DE10148236A1 - Tumor peptide antigens from human PRDI-BF1 protein - Google Patents

Tumor peptide antigens from human PRDI-BF1 protein

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Abstract

Die Erfindung betrifft tumorassoziierte Oligopeptide, die von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt werden, und die eine ZTL-induzierte Lyde und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Zellen des Multiplen Myeloms, herbeiführen. Die Oligopeptide weisen Aminosäuresequenzen auf, die Teilsequenzen des humanen PRDI-BF1-Proteins entsprechen. Jedes Oligopeptid stellt ein Epitop für CD8-positive ZTL dar und ist dazu geeignet, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Multiple-Myelom-Zellen und anderen Tumorzellen zu induzieren.The invention relates to tumor-associated oligopeptides which are recognized by CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes (ZTL) as peptide antigens and which cause ZTL-induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular cells of multiple myeloma. The oligopeptides have amino acid sequences which correspond to partial sequences of the human PRDI-BF1 protein. Each oligopeptide represents an epitope for CD8-positive ZTL and is suitable for a (restricted) immune response of CD8-positive ZTL against multiple- to human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allelic variant A2 To induce myeloma cells and other tumor cells.

Description

Die Erfindung betrifft ein tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird, und das eine ZTL- induzierte Lyse und/oder Apoptose von tumorzellen, insbesondere Zellen des Multiplen Myeloms herbeiführt. The invention relates to a tumor-associated oligopeptide that CD8-positive cytotoxic T lymphocytes (ZTL) is recognized as a peptide antigen, and that a ZTL- induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular cells of the multiple Causes myeloma.

CD8-positive ZTL stellen Effektorzellen des zellulären Immunsystems dar. Ihre Funktion besteht in der spezifischen Eliminierung von infizierten oder entarteten körpereigenen Zeilen. Die ZTL erkennen unter anderem tumorspezifische oder tumorassoziierte Peptidantigene (TAA), die an Haupthistokompatibilitätskomplex (MHG)-Moleküle der Klasse I gebunden und auf der Oberfläche der entarteten Zellen präsentiert sind. Die Erkennung der Peptidantigene im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen erfolgt durch 1 spezifische membranständige T-Zellrezeptoren (TZR) der ZTL. Nach Erkennung wird die betreffende Zelle abgetötet, indem die ZTL die Zielzellen lysieren und/oder den programmierten Zelltod (Apoptose) dieser Zielzellen induzieren oder Zytokine freisetzen. CD8-positive ZTL represent effector cells of the cellular immune system. Their function consists in the specific elimination of infected or degenerate body's own Lines. The ZTL recognize, among other things, tumor-specific or tumor-associated Peptide antigens (TAA) attached to major histocompatibility complex (MHG) molecules of the Class I bound and presented on the surface of the degenerate cells. The The peptide antigens in the context of MHC class I molecules are recognized by 1 specific membrane-bound T cell receptors (TZR) of the ZTL. After detection the cell in question is killed by the ZTL lysing the target cells and / or the programmed cell death (apoptosis) of these target cells or induce cytokines release.

Die Erkennung von Zielzellen durch ZTL wird durch die Expression des CD8- Korezeptors auf ZTL erleichtert. Der CD8-Korezeptor bindet an konservierte Regionen der α2- und α3-Domänen des MHC Klasse I-Moleküls und trägt damit zur Stabilisierung des TZR-Peptid-MHC-Komplexes bei. The detection of target cells by ZTL is supported by the expression of the CD8 Koreceptors relieved on ZTL. The CD8 coreceptor binds to conserved regions of the α2 and α3 domains of the MHC class I molecule and thus contributes to stabilization of the TZR-peptide-MHC complex.

Die Identifizierung humaner, tumorassoziierter Peptidantigene sowie die Generierung tumorreaktiver T-Lymphozyten mit Spezifität für diese Antigene sind essentielle Voraussetzungen für die Etablierung immunologischer Strategien in der Therapie bösartiger, humaner Tumoren, insbesondere auch des Multiplen Myeloms. Bislang angewandte Behandlungsmethoden an Patienten mit Multiplem Myelom (Plasmozytom) sind wenig erfolgreich. Es existieren jedoch zunehmend klinische und experimentelle Studien, die darauf hinweisen, daß das Multiple Myelom durch eine ZTL-basierte Immuntherapie beeinflußbar ist. Da für eine Immuntherapie des Multiplen Myeloms derzeit nur wenige universelle Multiple-Myelom-assoziierte Peptidantigene beschrieben sind, besteht weiterhin der Bedarf nach der Identifizierung von Peptidantigenen, die sich aus einem Protein ableiten, das in Multiple-Myelom-Zellen (= malignen Plasmazellen) im Vergleich zu Normalzellen überexprimiert wird. The identification of human, tumor-associated peptide antigens and the generation Tumor-reactive T lymphocytes with specificity for these antigens are essential Requirements for the establishment of immunological strategies in therapy malignant, human tumors, especially of multiple myeloma. So far Treatment methods used on patients with multiple myeloma (plasmacytoma) are not very successful. However, there are increasing clinical and experimental ones Studies suggesting that multiple myeloma is caused by a ZTL-based Immunotherapy can be influenced. As for multiple myeloma immunotherapy only a few universal multiple myeloma-associated peptide antigens are currently described there is still a need to identify peptide antigens that are derived from a protein that in multiple myeloma cells (= malignant plasma cells) in Compared to normal cells is overexpressed.

Das PRDI-BF1 Protein ist in die terminale Differenzierung von B-Zellen involviert, so daß Plasmazellen und deren Neoplasien, nämlich Zellen des Multiplen Myeloms, eine Überexpression von PRDI-BF 1 zeigen. Für das murine Homolog von PRDI-BF1 (Blimp-1) wurden verschiedene Normalgewebe auf RNA-Expression untersucht. Dabei wurde eine schwache Expression in Knochenmark, Milz und Lymphozyten nachgewiesen, ebenso in Gehirn, Lunge, Herz, Nieren, Haut und Testis. Die Ergebnisse jüngster Untersuchungen weisen darauf hin, daß PRDI-BF 1 auch in die Differenzierung von myeloiden Zellen involviert ist. The PRDI-BF1 protein is involved in the terminal differentiation of B cells that plasma cells and their neoplasms, namely cells of multiple myeloma, a Show overexpression of PRDI-BF 1. For the murine homolog of PRDI-BF1 (Blimp-1) different normal tissues were examined for RNA expression. there was poor expression in bone marrow, spleen and lymphocytes proven, also in the brain, lungs, heart, kidneys, skin and testis. The results Recent research suggests that PRDI-BF 1 also differentiates of myeloid cells is involved.

Die aus der zellulären Prozessierung des PRDI-BF1 Proteins resultierenden Oligopeptide können im Kontext von MHC Klasse I Molekülen der Allelvariante A2, Subtyp A2.1 (kurz: A2.1; das häufigste MHC-Klasse I-Allel in der kaukasischen Bevölkerung), auf der Zelloberfläche präsentiert werden und repräsentieren attraktive Zielstrukturen für CD8-positive ZTL. Sie können folglich unter bestimmten Voraussetzungen als Impfstoff zur Induktion von T-Zellen im allgemeinen und von Tumor-reaktiven T-Zellen im besonderen eingesetzt werden mit dem Ziel, daß diese T-Zellen die Remission und Eradikation von Multiple-Myelom-Zellen herbeiführen. Im Fall von Melanomen sind bereits einige Peptidantigene bekannt, die auf diese Weise zur Immuntherapie innerhalb klinischer Prüfungen verwendet werden. The oligopeptides resulting from the cellular processing of the PRDI-BF1 protein can in the context of MHC class I molecules of the allele variant A2, subtype A2.1 (short: A2.1; the most common MHC class I allele in the Caucasian population) are presented on the cell surface and represent attractive target structures for CD8 positive ZTL. You can therefore use it as a vaccine under certain conditions for the induction of T cells in general and of tumor-reactive T cells in be used with the aim that these T cells and the remission Cause eradication of multiple myeloma cells. In the case of melanoma Already known some peptide antigens that are used for immunotherapy within clinical trials can be used.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, tumorassoziierte, insbesondere Multiple-Myelom-assoziierte Peptidantigene bereitzustellen, die von CD8-positiven ZTL erkannt werden und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Multiple-Myelom-Zellen herbeiführen. The object of the present invention is tumor-associated, in particular Provide multiple myeloma-associated peptide antigens derived from CD8-positive ZTL are recognized and a ZTL-induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular induce multiple myeloma cells.

Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Oligopeptids, das (a1) eine der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, die den in dem betreffenden Sequenzprotokoll angegebenen Aminosäurepositionen des humanen PRDI-BF1-Proteins entspricht, oder das (a2) eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, -Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren von einer dieser Aminosäuresequenzen ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, und das (b) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt und (c) dazu geeignet ist, eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Multiple- Myelom-Zellen und andere Tumorzellen zu induzieren. One solution to this problem is to provide an oligopeptide that (a1) one of the amino acid sequences shown in the sequence listing 1 to 30 has that specified in the relevant sequence listing Corresponds to amino acid positions of the human PRDI-BF1 protein, or the (a2) one by amino acid substitution, deletion, insertion, addition, inversion and / or by chemical or physical modification of one or more amino acids of one of these amino acid sequences has a derivable amino acid sequence, and (b) represents an epitope for CD8-positive ZTL and (c) is suitable for converting one to human Leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant A2 (short: A2) restricted (restricted) immune response of CD8-positive ZTL against multiple To induce myeloma cells and other tumor cells.

Eine äquivalente Lösung besteht in der Bereitstellung eines zu diesem erfindungsgemäßen Oligopeptid analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids, das anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen Nichtpeptidbindungen wie z. B. -NH-CO-Bindungen aufweist (vgl. Meziere et al. 1997). An equivalent solution is to provide one for this oligopeptide analog retro-inverse peptide or pseudopeptide according to the invention, the instead of the -CO-NH peptide bonds non-peptide bonds such. B. -NH-CO bonds (see Meziere et al. 1997).

Mit den Oligopeptiden gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 werden erstmals Peptidantigene bereitgestellt, deren Aminosäuresequenz aus dem humanen PRDI-BF1- Protein stammen. Die PRDI-BF1-Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 und ihre Derivate stellen quantitativ tumorassoziierte, insbesondere an Multiple-Myelom- Zellen assoziierte ZTL-Epitope dar und liefern damit die molekulare Grundlage für eine PRDI-BF1-spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen, insbesondere des Multiplen Myeloms. With the oligopeptides according to sequence protocols 1 to 30 are the first Peptide antigens are provided, the amino acid sequence of which is derived from the human PRDI-BF1 Protein. The PRDI-BF1 oligopeptides according to sequence protocols 1 to 30 and their derivatives represent quantitatively tumor-associated, especially multiple-myeloma Cells associated ZTL epitopes and thus provide the molecular basis for one PRDI-BF1-specific immunotherapy for malignant diseases, especially the Multiple myeloma.

Die erfindungsgemäßen Oligopeptide (d. h. die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate) können insbesondere in der aktiven und passiven Immunisierung von Patienten mit Multiplem Myelom, bei denen die diesen Oligopeptiden entsprechenden Epitope im Kontext von A2.1 präsentiert werden, eingesetzt werden, um die Induktion, Generierung und Expandierung von zytotoxischen T-Lymphozyten herbeizuführen, die für die betreffenden PRDI-BF1- Aminosäuresequenzen spezifisch sind, und die in der Lage sind, die Multiple-Myelom- Zellen der betreffenden Patienten spezifisch abzutöten und dadurch eine Heilung zu vermitteln. The oligopeptides according to the invention (i.e. those in the sequence protocols 1 to 30 represented oligopeptides and their derivatives) can in particular in the active and passive immunization of multiple myeloma patients in whom this Epitopes corresponding to oligopeptides are presented in the context of A2.1, used to induce, generate and expand cytotoxic To induce T lymphocytes that are relevant for the PRDI-BF1- Amino acid sequences are specific, and are capable of multiple myeloma Specifically kill cells of the patient concerned and thereby cause healing convey.

Im Zuge der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß PRDI-BF1 in ruhenden B- Zellen, T-Zellen und in mononukleären Zellen des peripheren Blutes nur gering exprimiert ist und deshalb für eine Abtötung durch PRDI-BF1-spezifische Zellen nicht suszeptibel, d. h. kein geeigneter Angriffspunkt ist. Für die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate ergibt sich daraus der Vorteil eines breiten Indikationsgebiets bei vernachlässigbar geringem Risiko eines unerwünschten Angriffs auf Normalzellen. In the course of the present invention it was found that PRDI-BF1 in resting B- Cells, T cells and in mononuclear cells of the peripheral blood only slightly is expressed and therefore not for killing by PRDI-BF1-specific cells susceptible, d. H. is not a suitable target. For those in the sequence listing 1 up to 30 oligopeptides and their derivatives shown, this gives the advantage of broad indication area with negligible risk of an unwanted Attack on normal cells.

Die Derivate der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und/oder auch die davon abgeleitetenretro-inversen Peptide oder Pseudopeptide haben gegenüber dem jeweils ursprünglichen Oligopeptid selbst den Vorteil, daß damit eine potentielle funktionelle Selbsttoleranz (gegenüber den entsprechenden ursprünglichen Oligopeptiden) auf T-Zellebene umgangen werden kann. Während die PRDI-BF1- Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 aufgrund der (geringen) Expression in einigen Normalgeweben u. U. in dem betreffenden Organismus (Patientenkörper) ein sogenanntes Tolerogen darstellen und für die organismuseigenen (patienteneigenen) ZTL nicht immunogen sind, werden die Derivate dieser Oligopeptide im Regelfall als Antigene erkannt und induzieren die Aktivierung und Expandierung von ZTL. Diese Derivatinduzierten ZTL weisen in der Regel eine hohe Kreuzreaktivität gegenüber der/den betreffenden PRDI-BF1-Oligopeptid-Wildtypsequenz(en) auf und induzieren infolgedessen auch die Lyse und/oder Apoptose von solchen (Tumor-)Zellen, die PRDI- BF1-Oligopeptide gemäß der Sequenzprotokolle 1 bis 30 (im Kontext von A2, insbesondere von A2.1) auf ihrer Oberfläche präsentieren. The derivatives of the oligopeptides and / or shown in the sequence listing 1 to 30 the derived retro-inverse peptides or pseudopeptides also have the original oligopeptide itself the advantage that a potential functional self-tolerance (towards the corresponding original Oligopeptides) can be bypassed at the T cell level. While the PRDI-BF1- Oligopeptides according to sequence listing 1 to 30 due to the (low) expression in some normal tissues u. U. in the organism in question (patient's body) represent so-called tolerogen and for the organism's own (patient's own) ZTL are not immunogenic, the derivatives of these oligopeptides are usually used as antigens recognized and induce the activation and expansion of ZTL. This Derivative-induced ZTL usually have a high cross-reactivity towards the / the relevant PRDI-BF1 oligopeptide wild type sequence (s) and induce consequently also the lysis and / or apoptosis of such (tumor) cells that PRDI- BF1 oligopeptides according to sequence listing 1 to 30 (in the context of A2, present in particular of A2.1) on their surface.

Besonders bevorzugte Derivate der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide sind solche, die natürlicherweise in anderen Säuge- oder Wirbeltieren vorkommen, z. B. entsprechende Homologe aus der Maus. Diese PRDI-BF1- Oligopeptid-Homologe und die dafür kodierenden Nukleinsäuren können relativ leicht, nämlich direkt und mit geläufigen Isolationsverfahren, aus dem jeweiligen Organismus gewonnen werden. Particularly preferred derivatives of those shown in sequence listing 1 to 30 Oligopeptides are those that are naturally found in other mammals or vertebrates occur, e.g. B. corresponding homologues from the mouse. This PRDI-BF1- Oligopeptide homologs and the nucleic acids encoding them can be relatively easily, namely directly and with common isolation procedures, from the respective organism be won.

Die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und deren Derivate sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide können mittels gängiger Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, und die für diese Oligopeptide kodierenden Nukleotidsequenzen können mit bekannten chemischen oder mit molekularbiologischen Verfahren gewonnen werden. The PRDI-BF1 oligopeptides shown in the sequence protocols 1 to 30 and their Derivatives as well as the retro-inverse peptides or pseudopeptides can be used by means of common Peptide synthesis methods are prepared, and the coding for these oligopeptides Nucleotide sequences can be with known chemical or with molecular biological Procedures can be obtained.

Es besteht zudem die Möglichkeit, aus den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Oligopeptiden, einem flexiblem Linker und einer schweren Kette des HLA-Moleküls ein Fusionsprotein zu konstruieren, und zwar derart, daß das Oligopeptid dazu befähigt (in der Lage bzw. geeignet) ist, die Peptid-Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen. Diese Fusionsproteine und dafür kodierende Polynukleotide eignen sich insbesondere als (Wirkstoff von einem) Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30, insbesondere 1-4 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide erkennen. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Fusionsprotein, welches aus einem der vorstehend beschriebenen Oligopeptide, aus einer schweren Kette des HLA-Moleküls und aus einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet (in der Lage bzw. befähigt)ist, die Peptid-Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen, und welches zur Verwendung bzw. für den Einsatz als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von T-Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30, insbesondere 1-4 dargestellten PRDI-BF1-Oligopetide erkennen, geeignet ist. Die für dieses Fusionsprotein kodierende Polynukleotide sind ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung. There is also the possibility of the invention described above Oligopeptides, a flexible linker and a heavy chain of the HLA molecule To construct fusion protein in such a way that the oligopeptide enables (in capable or suitable) to occupy the peptide binding groove of the HLA molecule. These fusion proteins and polynucleotides encoding them are particularly suitable as (Active ingredient of a) diagnostic or therapeutic or prophylactic or generally for the detection and / or manipulation of T cells that are one of those in the Sequence listings 1 to 30, in particular 1-4 PRDI-BF1 oligopeptides shown detect. The invention therefore also relates to a fusion protein which consists of one of the Oligopeptides described above, from a heavy chain of the HLA molecule and consists of a flexible linker and is constructed such that the oligopeptide suitable (capable), the peptide binding groove of the HLA molecule to occupy, and which for use or for use as a diagnostic or Therapeutic or prophylactic or generally for detection and / or Manipulation of T cells that one of the in the sequence protocols 1 to 30, recognize in particular 1-4 PRDI-BF1 oligopetides shown is suitable. The for polynucleotides encoding this fusion protein are also the subject of the present invention Invention.

Die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide und deren Derivate sowie die retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide und die Fusionsproteine eignen sich sowohl zur in-vivo-Induktion von T-Lymphozyten im Patienten als auch zur in-vitro- Induktion und -Expansion entsprechend reaktiver patienteneigener oder patientenfremder T-Lymphozyten. The oligopeptides and their derivatives shown in sequence listing 1 to 30 as well as the retro-inverse peptides or pseudopeptides and the fusion proteins are suitable for in vivo induction of T lymphocytes in patients as well as for in vitro Induction and expansion according to reactive patient's own or non-patient's T-lymphocytes.

Für eine in-vivo-Induktion und -Expansion von T-Lymphozyten im Patienten kommen verschiedene Verfahren in Betracht, beispielsweise (a) die Injektion eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder eines oder mehrerer Derivate dieser Oligopeptide und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids und/oder eines Fusionsproteins als reines Peptid oder zusammen mit Adjuvantieri oder mit Cytokinen oder in einem geeigneten Freisetzungssystem wie z. B. Liposomen, (b) die Injektion einer Nukleinsäure, die für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide oder deren Derivate und/oder für eines der retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide und/oder für eines der Fusionsproteine kodiert - in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren oder zusammen mit Freisetzungssystemen wie kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren, (c) die Beladung von Zellen autologen; allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit einer oder mehreren der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide oder deren Derivaten oder dazu analogen retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden, (d) die Beladung von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit wenigstens einem der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1- Oligopeptiden oder dazu Homologen oder retro-inversen Peptiden oder Pseudopeptiden anderer Spezies, so daß infolgedessen das/die betreffende(n) PRDI-BFl-Oligopeptid(e) und/oder dessen/deren Derivat(e) und/oder oder das/die retro-inverse(n) Peptid(e) oder Pseudopeptid(e) auf den jeweiligen Zellen präsentiert wird/werden, oder (e) die Transfektion oder Infektion von Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs mit den mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide oder dessen Derivate oder davon abgeleitetes retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid oder Fusionsprotein kodierenden Nukleinsäuren (wiederum entweder in "nackter" oder komplexierter Form oder in Form von viralen oder nichtviralen Vektoren). Come for an in vivo induction and expansion of T lymphocytes in the patient various methods are considered, for example (a) the injection of one of the in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides and / or one or several derivatives of these oligopeptides and / or a retro-inverse peptide or Pseudopeptide and / or a fusion protein as a pure peptide or together with Adjuvantieri or with cytokines or in a suitable release system such. B. Liposomes, (b) the injection of a nucleic acid necessary for one of those in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides shown or their derivatives and / or for one of the retro-inverse peptides or pseudopeptides and / or for one of the Fusion proteins encoded - in "naked" or complexed form or in the form of viral or non-viral vectors or together with release systems such as cationic Lipids or cationic polymers, (c) autologous cell loading; allogeneic, xenogenic or microbiological origin with one or more of those in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides shown or their derivatives or retro-inverse peptides or pseudopeptides analogous thereto, (d) the loading of Cells with autologous, allogeneic, xenogeneic or microbiological origin at least one of the PRDI-BF1- shown in the sequence listing 1 to 30 Oligopeptides or homologues or retro-inverse peptides or pseudopeptides other species, so that as a result the relevant PRDI-BFl oligopeptide (s) and / or its derivative (s) and / or or the retro-inverse peptide (s) or Pseudopeptide (s) is / are presented on the respective cells, or (e) the Transfection or infection of autologous, allogeneic, xenogeneic or cells microbiological origin with at least one of the in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides shown or their derivatives or retro-inverse peptide or pseudopeptide or fusion protein derived therefrom coding nucleic acids (again either in "naked" or complex form or in the form of viral or non-viral vectors).

Im Fall einer in-vitro-Induktion und -Expansion werden die in-vitro gewonnenen T- Lymphozyten anschließend dem Patienten per Infusion oder Injektion o. ä. Verfahren zugeführt. In the case of in vitro induction and expansion, the in vitro obtained T- Lymphocytes are then given to the patient by infusion or injection or the like fed.

Die Erfindung betrüifft deshalb auch die Verwendung der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder deren Derivate und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide und/oder Fusionsproteine und/oder eines Polynukleotids, das mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide kodiert, zur Herstellung von Diagnostika - insbesondere MHC-Tetramere oder MHC-Dimere oder andere Strukturen, an die wenigstens ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid oder retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung assoziiert ist - und/oder Prophylaktika und/oder Therapeutika (insbesondere Impfstoffe) für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8- positiven ZTL. The invention therefore also relates to the use of the in the sequence listing 1 to 30 shown PRDI-BF1 oligopeptides and / or their derivatives and / or to it analog retro-inverse peptides or pseudopeptides and / or fusion proteins and / or of a polynucleotide which is used for at least one of the sequence protocols 1 to 30 PRDI-BF1-oligopeptides encoded, for the production of diagnostics - in particular MHC tetramers or MHC dimers or other structures to which at least one such oligopeptide or retro-inverse peptide according to the invention or Pseudopeptide is associated by covalent or non-covalent binding - and / or Prophylactic and / or therapeutic agents (especially vaccines) for detection and / or influencing and / or generation and / or expansion and / or Control of the activation and functional status of T cells, in particular CD8 positive ZTL.

Als Therapeutika und/oder Prophylaktika kommen insbesondere Impfstoffe oder Injektionen oder Infusionslösungen in Betracht, die als Wirkstoff (a) eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder wenigstens ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder wenigstens ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu deren Derivate analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder wenigstens eines der vorstehend beschriebenen Fusionsproteine enthalten, und/oder die (b) eine Nukleinsäure enthalten, die mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide oder mindestens für ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodiert, und/oder die (c) in-vitro erzeugte T- Lymphozyten, welche spezifisch gegen eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder deren Derivat(e) und/oder gegen ein zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analoges retroinverses Peptid oder Pseudopeptid gerichtet sind, enthalten. Vaccines or in particular come as therapeutic agents and / or prophylactic agents Injections or infusion solutions that are considered as active ingredient (a) one of the in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides shown and / or at least a derivative of one of these oligopeptides and / or at least one of these Oligopeptides or their inverse analogue retro-inverse peptide or pseudopeptide and / or contain at least one of the fusion proteins described above, and / or which (b) contain a nucleic acid which is at least for one of the in the Sequence listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides shown or at least for encodes a derivative of one of these oligopeptides, and / or the (c) T- generated in vitro Lymphocytes that are specific against one of the sequence protocols 1 to 30 shown PRDI-BF1 oligopeptides and / or their derivative (s) and / or against one one of these oligopeptides or a derivative of these oligopeptides analog retroinverse peptide or pseudopeptide are included.

Zur Herstellung der Diagnostika oder auch der Therapeutika oder auch der Prophylaktika eignen sich insbesondere auch rekombinante DNS- oder RNS-Vektormoleküle, die ein oder mehrere Polynukleotid(e) enthalten, welche für mindestens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BFI- Oligopeptide und/oder für mindestens ein Derivat eines dieser Oligopeptide kodieren, und die in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs transkribierbar bzw. exprimierbar sind. Die Erfindung umfaßt deshalb auch solche rekombinanten DNS- oder RNS-Vektormoleküle und Wirtszellen, die diese Vektormoleküle enthalten. For the production of diagnostics or therapeutic agents or Prophylactic drugs are also particularly suitable for recombinant DNA or RNA vector molecules containing one or more polynucleotide (s) which are suitable for at least one of the PRDI-BFI- shown in sequence listing 1 to 30 Code oligopeptides and / or for at least one derivative of one of these oligopeptides, and those of cells of autologous, allogeneic, xenogeneic or microbiological origin are transcribable or expressible. The invention therefore also includes such recombinant DNA or RNA vector molecules and host cells carrying them Contain vector molecules.

Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von Zellen, die eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide überexprimieren, können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante Antikörper eingesetzt werden, die gegen wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellte PRDI-BF1- Oligopeptide und/oder gegen wenigstens ein Derivat dieses Oligopeptids und/oder gegen wenigstens ein zu diesem Oligopeptid oder dessen Derivat analoges retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid oder Fusionsprotein gerichtet sind, oder die mit einem Komplex aus einem der betreffenden Oligopeptide bzw. dessen Derivate bzw. dazu retro-inversen Peptid(en) und/oder Pseudopeptid(en) und HLA-A2 reagieren. As a diagnostic or therapeutic or prophylactic or in general for one Detection and / or manipulation of cells that one of the in the sequence listing 1 to overexpress the PRDI-BF1 oligopeptides shown can be according to the invention polyclonal, monoclonal or recombinant antibodies can also be used against at least one of the PRDI-BF1- shown in the sequence listing 1 to 30 Oligopeptides and / or against at least one derivative of this oligopeptide and / or against at least one retro-inverse peptide analogous to this oligopeptide or its derivative or pseudopeptide or fusion protein, or which are complexed one of the oligopeptides in question or its derivatives or retro-inverse to it Peptide (s) and / or pseudopeptide (s) and HLA-A2 react.

Die Verwendung eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1- Oligopeptide und/oder eines Derivates dieser Oligopeptide und/oder eines zu einem dieser Oligopeptide oder zu einem Derivat dieser Oligopeptide analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids oder Fusionsproteins für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und der/die betreffende(n) Antikörper an sich sind folglich ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. The use of one of the PRDI-BF1- shown in the sequence protocols 1 to 30 Oligopeptides and / or a derivative of these oligopeptides and / or one to one of these oligopeptides or a retro-inverse analogue to a derivative of these oligopeptides Peptide or pseudopeptide or fusion protein for the production of polyclonal, monoclonal or recombinant antibody against such an inventive Oligopeptide or retro-inverse peptide or pseudopeptide and the relevant one (s) Antibodies per se are therefore also part of the present invention.

Als Diagnostikum oder Therapeutikum oder Prophylaktikum oder allgemein für eine Detektion und/oder Manipulation von Zellen, die wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide überexprimieren, können erfindungsgemäß auch polyklonale, monoklonale oder rekombinante A2- restringierte T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalente Moleküle eingesetzt werden, die spezifisch für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder für ein Derivat eines dieser Oligopeptide und/oder für dazu analoge retro-inverse Peptide oder Pseudopeptide oder für ein vorstehen beschriebenes Fusionsprotein sind. Die T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle können autologen, allogenen oder xenogenen Ursprungs sein. Zum Gegenstand vorliegender Erfindung gehört folglich vorrangig auch:

  • - die Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder Derivate eines dieser Oligopeptide und/oder dazu analoger retro-inverser Peptide oder Pseudopeptide oder die Verwendung von Polynukleotiden mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder ein Derivat dieser Oligopeptide kodiert, zur Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter A2-restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenter Moleküle mit Spezifität für ein solches erfindungsgemäßes Oligopeptid bzw. retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid,
  • - der/die betreffende(n) T-Zellrezeptor(en) an sich und dazu funktionell äquivalente Moleküle,
  • - sowie Polynukleotide, die für diese T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle kodieren,
  • - Expressionsvektoren mit der Fähigkeit zur Expression dieser T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Moleküle.
According to the invention, polyclonal, monoclonal or recombinant A2-restricted T-cell receptors can also be used as a diagnostic or therapeutic or prophylactic or in general for the detection and / or manipulation of cells which overexpress at least one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 or for this purpose functionally equivalent molecules are used which are specific for one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 and / or for a derivative of one of these oligopeptides and / or for analogous retro-inverse peptides or pseudopeptides or for one are described fusion protein. The T cell receptors or molecules functionally equivalent to them can be of autologous, allogeneic or xenogeneic origin. The subject matter of the present invention therefore also primarily includes:
  • - The use of at least one of the PRDI-BF1 oligopeptides and / or derivatives of one of these oligopeptides and / or derivatives of these oligopeptides and / or retro-inverse peptides or pseudopeptides analogous to that shown in the sequence listing 1 to 30 or the use of polynucleotides with a nucleotide sequence which is at least for one of the encoded in sequence protocols 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides and / or a derivative of these oligopeptides, for the production of polyclonal, monoclonal or recombinant A2-restricted T cell receptors or functionally equivalent molecules with specificity for such an inventive oligopeptide or retro- inverse peptide or pseudopeptide,
  • - the relevant T cell receptor (s) per se and functionally equivalent molecules,
  • polynucleotides which code for these T cell receptors or molecules which are functionally equivalent thereto,
  • - Expression vectors with the ability to express these T cell receptors or their functionally equivalent molecules.

Die Erfindung umfaßt außerdem Reagenzien zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven ZTL, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie unter Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide und/oder wenigstens eines Derivates eines dieser Oligopetide und/oder wenigstens eines dazu analogen retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids oder Fusionsproteins und/oder unter Verwendung wenigstens eines Polynukleotids, das mindestens für eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Oligopeptide oder deren Derivat(e) und/oder dazu analogen retro-inversen Peptide oder Pseudopeptide oder Fusionsproteine kodiert und/oder unter Verwendung wenigstens eines der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1-Oligopeptide oder dazu Homologen anderer Spezies hergestellt sind. Bei diesen Reagenzien kann es sich insbesondere um Therapeutika, und dabei vor allem um Impfstoffe handeln. The invention also includes reagents for in vivo or in vitro activation of T cells, in particular CD8-positive ZTL, which are characterized in that they using at least one of those shown in Sequence Listing 1 to 30 PRDI-BF1 oligopeptides and / or at least one derivative of one of these oligopetides and / or at least one retro-inverse peptide or pseudopeptide analogous thereto or fusion protein and / or using at least one polynucleotide which at least for one of the oligopeptides shown in the sequence listing 1 to 30 or their derivative (s) and / or retro-inverse peptides analogous thereto or Pseudopeptides or fusion proteins encoded and / or using at least one of the PRDI-BF1 oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 or homologues of other species are produced. These reagents can especially therapeutic agents, and above all vaccines.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Herstellungs- und Anwendungsbeispielen mit Figuren näher erläutert. In the following the invention is based on manufacturing and application examples explained in more detail with figures.

Die verwendeten Abkürzungen bedeuten
The abbreviations used mean

A2: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2"
A2.1: humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
A2Kb: A2.1/Kb = MHC Klasse I-Molekül aus α1- und α2-Domäne von A2 und α3-Domäne von Kb
APZ: antigenpräsentierende Zelle
ATCC: American Type Culture Collection
ATP: Adenosin-5'-triphosphat
bkgd: unspezifische Fluoreszenzintensität
Blimp-1: B lymphocyte induced maturation protein 1
bp: Basenpaare
PRDI-BF1: positive regulatory domain I binding factor 1
BSA: Rinderserumalbumin
C-terminal: Carboxyl-terminal
CD: Differenzierungscluster
CD8: humaner CDBα/β-Korezeptor
CDR: komplementaritätsbestimmende Region
cDNA: komplementäre DNA
CMV: Cytomegalievirus
Con A: Concanavalin A
DMSO: Dimethylsulfoxid
DNA: Desoxyribonukleinsäure
dNTP: Desoxynukleosidtriphosphat
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT: Dithiothreitol
DZ: dendritische Zellen
E: T: Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis
EBV: Epstein-Barr-Virus
EDTA: Ethylendiamintetraacetat
ER: Endoplasmatisches Retikulum
EtBr: Ethidiumbromid
FACS: Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierer
FCS: fötales Kälberserum
FITC: Fluoreszein-Isothiocyanat
Flu M1: A/PR/8/34 Influenza Virus-Matrixprotein M1
G-418: Geneticin (Neomycin-Antibiotikum)
GM-CSF: Granulozyten-Makrophagen-colony stimulating factor
HBV pol: Hepatitis B Virus-Polymerase
HEPES: N-(2-Hydroxyethyl)piperizan N'-ethansulfonsäure
HLA: humanes Leukozyten-Antigen
HLA-A2.1 humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante "A2", Subtyp "A2.1"
IFA: inkomplettes Freundsches Adjuvans
IFN: Interferon
Ig: Immunglobulin
IL: Interleukin
kb: Kilobasenpaare
Kb: H-2Kb
kDa: kilo Dalton
LCL: lymphoblastoide Zellinie
LPS: Lipopolysaccharid
MHC: Haupthistokompatibilitätskomplex
Mio: Million
MM: Multiples Myelom
mut: mutiert
N-terminal: Amino-terminal
OD: optische Dichte
PBMC: mononukleäre Zellen des peripheren Bluts
PBS: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PCR: Polymerasekettenreaktion
PG-E2: Prostaglandin E2
Rad: radiation absorbed dose
RNA: Ribonukleinsäure
RT: Reverse Transkriptase
SL: spezifische Lyse
TAA: tumorassoziierte(s) Antigen(e)
TAP: Transporter assoziiert mit Antigenprozessierung
Tg: Transgen
TIL: Tumorinfiltrierende Lymphozyten
TNF-α: Tumor Nekrosis Faktor-α
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TZR: T-Zellrezeptor
u: internationale Einheiten (units)
Upm: Umdrehungen pro Minute
VSV-N: Vesikuläres Stomatitis-Virus-Nukleoprotein
v/v: Volumen pro Volumen
wt: Wildtyp
w/v: Masse pro Volumen
ZTL: zytotoxische T-Lymphozyten
A2: human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant "A2"
A2.1: human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant "A2", subtype "A2.1"
A2K b : A2.1 / K b = MHC class I molecule from α 1 and α 2 domains of A2 and α 3 domains of K b
APZ: antigen-presenting cell
ATCC: American Type Culture Collection
ATP: adenosine 5'-triphosphate
bkgd: unspecific fluorescence intensity
Blimp-1: B lymphocyte induced maturation protein 1
bp: base pairs
PRDI-BF1: positive regulatory domain I binding factor 1
BSA: bovine serum albumin
C-terminal: carboxyl-terminal
CD: Differentiation Cluster
CD8: human CDBα / β coreceptor
CDR: complementarity determining region
cDNA: complementary DNA
CMV: Cytomegalovirus
Con A: Concanavalin A
DMSO: dimethyl sulfoxide
DNA: deoxyribonucleic acid
dNTP: deoxynucleoside triphosphate
DSMZ: German collection of microorganisms and cell cultures
DTT: dithiothreitol
DZ: dendritic cells
E: T: effector to target cell ratio
EBV: Epstein-Barr virus
EDTA: ethylenediaminetetraacetate
ER: endoplasmic reticulum
EtBr: ethidium bromide
FACS: fluorescence-activated cell sorter
FCS: fetal calf serum
FITC: fluorescein isothiocyanate
Flu M1: A / PR / 8/34 influenza virus matrix protein M1
G-418: Geneticin (neomycin antibiotic)
GM-CSF: Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor
HBV pol: hepatitis B virus polymerase
HEPES: N- (2-hydroxyethyl) piperizan N'-ethanesulfonic acid
HLA: human leukocyte antigen
HLA-A2.1 human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant "A2", subtype "A2.1"
IFA: incomplete Freund's adjuvant
IFN: interferon
Ig: immunoglobulin
IL: Interleukin
kb: kilobase pairs
K b : H-2K b
kDa: kilo Dalton
LCL: lymphoblastoid cell line
LPS: lipopolysaccharide
MHC: major histocompatibility complex
Mio: million
MM: Multiple myeloma
courage: mutated
N-terminal: amino terminal
OD: optical density
PBMC: peripheral blood mononuclear cells
PBS: phosphate buffered saline
PCR: polymerase chain reaction
PG-E 2 : prostaglandin E 2
Rad: radiation absorbed dose
RNA: ribonucleic acid
RT: reverse transcriptase
SL: specific lysis
TAA: tumor-associated antigen (s)
TAP: Transporter associated with antigen processing
Tg: transgene
TIL: Tumor-infiltrating lymphocytes
TNF-α: tumor necrosis factor-α
Tris: tris (hydroxymethyl) aminomethane
TZR: T cell receptor
u: international units
Rpm: revolutions per minute
VSV-N: Vesicular stomatitis virus nucleoprotein
v / v: volume per volume
wt: wild type
w / v: mass per volume
ZTL: cytotoxic T lymphocytes

Abkürzungen für AminosäurenAbbreviations for amino acids

A: Alanin
C: Cystein
D: Aspartat
E: Glutamat
F: Phenylalanin
G: Glycin
H: Histidin
I: Isoleucin
K: Lysin
L: Leucin
M: Methionin
N: Asparagin
P: Prolin
Q: Glutamin
R: Arginin
S: Serin
T: Threonin
V: Valin
W: Tryptophan
Y: Tyrosin
A: Alanine
C: cysteine
D: aspartate
E: glutamate
F: phenylalanine
G: glycine
H: histidine
I: isoleucine
K: Lysine
L: leucine
M: methionine
N: asparagine
P: Proline
Q: Glutamine
R: arginine
S: serine
T: Threonine
V: Valine
W: tryptophan
Y: tyrosine

Die Figuren zeigen The figures show

Fig. 1 Bindung selektierter synthetischer PRDI-BF1 Peptide. Die relative A2.1- Bindungsaffinität (angegeben als % Inhibition) wurde bestimmt durch die Fähigkeit des jeweiligen Peptids, die A2.1-Bindung des Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Dies wurde anhand der Inhibition der p53-spezifischen ZTL-Lyse von p53 264-272-beladenen T2- Zielzellen durch PRDI-BF 1 Peptide unterschiedlicher Konzentration gemessen. Die Inhibitionswerte für die Peptide FluM1 und VSV-N wurden aus 6 unabhängigen Experimenten gemittelt. Fig. 1 binding selected synthetic PRDI-BF1 peptides. The relative A2.1 binding affinity (expressed as% inhibition) was determined by the ability of the respective peptide to inhibit the A2.1 binding of peptide p53 264-272. This was measured based on the inhibition of p53-specific CTL lysis of p53 264-272-loaded T2 target cells by PRDI-BF 1 peptides of different concentrations. The inhibition values for the peptides FluM1 and VSV-N were averaged from 6 independent experiments.

Fig. 2 A2.1-restringierte Immunogenität synthetischer PRDI-BFI Peptide in A2Kb oder CD8 × A2(Kb)-tg Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 0,2 µg Peptid-beladene oder unbeladene T2A2Kb Zellen oder T2 Zellen (zur Überprüfung der Immunogenität von PRDI-BFI 377-386) eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 2 immunisierten Mäusen. Fig. 2 A2.1-restricted immunogenicity of synthetic PRDI-BFI peptides in A2K b or CD8 × A2 (K b ) -tg mice. The immunogenicity was checked on the basis of the lytic activity of the CTL-induced in these mice by peptide immunization in a 4-hour cytotoxicity test. The target cells used were 0.2Ag peptide-loaded or unloaded T2A2K b cells or T2 cells (for checking the immunogenicity of PRDI-BFI 377-386). Representative specific lyses of individual ZTL cultures from an average of 2 immunized mice are shown.

Fig. 3 H-2b-restringierte Immunogenität synthetischer PRDI-BF1 Peptide in A2Kb oder CD8 × A2(Kb)-tg Mäusen. Die Immunogenität wurde anhand der lytischen Aktivität der in diesen Mäusen durch Peptid-Immunisierung induzierten ZTL in einem 4-stündigen Zytotoxizitätstest überprüft. Als Zielzellen wurden mit 0,2 µg Peptid-beladene oder unbeladene EL-4 Zellen eingesetzt. Dargestellt sind repräsentative spezifische Lysen individueller ZTL-Kulturen aus durchschnittlich 2 immunisierten Mäusen. Fig. 3 H-2 b -restricted immunogenicity of synthetic peptides BF1 PRDI-b in A2K or CD8 × A2 (K b) TG mice. The immunogenicity was checked on the basis of the lytic activity of the CTL-induced in these mice by peptide immunization in a 4-hour cytotoxicity test. EL-4 cells loaded or unloaded with 0.2 μg of peptide were used as target cells. Representative specific lyses of individual ZTL cultures from an average of 2 immunized mice are shown.

Fig. 4 Peptidspezifität und A2.1-Restriktion der ZTL-Linien CD8 × A2Kb 377 (A), CD8 × A2Kb 402p (B) und CD8 × A2Kb 401 (C), die durch wiederholte in vitro Stimulation mit dem jeweilig relevanten Peptid etabliert wurden. Zur Überprüfung der Peptidspezifität wurden T2-Zellen mit FluM1 58-66 Peptid (♦), dem jeweilig relevanten Peptid: PRDI-BFI 377-386 in (A), PRDI-BF1 402-410 in (B) und PRDI-BFI 401-410 in (C) (●), sowie PRDI-BF I 402-410A in (B) bzw. PRDI-BF1 402-410 in (C) (▪) oder keinem Peptid (○) beladen und in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E : T Verhältnissen als Zielzellen eingesetzt. Zur Uberprüfung der Restriktion dienten peptidbeladene (▴) und unbeladene (▵) EL-4 Zellen. Fig. 4 peptide specificity and A2.1 restriction of the ZTL lines CD8 × A2K b 377 (A), CD8 × A2K b 402p (B) and CD8 × A2K b 401 (C) by repeated in vitro stimulation with the respective relevant peptide were established. To check the peptide specificity, T2 cells with FluM1 58-66 peptide (♦), the relevant peptide: PRDI-BFI 377-386 in (A), PRDI-BF1 402-410 in (B) and PRDI-BFI 401- 410 in (C) (●), as well as PRDI-BF I 402-410A in (B) or PRDI-BF1 402-410 in (C) (▪) or no peptide (○) and loaded in a 6-hour 51 Cr release test used as target cells at the specified E: T ratios. To check the restriction, peptide-loaded (▴) and unloaded (▵) EL-4 cells were used.

Fig. 5 ZTL-Linien CD8 × A2Kb 377 (A), CD8 × A2Kb 402p (B) und CD8 × A2Kb 401 (C): Effizienz in der Peptiderkennung. Dazu wurden T2 Zellen mit den angegebenen Peptidkonzentrationen von PRDI-BF1 377-386 in (A), PRDI-BF1 402-410 in (B) und PRDI-BF1 401-410 in (C) (●), sowie PRDI-BF1 402-410A in (8) bzw. PRDI-BF1 402-410 in (C) (▪) inkubiert und als Zielzellen in einem 4 (B,C) und 6 (A) stündigen Zytotoxizitätstest bei einem E : T Verhältnis von 10 : 1 getestet. Fig. 5 CTL lines CD8 × A2K b 377 (A), CD8 × A2K b 402p (B) and CD8 × A2K b 401 (C): efficiency of peptide recognition. For this purpose, T2 cells with the specified peptide concentrations of PRDI-BF1 377-386 in (A), PRDI-BF1 402-410 in (B) and PRDI-BF1 401-410 in (C) (●), as well as PRDI-BF1 402 -410A in (8) or PRDI-BF1 402-410 in (C) (▪) and as target cells in a 4 (B, C) and 6 (A) hourly cytotoxicity test with an E: T ratio of 10: 1 tested.

Fig. 6 PRDI-BF1 RNA-Expression von Multiplen Myelom-Zellinien. Zytoplasmatische RNA von den Multiplen Myelom Zellinien L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 und NCI-H929 wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI-BF1- oder β-Actin- spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6%igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt. EL-4 fungierte als Negativkontrolle. Die Pfeile markieren die 390 bp (β-Actin PCR- Amplifikat) und die 540 bp Gelbande (PRDI-BF1 PCR-Amplifikat). Fig. 6 PRDI-BF1 RNA expression from multiple myeloma cell lines. Cytoplasmic RNA from the multiple myeloma cell lines L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 and NCI-H929 was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI-BF1 or β-actin-specific primers in a subsequent PCR reaction. The PCR products were separated electrophoretically in a 1.6% agarose gel containing EtBr. EL-4 acted as a negative control. The arrows mark the 390 bp (β-actin PCR amplificate) and the 540 bp gel band (PRDI-BF1 PCR amplificate).

Fig. 7 PRDI-BF1 RNA-Expression von den Osteosarkom-Zellinien Saos-2 und U2OS. Zytoplasmatische RNA von Saos-2 und U2OS wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI-BF1- oder β-Actin-spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6%igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt. EL-4 fungierte als Negativkontrolle, L363 als Positivkontrolle. Die Pfeile markieren die 390 bp (β-Actin PCR-Amplifikat) und die 540 bp Gelbande (PRDI-BF1 PCR-Amplifikat). Fig. 7 PRDI-BF1 RNA expression from the osteosarcoma cell lines Saos-2 and U2OS. Cytoplasmic RNA from Saos-2 and U2OS was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI-BF1 or β-actin-specific primers in a subsequent PCR reaction. The PCR products were separated electrophoretically in a 1.6% agarose gel containing EtBr. EL-4 acted as a negative control, L363 as a positive control. The arrows mark the 390 bp (β-actin PCR amplificate) and the 540 bp gel band (PRDI-BF1 PCR amplificate).

Fig. 8 ZTL-Erkennung von PRDI-BF1-überexprimierenden Plasmozytom-Zellinien. ZTL CD8 × A2Kb 402 p, CD8 × A2Kb 401 und CD8 × A2Kb 377 wurden als Effektorzellen unter den angegebenen E : T Verhältnissen in einem 6-stündigen Zytotoxizitätstest gegen die A2.1-positiven Zielzellen Saos-2 (○), U266 (●), OPM-2 (▪), MC-CAR (▴) und die A2.1-negative Zielzelle NCI-H929 (▵) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 allo A2 und CD8 × A2Kb FluM1. Fig. 8 ZTL detection of PRDI-BF1 overexpressing plasmacytoma cell lines. ZTL CD8 × A2K b 402 p, CD8 × A2K b 401 and CD8 × A2K b 377 were used as effector cells under the specified E: T ratios in a 6-hour cytotoxicity test against the A2.1-positive target cells Saos-2 (○), U266 (●), OPM-2 (▪), MC-CAR (▴) and the A2.1 negative target cell NCI-H929 (▵) tested. The ZTL lines CD8 allo A2 and CD8 × A2K b FluM1 served as controls.

Fig. 9 PRDI-BF1 RNA-Expression von Normalzellen. Zytoplasmatische RNA von Monozyten, T-Zellen und B-Zellen wurde in cDNA revers transkribiert und mit PRDI- BFI- oder β-Actin-spezifischen Primern in anschließender PCR-Reaktion amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,6%igen EtBr-haltigen Agarose Gel elektrophoretisch aufgetrennt. EL-4 fungierte als Negativkontrolle, L363 und NCI-H929 als Positivkontrolle. Die Pfeile markieren die 390 bp (β-Actin PCR-Amplifikat) und die 540 bp Gelbande (PRDI-BF1 PCR-Amplifikat). Fig. 9 PRDI-BF1 RNA expression from normal cells. Cytoplasmic RNA from monocytes, T cells and B cells was reverse transcribed in cDNA and amplified with PRDI, BFI or β-actin-specific primers in a subsequent PCR reaction. The PCR products were separated electrophoretically in a 1.6% agarose gel containing EtBr. EL-4 acted as a negative control, L363 and NCI-H929 as a positive control. The arrows mark the 390 bp (β-actin PCR amplificate) and the 540 bp gel band (PRDI-BF1 PCR amplificate).

Fig. 10 Fehlen substantieller Erkennung ruhender lymphohämopoetischer Zellen. ZTL CD8 × A2Kb 402p (A), CD8 × A2Kb 401 (B), CD8 × A2Kb 377 (C) wurden als Effektorzellen in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E : T Verhältnissen gegen ruhende B-Zellen (○) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI- BFI 402-410 (●) in (A, B, D, E) und PRDI-BF1 377-386 (▪) in (C, D, E) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 × A2Kb FluM1 (D) und CD8 allo A2 (E). Fig. 10 Lack of substantial recognition of resting lymphohemopoietic cells. ZTL CD8 × A2K b 402p (A), CD8 × A2K b 401 (B), CD8 × A2K b 377 (C) were used as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the given E: T ratios against resting B- Cells (○) and the same cells loaded with PRDI-BFI 402-410 (●) in (A, B, D, E) and PRDI-BF1 377-386 (▪) tested in (C, D, E). The ZTL lines CD8 × A2K b FluM1 (D) and CD8 allo A2 (E) served as controls.

Fig. 11 Fehlen substantieller Erkennung ruhender lymphohämopoetischer Zellen. ZTL CD8 × A2Kb 402p (A), CD8 × A2Kb 401 (B), CD8 × A2Kb 377 (C) wurden als Effektorzellen in einem 6-stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E : T Verhältnissen gegen ruhende T-Zellen (○) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI- BFI 402-410 (●) in (A, B, D, E) und PRDI-BF1 377-386 (▪) in (C, D, E) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL-Linien CD8 × A2Kb FIuM1 (D) und CD8 allo A2 (E). Fig. 11 Lack of substantial recognition of resting lymphohemopoietic cells. ZTL CD8 × A2K b 402p (A), CD8 × A2K b 401 (B), CD8 × A2K b 377 (C) were used as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the given E: T ratios against resting T- Cells (○) and the same cells loaded with PRDI-BFI 402-410 (●) in (A, B, D, E) and PRDI-BF1 377-386 (▪) tested in (C, D, E). The ZTL lines CD8 × A2K b FIuM1 (D) and CD8 allo A2 (E) served as controls.

Fig. 12 Fehlen substantieller Erkennung aktivierter reifer dendritischer Zellen (DZ). ZTL CD8 × A2Kb 402p (A), CD8 × A2Kb 377 (B) wurden als Effektorzellen in einem 6- stündigen 51Cr-Freisetzungstest bei den angegebenen E : T Verhältnissen gegen aktivierte reife DZ (○) und die gleichen Zellen beladen mit PRDI-BF1 402-410 (●) in (A, C und D) und PRDI-BF1 377-386 (▪) in (B, C und D) getestet. Als Kontrolle dienten die ZTL- Linien CD8 × A2Kb FluM1 (C) und CD8 ab A2 (D). Fig. 12 Lack of substantial recognition of activated mature dendritic cells (DZ). ZTL CD8 × A2K b 402p (A), CD8 × A2K b 377 (B) were loaded as effector cells in a 6-hour 51 Cr release test at the indicated E: T ratios against activated mature DC (○) and the same cells PRDI-BF1 402-410 (●) tested in (A, C and D) and PRDI-BF1 377-386 (▪) in (B, C and D). The ZTL lines CD8 × A2K b FluM1 (C) and CD8 from A2 (D) served as controls.

A) In den Beispielen erwähnte MaterialienA) Materials mentioned in the examples (1) Mäuse(1) mice

Transgene (Tg) Mäuse, die das humane MHC Klasse I-Tg HLA-A2.1 (A2.1) exprimieren, wurden mit fachüblichen Methoden in den C57BL/6-Hintergrund eingekreuzt (Irwin et al., 1989). Hierfür wurden folgende Stämme verwendet:

  • 1. A2.1/Kb (A2Kb)-Tg Mäuse - sie sind homozygot für ein chimäres MHC Klasse I- Tg, das sich aus den humanen α1- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3- Domäne von H-2Kb der Maus zusammensetzt, sowie für das H-2b-Gen.
  • 2. huCD8α/β (CD8)-Tg Mäuse - sie sind homozygot für die α- und β-Kette des humanen CD8-Korezeptors.
  • 3. [huCD8α/β × A2.1/Kb]F1 (CD8 × A2Kb)-Tg Mäuse - sie exprimieren heterozygot das chimäre A2Kb-Molekül und zusätzlich die α- und β-Kette des humanen CD8. Außerdem sind sie homozygot für H-2b.
  • 4. A2.1-Tg Mäuse (([A2.1 × C57BL/6] × C57BL/6)F1-Tg) - sie exprimieren die α1-, α2- und α3-Domänen des humanen A2.1-Moleküls heterozygot und sind homozygot für H-2b.
  • 5. C57BL/6-Mäuse - sie besitzen den H-2b-Phänotyp.
Transgenic (Tg) mice expressing the human MHC class I Tg HLA-A2.1 (A2.1) were crossed into the C57BL / 6 background using standard methods (Irwin et al., 1989). The following strains were used for this:
  • 1. A2.1 / K b (A2K b ) -Tg mice - they are homozygous for a chimeric MHC class I Tg, which is derived from the human α 1 and α 2 domains of A2.1 and from the α 3 - Domain of H-2K b composed of the mouse, as well as for the H-2 b gene.
  • 2. huCD8α / β (CD8) -Tg mice - they are homozygous for the α and β chain of the human CD8 coreceptor.
  • 3. [huCD8α / β × A2.1 / K b ] F1 (CD8 × A2K b ) -Tg mice - they heterozygously express the chimeric A2K b molecule and additionally the α and β chain of human CD8. They are also homozygous for H-2 b .
  • 4. A2.1-Tg mice (([A2.1 × C57BL / 6] × C57BL / 6) F1 -Tg) - they express the α 1 -, α 2 - and α 3 domains of human A2.1- Molecule heterozygous and are homozygous for H-2 b .
  • 5. C57BL / 6 mice - they have the H-2 b phenotype.

(2) Synthetische Peptide(2) Synthetic peptides

Synthetische Peptide wurden von SNPE (Neosystem laboratoire, Straßburg, Frankreich) bezogen. Die Reinheit der synthetisierten Peptide betrug mindestens 75%, die der Peptide PRDI-BF1 401 und PRDI-BF1 402 mindestens 97%. Reinheit und korrekte Aminosäurezusammensetzung aller Peptide wurde durch HPLC-Analyse sowie massenspektrometrisch überprüft. Die Peptide wurden in DMSO oder H2O zu 10 mg/ml gelöst. Die Lagerung erfolgte in Aliquots bei -20 bis -80°C. Zusätzlich wurde ein Peptid, das die Residuen 128-140 des Hepatitis B-Virus Core-Proteins repräsentiert (TPPAYRPPNAPIL), synthetisiert. Synthetic peptides were obtained from SNPE (Neosystem laboratoire, Strasbourg, France). The purity of the synthesized peptides was at least 75%, that of the peptides PRDI-BF1 401 and PRDI-BF1 402 at least 97%. The purity and correct amino acid composition of all peptides was checked by HPLC analysis and mass spectrometry. The peptides were dissolved in DMSO or H 2 O at 10 mg / ml. The storage took place in aliquots at -20 to -80 ° C. In addition, a peptide representing residues 128-140 of the hepatitis B virus core protein (TPPAYRPPNAPIL) was synthesized.

(3) Antikörper(3) Antibodies

Zur HLA-Typisierung von Tumor-Zellinien und von A2-Tg Mäusen wurde der von der Maus-Hybridom-Linie BB7.2 (ATCC HB-82) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt. For the HLA typing of tumor cell lines and of A2-Tg mice, that of the Mouse hybridoma line BB7.2 (ATCC HB-82) produced monoclonal antibodies used.

Zur Detektion von monoklonalen Antikörpern der Maus in der Durchflußzytometrie wurde ein FITC-konjugierter polyklonaler Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG F(ab)2-Fragment; 1 : 30-Verdünnung; Jackson [Dianova], Hamburg) eingesetzt. For the detection of mouse monoclonal antibodies in flow cytometry, a FITC-conjugated polyclonal secondary antibody (goat anti-mouse IgG F (ab) 2 fragment; 1:30 dilution; Jackson [Dianova], Hamburg) was used.

(4) Zellen, Zellinien und Transfektanten(4) cells, cell lines and transfectants

Sämtliche Zellen und Zellinien wurden in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) in Gegenwart von 10% hitzeinaktiviertem (30 min. 56°C) FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich), 1% 0,2 M L-Glutamin (Biowhittaker) und 50 µg/ml Gentamycin (Gibco BRL, Eggenstein) kultiviert. Zur Propagation von Zellen und ZTL-Linien aus der Maus wurde dem Medium zusätzlich β-Mercaptoethanol in einer Endkonzentration von 5 × 10-5 M zugesetzt. Zur Kultivierung Neomycin-transfizierter Zellen wurde dem Medium Geneticin (G-418) (Gibco BRL) in einer effektiven Konzentration von 280-560 µg/ml zugegeben. Alle Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 in Wasserdampf- gesättigter Atmosphäre in Zellkulturflaschen oder 24-Loch-Platten (ZTL) (Corning Costar, Bodenheim) kultiviert. All cells and cell lines were in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgium) in the presence of 10% heat inactivated (30 min. 56 ° C) FCS (PAA Laboratories, Linz, Austria), 1% 0.2 M L-glutamine (Biowhittaker ) and 50 µg / ml gentamycin (Gibco BRL, Eggenstein). For the propagation of cells and ZTL lines from the mouse, β-mercaptoethanol was additionally added to the medium in a final concentration of 5 × 10 -5 M. For the cultivation of neomycin-transfected cells, the medium Geneticin (G-418) (Gibco BRL) was added in an effective concentration of 280-560 µg / ml. All cells were cultivated at 37 ° C. and 5% CO 2 in a water vapor-saturated atmosphere in cell culture bottles or 24-hole plates (ZTL) (Corning Costar, Bodenheim).

(4.1) Zellen(4.1) cells

Zur Gewinnung von mononukleären Zellen des peripheren Bluts (PBMZ) wurde das Blut eines gesunden A2-positiven Spenders mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) im Verhältnis 1 : 3 verdünnt und mit dem gleichen Volumen Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) unterschichtet. Nach Zentrifugation (1400 Upm, 21°C, 20 min) wurden die PBMZ aus der Interphase isoliert und gewaschen. To obtain peripheral blood mononuclear cells (PBMZ) the blood of a healthy A2-positive donor with PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) diluted 1: 3 and with the same volume of Ficoll (Seromed Biochrom, Berlin) underlayed. After centrifugation (1400 rpm, 21 ° C, 20 min) the PBMZ were isolated from the interphase and washed.

Die Gewinnung ruhender T- und B-Zellen erfolgte nach negativer Selektion von A2- positiven PBMZ mit Antikörper-beschichteten "beads" (Dynal, Hamburg). Zur Isolierung von T-Zellen wurden die PBMZ nach Anweisung des Herstellers mit anti-CD19- und anti-CD14-"beads" inkubiert, zur Isolierung von B-Zellen mit anti-CD2- und anti-CD14- "beads" und zur Isolierung von Monozyten mit anti-CD2- und anti-CD19-"beads". Dendritische Zellen (DZ) wurden mit fachüblichen Methoden aus PBMZ eines A2- positiven Spenders generiert. Nach Inkubation der PBMZ für 45 min bei 37°C in einer 6-Loch-Platte (Corning Costar, Bodenheim) wurden nicht-adhärente Zellen abgespült und die adhärenten PBMZ in X-Vivo 15 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) aufgenommen, das mit 1,5% autologem hitzeinaktiviertem Plasma, 1000 U/ml IL-4 (PBH Strathmann Biotech, Hannover) und 800 U/ml GM-CSF ("Leucomax"; Sandoz, Nürnberg) supplementiert wurde (Jonuleit et al., 1997). An Tag 3 und 5 erfolgte ein teilweiser Mediumwechsel unter Zugabe von 1000 U/ml IL-4 und 1600 U/ml GM-CSF, jedoch ohne autologes Plasma. Die adhärenten PBMZ differenzierten zu nichtadhärenten "Dendriphagen". An Tag 7 wurden diese unreifen DZ in X-Vivo 15 mit 1,5% autologem Plasma ausgesät und mit 500 U/ml IL-4, 800 U/ml GM-CSF, 10 ng/ml TNF-α (Genzyme, Cambridge, MA), 10 ng/ml IL-1β (PBH Strathmann Biotech), 1000 U/ml 1L-6 (PBH Strathmann Biotech) und 1 µg/ml PG-E2 ("Minprostin E2"; Pharmacia Biotech, Freiburg) behandelt (Jonuleit et al., 1997). Die reifen DZ exprimierten an Tag 9 und 10 HLA-DR, CD58, CD80, CD83 und CD86. The resting T and B cells were obtained after negative selection of A2-positive PBMZ with antibody-coated "beads" (Dynal, Hamburg). For the isolation of T cells, the PBMZ were incubated according to the manufacturer's instructions with anti-CD19 and anti-CD14 "beads", for the isolation of B cells with anti-CD2 and anti-CD14 "beads" and for isolation of monocytes with anti-CD2 and anti-CD19 beads. Dendritic cells (DC) were generated using standard methods from PBMC from an A2 positive donor. After incubating the PBMZ for 45 min at 37 ° C. in a 6-well plate (Corning Costar, Bodenheim), non-adherent cells were rinsed off and the adherent PBMZ in X-Vivo 15 (Biowhittaker, Verviers, Belgium), which was taken up with 1.5% autologous heat-inactivated plasma, 1000 U / ml IL-4 (PBH Strathmann Biotech, Hanover) and 800 U / ml GM-CSF ("Leucomax"; Sandoz, Nuremberg) was supplemented (Jonuleit et al., 1997). On days 3 and 5 there was a partial change of medium with the addition of 1000 U / ml IL-4 and 1600 U / ml GM-CSF, but without autologous plasma. The adherent PBMZ differentiated to non-adherent "Dendriphagen". On day 7, these immature DCs were sown in X-Vivo 15 with 1.5% autologous plasma and with 500 U / ml IL-4, 800 U / ml GM-CSF, 10 ng / ml TNF-α (Genzyme, Cambridge, MA), 10 ng / ml IL-1β (PBH Strathmann Biotech), 1000 U / ml 1L-6 (PBH Strathmann Biotech) and 1 µg / ml PG-E 2 ("Minprostin E2"; Pharmacia Biotech, Freiburg) treated ( Jonuleit et al., 1997). The mature DCs expressed HLA-DR, CD58, CD80, CD83 and CD86 on days 9 and 10.

Sämtliche aufgeführte Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest ("ZTL- Erkennung"). All of the cells listed served as target cells in the cytotoxicity test ("ZTL- Recognition").

(4.2) Zellinien und Transfektanten(4.2) Cell lines and transfectants

Für die hier beschriebenen Untersuchungen wurden die nachfolgend aufgelisteten, gemäß (4.1) hergestellten oder im Stand der Technik bekannten und jederzeit erhältlichen Zellinien eingesetzt:

  • - die humane A2.1-positive T2-Zellinie ist ein BIT-Zellhybridom der Fusionspartner 721.147 und CEM (Salter und Cresswell, 1986),
  • - T2-Zellen, die gemäß Theobald et al., 1995, mit dem A2Kb-Gen transfiziert wurden (T2A2b),
  • - die Thymom-Zellinie EL-4 aus der C57BL/6-Maus (Theobald et al., 1995),
  • - die humane T-Zell Leukämie-Linie Jurkat (Theobald et al., 1995),
  • - Jurkat-Zellen, die mit A2.1 transfiziert waren (JA2) (Theobald et al., 1995),
  • - die konstitutiv A2.1-positive und p53-defektmutante Osteosarkom-Zellinie Saos-2 (Dittmer et al., 1993)
  • - die Osteosarkom-Zellinie U2OS (HTB-96, ATCC, VA, USA)
  • - die A2-positive Zellinie Plasmozytom OPM-2 (DSM ACC 50; DSMZ, Braunschweig, Deutschland)
  • - die A2-positive Zellinie Plasmozytom U266 (TIB-196; ATCC, VA, USA)
  • - die A2-positive Zellinie Plasmozytom MC-CAR (CRL-8083; ATCC, VA, USA)
  • - die A2-positive Zellinie Plasmozytom L363 (DSM ACC 49; DSMZ, Braunschweig)
  • - die A2-positive Zellinie Plasmozytom IM9 (CCL-159; ATCC, VA, USA)
  • - die A2-negative Zellinie Plasmozytom NCI-H929 (CRL-9068, ATCC, VA, USA)
For the investigations described here, the cell lines listed below, manufactured according to (4.1) or known in the prior art and available at any time:
  • the human A2.1 positive T2 cell line is a BIT cell hybridoma of the fusion partners 721.147 and CEM (Salter and Cresswell, 1986),
  • T2 cells transfected with the A2K b gene according to Theobald et al., 1995 (T2A2 b ),
  • the thymoma cell line EL-4 from the C57BL / 6 mouse (Theobald et al., 1995),
  • the Jurkat human T-cell leukemia line (Theobald et al., 1995),
  • Jurkat cells transfected with A2.1 (JA2) (Theobald et al., 1995),
  • - the constitutive A2.1-positive and p53-defective mutant osteosarcoma cell line Saos-2 (Dittmer et al., 1993)
  • - the osteosarcoma cell line U2OS (HTB-96, ATCC, VA, USA)
  • - the A2-positive cell line plasmacytoma OPM-2 (DSM ACC 50; DSMZ, Braunschweig, Germany)
  • - the A2-positive cell line plasmacytoma U266 (TIB-196; ATCC, VA, USA)
  • - the A2-positive cell line plasmacytoma MC-CAR (CRL-8083; ATCC, VA, USA)
  • - the A2-positive cell line plasmacytoma L363 (DSM ACC 49; DSMZ, Braunschweig)
  • - the A2-positive cell line plasmacytoma IM9 (CCL-159; ATCC, VA, USA)
  • - the A2-negative cell line plasmacytoma NCI-H929 (CRL-9068, ATCC, VA, USA)

Sämtliche aufgeführten Zellen dienten als Zielzellen im Zytotoxizitätstest. All of the cells listed served as target cells in the cytotoxicity test.

B) In den Beispielen verwendete MethodenB) Methods used in the examples (1) Durchflußzytometrie(1) Flow cytometry

Die A2.1-Expression von Zellen und Zellinien wurde im Fluoreszenz-aktivierten Zell- Sortierer (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA) gemessen. Jeweils 0,5 Mio Zellen wurden abzentrifugiert und mit dem anti-A2.1 monoklonalen Antikörper BB7.2 (oder RPMI 1640, 10% FCS, s. 2.4) in einem Volumen von 50 µl markiert (Lustgarten et al., 1997). Nach einstündiger Inkubation auf Eis wurden die Ansätze zweimal mit PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) gewaschen und die Zellen anschließend mit einem FITC-konjugierten Sekundär-Antikörper (Ziege anti-Maus IgG Fab-Fragment; 50 µl einer 1 : 30-Verdünnung in PBS) gegengefärbt. Nach 25 min Inkubation auf Eis wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen und schließlich in PBS und 1% Formalin fixiert. Die Fluoreszenz-Aktivität der im Vorwärtsstreulicht selektierten Zellpopulationen wurde im FACS ermittelt. A2.1 expression of cells and cell lines was measured in the fluorescence-activated cell sorter (FACS) (Becton Dickinson, San Jose, CA). In each case 0.5 million cells were centrifuged off and labeled with the anti-A2.1 monoclonal antibody BB7.2 (or RPMI 1640, 10% FCS, see 2.4) in a volume of 50 μl (Lustgarten et al., 1997). After incubation on ice for one hour, the batches were washed twice with PBS (Biowhittaker, Walkersville, MA) and the cells were then washed with a FITC-conjugated secondary antibody (goat anti-mouse IgG F ab fragment; 50 μl of a 1:30 dilution counterstained in PBS). After 25 min incubation on ice, the samples were washed twice with PBS and finally fixed in PBS and 1% formalin. The fluorescence activity of the cell populations selected in the forward scattered light was determined in the FACS.

(2) Bestimmung der Peptidbindungs-Affinität für HLA-A2.1(2) Determination of the peptide binding affinity for HLA-A2.1

Ein Kompetitionstest wurde angewandt, um die Bindung der PRDI-BF1-Peptide an A2.1 zu ermitteln. T2-Zellen wurden mit 0,01 oder 0,003 µg des A2.1-bindenden Peptids p53 264-272 (Theobald et al., 1995) und 3 oder 10 µg PRDI-BF1-Peptid beladen. Das A2.1- bindende Peptid 58-66 des A/PR/8/34 Influenza Virus Matrix-Proteins M1 (Flu M1 58- 66) (Theobald et al, 1995) diente als Positivkontrolle, das H-2Kb-bindende Peptid 52-59 des Vesikulären Stomatitis Virus-Nukleoproteins (VSV-N 52-59) (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle. Die A2.1-restringierten und p53 264-272-spezifischen ZTL A2 264 Klon 46 wurden bei verschiedenen Effektor- zu Zielzell (E : T)-Verhältnissen auf ihre lytische Aktivität gegenüber peptidbeladenen und unbeladenen T2-Zielzellen in einem, 4-stündigen Zytotoxizitätstest (s. Kapitel B 6) untersucht (Theobald et al., 1995). Die prozentuale Inhibition der ZTL A2 264-vermittelten spezifischen Lyse (SL) von p53 264-272-beladenen T2-Zellen durch die Test-Peptide wurde bei einem E : T-Verhältnis von 3 : 1 nach folgender Formel berechnet:


A competition test was used to determine the binding of the PRDI-BF1 peptides to A2.1. T2 cells were loaded with 0.01 or 0.003 µg of the A2.1-binding peptide p53 264-272 (Theobald et al., 1995) and 3 or 10 µg PRDI-BF1 peptide. The A2.1-binding peptide 58-66 of the A / PR / 8/34 influenza virus matrix protein M1 (Flu M1 58-66) (Theobald et al, 1995) served as a positive control, the H-2K b -binding peptide 52-59 of Vesicular Stomatitis Virus nucleoprotein (VSV-N 52-59) (Theobald et al., 1995) as a negative control. The A2.1-restricted and p53 264-272-specific ZTL A2 264 clone 46 were tested at various effector to target cell (E: T) ratios for their lytic activity against peptide-loaded and unloaded T2 target cells in a 4-hour cytotoxicity test (see Chapter B 6) (Theobald et al., 1995). The percentage inhibition of the ZTL A2 264-mediated specific lysis (SL) of p53 264-272-loaded T2 cells by the test peptides was calculated at an E: T ratio of 3: 1 using the following formula:


(3) Immunisierung A2.1-Tg Mäuse und Induktion peptidspezifischer sowie alloreaktiver ZTL(3) Immunization of A2.1-Tg mice and induction of peptide-specific as well alloreactive ZTL

Zur Generierung A2.1-restringierter peptidspezifischer ZTL wurden 8-12 Wochen alten A2.1-Tg Mäusen 100 µg des jeweiligen Test-Peptids sowie 120 µg HBV core 128-140 (ein I-Ab-bindendes synthetisches T-Helfer-Peptid) (Theobald et al., 1995), emulgiert in 100 µl inkomplettem Freundschen Adjuvans (IFA Difco Laboratories, Detroit, USA), subkutan in den Schwanzansatz injiziert (Theobald et al., 1995). Nach etwa 10 Tagen wurde die Milz entnommen, zerrieben und die Milzzellsuspension zweimal gewaschen (1500 Upm, 5°C, 7 min). Die Milzzellen wurden zu 7 Mio/ml/Loch in eine 24- Lochplatte ausgesät. Als Stimulatorzellen wurden mit 3000 Rad (132Cäsium) bestrahlte LPS-aktivierte B-Zellblasten, beladen mit 5 µg/ml des jeweiligen Test-Peptids und 10 µg/ml humanem β2-Mikroglobulin, nach zweimaligem Waschen zu 3 Mio/ml/Loch dazugegeben (Theobald et al., 1995). Die LPS-Blasten wurden durch dreitägige Stimulation von Milzzellen (1 Mio/ml) aus A2.1-Tg Mäusen mit 25 µg/ml LPS (Salmonella typhosa) und 7 µg/ml Dextransulfat (Pharmacia Biotech, Freiburg) gewonnen. Die Ansätze aus Effektor- und Stimulatorzellen wurden für 6 Tage inkubiert (I° Kulturen) und einem Zytotoxizitätstest unterzogen. To generate A2.1-restricted peptide-specific ZTL, 8 µg-old A2.1-Tg mice were given 100 µg of the respective test peptide and 120 µg HBV core 128-140 (an IA b -binding synthetic T-helper peptide) ( Theobald et al., 1995), emulsified in 100 ul incomplete Freund's adjuvant (IFA Difco Laboratories, Detroit, USA), injected subcutaneously into the tail (Theobald et al., 1995). After about 10 days, the spleen was removed, ground and the spleen cell suspension washed twice (1500 rpm, 5 ° C., 7 min). The spleen cells were sown at 7 million / ml / well in a 24-well plate. LPS-activated B-cell blasts irradiated with 3000 Rad ( 132 cesium), loaded with 5 µg / ml of the respective test peptide and 10 µg / ml human β 2 -microglobulin, were washed as stimulator cells after washing twice at 3 million / ml / well added (Theobald et al., 1995). The LPS blasts were obtained by stimulating spleen cells (1 million / ml) from A2.1-Tg mice with 25 µg / ml LPS (Salmonella typhosa) and 7 µg / ml dextran sulfate (Pharmacia Biotech, Freiburg) for three days. The effector and stimulator cell batches were incubated for 6 days (I ° cultures) and subjected to a cytotoxicity test.

(4) Etablierung von ZTL-Linien(4) Establishment of ZTL lines

Polyklonale peptidspezifische ZTL-Linien mit Spezifität für PRDI-BF1 377-386; 402-410 und 401-410 (ZTL CD8 × A2Kb 377, CD8 × A2Kb 402p, CD8 × A2Kb 401) und für Flu M1 58-66 (ZTL CD8 × A2Kb Flu M1) wurden durch wöchentliche Restimulation der Effektorzellen mit peptidbeladenen Stimulatorzellen etabliert. Als Stimulatorzellen dienten JA2-Zellen, die mit 20000 Rad bestrahlt, anschließend in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgien) mit 5 µg/ml des jeweiligen Peptids und 10 µg/ml humanem β2-Mikroglobulin für etwa 30 min beladen und schließlich zweimal gewaschen wurden. Die Effektorzellen wurden zusammen mit 0,5 Mio JA2-Zellen und 6 Mio mit 3000 Rad bestrahlten C57BL/6-Milzzellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml/Loch in eine 24-Loch-Platte ausgesät. Den Ansätzen wurde 2-5% (v/v) Überstand aus dem Kulturmedium Con A-aktivierter Milzzellen (TCGF) von Lewis-Ratten zugegeben (Theobald et al., 1995). Polyclonal peptide-specific ZTL lines with specificity for PRDI-BF1 377-386; 402-410 and 401-410 (ZTL CD8 × A2K b 377, CD8 × A2K b 402p, CD8 × A2K b 401) and for Flu M1 58-66 (ZTL CD8 × A2K b Flu M1) were determined by weekly restimulation of the effector cells with peptide-loaded stimulator cells established. JA2 cells, which were irradiated with 20,000 rads, were used as stimulator cells, then loaded in RPMI 1640 (Biowhittaker, Verviers, Belgium) with 5 μg / ml of the respective peptide and 10 μg / ml human β 2 -microglobulin for about 30 min and finally twice were washed. The effector cells were sown together with 0.5 million JA2 cells and 6 million C57BL / 6 spleen cells irradiated with 3000 Rad in a total volume of 2 ml / hole in a 24-hole plate. 2-5% (v / v) supernatant from the culture medium Con A-activated spleen cells (TCGF) from Lewis rats was added to the batches (Theobald et al., 1995).

Allo-A2.1-reaktive ZTL-Linien wurden durch intraperitoneale Immunisierung von CD8- Tg Mäusen mit 20 Mio JA2-Zellen/Maus induziert. Nach drei Wochen wurden die Milzzellen isoliert und in vitro (7 Mio/ml/Loch) mit bestrahlten JA2-Zellen (0,5 Mio/ml/Loch) oder Milzzellen (6 Mio/mllLoch) A2.1-Tg Mäuse stimuliert. Durch wiederholte wöchentliche in vitro-Restimulation mit JA2-Zellen in Gegenwart von bestrahlten C57BL/6-Milzzellen (6 Mio/ml/Loch) und 2-5% TCGF wurden schließlich allo-A2.1-reaktive ZTL-Linien generiert. Allo-A2.1-reactive CTL lines were determined by intraperitoneal immunization of CD8- Tg mice induced with 20 million JA2 cells / mouse. After three weeks, the Spleen cells isolated and in vitro (7 million / ml / well) with irradiated JA2 cells (0.5 million / ml / hole) or spleen cells (6 million / ml hole) A2.1-Tg mice stimulated. By repeated weekly in vitro restimulation with JA2 cells in the presence of irradiated C57BL / 6 spleen cells (6 million / ml / well) and 2-5% TCGF were eventually allo-A2.1-reactive ZTL lines generated.

(5) RT-PCR(5) RT-PCR a) Isolation von zytoplasmatischer RNAa) Isolation of cytoplasmic RNA

Zytoplasmatische RNA wurde nach Anweisung des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit ("RNeasy Mini Protocol for the Isolation of RNA from the Cytoplasm of Animal Cells", Quiagen, Hilden) aus Zellen und Zellinien isoliert. Cytoplasmic RNA has been identified Instructions of the manufacturer with the RNeasy Mini Kit ("RNeasy Mini Protocol for the Isolation of RNA from the Cytoplasm of Animal Cells ", Quiagen, Hilden) Cells and cell lines isolated.

b) RNA-Bestimmungb) RNA determination

Die RNA-Konzentration wurde photometrisch durch Messung der Absorption (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. The RNA concentration was measured photometrically the absorption (OD) at a wavelength of 260 nm.

c) Reverse Transkriptionc) reverse transcription

In der Reversen Transkription (RT) Reaktion wurde 2 µg RNA mit einem oligo-dT-V Primer (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT(AGC)-3') und 20U AMV-Reverse Transkriptase (Roche) in Gegenwart von 2U RNase- Inhibitor (Roche) und 1 mM Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) (Sigma,) in 1× cDNA Synthesis Puffer (Roche) in Einzelstrang-cDNA umgeschrieben. Die RT Reaktion erfolgte in einem Thermocycler (Master Cycler gradient 5331, Eppendorf) bei 55°C für 60 min und anschließenden 10 min bei 65°C. Die Aufreinigung der cDNA-Produkte erfolgte im Anschluss mit dem High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) nach Anweisung des Herstellers. In the reverse transcription (RT) reaction, 2 µg RNA with an oligo-dT-V primer (5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT (AGC) -3 ') and 20U AMV reverse transcriptase (Roche) in the presence of 2U RNase Inhibitor (Roche) and 1 mM deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) (Sigma,) in 1 × cDNA synthesis buffer (Roche) rewritten into single-strand cDNA. The RT Reaction took place in a thermal cycler (Master Cycler gradient 5331, Eppendorf) at 55 ° C for 60 min and then 10 min at 65 ° C. The purification of the cDNA products were then processed using the High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) according to the manufacturer's instructions.

d) PCR-Reaktiond) PCR reaction

Ein Zehntel der gereinigten cDNA wurde mit PRDI-BF1- spezifischen Primern (forward Primer: 5'-CAC ACG GGA GAA AAG CCA CAT- 3' und reverse Primer: 5'-GAG GCA ACT TCA TGA GGG GTA GAT-3') und parallel mit β-Actin-spezifischen Primern (forward Primer: 5'-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3' und reverse Primer: 5'-CTT CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3') und 2,5U Taq-Polymerase (Sigma) in 1. PCR Puffer (Sigma) 0,25 mM dNTPs amplifiziert. Die PCR-Reaktion umfasste einen Hotstart (2 Min 30 Sec bei 94°C), 40 Zyklen (Denaturierung: 30 Sec 94°C, Annealing: 1 Min 65°C und Elongation: 1 Min 30 Sec 72°C + 5 sec/Zyklus ab Zyklus 11) und abschliessende Elongation von 7 Min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden anschliessend in einem ETBr-haltigen 1,6%igen (w/v) Agarosegel analysiert. Als Längenstandard diente ein 100 bp Marker. One tenth of the purified cDNA was treated with PRDI-BF1 specific primers (forward primer: 5'-CAC ACG GGA GAA AAG CCA CAT- 3 'and reverse primer: 5'-GAG GCA ACT TCA TGA GGG GTA GAT-3') and in parallel with β-actin-specific primers (forward primer: 5'-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA T-3 'and reverse primer: 5'-CTT CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT-3 ') and 2.5U Taq polymerase (Sigma) in 1st PCR buffer (Sigma) 0.25 mM amplified dNTPs. The PCR reaction included a hot start (2 min 30 sec 94 ° C), 40 cycles (denaturation: 30 sec 94 ° C, annealing: 1 min 65 ° C and Elongation: 1 min 30 sec 72 ° C + 5 sec / cycle from cycle 11) and final Elongation of 7 min at 72 ° C. The PCR products were then in one ETBr-containing 1.6% (w / v) agarose gel analyzed. Served as the length standard a 100 bp marker.

(6) Zytotoxizitätstest(6) Cytotoxicity test

Die lytische Reaktivität von Effektorzellen gegenüber verschiedenen Zielzellen wurde in einem 51Cr-Freisetzungstest überprüft (Theobald et al., 1995). Als Zielzellen für Peptidtitrationstests wurden T2-Zellen eingesetzt. 1-5 Mio Zielzellen wurden für 60-90 min mit 150 µCi Na (51Cr) O4 (1 mCi/ml) (NEN Life Science, Belgien) markiert. Vor dieser Markierung wurde den Zellen bei Peptidtitrationstests 2 µl Peptidlösung unterschiedlicher Konzentration und 15 µl FCS (PAA Laboratories, Linz, Österreich) oder FCS ohne Peptid zugegeben. Die markierten Zielzellen wurden viermal gewaschen und die Zellzahl auf 0,1 Mio/ml eingestellt. Die Effektorzellen wurden mit Zellkulturmedium seriell 1 : 3 verdünnt und zu 0,1 ml/Loch in 96-Loch-Platten ausgesät. Insgesamt wurden fünf verschiedene E : T-Verhältnisse getestet. Anschließend wurden 0,1 ml/Loch der Zielzellsuspension zu den Effektorzellen gegeben und die Ansätze für 4-6 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert (1300 Upm, 5°C, 9 min), der Überstand (0,1 ml/Loch) abgenommen und die 51Cr-Freisetzung mit einem Gamma- "Counter" (Canberra Packard, Dreieich) gemessen. Die prozentuale spezifische Lyse (SL) wurde nach folgender Formel berechnet:


The lytic reactivity of effector cells towards different target cells was checked in a 51 Cr release test (Theobald et al., 1995). T2 cells were used as target cells for peptide titration tests. 1-5 million target cells were labeled with 150 μCi Na ( 51 Cr) O 4 (1 mCi / ml) (NEN Life Science, Belgium) for 60-90 min. Before this labeling, 2 μl of peptide solution of different concentrations and 15 μl of FCS (PAA Laboratories, Linz, Austria) or FCS without peptide were added to the cells in peptide titration tests. The marked target cells were washed four times and the cell number was set to 0.1 million / ml. The effector cells were serially diluted 1: 3 with cell culture medium and seeded at 0.1 ml / well in 96-well plates. A total of five different E: T ratios were tested. Then 0.1 ml / well of the target cell suspension was added to the effector cells and the batches were incubated for 4-6 hours. The cells were then centrifuged off (1300 rpm, 5 ° C., 9 min), the supernatant (0.1 ml / hole) was removed and the 51 Cr release was measured using a gamma counter (Canberra Packard, Dreieich). The percentage specific lysis (SL) was calculated using the following formula:


Die maximale 51Cr-Freisetzung entsprach der gesamten 51Cr-Inkorporation durch die Zielzellen, die spontane 51Cr-Freisetzung entsprach der Zielzell-Lyse in Abwesenheit von Effektorzellen und betrug in der Regel weniger als 10% der maximalen 51Cr- Freisetzung. Die Werte für spontane und maximale Lysen wurden aus jeweils vier, die für experimentelle Lysen aus zwei Ansätzen gemittelt. The maximum 51 Cr release corresponded to the total 51 Cr incorporation by the target cells, the spontaneous 51 Cr release corresponded to the target cell lysis in the absence of effector cells and was generally less than 10% of the maximum 51 Cr release. The values for spontaneous and maximum lysis were averaged from four approaches, and those for experimental lysis from two approaches.

C) BeispieleC) Examples Beispiel 1example 1 Experimentelle Gewinnung der PRDI-BF1-Oligopeptide mit den in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten AminosäuresequenzenExperimental extraction of the PRDI-BF1 oligopeptides with the in Sequence listing 1 to 30 amino acid sequences shown (1.1) Selektion potentiell A2.1-bindender PRDI-BF1-Peptide(1.1) Selection of potentially A2.1-binding PRDI-BF1 peptides

Anhand der bekannten Aminosäuresequenz des PRDI-BF1-Proteins wurden 8mere, 9mere, 10mere und 11mere bestimmt, die Teilsequenzen dieses PRDI-BF 1 Polypeptids darstellen und die die folgenden Kriterien erfüllen:

  • 1. Sie weisen als sogenannte primäre Ankeraminosäuren, das sind Aminosäuren innerhalb des Peptids, die mit Resten der Bindungstasche des MHC Klasse I- Moleküls interagieren und die sich bei endogen prozessierten und im Kontext von MHC Klasse I-Molekülen präsentierten Peptide an Position 2 und am C-Terminus des Epitops befinden, an Position 2 klassischerweise die Aminosäuren L, M, I, V oder T und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, Q oder K auf und am C- Terminus klassischerweise die Aminosäuren V, L oder I und nichtklassischerweise die Aminosäuren A, M oder T (Theobald et al., 1995).
  • 2. Die betreffenden PRDI-BF1 Peptide sind bis auf die Peptide mit den SEQ ID NO 13- 16, 19, 20, 22, 23 und 29 nicht homolog zu den korrespondierenden Blimp-1 Peptiden der Maus.
Based on the known amino acid sequence of the PRDI-BF1 protein, 8mers, 9mers, 10mers and 11mers were determined, which represent partial sequences of this PRDI-BF 1 polypeptide and which meet the following criteria:
  • 1. They have so-called primary anchor amino acids, which are amino acids within the peptide that interact with residues of the binding pocket of the MHC class I molecule and that are present at position 2 and am in endogenously processed and presented in the context of MHC class I molecules The C-terminus of the epitope is classically located at position 2, the amino acids L, M, I, V or T and not classically the amino acids A, Q or K, and at the C-terminus classically the amino acids V, L or I and not classically the amino acids A , M or T (Theobald et al., 1995).
  • 2. The relevant PRDI-BF1 peptides, with the exception of the peptides with SEQ ID NO 13- 16, 19, 20, 22, 23 and 29, are not homologous to the corresponding Blimp-1 peptides of the mouse.

Mit diesem Verfahren wurden die in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF1 Peptide selektiert (siehe Fig. 1), die eine starke oder intermediäre Bindungsaffinität zu A2.1 zeigen (siehe Bsp. 1.2). Die diesen Oligopeptiden entsprechenden Teilsequenzen des PRDI-BF1-Proteins mit der Gen Bank Accession Nummer: A39564 sind in Tabelle 1 aufgelistet. With this method, the PRDI-BF1 peptides shown in the sequence protocols 1 to 30 were selected (see FIG. 1), which show a strong or intermediate binding affinity to A2.1 (see example 1.2). The partial sequences of the PRDI-BF1 protein with the Gen Bank Accession Number: A39564 corresponding to these oligopeptides are listed in Table 1.

(1.2) Bindung selektierter synthetischer PRDI-BF1 Peptide an A2.1(1.2) Binding of selected synthetic PRDI-BF1 peptides to A2.1

Die gemäß (1.1) anhand ihrer theoretischen Bindungsstärke selektierten PRDI-BF1 Peptide wurden auf ihre tatsächliche Bindungsaffinität für A2.1 untersucht. Hierfür wurde in einem kompetitiven Bindungstest, der in der Publikation von Theobald et al. (1995) näher beschrieben ist, funktionell die Fähigkeit der PRDI-BF1 Peptide getestet, die A2.1-Bindung des konkurrierenden synthetischen Peptids p53 264-272 zu inhibieren. Diese Inhibition wurde anhand der Abnahme der durch einen A2.1-restringierten p53 264-272-spezifischen ZTL-Klon-vermittelte Lyse von T2-Zellen gemessen, die mit p53 264-272-Peptid und dem individuellen PRDI-BF1 Testpeptid beladen waren. Die Bindungsergebnisse sind in Fig. 1 zusammengefaßt dargestellt. Das bekannte A2.1-bindende Peptid Flu M1 58-66 (vgl. Theobald et al., 1995) diente als Positivkontrolle und zeigte bei 3 µg und auch bei 10 µg mehr als 80% Inhibition, während das H-2Kb-bindende Peptid VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) als Negativkontrolle keinerlei A2.1-Bindungsaktivität aufwies. Die PRDI-BF1 Peptide wurden nach ihrer Bindungsstärke in 4 Gruppen eingeteilt. Von insgesamt 61 getesteten Peptiden hatten 16 eine hohe Bindungsaktivität (mindestens 85% Inhibition bei 10 µg Testpeptid), 28 eine mittlere (40-84% Inhibition), 10 eine schwache (14-39%) und 7 keine Bindungsaktivität (< 13% oder keine Dosisabhängigkeit der Inhibition). Die am stärksten bindenden PRDI-BF1 Peptide waren das Peptid 402-410 (SEQ ID NO. 1) und die beiden homologen Peptide 747-755 (SEQ ID NO. 13) und 681-690 (SEQ ID NO. 19), die sowohl bei 10 µg als auch bei 3 µg eine 100%ige Inhibition der Bindung des konkurrierenden Peptids p53 264-272 zeigten. Dosisabhängigkeit zeigte sich für diese Peptide erst bei einer E : T von 1 : 1. Die 13 anderen stark bindenden Peptide inklusive der Peptide mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 2-4, 14, 16 und 18 zeigten eine deutliche dosisabhängige Inhibition. Die Peptide mit den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 5-12, 15, 17 und 20-30 wiesen eine intermediäre Bindungsaktivität auf. The PRDI-BF1 peptides selected according to (1.1) on the basis of their theoretical binding strength were examined for their actual binding affinity for A2.1. For this purpose, a competitive binding test, which was published in Theobald et al. (1995) is functionally tested, the ability of the PRDI-BF1 peptides to inhibit the A2.1 binding of the competing synthetic peptide p53 264-272. This inhibition was measured from the decrease in lysis of T2 cells loaded with p53 264-272 peptide and the individual PRDI-BF1 test peptide, mediated by an A2.1-restricted p53 264-272-specific CTL clone. The binding results are summarized in Fig. 1. The known A2.1-binding peptide Flu M1 58-66 (cf. Theobald et al., 1995) served as a positive control and showed more than 80% inhibition at 3 µg and also at 10 µg, while the H-2K b -binding Peptide VSV-N 52-59 (Theobald et al., 1995) as a negative control showed no A2.1 binding activity. The PRDI-BF1 peptides were divided into 4 groups according to their binding strength. Of a total of 61 peptides tested, 16 had a high binding activity (at least 85% inhibition with 10 µg test peptide), 28 a medium (40-84% inhibition), 10 a weak (14-39%) and 7 no binding activity (<13% or no dose dependence of inhibition). The most binding PRDI-BF1 peptides were peptide 402-410 (SEQ ID NO. 1) and the two homologous peptides 747-755 (SEQ ID NO. 13) and 681-690 (SEQ ID NO. 19), both of which showed a 100% inhibition of the binding of the competing peptide p53 264-272 at 10 µg and at 3 µg. Dose dependency for these peptides only became apparent at an E: T of 1: 1. The 13 other strongly binding peptides including the peptides with the sequences according to SEQ ID NO. 2-4, 14, 16 and 18 showed a clear dose-dependent inhibition. The peptides with the sequences according to SEQ ID NO. 5-12, 15, 17 and 20-30 showed intermediate binding activity.

Insgesamt zeigten 72% aller selektierten Peptide eine starke oder intermediäre A2.1- Bindung, nur 11% konnten nicht an A2.1 binden. Overall, 72% of all selected peptides showed a strong or intermediate A2.1- Binding, only 11% could not bind to A2.1.

Beispiel 2Example 2 Experimenteller Nachweis der Eignung der PRDI-BF1 Oligopeptide 402-410, 401-410, 377-386 und 406-415 (SEQ ID NO. 1-4), zur Erzeugung einer spezifischen, ZTL-vermittelten ImmunogenitätExperimental proof of the suitability of the PRDI-BF1 oligopeptides 402-410, 401-410, 377-386 and 406-415 (SEQ ID NO. 1-4), for Generation of a specific, ZTL-mediated immunogenicity (2.1) Immunogenität A2.1-bindender synthetischer PRDI-BF1 Peptide in A2.1-Tg Mäusen(2.1) Immunogenicity of A2.1-binding synthetic PRDI-BF1 peptides in A2.1-Tg mice

Ein Hindernis bei der Erkennung von humanen MHC Klasse I-Molekülen durch Maus-T- Zellen ist die Unfähigkeit von Maus-CD8, mit HLA-Molekülen wie A2.1 zu interagieren. Zur Umgehung bzw. Behebung dieses Hindernisses wurden zwei Strategien angewendet. Die eine Strategie bestand in der Konstruktion des chimären Moleküls A2.1/Kb (A2Kb), das sich aus den humanen α1- und α2-Domänen von A2.1 und aus der α3-Domäne von Maus-Kb, die für die Interaktion mit CD8 wesentlich ist, zusammensetzt. In A2Kb-Tg Mäusen induzierte ZTL mit Restriktion für das A2Kb-Tg erkennen dieselben Peptidantigene, die auch in A2.1-positiven Menschen immunogen sind. An obstacle to the detection of human MHC class I molecules by mouse T cells is the inability of mouse CD8 to interact with HLA molecules such as A2.1. Two strategies have been used to circumvent or remove this obstacle. One strategy consisted in the construction of the chimeric molecule A2.1 / K b (A2K b ), which is composed of the human α1 and α2 domains of A2.1 and the α3 domain of mouse K b , which is responsible for the interaction with CD8 is essential. In A2K b -Tg mice induced ZTL with restriction for the A2K b -Tg recognize the same peptide antigens that are also immunogenic in A2.1 positive humans.

Die andere Strategie zur Verstärkung der A2.1-restringierten Antwort bestand in der Erzeugung einer doppelt-Tg Maus "CD8 × A2.1/Kb" durch Kreuzung einer A2Kb-Tg mit einer huCD8α/β-Tg Maus. Die Expression der α- und β-Kette des huCD8-Moleküls ermöglicht den generierten ZTL, mit der α3-Domäne des A2.1-Moleküls humaner Zellen zu interagieren. The other strategy to enhance the A2.1 restricted response was to create a double-Tg mouse "CD8 × A2.1 / K b " by crossing an A2K b -Tg with a huCD8α / β-Tg mouse. The expression of the α and β chain of the huCD8 molecule enables the generated CTL to interact with the α3 domain of the A2.1 molecule of human cells.

Mit den gemäß Beispiel 1 gewonnenen stark oder intermediär bindenden Peptiden (s. Fig. 1) wurden A2Kb- und CD8 × A2Kb-Tg Mäuse immunisiert, um PRDI-BF1 Peptid-reaktive ZTL zu gewinnen. 9 bis 11 Tage nach der Immunisierung wurden Milzzellen der betreffenden Mäuse in vitro mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert und 6 Tage danach auf eine A2.1-restringierte peptidspezifische ZTL-Antwort in einem Zytotoxizitätstest untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 zusammengefaßt dargestellt. Für die Positivkontrolle Flu M1 58-66 war die Induktion A2.1-restringierter ZTL bereits bekannt (Theobald et al., 1995). Eine A2.1-restringierte und peptidspezifische ZTL-Antwort wurde bislang für die stark bindenden Peptide 401-410 (SEQ ID NO. 2), 402-410 (SEQ ID NO. 1), 377-386 (SEQ ID NO. 3) und 406-415 (SEQ ID NO. 4) nachgewiesen. Die Höhe der Lyse war vom E : T-Verhältnis abhängig. Die ZTL waren peptidspezifisch, da sie mit dem entsprechenden Peptid-beladene Zellen lysierten, nicht aber Zellen, die mit irrelevanten A2.1-bindenden Peptiden beladen waren. A2K b - and CD8 × A2K b -Tg mice were immunized with the strongly or intermediate-binding peptides obtained according to Example 1 (see FIG. 1) in order to obtain PRDI-BF1 peptide-reactive ZTL. 9 to 11 days after the immunization, spleen cells of the mice in question were stimulated in vitro with peptide-loaded syngeneic LPS blasts and examined for an A2.1-restricted peptide-specific CTL response in a cytotoxicity test 6 days later. The results are summarized in Fig. 2. The induction of A2.1-restricted ZTL was already known for the positive control Flu M1 58-66 (Theobald et al., 1995). An A2.1-restricted and peptide-specific ZTL response has so far been used for the strongly binding peptides 401-410 (SEQ ID NO. 2), 402-410 (SEQ ID NO. 1), 377-386 (SEQ ID NO. 3) and 406-415 (SEQ ID NO. 4). The level of lysis was dependent on the E: T ratio. The ZTL were peptide-specific, since they lysed cells loaded with the corresponding peptide, but not cells that were loaded with irrelevant A2.1-binding peptides.

Durch PRDI-BF1 401-410, 402-410, 377-386 induzierte ZTL waren A2.1-restringiert, da mit dem entsprechenden Peptid-beladene A2.1-negative EL-4-Zellen (H-2b) der Maus nicht erkannt wurden (Fig. 3). Für das Oligopeptid 406-415 wurde neben einer A2.1-restringierten vornehmlich eine H-2b-restringierte ZTL-Antwort induziert, da ausser PRDI-BF1 406-415 -beladenen T2 Zellen auch EL-4 Zellen, die mit diesem Peptid beladen waren, spezifisch erkannt wurden (Fig. 3). ZTL induced by PRDI-BF1 401-410, 402-410, 377-386 were A2.1-restricted, since the corresponding peptide-loaded A2.1-negative EL-4 cells (H-2 b ) of the mouse were not were recognized ( Fig. 3). For the 406-415 oligopeptide, an H-2 b- restricted ZTL response was primarily induced in addition to an A2.1-restricted, since in addition to PRDI-BF1 406-415-loaded T2 cells, EL-4 cells loaded with this peptide were also induced were specifically recognized ( Fig. 3).

(2.2) PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL: A2.1- Restriktion, Peptidspezifität und Effizienz der Peptiderkennung(2.2) PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL: A2.1- Restriction, peptide specificity and efficiency of peptide recognition

A2.1-restringierte und für PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL wurden im folgenden näher untersucht. Da bis zu diesem Zeitpunkt der Arbeit nur aus A2Kb-Tg Mäusen generierte PRDI-BF1 401-410- und 402-410-spezifische ZTL-Linien existierten, wurden CD8 × A2Kb-Tg Mäuse mit PRDI-BF1 401-410 und 402-410 immunisiert in der Absicht, ZTL mit höherer Avidität zu erhalten. Für den Nachweis der Immunogenität von PRDI-BF1 377-386 wurden bereits CD8 × A2Kb-Tg Mäuse verwendet (Fig. 2 und 3). A2T-restricted and for PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL were examined in more detail below. As there were only PRDI-BF1 401-410 and 402-410-specific ZTL lines generated from A2K b -Tg mice, CD8 × A2K b -Tg mice with PRDI-BF1 401-410 and 402 -410 immunized with the intention of obtaining ZTL with higher avidity. CD8 × A2K b -Tg mice have already been used to demonstrate the immunogenicity of PRDI-BF1 377-386 (FIGS . 2 and 3).

Nach Immunisierung von CD8 × A2Kb-Tg Mäusen mit PRDI-BF1 401-410 und 402-410 wurden die Milzzellen mit Peptid-beladenen syngenen LPS-Blasten stimuliert (I° Kultur) und 6 Tage später im Zytotoxizitätstest gegen T2-Zielzellen, inkubiert mit PRDI-BF1 401-410 oder 402-410, getestet. Für beide Peptide wurden peptidspezifische ZTL induziert (Daten nicht gezeigt). After immunization of CD8 × A2K b -Tg mice with PRDI-BF1 401-410 and 402-410, the spleen cells were stimulated with peptide-loaded syngeneic LPS blasts (I ° culture) and incubated 6 days later in the cytotoxicity test against T2 target cells with PRDI-BF1 401-410 or 402-410, tested. Peptide-specific CTLs were induced for both peptides (data not shown).

Durch wiederholte Restimulation von I°ZTL aus CD8 × A2Kb-Tg Mäusen mit Peptidbeladenen Stimulatorzellen wurden stabile ZTL-Linien mit Spezifität für PRDI-BF1 401- 410, 402-410 und 377-386 generiert. Die Peptidspezifität und A2.1-Restriktion der etablierten ZTL-Linien CD8 × A2Kb 377, CD8 × A2Kb 402p und CD8 × A2Kb 401 sind in Fig. 4 A-C dargestellt. Unbeladene oder mit dem irrelevanten Peptid Flu M1 58-66 - beladene T2-Zielzellen wurden von diesen ZTL nicht erkannt. Flu M1 58-66- präsentierende T2-Zellen wurden jedoch von einer CD8 × A2Kb T-Zell-Population mit Spezifität für Flu M1 58-66 lysiert (ohne Figur). Die ZTL waren A2.1-restringiert, da mit dem entsprechenden Peptid-beladene A2.1-negative EL-4-Zellen (H-2b) der Maus nicht erkannt wurden (Fig. 4 A-C). By repeated restimulation of I ° ZTL from CD8 × A2K b -Tg mice with peptide-loaded stimulator cells, stable ZTL lines with specificity for PRDI-BF1 401-410, 402-410 and 377-386 were generated. The peptide specificity and A2.1 restriction of the established ZTL lines CD8 × A2K b 377, CD8 × A2K b 402p and CD8 × A2K b 401 are shown in FIG. 4 AC. These ZTL did not recognize unloaded T2-cells or the irrelevant peptide Flu M1 58-66. However, T2 cells presenting Flu M1 58-66 were lysed from a CD8 × A2K b T cell population specific for Flu M1 58-66 (without figure). The ZTL were A2.1-restricted, since the corresponding peptide-loaded A2.1-negative EL-4 cells (H-2 b ) of the mouse were not recognized ( FIG. 4 AC).

Die ZTL CD8 × A2Kb 402p erkannten neben dem Peptid 402-410 auch die Peptidvariante 402-410A, die an Position 408 eine Aminosäuresubstitution von Cystein nach Alanin besitzt (Fig. 4B). Wurden T2-Zellen bei unterschiedlichen Konzentrationen an synthetischem Peptid 402-410 und 402-410A inkubiert und als Zielzellen für CD8 × A2Kb 402p im Zytotoxizitätstest eingesetzt, zeigte die ZTL Linie eine um ca. eine log- Stufe effizientere Erkennung der Peptidvariante 402-410A (Fig. 5B). Die ZTL Linie CD8 × A2Kb 401 zeigte ebenfalls Kreuzreaktivität gegenüber dem um eine Aminosäure verkürzten Peptid PRDI-BF1 402-410 (Fig. 4C). Das Peptid 402-410 wurde von dieser ZTL Linie um eine log-Stufe effizienter erkannt als das zur Propagation der ZTL verwendete Peptid PRDI-BF1 401-410 (Erkennung von PRDI-BF1 402-410 noch bei einer Peptidkonzentration von 1nM im Vergleich zu 10 nM für PRDI-BF1 401-410) (Fig. 5C). Für die ZTL CD8 × A2Kb 377 ist ebenfalls die Effizienz der Peptiderkennung bei einem E : T Verhältnis von 10 : 1 in Fig. 5A dargestellt. Die ZTL erkannten das spezifische Peptid PRDI-BF1 377-386 bis zu einer Peptidkonzentration von 1-10 nM. In addition to the peptide 402-410, the ZTL CD8 × A2K b 402p also recognized the peptide variant 402-410A, which has an amino acid substitution of cysteine for alanine at position 408 ( FIG. 4B). If T2 cells were incubated at different concentrations of synthetic peptide 402-410 and 402-410A and used as target cells for CD8 × A2K b 402p in the cytotoxicity test, the ZTL line showed a more efficient logging of the peptide variant 402-410A ( Fig. 5B). The ZTL line CD8 × A2K b 401 also showed cross-reactivity towards the peptide PRDI-BF1 402-410 shortened by an amino acid ( FIG. 4C). The peptide 402-410 was recognized by this ZTL line by one log level more efficiently than the peptide PRDI-BF1 401-410 used to propagate the ZTL (detection of PRDI-BF1 402-410 even at a peptide concentration of 1nM compared to 10 nM for PRDI-BF1 401-410) ( Fig. 5C). For the ZTL CD8 × A2K b 377, the efficiency of peptide recognition with an E: T ratio of 10: 1 is also shown in FIG. 5A. The ZTL recognized the specific peptide PRDI-BF1 377-386 up to a peptide concentration of 1-10 nM.

Im Endergebnis wurden A2.1-restringierte ZTL-Populationen mit Spezifität für PRDI- BF1 401-410, 402-410 und 377-386 generiert. The end result was A2.1-restricted ZTL populations with specificity for PRDI- BF1 401-410, 402-410 and 377-386 generated.

Beispiel 3Example 3 Verwendung von PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischen ZTL zur spezifischen Erkennung von Multiple-Myelom- ZellenUse of PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386- specific ZTL for the specific detection of multiple myeloma cell (3.1) PRDI-BF1-Expression in MM-Zellinien(3.1) PRDI-BF1 expression in MM cell lines

Um zu bestimmen, ob das PRDI-BF1 Protein tatsächlich in malignen Plasmazellen überexprimiert wird und damit endogen prozessierte und A2.1-präsentierte PRDI-BF1- Peptide MM-assozierte Peptidantigene darstellen, wurden zunächst verschiedene MM- Zellinien auf die Expression von PRDI-BF1 RNA untersucht. Dazu wurde die zytoplasmatische RNA isoliert, mit einem oligo-dT Primer die polyA-RNA (mRNA) in cDNA umgeschrieben (Reverse Transkription) und mit PRDI-BF1-spezifischen Primern in anschliessender PCR Reaktion amplifiziert. Zur Kontrolle wurde die cDNA ebenfalls mit β-Actin-spezifischen Primern amplifiziert. Da β-Actin in allen Zellen konstitutiv exprimiert wird, ist in allen Zellen ein vergleichbares β-Actin Signal zu erwarten. Sowohl die β-Actin-spezifischen Primer als auch die PRDI-BF1-spezifischen Primer wurden Intron-überspannend gewählt, sodass aufgrund der Grösse des PCR-Produkts zwischen einem RNA-Amplifikat (PRDI-BF1: 540bp Fragment; β-Actin: 390bp Fragment) und einem von eventuell kontaminierender DNA-abstammendem Amplifikat (PRDI-BF1: 950bp Fragment; β-Actin: 830bp Fragment) unterschieden werden konnte. In Fig. 6 ist die PRDI-BF1 RNA-Expression der mm-Zellinien L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 und NCI-H929 dargestellt. Im Gegensatz zur PRDI-BF1-negativen Zellinie EL-4 zeigen die mm-Zellinien eine starke PRDI-BF1-Expression (540bp Amplifikat). Alle untersuchten Zellinien zeigen eine vergleichbare Expression von β-Actin (390bp Amplifikat). Die PRDI-BF1 RNA-Expression wurde ebenfalls für die beiden Osteosarkom-Zellinien Saos-2 und U2OS untersucht (Fig. 7). Für die Zellinie U2OS wurde bereits von Keller und Maniatis (1991) die Expression von PRDI-BF1 RNA nachgewiesen. U2OS exprimieren deutlich mehr PRDI-BF1 RNA als Saos-2. Beide Zellinien zeigen eine geringere Expression im Vergleich zu der mm-Zellinie L363, die hier als Positivkontrolle diente (Fig. 7). EL-4 fungierte als Negativkontrolle (Fig. 7) In order to determine whether the PRDI-BF1 protein is actually overexpressed in malignant plasma cells and thus endogenously processed and A2.1-presented PRDI-BF1 peptides represent MM-associated peptide antigens, various MM cell lines were first tested for the expression of PRDI-BF1 RNA examined. For this purpose, the cytoplasmic RNA was isolated, the polyA-RNA (mRNA) was transcribed into cDNA (reverse transcription) with an oligo-dT primer and amplified with PRDI-BF1-specific primers in a subsequent PCR reaction. As a control, the cDNA was also amplified with β-actin-specific primers. Since β-actin is constitutively expressed in all cells, a comparable β-actin signal can be expected in all cells. Both the β-actin-specific primers and the PRDI-BF1-specific primers were chosen to be intron-spanning, so that due to the size of the PCR product, an RNA amplificate (PRDI-BF1: 540bp fragment; β-actin: 390bp fragment ) and a possibly contaminating DNA-derived amplificate (PRDI-BF1: 950bp fragment; β-actin: 830bp fragment). FIG. 6 shows the PRDI-BF1 RNA expression of the mm cell lines L363, MC-CAR, U266, IM9, OPM-2 and NCI-H929. In contrast to the PRDI-BF1-negative cell line EL-4, the mm cell lines show a strong PRDI-BF1 expression (540 bp amplificate). All examined cell lines show a comparable expression of β-actin (390 bp amplificate). PRDI-BF1 RNA expression was also examined for the two osteosarcoma cell lines Saos-2 and U2OS ( FIG. 7). For the U2OS cell line, the expression of PRDI-BF1 RNA was already proven by Keller and Maniatis (1991). U2OS express significantly more PRDI-BF1 RNA than Saos-2. Both cell lines show a lower expression compared to the mm cell line L363, which served here as a positive control ( FIG. 7). EL-4 acted as a negative control ( Fig. 7)

(3.2) Erkennung von PRDI-BF1-überexprimierenden MM-Zellen durch PRDI- BF1 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL(3.2) Recognition of PRDI-BF1 Overexpressing MM Cells by PRDI BF1 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL

Um zu prüfen, ob die MM-Zellinien aufgrund ihrer starken Expression von PRDI-BF1 suszeptibel sind für die Erkennung durch PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifische ZTL, wurden die A2-positiven mm-Zellinien U266, OPM-2 und MC-CAR und die A2-negative MM-Zellinie NCI-H929 (Daten zur A2.1-Expression in der Durchflußzytometrie nicht gezeigt) im Vergleich mit der A2-positiven Osteosarkom- Zellinie Saos-2 als Zielzellen für die ZTL CD8 × A2Kb 377, CD8 × A2Kb 402p und CD8 × A2Kb 401 im Zytotoxizitätstest eingesetzt (Fig. 8). Die ZTL Linien zeigten eine selektive und effiziente Lyse der A2+ MM-Zellinien, die A2- NCI-H929 Zellen wurden von keiner ZTL Linie lysiert (Fig. 8). A2+ Saos-2 Zellen, die eine deutlich geringere PRDI-BF1-Expression in der RT-PCR zeigten (Fig. 7) wurden entsprechend von den PRDI-BF1-spezifischen ZTL nicht erkannt (Fig. 8). Als Positivkontrolle diente die ZTL Linie CD8 allo A2. Sowohl die mm-Zellinien U266, OPM-2 und MC-CAR als auch Saos-2-Zellen wurden durch die allo-A2.1-reaktiven Effektorzellen lysiert, nicht jedoch die A2- Zellinie NCI-H929 (Fig. 8). Als Negativkontrolle fungierte die A2.1-restringierte ZTL-Linie CD8 × A2Kb FluM1, die keine der getesteten Zielzellen lysierte (Fig. 8). Die Ergebnisse deuten auf die endogene Prozessierung und A2.1-Präsentation der PRDI- BF1 Peptidantigene 401-410, 402-410 und 377-386 hin. Die spezifische Lyse von mm- Zellinien durch PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386-spezifische ZTL und die fehlende Suszeptibilität von getesteten Tumorentitäten unterschiedlichen Ursprungs wie z. B. Mammakarzinomen, Kolorektal-Karzinomen und Hepatoblastomen gegenüber diesen ZTL (Daten nicht gezeigt) weisen darauf hin, dass PRDI-BF1-Peptidantigene als MM-assoziierte Tumorantigene dienen können. In order to check whether the MM cell lines are susceptible to recognition by PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386- specific ZTL due to their strong expression of PRDI-BF1, the A2-positive mm- Cell lines U266, OPM-2 and MC-CAR and the A2-negative MM cell line NCI-H929 (data on A2.1 expression not shown in flow cytometry) in comparison with the A2-positive osteosarcoma cell line Saos-2 as target cells used for the ZTL CD8 × A2K b 377, CD8 × A2K b 402p and CD8 × A2K b 401 in the cytotoxicity test ( FIG. 8). The ZTL lines showed a selective and efficient lysis of the A2 + MM cell lines, the A2 - NCI-H929 cells were not lysed by any ZTL line ( FIG. 8). A2 + Saos-2 cells which showed a significantly lower PRDI-BF1 expression in the RT-PCR ( FIG. 7) were accordingly not recognized by the PRDI-BF1-specific CTL ( FIG. 8). The ZTL line CD8 allo A2 served as a positive control. Both the cell lines U266 mm, OPM-2 and MC-CAR as well as Saos-2 cells were lysed by the allo-A2.1-reactive effector cells, but not the A2 - Cell Line NCI-H929 (Fig. 8). The A2.1-restricted CDT line CD8 × A2K b FluM1, which did not lyse any of the target cells tested, acted as a negative control ( FIG. 8). The results indicate the endogenous processing and A2.1 presentation of the PRDI-BF1 peptide antigens 401-410, 402-410 and 377-386. The specific lysis of mm cell lines by PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386-specific ZTL and the lack of susceptibility of tested tumor entities of different origins such as e.g. B. Breast cancer, colorectal cancer and hepatoblastoma compared to these CTLs (data not shown) indicate that PRDI-BF1 peptide antigens can serve as MM-associated tumor antigens.

Beispiel 4Example 4 Verwendung von PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischen ZTL zur selektiven Erkennung von MM-ZellenUse of PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386- specific ZTL for the selective detection of MM cells (4.1) PRDI-BF1-Expression von nicht-transformierten Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs(4.1) PRDI-BF1 expression from non-transformed cells lymphohematopoietic origin

Für eine potentielle, PRDI-BF1-spezifische ZTL-vermittelte Immuntherapie ist es wünschenswert, daß Normalzellen nicht lysiert werden. PRDI-BF1 RNA wird in MM- Zellen überexprimiert (siehe Beispiel 3, (3.1)) und wird bekanntermaßen auch von einigen Normalzellen, darunter auch lymphohämopoetischen Zellen, exprimiert. In Fig. 9 ist die PRDI-BF1 RNA-Expression für ruhende Monozyten, T-Zellen und B- Zellen dargestellt. Diese lymphohämopoetischen Zellen weisen im Vergleich zu den beiden mm-Zellinien L363 und NCI-H929 eine wesentlich geringere, aber immer noch substantielle Menge an PRDI-BF1 RNA auf. EL-4 Zellen fungierten als Negativkontrolle. For potential, PRDI-BF1-specific CTL-mediated immunotherapy, it is desirable that normal cells not be lysed. PRDI-BF1 RNA is overexpressed in MM cells (see Example 3, (3.1)) and is known to be also expressed by some normal cells, including lymphohematopoietic cells. FIG. 9 shows the PRDI-BF1 RNA expression for resting monocytes, T cells and B cells. In comparison to the two mm cell lines L363 and NCI-H929, these lymphohemopoetic cells have a significantly lower, but still substantial amount of PRDI-BF1 RNA. EL-4 cells acted as a negative control.

(4.2) Zytolytische Reaktivität PRDI-BF1 401-410-, 402-410- und 377-386- spezifischer ZTL gegenüber nicht-transformierten Zellen lymphohämopoetischen Ursprungs(4.2) Cytolytic reactivity PRDI-BF1 401-410-, 402-410- and 377-386- specific ZTL compared to non-transformed cells lymphohematopoietic origin

Nicht transformierte lymphohämopoetische Zellen wurden im folgenden als Zielzellen für A2.1-restringierte ZTL mit Spezifität für PRDI-BF1 401-410, 402-410 und 377-386 eingesetzt. Ruhende B-Zellen und T-Zellen wurden von keiner der PRDI-BF1- spezifischen ZTL erkannt (Fig. 10 und 11A-C). ZTL-Lyse konnte durch Zugabe von Peptid PRDI-BF1 402-410 für CD8 × A2Kb 402p und CD8 × A2Kb 401 und von PRDI- BF1 377-386 für CD8 × A2Kb 377 rekonstituiert werden (Fig. 10 u. 11A-C), was eine hinreichende A2.1-Expression der Zielzellen bestätigte. A2.1-Expression wurde ebenfalls mit der allo-A2.1-reaktiven ZTL Linie CD8 allo A2 bestätigt, die eine effiziente Lyse von B-Zellen und T-Zellen zeigten (Fig. 10 u. 11 E). Durch FluM1-spezifische ZTL erfolgte keine Erkennung (Fig. 10 u. 11D). Non-transformed lymphohemopoietic cells were subsequently used as target cells for A2.1-restricted CTLs with specificity for PRDI-BF1 401-410, 402-410 and 377-386. Dormant B cells and T cells were not recognized by any of the PRDI-BF1-specific CTLs ( Figures 10 and 11A-C). ZTL lysis could be reconstituted by adding peptide PRDI-BF1 402-410 for CD8 × A2K b 402p and CD8 × A2K b 401 and PRDI-BF1 377-386 for CD8 × A2K b 377 (FIGS . 10 and 11A- C), which confirmed sufficient A2.1 expression of the target cells. A2.1 expression was also confirmed with the allo-A2.1-reactive ZTL line CD8 allo A2, which showed an efficient lysis of B cells and T cells ( FIGS. 10 and 11 E). No detection was carried out by FluM1-specific ZTL ( FIGS. 10 and 11D).

Da neuere Untersuchungen zeigten, daß PRDI-BF1 auch in die Differenzierung myeloider Zellen involviert ist (Chang et al., 2000), wurden Monozyten zu Dendritischen Zellen (DZ) in vitro differenziert und gleichermaßen als Zielzellen für PRDI-BF1 402- 410- und 377-386-spezifische ZTL eingesetzt. Für die ZTL CD8 × A2Kb 402p und CD8 × A2Kb 377 war keine lytische Aktivität gegen DZ zu beobachten (Fig. 12A u. B). Beladung der DZ mit dem entsprechenden Peptid führte zur Rekonstitution der Lyse, was für eine hinreichende Expression von A2.1 Molekülen sprach (Fig. 12A u. B). ZTL CD8 allo A2 diente auch hier als Positivkontrolle und zeigte eine effiziente Lyse der DZ (Fig. 12D). Von seiten der ZTL CD8 × A2Kb Flu M1 fand sich keine lytische Aktivität (Fig. 12C). Zusammenfassend deuten die Ergebnisse daraufhin, daß Normalzellen trotz substantieller Expression von PRDI-BF1-RNA für eine PRDI-BF1-spezifische ZTL-vermittelte Lyse nicht suszeptibel sind. Since recent studies have shown that PRDI-BF1 is also involved in the differentiation of myeloid cells (Chang et al., 2000), monocytes were differentiated into dendritic cells (DZ) in vitro and were also used as target cells for PRDI-BF1 402-410- and 377-386-specific ZTL used. No lytic activity against DZ was observed for the ZTL CD8 × A2K b 402p and CD8 × A2K b 377 ( FIGS. 12A and B). Loading the DC with the corresponding peptide led to the reconstitution of the lysis, which indicated sufficient expression of A2.1 molecules (FIGS . 12A and B). ZTL CD8 allo A2 also served as a positive control and showed efficient lysis of the DC ( Fig. 12D). No lytic activity was found on the part of the ZTL CD8 × A2K b Flu M1 ( FIG. 12C). In summary, the results indicate that, despite substantial expression of PRDI-BF1-RNA, normal cells are not susceptible to PRDI-BF1-specific CTL-mediated lysis.

Beispiel 5Example 5 Herstellung von A2.1-restringierten T-Zellrezeptoren, die spezifisch für ein erfindungsgemäßes PRDI-BF1-Oligopeptid mit einer in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen sindProduction of A2.1-restricted T cell receptors that are specific for a PRDI-BF1 oligopeptide according to the invention with a in the Sequence listing 1 to 30 amino acid sequences are shown

A2.1-Tg Mäuse werden mit einem erfindungsgemäßen PRDI-BF1 Oligopeptid, das eine der in den Sequenzprotokollen 1-30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, immunisiert. Nach 10 Tagen wird die Milz entnommen. Die Milzzellen werden mit zuvor hergestellten, A2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Oligopeptid beladen sind, in vitro stimuliert. Die Herstellung dieser A2.1-positiven Antigen-präsentierenden Zellen erfolgte mit den im Stand der Technik bekannten und dem Fachmann geläufigen Techniken. Nach mehrwöchiger Kultur werden die T-Zellen auf ihre Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1- Restriktion überprüft. Nach erfolgreicher Testung wird die T-Zellinie kloniert. Die resultierenden T-Zellklone werden erneut hinsichtlich Peptid- und Tumorerkennung, Peptidspezifität und A2.1-Restriktion getestet. A2.1-Tg mice are treated with a PRDI-BF1 oligopeptide according to the invention, the one of the amino acid sequences shown in the sequence listing 1-30, immunized. The spleen is removed after 10 days. The spleen cells are covered with previously prepared, A2.1-positive antigen-presenting cells, which with the oligopeptide according to the invention are loaded, stimulated in vitro. The making of this A2.1-positive antigen-presenting cells were made using the ones in the prior art known techniques known to those skilled in the art. After several weeks of culture the T cells for their peptide and tumor recognition, peptide specificity and A2.1- Restriction checked. After successful testing, the T cell line is cloned. The resulting T cell clones are again used for peptide and tumor detection, Peptide specificity and A2.1 restriction tested.

Von einem T-Zelklon mit positivem Testergebnis wird die Gesamt-mRNA präpariert. Mittels RT-PCR werden die T-Zellrezeptor α- und β-Ketten amplifiziert. Die jeweiligen Ketten werden zunächst in bakterielle Plasmide kloniert und sequenziert. Die Ketten werden partiell humanisiert, indem die konstanten Maus-Regionen durch die homologen humanen Regionen ersetzt werden. Anschließend erfolgt die Klonierung der resultierenden Konstrukte in geeignete retrovirale Vektoren. The total mRNA is prepared from a T cell clone with a positive test result. The T cell receptor α and β chains are amplified by means of RT-PCR. The respective Chains are first cloned into bacterial plasmids and sequenced. The chains are partially humanized by the constant mouse regions by the homologous human regions. The cloning is then carried out resulting constructs into suitable retroviral vectors.

Periphere Blut-Lymphozyten eines A2.1-positiven Krebspatienten, dessen Tumorzellen PRDI-BF1-Protein überexprimieren, werden entnommen, mit den Vektoren für α- und β-Kette des T-Zellrezeptors in vitro transduziert und die Genexpression auf Proteinebene untersucht. T-Zellrezeptor-exprimierende T-Lymphozyten werden auf ihre Fähigkeit zur Lyse von Tumorzellen analysiert. Nach erfolgreicher Testung werden die genmodifizierten Lymphozyten in den Patienten transfundiert und sollen dort die Abtötung der entarteten Zellen und damit die Heilung bewirken. Peripheral blood lymphocytes of an A2.1-positive cancer patient, whose tumor cells Overexpressing PRDI-BF1 protein are removed using the vectors for α- and β chain of the T cell receptor transduced in vitro and gene expression at the protein level examined. T cell receptor expressing T lymphocytes are assessed for their ability to Lysis of tumor cells analyzed. After successful testing, the gene-modified lymphocytes are transfused in the patient and are said to be there Killing the degenerated cells and thus causing healing.

Alternativ werden PRDI-BF1-spezifische α/β-T-Zellrezeptorketten in Vektoren kloniert, die die Fähigkeit besitzen, in vivo Patienten-T-Zellen zu infizieren. Diese infizierten T- Zellen exprimieren PRDI-BF1-spezifische T-Zellrezeptoren und sind damit in der Lage, PRDI-BF1-überexprimierende Tumorzellen der Patienten zu erkennen und abzutöten. Literaturverzeichnis Chang D. H., Angelin-Duclos C., Calame K.: Blimp-1: trigger for differentiation of myeloid lineage. Nat. immunol. 1: 169; 2000
Irwin M. J., Heath W. R., Sherman L. A. (1989). Species-restricted interactions between CD8 and the α3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response. J. Exp. Med 179, 1091-1101.
Jonuleit H., Kühn U., Müller G., Steinbrink K., Paragnik L., Schmitt E., Knop J., Enk A. H. (1997). Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142.
Kelter A. D., Maniatis T.: Identification and characterization of a novel repressor of β- interferon gene expression. Genes & Dev. 5: 868, 1991
Lin Y., Wong K., Calame K.: Repression of c-myc transcription by Blimp-1, an inducer of terminal B cell differentiation. Science 276: 596, 1997
Lustgarten J., Theobald M., Labadie C., LaFace D., Peterson P., Disis M. L., Cheever M. A., Sherman L. A (1997). Identifleation of Her-2/neu CTL epitopes using double transgenic mice expressing HLA-A2.1 and human CD8. Human Immunol. 52, 109-118.
Meziere, C., Viguier M., Dumortier H., Lo-Man R., Leclerc C., Guillet J:G., Briand J. P., Muller S. (1997). In vivo T helper cell response to retro-inverso peptidomimetics. J. Immunol. 159 (7), 3230-3237.
Parker K. C., Bednarek M. A., Coligan J. E. (1994). Scheme for ranking potential HLA- A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152, 163-175.
Satter R. D., Cresswell P. (1986). Impaired assembly and transport of HLA-A and -B antigens in a mutant TxB cell hybrid. EMBO J. S. 943-949.
Theobald M., Biggs J., Dittmer D., Levine A. J., Sherman L. A. (1995). Targeting p53 as a general tumor antigen. Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 11993-11997.
Theobald M., Ruppert T., Kuckelkorn U., Hernandez J., Häußler A., Antunes Ferreira E., Liewer U., Biggs J., Levine A. J., Huber C., Koszinowski U. H., Kloetzel P.-M., Sherman L. A. (1998). The sequence alteration associated with a mutational hotspot in p53 protects cells from lysis by cytotoxic T lymphocytes specific for a flanking peptide epitope. J. Exp. Med 188, 1017-1028.
Tuner C. A., Mack D. H., Davis M. M.: Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells. Cell 77: 297, 1994
Wölfel T., Van Pel A., Brichard V., Schneider J., Seliger B., Meyer zum Büschenfelde K. H., Boon T. (1994). Two tyrosinase nonapeptides recognized on HLA-A2 melanomas by autologous cytolytic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 24, 759-764. Tabelle 1 Korrelation zwischen den in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten PRDI-BF 1 Oligopeptiden und Teilsequenzen des PRDI- BF1-Proteins mit der Gen Bank Accession Nummer A39564

SEQUENZPROTOKOLL



















Alternatively, PRDI-BF1 specific α / β T cell receptor chains are cloned into vectors that have the ability to infect patient T cells in vivo. These infected T cells express PRDI-BF1-specific T cell receptors and are therefore able to recognize and kill PRDI-BF1-overexpressing tumor cells of the patients. Bibliography Chang DH, Angelin-Duclos C., Calame K .: Blimp-1: trigger for differentiation of myeloid lineage. Nat. Immunol. 1: 169; 2000
Irwin MJ, Heath WR, Sherman LA (1989). Species-restricted interactions between CD8 and the α3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response. J. Exp. Med 179, 1091-1101.
Jonuleit H., Kühn U., Müller G., Steinbrink K., Paragnik L., Schmitt E., Knop J., Enk AH (1997). Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142.
Kelter AD, Maniatis T .: Identification and characterization of a novel repressor of β- interferon gene expression. Genes & Dev. 5: 868, 1991
Lin Y., Wong K., Calame K .: Repression of c-myc transcription by Blimp-1, an inducer of terminal B cell differentiation. Science 276: 596, 1997
Lustgarten J., Theobald M., Labadie C., LaFace D., Peterson P., Disis ML, Cheever MA, Sherman L. A (1997). Identifleation of Her-2 / neu CTL epitopes using double transgenic mice expressing HLA-A2.1 and human CD8. Human immunol. 52, 109-118.
Meziere, C., Viguier M., Dumortier H., Lo-Man R., Leclerc C., Guillet J: G., Briand JP, Muller S. (1997). In vivo T helper cell response to retro-inverso peptidomimetics. J. Immunol. 159 (7), 3230-3237.
Parker KC, Bednarek MA, Coligan JE (1994). Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152, 163-175.
Satter RD, Cresswell P. (1986). Impaired assembly and transport of HLA-A and -B antigens in a mutant TxB cell hybrid. EMBO JS 943-949.
Theobald M., Biggs J., Dittmer D., Levine AJ, Sherman LA (1995). Targeting p53 as a general tumor antigen. Proc. Natl. Acad Sci. USA 92, 11993-11997.
Theobald M., Ruppert T., Kuckelkorn U., Hernandez J., Häußler A., Antunes Ferreira E., Liewer U., Biggs J., Levine AJ, Huber C., Koszinowski UH, Kloetzel P.-M., Sherman LA (1998). The sequence alteration associated with a mutational hotspot in p53 protects cells from lysis by cytotoxic T lymphocytes specific for a flanking peptide epitope. J. Exp. Med 188, 1017-1028.
Tuner CA, Mack DH, Davis MM: Blimp-1, a novel zinc finger-containing protein that can drive the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin-secreting cells. Cell 77: 297, 1994
Wölfel T., Van Pel A., Brichard V., Schneider J., Seliger B., Meyer zum Büschenfelde KH, Boon T. (1994). Two tyrosinase nonapeptides recognized on HLA-A2 melanomas by autologous cytolytic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 24, 759-764. Table 1 Correlation between the PRDI-BF 1 oligopeptides shown in sequence protocols 1 to 30 and partial sequences of the PRDI-BF1 protein with the Gen Bank Accession number A39564

SEQUENCE LISTING



















Claims (24)

1. Tumorassoziiertes Oligopeptid, das von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten (ZTL) als Peptidantigen erkannt wird und eine ZTL-induzierte Lyse und/oder Apoptose von Tumorzellen, insbesondere Multiple-Myelom-Zellen herbeiführt,
dadurch gekennzeichnet, daß das Oligopeptid 1. eine der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweist, die einer Teilsequenz des humanen PRDI-BF1- Proteins entspricht, oder 2. eine durch Aminosäure-Substitution, -Deletion, -Insertion, -Addition, - Inversion und/oder durch chemische oder physikalische Modifikation einer oder mehrerer Aminosäuren von einer dieser Aminosäuresequenzen ableitbare Aminosäuresequenz aufweist, die ein funktionelles Äquivalent zu einer der in den Sequenzprotokollen 1 bis 30 angeführten Aminosäuresequenzen darstellt, und daß es a) ein Epitop für CD8-positive ZTL darstellt
und
b) dazu geeignet ist; eine auf humanes Leukozyten-Antigen der Molekülgruppe "MHC Klasse I", Allelvariante A2 (kurz: A2) eingeschränkte (restringierte) Immunantwort von CD8-positiven ZTL gegen Tumorzellen, insbesondere Multiple- Myelom-Zellen zu induzieren.
1. tumor-associated oligopeptide which is recognized as a peptide antigen by CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes (ZTL) and which causes ZTL-induced lysis and / or apoptosis of tumor cells, in particular multiple myeloma cells,
characterized in that the oligopeptide 1. has one of the amino acid sequences shown in the sequence listing 1 to 30, which corresponds to a partial sequence of the human PRDI-BF1 protein, or 2. has an amino acid sequence which can be derived from one of these amino acid sequences by amino acid substitution, deletion, insertion, addition, inversion and / or by chemical or physical modification of one or more amino acids and which has a functional equivalent to one of those in the sequence listing 1 to 30 amino acid sequences listed, and that it a) represents an epitope for CD8-positive ZTL
and
b) is suitable for this; to induce a restricted (restricted) immune response of CD8-positive CTL against tumor cells, in particular multiple myeloma cells, to human leukocyte antigen of the molecular group "MHC class I", allele variant A2 (short: A2).
2. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. 2. tumor-associated oligopeptide according to claim 1, characterized in that it is the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO 1 having. 3. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. 3. tumor-associated oligopeptide according to claim 1, characterized in that that it is the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO 2 having. 4. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 3 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. 4. tumor-associated oligopeptide according to claim 1, characterized in that that it is the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO 3 having. 5. Tumorassoziiertes Oligopeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die in dem Sequenzprotokoll SEQ ID NO 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. 5. tumor-associated oligopeptide according to claim 1, characterized in that it is the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO 4 having. 6. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es einem Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 entspricht, bei dem anstelle der -CO-NH-Peptidbindungen Nil-CO-Bindungen oder andere Nichtpeptidbindungen ausgebildet sind. 6. Retro-inverse peptide or pseudopeptide, characterized in that it is one Oligopeptide according to one of claims 1 to 5, in which instead of -CO-NH peptide bonds Nile-CO bonds or other non-peptide bonds are trained. 7. Fusionsprotein welches aus einem Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, einer schweren Kette des HLA-Moleküls und einem flexiblem Linker besteht und derart konstruiert ist, daß das Oligopeptid geeignet und befähigt ist, die Peptid- Bindungsfurche des HLA-Moleküls zu besetzen. 7. fusion protein which consists of an oligopeptide according to any one of claims 1 to 6, a heavy chain of the HLA molecule and a flexible linker and is constructed such that the oligopeptide is capable and capable of Occupy the furrow of the HLA molecule. 8. Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz, die mindestens für ein Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert. 8. Polynucleotide with a nucleotide sequence which is at least for one oligopeptide encoded one of claims 1 to 7. 9. Verwendung eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 8 zur Herstellung von Diagnostika und/oder Therapeutika und/oder Prophylaktika für den Nachweis und/oder die Beeinflussung und/oder Generierung und/oder Expandierung und/oder Steuerung des Aktivierungs- und Funktionszustands von T-Zellen, insbesondere CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten. 9. Use of an oligopeptide according to one of claims 1 to 5 and / or one retro-inverse peptide or pseudopeptide according to claim 6 and / or one Fusion protein according to claim 7 and / or a polynucleotide according to claim 8 for Manufacture of diagnostic and / or therapeutic and / or prophylactic for the Evidence and / or influencing and / or generation and / or expansion and / or control of the activation and functional state of T cells, especially CD8 positive cytotoxic T lymphocytes. 10. Reagenz zur in-vivo- oder in-vitro-Aktivierung von T-Zellen, insbesondere CD8- positiven zytotoxischen T-Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagenz unter Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 und/oder eines Polynukleotids nach Anspruch 8 hergestellt ist. 10. Reagent for the in vivo or in vitro activation of T cells, in particular CD8 positive cytotoxic T lymphocytes, characterized in that the reagent using at least one oligopeptide according to one of the Claims 1 to 5 and / or a retro-inverse peptide or pseudopeptide according to Claim 6 and / or a fusion protein according to Claim 7 and / or one Polynucleotide according to claim 8 is produced. 11. Rekombinantes DNS- oder RNS-Vektormolekül, das mindestens ein oder mehrere Polynukleotid(e) nach Anspruch 8 enthält und das in Zellen autologen, allogenen, xenogenen oder mikrobiologischen Ursprungs exprimierbar ist. 11. Recombinant DNA or RNA vector molecule that has at least one or more Contains polynucleotide (s) according to claim 8 and that in cells autologous, allogeneic, xenogenic or microbiological origin is expressible. 12. Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 8 oder ein Vektormolekül gemäß Anspruch 11 enthält. 12. Host cell which according to a polynucleotide according to claim 8 or a vector molecule Claim 11 contains. 13. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 für die Herstellung polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper gegen das/die betreffende(n) Oligopeptide(e) oder gegen einen Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2. 13. Use of at least one oligopeptide according to one of claims 1 to 5 and / or a retro-inverse peptide or pseudopeptide according to claim 6 and / or a fusion protein according to claim 7 for the production of polyclonal, monoclonal or recombinant antibody against the relevant (s) Oligopeptide (s) or against a complex of the concerned Oligopeptide (s) and HLA-A2. 14. Antikörper, der spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einem retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 7 oder mit einem Komplex aus dem/den betreffenden Oligopeptid(en) und HLA-A2 reagiert. 14. Antibody specific with at least one oligopeptide according to one of the Claims 1 to 5 and / or a retro-inverse peptide or pseudopeptide according to Claim 6 and / or a fusion protein according to claim 7 or with one Complex of the relevant oligopeptide (s) and HLA-A2 reacts. 15. Oligopeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder Fusionsprotein nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht-kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC-Klasse I-Dimere oder pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt. 15. Oligopeptide according to one of claims 1 to 5 and / or fusion protein Claim 7, characterized in that it is covalent or non-covalent to MHC Class I tetramers or MHC class I dimers or pharmaceutically acceptable ones Carrier or other structures are bound. 16. Retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es kovalent oder nicht-kovalent an MHC Klasse I-Tetramere oder MHC-Klasse I-Dimere oder pharmazeutisch geeignete Träger oder sonstige Strukturen gebunden vorliegt. 16. Retro-inverse peptide or pseudopeptide according to claim 6, characterized characterized in that it is covalent or non-covalent to MHC class I tetramers or MHC class I dimers or pharmaceutically acceptable carriers or others Structures are bound. 17. Verwendung wenigstens eines Oligopeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder eines retro-inversen Peptids oder Pseudopeptids gemäß Anspruch 6 und/oder eines Fusionsproteins nach Anspruch 7 oder eines Polynukleotids gemäß Anspruch 8 zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler oder rekombinanter A2- restringierter T-Zellrezeptoren oder dazu funktionell äquivalenten Molekülen gegen das/die betreffenden(n) Oligopeptid(e). 17. Use of at least one oligopeptide according to one of claims 1 to 5 and / or a retro-inverse peptide or pseudopeptide according to claim 6 and / or a fusion protein according to claim 7 or a polynucleotide according to Claim 8 for the production of polyclonal or monoclonal or recombinant A2 restricted T cell receptors or molecules that are functionally equivalent to them the oligopeptide (s) in question. 18. T-Zellrezeptor oder dazu funktionell äquivalentes Molekül, der/das spezifisch mit wenigstens einem Oligopeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 und/oder einem retro-inversen Peptid oder Pseudopeptid gemäß Anspruch 6 und/oder einem Fusionsprotein nach Anspruch 7 reagiert. 18. T cell receptor or molecule that is functionally equivalent to it, that specifically with at least one oligopeptide according to one of claims 1 to 5 and / or one retro-inverse peptide or pseudopeptide according to claim 6 and / or one Fusion protein according to claim 7 reacts. 19. Polynukleotid, das für einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 18 kodiert. 19. A polynucleotide encoding a T cell receptor according to claim 18. 20. Expressionsvektor, der die Fähigkeit besitzt, einen T-Zellrezeptor gemäß Anspruch 18 zu exprimieren. 20. Expression vector which has the ability to a T cell receptor according to claim 18 to express. 21. Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 19 oder einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 20 enthält. 21. A host cell which is a polynucleotide according to claim 19 or an expression vector according to claim 20. 22. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von PRDI-BF1- Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen kombiniert wird. 22. Process for the manufacture of a medicament for the treatment of PRDI-BF1- Protein-associated diseases, characterized in that at least one Oligopeptide and / or at least one retro-inverse peptide or pseudopeptide and / or at least one fusion protein and / or at least one polynucleotide and / or at least one T cell receptor and / or at least one vector molecule and / or at least one host cell and / or at least one antibody after one the aforementioned claims together with suitable additives and auxiliary substances is combined. 23. Arzneimittel zur Behandlung von PRDI-BF1-Protein assoziierten Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Oligopeptid und/oder mindestens ein retro-inverses Peptid oder Pseudopeptid und/oder mindestens ein Fusionsprotein und/oder mindestens ein Polynukleotid und/oder mindestens ein T-Zellrezeptor und/oder mindestens ein Vektormolekül und/oder mindestens eine Wirtszelle und/oder mindestens ein Antikörper nach einem der vorgenannten Ansprüche, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen, enthält. 23. Medicines for the treatment of diseases associated with PRDI-BF1 protein. characterized in that it contains at least one oligopeptide and / or at least one retro-inverse peptide or pseudopeptide and / or at least one fusion protein and / or at least one polynucleotide and / or at least one T cell receptor and / or at least one vector molecule and / or at least one host cell and / or at least one antibody according to one of the preceding claims, optionally together with suitable additives and auxiliaries. 24. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 23 zur Behandlung von PRDI-BF1- Proteinassoziierten Erkrankungen. 24. Use of a medicament according to claim 23 for the treatment of PRDI-BF1- Protein Associated Diseases.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US8075895B2 (en) * 2009-09-22 2011-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Identification of antigenic peptides from multiple myeloma cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5831008A (en) * 1994-08-18 1998-11-03 La Jolla Cancer Research Foundation Retinoblastoma protein-interacting zinc finger proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEM. ABSTR. 116, 52599 (1992) *

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