flow cytometry.

57. The method according to claim 55 or 56, characterized in that the substances are used in high-throughput screening on living cells to find activators or inhibitors of phospholipase A ₂ and calcium channels in the plasma membrane.