DE10146632A1

DE10146632A1 - New peptide compounds containing upto 6 aminoacid residues, are potent and specific thrombin inhibitors used for treating and diagnosing diseases associated with thrombin

Info

Publication number: DE10146632A1
Application number: DE2001146632
Authority: DE
Inventors: Marcel THÜRK
Original assignee: Novel Science International GmbH
Current assignee: Novel Science International GmbH
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2005-02-03

Abstract

Peptide compounds (I), containing upto 6 aminoacid residues, are new. Peptide compounds of formula Y 1>-(NH-X 1>-CO)-(NH-X 2>-CO)-(NH-X 3>-CO)-(NH-X 4>-CO)-(NH-X 5>-CO)-(NH-X 6>-CO)-Y 2>(I), their derivatives truncated by at least one aminoacid at the C- and/or N-terminal and salts, are new. Y 1H, Me, acetyl or a group having a 1-32C chain as backbone; NH-X 1-CO : basic aminoacid residue, preferably Arg, Lys or Orn; NH-X 2-CO : cyclic, non-polar aminoacid residue, preferably cyclohexylalanine (Cha) or cyclohexylglycine; NH-X 3-CO : any aminoacid residue, preferably Nle, Leu, Ile, Cha, cyclohexylglycine, Pro, Asp or Glu; NH-X 4-CO : cyclic aminoacid residue, preferably Cha, cyclohexylglycine, Tyr or Phe; NH-X 5-CO : aminoacid residue with a polar side-chain, preferably Gln, Orn, Glu, Arg, Lys, Asn or Asp, or is replaced by a direct bond; NH-X 6-CO : any aminoacid residue, preferably Arg, or is replaced by a direct bond; Y 2OH (C-terminal carboxy group), NH 2(C-terminal amide group), H (C-terminal aldehyde group), 7-amido-4-methyl-coumarin (bonded via the carboxy group), p-nitroanilide (bonded via the carboxy group) or the residue of a compound with a 1-35 atom chain; all aminoacid residues are in L- or D-isomer form. In alternative definitions of the substituents of (I), Y 1and Y 2are as above and: (a) NH-X 1-CO : any aminoacid residue, preferably Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Asp, Glu, Ser, Thr, Tyr, Arg, Lys or Orn, or is replaced by a direct bond; NH-X 2-CO : any aminoacid residue, preferably Ala, Val, Leu, Ile, Nle, Ser, Thr, Tyr, Pro, citrulline, Arg, Lys, Orn, Cha or cyclohexylglycine, or is replaced by a direct bond; NH-X 3-CO : any aminoacid residue, preferably Cha or cyclohexylglycine; NH-X 4-CO : small aminoacid residue, preferably Pro, or is replaced by a direct bond; NH-X 5-CO : any aminoacid residue, preferably Tyr or Phe, or is replaced by a direct bond; NH-X 6-CO : basic aminoacid residue, preferably Arg, Lys or Orn; (b) NH-X 1-CO : as in (a); NH-X 2-CO : any aminoacid residue, preferably Ala, Val, Leu, Ile, Nle, Ser, Thr, Tyr, Pro, citrulline, Arg, Lys, Orn, His, Glu, Asp, Trp, Cha or cyclohexylglycine, or is replaced by a direct bond; X 3-X 6as in (a); (c) X 1-X 3as in (b); NH-X 4-CO : small aminoacid residue, preferably Pro or azetidine-2-carboxylic acid; NH-X 5-CO : aromatic aminoacid residue, preferably Tyr or Phe; NH-X 6-CO : basic aminoacid residue, preferably Arg, Lys, Orn or homoarginine; (d) NH-X 1-CO : any aminoacid residue, preferably Val, Ala, Leu, Ile, Nle, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, Arg, Lys, Orn, Phe, dichlorophenylalanine, tetrahydronorharman-3-carboxylic acid, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid, 4-phenyl-piperidine-4-carboxylic acid, thienylalanine, phenylglycine or p-nitirophenylalanine, or is replaced by a direct bond; X 2as in (b); X 3as in (a), and X 4-X 6as in (c); all aminoacid residues are in L- or D-isomer form. ACTIVITY : Anticoagulant; Thrombolytic; Vasotropic; Antiarteriosclerotic; Antiinflammatory; Cytostatic; Neuroprotective. MECHANISM OF ACTION : Thrombin inhibitor. N-Acetyl-L-Phg-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amide (Ia) inhibited thrombin by 95% at a concentration of 250 nM.

Description

Diese Erfindung betrifft biologische Wirkstoffe, die mit Thrombin interagieren und dieses hemmen. Die Wirkstoffe sind als Antikoagulationsmittel für Menschen und Tiere nützlich. Insbesondere erstreckt sich diese Erfindung auf kleine peptidische Moleküle der Länge 3–6 Aminosäuren der allgemeinen Formel (I) Y¹-(NH-X¹-C=O)-(NH-X²-C=O)-(NH-X³-C=O)-(NH-X⁴-C=O)-(NH-X⁵-C=O)-(NH-X⁶-C=O)-Y² (I)in der Y¹, Y² und X^1–6 die in der Beschreibung genannten Bedeutungen haben, oder N- oder C-terminal verkürzte Varianten von Formel (I) mit hoher antithrombischer Wirkung. Die Erfindung betrifft auch Zusammenstellungen und Kombinationen mit diesen Stoffen für therapeutische, prophylaktische und diagnostische Zwecke.This invention relates to biological agents that interact with and inhibit thrombin. The active ingredients are useful as anticoagulants for humans and animals. In particular, this invention extends to small peptidic molecules of length 3-6 amino acids of the general formula (I) Y ¹ - (NH-X ¹ -C =O) - (NH-X ² -C =O) - (NH-X ³ -C =O) - (NH-X ⁴ -C = O) - (NH ³ ) X ⁵ -C = O) - (NH-X ⁶ -C = O) -Y ² (I) in which Y ¹ , Y ² and X ^{1-6 have} the meanings given in the description, or N- or C-terminally shortened variants of formula (I) having a high antithrombotic activity. The invention also relates to compositions and combinations with these substances for therapeutic, prophylactic and diagnostic purposes.

Akute Gefäßerkrankungen, wie der myokordiale Infarkt, der Schlaganfall, die Lungenembolie, die tiefe Venenthrombose oder die periphere Gefäßverstopfung und andere Thrombosen des Blutsystems, bilden eine wesentliche gesundheitliche Gefahrenquelle. Derartige Erkrankungen werden durch vollständige oder teilweise Verstopfung des Blutgefäßes durch einen Pfropfen, der Fibrin und Blutplättchen enthält, hervorgerufen.acute vascular diseases, such as myocardial infarction, stroke, pulmonary embolism, deep vein thrombosis or peripheral vascular obstruction and other thrombosis of the blood system, constitute a significant health hazard. Such disorders are caused by complete or partial constipation of the blood vessel a plug containing fibrin and platelets.

Gegenwärtige Methoden der Behandlung und Prophylaxe solcher Thromboseerkrankungen umfassen Therapeutika, die auf zwei verschiedenen Wegen wirken. Der erste Typ der Therapeutika verhindert die Thrombin-Aktivität oder Thrombose-Bildung und damit die Bildung des Pfropfens. Diese Medikamente verhindern auch die Entwicklung von Blutplättchen und deren Aggregation. Die zweite Kategorie von Medikamenten beschleunigt die Thrombolyse und löst den Pfropfen auf, beseitigt damit diesen aus dem Blutgefäß und hebt die Blockade des Blutflusses auf.Current methods the treatment and prophylaxis of such thrombosis diseases Therapeutics that work in two different ways. The first Type of therapeutics prevents thrombin activity or thrombosis formation and thus the formation of the plug. Prevent these medications also the development of platelets and their aggregation. The second category of drugs is accelerating the thrombolysis and dissolves The plug on, thus eliminating this from the blood vessel and lifts the blockage of blood flow.

Heparin und Cumarin, Präparate des ersten Typs, werden in großem Maße zur Behandlung von venöser Thromboseembolien eingesetzt, in der die thrombotische Aktivität für die Entwicklung und Ausdehnung des Thrombus verantwortlich ist. Obgleich wirkungsvoll, ruft Heparin jedoch viele unerwünschte Nebenwirkungen hervor, wie Blutungen oder Thrombocytopenie. Das gleiche gilt für Cumarin, das durch die Blockade oder Verhinderung der Bildung von Prothrombin wirkt und einige Zeit bis zu seiner vollen Wirkungsentfaltung benötigt. Zusammengenommen hat dies zu einer Suche nach spezifischer wirkenden und weniger toxischen Antigerinnungsmitteln geführt, wie z.B. peptidischen Hemmern.heparin and coumarin, preparations of the first type will be in great Measurements to Treatment of venous Thrombosis embolism used in the thrombotic activity for development and expansion of the thrombus is responsible. Although effective, However, heparin causes many undesirable side effects like bleeding or thrombocytopenia. The same applies to coumarin, that by blocking or preventing the formation of prothrombin works and takes some time to fully unfold its full effect. Taken together this leads to a search for more specific and less toxic ones Anticoagulants led, as e.g. peptidic inhibitors.

Hirudin ist ein natürliches vorkommendes Polypeptid, das vom Blutegel Hirudo medicinalis produziert wird. Dieser Wirkstoff, der in der Speicheldrüse des Blutegels synthetisiert wird, ist der wirkungsvollste bekannte natürliche Gerinnungshemmer. Hirudin ist ein direkter Thrombininhibitor und unterbindet die Koagulation des Blutes durch eine starke Bindung an das Thrombin (Kd = 2 × 10^–14 M) in einem stöchiometrischen 1:1 Komplex [Stone & Hofstenge, Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin, Biochemistry 25, S. 4622–4628 (1986)]. Dieses wiederum verhindert, daß das Thrombin die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin (dem Pfropfen) katalysiert, wie es auch alle anderen Thrombin-vermittelten Spaltungsprozesse verhindert.Hirudin is a naturally occurring polypeptide produced by the leech Hirudo medicinalis. This active ingredient, which is synthesized in the salivary gland of the leech, is the most effective known natural anticoagulant. Hirudin is a direct thrombin inhibitor and inhibits coagulation of the blood by a strong binding to thrombin (Kd = 2 × 10 ^-14 M) in a stoichiometric 1: 1 complex [Stone & Hofstenge, Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin, Biochemistry 25, pp. 4622-4628 (1986)]. This, in turn, prevents the thrombin from catalyzing the conversion of fibrinogen to fibrin (grafting), as well as preventing any other thrombin-mediated cleavage processes.

In Tierstudien wurde die Effizienz von Hirudin, in gereinigter Form aus Blutegeln gewonnen, bei der Prävention von venöser Thrombose, Gefäßverstopfung und Thrombin-induzierter verbreiteter intravaskulärer Koagulation demonstriert. Darüber hinaus zeigt Hirudin eine geringe Toxizität, geringe Antikörperbildung und eine schnelle Abbaubarkeit aus dem Blutkreislauf [F.Markwardt et al., Pharmacological studies on the antithrombic action of Hirudin in experimental animals, Thromb. Haemost. 47, S. 226–229 (1982)]. In Projekten, die darauf abzielen, größere Mengen von Hirudin herzustellen, wurden Versuche unternommen, das Polypeptid durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen. Die Gegenwart eines O-sulfatisierten Tyrosin-Rests im natürlichen Hirudin und die Unfähigkeit der Mikroorganismen, eine gleichartige Modifikation durchzuführen, machten die Aussicht auf eine rekombinante Produktion biologisch aktiven Hirudins hochspekulativ. Die Beobachtung, daß desulfatisiertes Hirudin fast so wirkungsvoll ist wie das sulfierte Gegenstück [U.S.Pat.No. 4 654 302], zeigte den Weg zur Klonierung und Darstellung in verschiedenen Expressionssystemen auf, unter anderem S. cerevisiae [Harvey et al., Cloning and expression of cDNA coding for the anticoagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinalis, PNAS 83, S. 1084–1088; Europ.Pat.Appl. 158 654, 168 342 und 171 024], E. coli [Bergmann et al., Chemical synthesis and expression of a gene coding for hirudin, the thrombin-specific inhibitor from the leech Hirudo medicinalis, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, S. 731–740; Europ.Pat.Appl. 200 655] und auf den Spitzen eines filamentösen Phagen als Verschmelzungprotein mit Protein III (pIII) [Wirsching et al., Display of functional thrombin inhibitor hirudin on the surface of phage M13, Gene 204, S. 177–184]. Trotz dieser Fortschritte ist Hirudin in der Produktion nach wie vor recht teuer. Dennoch hat es die dritte klinische Phase durchlaufen und wurde kürzlich für die Behandlung von Heparin-induzierter Thrombocytopenia zugelassen (HMR).In Animal studies have shown the efficacy of hirudin, in purified form derived from leeches, in the prevention of venous thrombosis, vessel blockage and thrombin-induced common intravascular Coagulation demonstrated. About that In addition, hirudin shows low toxicity, low antibody production and rapid biodegradation [F.Markwardt et al., Pharmacological studies on the antithrombic action of hirudin in experimental animals, Thromb. Haemost. 47, pp. 226-229 (1982)]. In projects aimed at producing larger quantities of hirudin, Attempts have been made to obtain the polypeptide by recombinant DNA technology manufacture. The presence of an O-sulfated tyrosine residue in the natural Hirudin and the inability of the microorganisms to carry out a similar modification made the prospect of a biologically active recombinant production Hirudins highly speculative. The observation that desulfated hirudin almost as effective as the sulfated counterpart [U.S. Pat. 4,654,302], showed the way to cloning and representation in various Expression systems, including S. cerevisiae [Harvey et al., Cloning and expression of cDNA coding for the anticoagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinalis, PNAS 83, Pp. 1084-1088; Europ.Pat.Appl. 158,654, 168,342 and 171,024], E. coli [Bergmann et al., Chemical synthesis and expression of a gene coding for hirudin, the thrombin-specific inhibitor from the leech Hirudo medicinalis, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, pp. 731-740; Europ.Pat.Appl. 200 655] and on the tips of a filamentous phage as a fusion protein with protein III (pIII) [Wirsching et al., Display of functional thrombin inhibitor hirudin on the surface of phage M13, Gene 204, Pp. 177-184]. Despite these advances, hirudin is still in production quite expensive. Nevertheless, it has gone through the third clinical phase and has been recently for the Treatment of heparin-induced thrombocytopenia (HMR).

Erst kürzlich wurden bei der Identifikation von Peptidfragmenten natürlichen Hirudins Erfolge erzielt, die ebenso die Koagulationszeit verlängern. Solche Peptidfragmente können jedoch aufgrund ihrer geringen Wirksamkeit bezüglich der Verhinderung der Pfropfenbildung nicht voll zufriedenstellen. So hat z.B. N-Acetyl-Hirudin_45–65 eine um vier Größenordnungen geringere Wirksamkeit als natürliches Hirudin, obgleich es nach wie vor ein relativ großes Molekül ist. Das Problem eher geringer Affinitäten für Thrombin wurde durch die Entwicklung von Hirulogen [U.S.Pat.No. 5 433 940] gelöst. Diese Moleküle ahmen die Wirkung von Hirudin dadurch nach, daß sie sowohl an die nach außen gerichtete Anion-bindende Seite geringer Affinität binden, wie auch an die katalytische Seite des α-Thrombins. Von daher sind Hiruloge durch eine an die Anion-bindende Thrombin-Außenseite assoziierte Hälfte, eine Verbindungsgruppe und einen gegen das katalytische Zentrum des Thrombins gerichteten Anteil charakterisiert. Das am meisten bevorzugte Hirulog ist Hirulog-8, ein Peptid aus 20 Aminosäuren, das aus dem das katalytische Zentrum hemmenden Peptid D-Phe-Pro-Arg-Pro-, einer Gly₄-Verbindungs-Sequenz und der Sequenz -Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH des Hirudins aufgebaut ist. Hirulog-8 befindet sich seit kurzem in den USA auf dem Markt.More recently, the identification of peptide fragments of natural hirudin has been successful achieved, which also extend the coagulation time. However, such peptide fragments can not be fully satisfactory because of their low effectiveness in preventing grafting. For example, N-acetyl-hirudin _45-65 has four orders of magnitude lower activity than natural hirudin, although it is still a relatively large molecule. The problem of rather low affinities for thrombin has been explained by the development of Hirulogen [US Pat. No. 5 433 940]. These molecules mimic the action of hirudin by binding to both the outward anion-binding side of low affinity and to the catalytic side of α-thrombin. Thus, hiruloges are characterized by a half associated with the anion-binding thrombin exterior, a linking group, and a portion directed against the catalytic site of thrombin. The most preferred Hirulog is Hirulog-8, a 20 amino acid peptide consisting of the catalytic center inhibiting peptide D-Phe-Pro-Arg-Pro, a Gly ₄ junction sequence and the sequence -Asn-Gly- Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH of hirudin is constructed. Hirulog-8 has recently entered the US market.

Trotz der Fortschritte relativ hoher Wirksamkeit für Thrombin (K_i = 2,3 nM) sind Hiruloge immer noch relativ große Moleküle, die in relativ mühsamen Schemata, wie gemischten heterologen/festen Phasen, synthetisiert werden müssen. Wie Hirudin sind Hirologe nur parenteral hilfreich und müssen sorgfältig überwacht werden. Daher sind Hiruloge nicht als Leitstrukturen für kleine Moleküle geeignet, die schließlich auch oral verabreicht werden könnten.Despite the progress of relatively high efficiency for thrombin (K _i = 2.3 nM), hirulogs are still relatively large molecules that must be synthesized in relatively cumbersome schemes, such as mixed heterologous / solid phases. Like hirudin, hirologists are only parenterally helpful and must be monitored carefully. Therefore, Hiruloge are not suitable as lead structures for small molecules, which could eventually be administered orally.

Daher gab es einige Anstrengungen, um kleinere Peptide als potente Thrombinhemmer zu identifizieren. Bereits 1956 zeigte Bettelheim, daß das Fibrinopeptid A die Reaktion zwischen Thrombin und Fibrinogen vergleichbar hemmt. In einer gemeinsamen Forschung von Blombäck und der Nobel Pharma/Kabi in Stockholm wurden vom Fibrinopeptid A abgeleitete Peptidsequenzen mit nicht mehr als neun Aminosäuren mit guter Wirksamkeit auf Thrombin gefunden. Wesentliche Bestandteile der Wirksamkeit waren ein N-endständiges Phe und ein C-endständiges Arg, getrennt durch sieben Aminosäuren. Weniger Aminosäuren verringerten die Wirksamkeit, aber erstaunlicherweise zeigte ein Tripeptid mit N- und C-endständigem Phe bzw. Arg exzellente Wirksamkeit. Das beste Tripeptid mit hemmender Wirkung auf die Thrombin-Fibrinogen-Reaktion war Bz-Phe-Val-Arg-OMe, wobei Val wie im Fibrinopeptid ganzer Länge dem Arg vorausgeht [Blombäck et al., Synthetic peptides with anticoagulant and vaodilating activity, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 24, S. 59–66 (1969), U.S.Pat.No. 3 826 794 (1974)]. Im Gegensatz zum Fibrinopeptid A geht Pro dem Arg in einer Reihe anderer Thrombinausschnittsbereiche, wie der des Prothrombins, des Faktors XIII und der menschlichen Wachstumshormone voraus. Auf Basis der Pro-Arg-Sequenz wurden die meisten der heu te wirksamsten Thrombin-hemmenden Peptide und Peptidomimetiken entwickelt. Unter diesen wirkungsvollsten Hemmern befindet sich H-D-Phe-Pro-Arg-H (K_i = 70 nM) [Bajuz et al., Inhibition of thrombin and trypsin by tripeptide aldehydes, Int. J. Peptide Protein Res. 12, S. 217–221 (1978); Hung.Pat. 169870 (1974)]. Die Idee zu diesem Peptidaldehyd erwuchs aus der Entdeckung von Peptidaldehyden bakteriellen Ursprungs durch H. Umezawa. Diese so genannten Leupeptide (z.B. Ac-Leu-Leu-Arg-H) sind Hemmer des Plasmins und anderer Trypsin-ähnlicher Proteasen, jedoch nicht des Thrombins. Der Aldehyd-Kohlenstoff hat in seiner acetalen Form eine tetraedrale Struktur, die gleiche wie der Carbonyl-Kohlenstoff von Substraten in der Übergangsphase.Therefore, there has been some effort to identify smaller peptides as potent inhibitors of thrombin. Already in 1956 Bettelheim showed that the fibrinopeptide A comparably inhibits the reaction between thrombin and fibrinogen. In a joint research by Blombäck and Nobel Pharma / Kabi in Stockholm, fibrinopeptide A-derived peptide sequences having not more than nine amino acids have been found to be effective on thrombin. Essential components of the efficacy were an N-terminal Phe and a C-terminal Arg separated by seven amino acids. Fewer amino acids reduced potency, but surprisingly, a tripeptide with N- and C-terminal Phe and Arg, respectively, showed excellent potency. The best tripeptide inhibiting the thrombin-fibrinogen reaction was Bz-Phe-Val-Arg-OMe, with Val preceding the Arg as in the full-length fibrinopeptide [Blombäck et al., Synthetic peptides with anticoagulant and vodorizing activity, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 24, pp. 59-66 (1969), US Pat. No. 3,826,794 (1974)]. In contrast to fibrinopeptide A, Pro precedes Arg in a number of other thrombin clipping regions, such as prothrombin, factor XIII and human growth hormones. Based on the Pro-Arg sequence, most of the most effective thrombin-inhibiting peptides and peptidomimetics were developed. Among these most potent inhibitors is HD-Phe-Pro-Arg-H (K _i = 70 nM) [Bajuz et al., Inhibition of thrombin and trypsin by tripeptide aldehydes, Int. J. Peptide Protein Res. 12, pp. 217-221 (1978); Hung.Pat. 169870 (1974)]. The idea for this peptide aldehyde arose from the discovery of peptide aldehydes of bacterial origin by H. Umezawa. These so-called leupeptides (eg, Ac-Leu-Leu-Arg-H) are inhibitors of plasmin and other trypsin-like proteases, but not thrombin. The aldehyde carbon in its acetal form has a tetrahedral structure, the same as the carbonyl carbon of substrates in the transition phase.

Aus diesen eben erwähnten Aldehyden synthetisierten Shaw et al. den irreversiblen Chlormethylketon-Hemmer H-D-Phe-Pro-Arg-CH₂-Cl mit einem K_i von 25 nM [Kettner et al., H-D-Phe-Pro-Arg-CH₂-Cl – a selective activity label for thrombin, Thromb. Res. 14, S.969–973 (1979)]. Entwicklungsarbeiten bei Eli Lilly führten zu N-Methyl-D-Phe-Pro-Arg-H, auch als Efegatran [tm] bekannt. Die D-Phe-Pro-Arg-Sequenz wurde kürzlich nochmals weiterentwickelt. Spekulationen, daß eine N-endständige Aminosäure mit aromatischen/lipophilen Gruppen eine größere Wirksamkeit gegenüber Thrombin ergeben könnte, führten zur Entdeckung einiger Hemmer mit neuen Aminosäuren an dieser Position, darunter das β-β-Diphenylalanin (Dpa), Phenylglycin, Cyclohexylglycin, Carboxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin (Tiq) [Schuman et al., Highly selective thrombin inhibitors, J. Med. Chem. 36, S.314–319 (1993)]. Die interessanteste Verbindung war D-1-Tiq-Pro-Arg-H, die verglichen mit Boc-D-Phe-Pro-Arg-H, den doppelten Wirksamkeitsgewinn ergab. Jedoch wird Trypsin in gleichem Maße wie das Thrombin gehemmt.From these aldehydes just mentioned, Shaw et al. the irreversible chloromethyl ketone inhibitor HD-Phe-Pro-Arg-CH ₂ -Cl with a K _i of 25 nM [Kettner et al., HD-Phe-Pro-Arg-CH ₂ -Cl - a selective activity label for thrombin, Thromb. Res. 14, pp. 969-973 (1979)]. Development work at Eli Lilly has resulted in N-methyl-D-Phe-Pro-Arg-H, also known as Efegatran [tm]. The D-Phe-Pro-Arg sequence has recently been further developed. Speculation that an N-terminal amino acid with aromatic / lipophilic groups might give greater efficacy against thrombin has led to the discovery of several new amino acid inhibitors at this position, including β-β-diphenylalanine (Dpa), phenylglycine, cyclohexylglycine, carboxy- 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline (Tiq) [Schuman et al., Highly selective thrombin inhibitors, J. Med. Chem. 36, p.314-319 (1993)]. The most interesting compound was D-1-Tiq-Pro-Arg-H, which gave twice the efficacy compared to Boc-D-Phe-Pro-Arg-H. However, trypsin is inhibited to the same extent as thrombin.

Aus den heute zugänglichen Daten ist klar, daß, obgleich es einige effektive antigerinnungswirksame Verbindungen gibt, ein Bedarf an leistungsfähigen Antithrombinmitteln besteht, die schnell wirken, um die Pfropfenbildung zu verhindern und die nicht mit anderen Proteaseaktivitäten, z.B. der Plasminwirkung beim Auflösen des Pfropfens interferieren.Out accessible today Data is clear that, although there are some effective anticoagulant compounds There is a need for powerful Antithrombin agents that act quickly to stop the grafting and which do not interfere with other protease activities, e.g. the plasmin effect on dissolution of the plug interfere.

Ausgehend von diesem Stand der Technik lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verbindungen bereitzustellen, die im Sinne einer Thrombinhemmung biologisch aktiv sind und die Nachteile des vorhergehend beschriebenen Standes der Technik vermeiden. Das der Erfindung zugrundeliegende Problem bestand darüberhinaus darin, Thrombin spezifisch mit geringen Wirkstoffkonzentrationen und geringer Zelltoxizität zu inhibieren.Based on this prior art, the present invention was based on the object to provide compounds which are biologically active in terms of thrombin inhibition and avoid the disadvantages of the prior art described above. This is the basis of the invention The underlying problem was also to inhibit thrombin specifically with low drug concentrations and low cell toxicity.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verbindung mit der Formel Y¹-(NH-X¹-C=O)-(NH-X²-C=O)-(NH-X³-C=O)-(NH-X⁴-C=O)-(NH-X⁵-C=O)-(NH-X⁶-C=O)-Y² (I)gelöst,
wobei Y¹ entweder

1. ein Wasserstoff oder
2. eine Methylgruppe oder
3. eine Acetylgruppe ist oder
4. durch ein Rückgrat aus einer Kette von 1 bis 32 Kohlenstoffatomen charakterisiert ist,

wobei (NH-X¹-C=O) eine D- oder L-Aminosäure, vorzugsweise

1. Valin oder
2. Alanin oder
3. Leucin oder
4. Isoleucin oder
5. Norleucin oder
6. Asparaginsäure oder
7. Glutaminsäure oder
8. Serin oder
9. Threonin oder
10. Tyrosin oder
11. Arginin oder
12. Lysin oder
13. Ornithin ist
14. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird,

wobei (NH-X²-C=O) eine D- oder L-Aminosäure, vorzugsweise

1. Alanin oder
2. Valin oder
3. Leucin oder
4. Isoleucin oder
5. Norleucin oder
6. Serin oder
7. Threonin oder
8. Tyrosin oder
9. Prolin oder
10. Citrullin oder
11. Arginin oder
12. Lysin oder
13. Ornithin oder
14. Cyclohexylalanin oder
15. Cyclohexylglycin ist
16. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird,

wobei (NH-X³-C=O) eine beliebige Aminosäure, beispielsweise

1. L-Cyclohexylalanin oder
2. D-Cyclohexylalanin oder
3. L-Cyclohexylglycin oder
4. D-Cyclohexylglycin ist,

wobei (NH-X⁴-C=O) eine kleine Aminosäure, vorzugsweise

1. L-Prolin oder
2. D-Prolin ist
3. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird,

wobei (NH-X⁵-C=O) eine vorzugsweise aromatische Aminosäure, wie

1. L-Tyrosin oder
2. D-Tyrosin oder
3. L-Phenylalanin oder
4. D-Phenylalanin ist
5. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird,

wobei (NH-X⁶-C=O) eine Aminosäure mit basischer Seitenkette, vorzugsweise

1. L-Arginin oder
2. D-Arginin oder
3. L-Lysin oder
4. D-Lysin oder
5. L-Ornithin oder
6. D-Ornithin ist,

wobei Y² entweder

1. eine OH-Gruppe (die C-endständige Aminosäure hat eine endständige Carbonsäure-Gruppe) oder
2. eine Aminogruppe (bei der C-endständigen Aminosäure ist die Carbonsäure- durch eine Amid-Gruppe ersetzt) oder
3. ein Wasserstoff (bei der C-endständigen Aminosäure ist die Carbonsäure- durch eine Aldehyd-Gruppe ersetzt) oder
4. 7-Amido-4-methylcumarin (über die Carbonsäuregruppe kombiniert) oder
5. Paranitroanilid (über die Carbonsäuregruppe kombiniert) oder
6. durch eine Verbindungskette aus eins bis 35 Atomen ersetzt ist,

oder ein am C-Terminus und/oder am N-Terminus um nicht weniger als eine Aminosäure verkürztes Molekül und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.According to the invention, this object is achieved by the compound of the formula Y ¹ - (NH-X ¹ -C =O) - (NH-X ² -C =O) - (NH-X ³ -C =O) - (NH-X ⁴ -C = O) - (NH ³ ) X ⁵ -C = O) - (NH-X ⁶ -C = O) -Y ² (I) solved,
where Y ^{1 is} either

1. a hydrogen or
2. a methyl group or
3. is an acetyl group or
4. characterized by a backbone of a chain of 1 to 32 carbon atoms,

where (NH-X ¹ -C = O) is a D- or L-amino acid, preferably

1. Valine or
2. Alanine or
3. Leucine or
4. Isoleucine or
5. norleucine or
6. aspartic acid or
7. glutamic acid or
8. Serine or
9. Threonine or
10. Tyrosine or
11. Arginine or
12. Lysine or
13. Ornithine is
14. or is replaced by a chemical bond,

where (NH-X ² -C = O) is a D- or L-amino acid, preferably

1. Alanine or
2. Valine or
3. Leucine or
4. Isoleucine or
5. norleucine or
6. Serine or
7. Threonine or
8. Tyrosine or
9. Proline or
10. Citrulline or
11. Arginine or
12. Lysine or
13. Ornithine or
14. cyclohexylalanine or
15. Cyclohexylglycine is
16. or is replaced by a chemical bond,

where (NH-X ³ -C = O) is any amino acid, for example

1. L-cyclohexylalanine or
2. D-cyclohexylalanine or
3. L-cyclohexylglycine or
4. D-cyclohexylglycine is,

where (NH-X ⁴ -C = O) is a small amino acid, preferably

1. L-proline or
2. D-proline is
3. or replaced by a chemical bond,

where (NH-X ⁵ -C = O) is a preferably aromatic amino acid, such as

1. L-Tyrosine or
2. D-tyrosine or
3. L-phenylalanine or
4. D-phenylalanine is
5. or is replaced by a chemical bond,

where (NH-X ⁶ -C = O) an amino acid with a basic side chain, preferably

1. L-arginine or
2. D-arginine or
3. L-lysine or
4. D-lysine or
5. L-ornithine or
6. D-ornithine is,

where Y ^{2 is} either

1. an OH group (the C-terminal amino acid has a terminal carboxylic acid group) or
2. an amino group (in the C-terminal amino acid, the carboxylic acid is replaced by an amide group) or
3. a hydrogen (in the C-terminal amino acid, the carboxylic acid is replaced by an aldehyde group) or
4. 7-amido-4-methylcoumarin (combined via the carboxylic acid group) or
5. Paranitroanilide (combined via the carboxylic acid group) or
6. is replaced by a linking chain of one to 35 atoms,

or a molecule shortened at the C-terminus and / or at the N-terminus by not less than one amino acid and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Die Erfindung betrifft auch Derivate der oben genannten Verbindungen.The The invention also relates to derivatives of the above-mentioned compounds.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn es sich bei dem erfindungsgemäßen Peptid um N-Acetyl-D-Val-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Asp-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ile-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-D-Lys-D-Pro-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-L-Cha-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ser-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid oder um N-Acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid handelt.Particularly advantageous results are obtained when the peptide according to the invention is N-acetyl-D-Val-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide, N-acetyl-L -Asp-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to give N-acetyl-L-Ile-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg- amide to N-acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide N-acetyl-L-Ser-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-D-Lys-D-Pro-L-Cha-D-Pro D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-L-Ser -D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to give N-acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L- Arg-amide to give N-acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-L-Ser-L-Cha-L- Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to give N-acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide. Acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide to N-acetyl-L-Ser-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide or to N-acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D -Tyr-L-Arg-amide.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Hemmung aller Thrombin-vermittelten oder Thrombin-assoziierten Funktionen und Prozesse verwendet werden. Pharmazeutische Zusammenstellungen, die diese Verbindungen enthalten, wie auch Methoden zur Behandlung und Prophylaxe von Gefäßerkrankungen, entzündlichen Reaktionen, Karzinomen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Verbindungen verwenden, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Verbindungen können auch zur ex vivo Darstellung verwendet werden, zur Lagerung und Behandlung von Blut außerhalb des Körpers und zur Beschichtung von invasiven Geräten. Ferner können die Verbindungen einem Patienten (unter Patient wird hier ein Mensch oder Tier verstanden) in Kombination mit einem fibrinolytischem Mittel verabreicht werden, um die Wirksamkeit einer gegebenen Dosis zu erhöhen oder die zur Erzielung eines gewünschten Effekts notwendige Dosis zu verringern, wie das Auflösen und Blutpfropfens oder die Verhinderung der Wiederverstopfung des zuvor blockierten Blutgefäßes.The Compounds of the invention can to inhibit all thrombin-mediated or thrombin-associated Functions and processes are used. Pharmaceutical compositions, containing these compounds, as well as methods of treatment and prophylaxis of vascular diseases, inflammatory Reactions, carcinomas and neurodegenerative diseases affecting these Use compounds are also the subject of the invention. The connections can also used for ex vivo imaging, for storage and treatment from blood outside of the body and for coating invasive devices. Furthermore, the Connections to a patient (a patient becomes a human here or animal) in combination with a fibrinolytic agent be administered to increase the effectiveness of a given dose increase or to achieve a desired To reduce the effect of necessary dose, such as dissolving and Grafting or preventing the clogging of the previously blocked blood vessel.

Aufgrund ihres hohen Potentials und der Tatsache, daß sie durch chemische Synthesetechniken hergestellt werden können, können die Verbindungen preisgünstig in kommerziell praktikablen Mengen produziert werden. Die Peptide werden in passende Salzformen wie Acetate und Sulfate umgewandelt.by virtue of their high potential and the fact that they are made by chemical synthesis techniques can be can the connections reasonably priced be produced in commercially practicable quantities. The peptides are converted into suitable salt forms such as acetates and sulfates.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Moleküle wesentlich kleiner als Hirudin und die anderen bisher beschriebenen peptidischen Thrombinhemmer. Daher ist es unwahrscheinlicher, eine unerwünschte Reaktion des Immunsystems bei mit diesen Substanzen behandelten Patienten hervorzurufen. Dementsprechend ist der Einsatz dieser Thrombin-Hemmer nicht auf die Behandlung akuter Erkrankungen beschränkt. Diese Verbindungen können auch in der Therapie chronischer thrombo-embolitischer Erkrankungen wie der Arteriosklerose oder der Restenosis infolge einer Angioplastie, eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in einer Vielzahl anderer Anwendungen anstelle natürlichen und rekombinanten Thrombins eingesetzt werden.Furthermore the molecules of the invention are essential smaller than hirudin and the other peptides previously described Thrombin inhibitor. Therefore, it is unlikely an undesirable reaction of the immune system in patients treated with these substances cause. Accordingly, the use of these thrombin inhibitors not limited to the treatment of acute illnesses. These Connections can also in the treatment of chronic thrombo-embolic diseases such as arteriosclerosis or restenosis due to angioplasty, be used. The compounds of the invention may also in a variety of other applications instead of natural and recombinant thrombin.

Wie man aus der Offenlegung folgern kann, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen, Zusammenstellungen und Verfahren nützlich zur Behandlung und Vorsorge verschiedener Krankheiten in Zusammenhang mit unerwünschten Wirkungen des Thrombins, wie auch für diagnostische Zwecke.As one can conclude from the disclosure, are the compounds of the invention, Compilations and procedures useful for treatment and prevention various diseases related to unwanted Effects of thrombin, as well as for diagnostic purposes.

Schließlich soll erwähnt werden, daß die Moleküle dieser Erfindung als Leitstrukturen zur Entwicklung von Molekülen mit noch vorteilhafteren Eigenschaften in Hinblick auf die oben genannten Anwendungen dienen können.Finally, should mentioned be that the molecules of this invention as lead structures for the development of molecules with even more advantageous properties in view of the above Applications can serve.

Pharmazeutisch akzeptable Salze von Peptiden dieser Erfindung beinhalten die durch Säurezugabe erzeugten Salze, die aus anorganischen Säuren und Carbonsäuren gebildet werden. Die Verbindungen, die durch die Formel (I) repräsentiert werden, werden durch bekannte Methoden der Peptidkopplung hergestellt.pharmaceutical Acceptable salts of peptides of this invention include those disclosed in U.S. Pat addition of acid produced salts formed from inorganic acids and carboxylic acids become. The compounds represented by the formula (I) are prepared by known methods of peptide coupling.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen als Verbindungsgemisch vor, das durch seinen Gehalt an mindestens zwei der erfindungsgemäßen Verbindungen charakterisiert ist. Bevorzugte pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen werden mit einer anorganischen Säure gebildet. Besonders bevorzugt ist dabei die Bildung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes mit Chlorwasserstoffsäure, Chlorsäure, Bromwasserstoffsäure, Bromsäure und/oder einer anderen Halogensäure. Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform besteht in der Bildung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes mit Schwefelsäure und/oder Phosphorsäure. Vorteilhaft kann auch ein pharmazeutisch akzeptables Salz mit einer organischen Säure gebildet werden. Besonders bevorzugt ist dabei die Bildung des pharmazeutisch akzeptablen Salzes mit Essigsäure, Propionsäure, Malonsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Benzoesäure, und/oder einer ähnlichen Carbonsäuren. Die durch Säurezugabe gebildeten Salze werden auf konventionelle Weise hergestellt, z.B. durch Neutralisieren der freien Basenform der Verbindung (I) mit der Säure.In a preferred embodiment are the compounds of the invention as a compound mixture, which by its content of at least two of the compounds of the invention is characterized. Preferred pharmaceutically acceptable salts The compounds are formed with an inorganic acid. Particularly preferred is the formation of a pharmaceutically acceptable Salt with hydrochloric acid, Chloric acid, hydrobromic acid, bromic acid and / or another halogen acid. Another particularly preferred embodiment is the formation a pharmaceutically acceptable salt with sulfuric acid and / or Phosphoric acid. Advantageously, a pharmaceutically acceptable salt with an organic Acid formed become. Particularly preferred is the formation of the pharmaceutical acceptable salt with acetic acid, propionic acid, malonic, maleic acid, Citric acid, Succinic acid, Fumaric acid, malic acid, benzoic acid, and / or the like Carboxylic acids. The by acid addition formed salts are prepared in a conventional manner, e.g. by neutralizing the free base form of the compound (I) with the acid.

Die verbindungsgemäßen Substanzen können in Verbindungen und Methoden zur Hemmung aller Thrombin-vermittelten oder Thrombin-assoziierten Funktionen verwendet werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Moleküle enthalten, sind, wie auch Methoden zur Behandlung und Prophylaxe von Gefäßerkrankungen, entzündlichen Reaktionen, Karzinomen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Verbindungen verwenden, ebenfalls Teil der Erfindung. Die Substanzen können auch in Zusammensetzung zur ex vivo-Darstellung verwendet werden, zur Lagerung und zur Behandlung von Blut außerhalb des Körpers und zur Beschichtung von invasiven Geräten. Ferner können die erfindungsgemäßen Verbindungen einem Patienten (unter Patient wird hier ein Mensch oder ein Tier verstanden) in Kombination mit einem fibrinolytischen Mittel verabreicht werden, um die Wirksamkeit einer gegebenen Dosis zu erhöhen oder um die Erzielung eines gewünschten Effektes, wie das Auflösen eines Blutpfropfens oder das Verhindern der Wiederverstopfung des zuvor blockierten Blutgefäßes notwendige Dosis zu verringern.The compounds according to the invention can be used in compounds and methods for the inhibition of all thrombin-mediated or thrombin-associated functions. pharmaceutical Compositions containing these molecules are also part of the invention, as are methods for the treatment and prophylaxis of vascular diseases, inflammatory reactions, carcinomas and neurodegenerative diseases using these compounds. The substances may also be used in compositions for ex vivo imaging, for storage and treatment of blood outside the body and for coating invasive devices. Further, the compounds of the present invention may be administered to a patient (the term "patient" herein means a human or an animal) in combination with a fibrinolytic agent to increase the efficacy of a given dose or to achieve a desired effect, such as dissolving a blood plug to reduce the necessary dose to prevent re-blockage of the previously blocked blood vessel.

Aufgrund ihres hohen Potentials und der Tatsache, daß sie durch chemische Synthesetechniken hergestellt werden können, sind die erfindungsgemäßen Substanzen preisgünstig in kommerziell praktikabler Menge produzierbar. Bevorzugt werden die Peptide in passende Salzformen, wie Acetate oder Sulfate umgewandelt.by virtue of their high potential and the fact that they are made by chemical synthesis techniques can be are the substances according to the invention inexpensive producible in a commercially practicable amount. To be favoured the peptides are converted into suitable salt forms, such as acetates or sulfates.

Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das durch seinen Gehalt an einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen mit den üblichen Trägerstoffen, Hilfsmitteln oder Zusatzstoffen charakterisiert ist. Ferner ist auch eine Diagnostikzusammensetzung mit einem Gehalt an einer oder mehreren der Verbindungen Gegenstand der Erfindung.The The invention also relates to a medicament characterized by its content on one or more compounds according to the invention with the customary carrier substances, Auxiliary agents or additives is characterized. Further is also a diagnostic composition containing one or several of the compounds of the invention.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Verwendung der Verbindung als Thrombininhibitor sowie zur Herstellung eines Arzneimittels zur Thrombininhibierung, Inhibierung der Fibrinbildung und/oder zur Inhibierung der Bildung eines Gerinnungspfropfens.One Another object of the invention is the use of the Compound as thrombin inhibitor and for the manufacture of a medicament for Thrombin inhibition, inhibition of fibrin formation and / or to Inhibition of the formation of a coagulation plug.

Die Verwendung einer oder mehrerer der Verbindungen zur Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In einer der besonders bevorzugten Ausführungsformen wird zur Herstellung der diagnostischen Zusammensetzung eine erfindungsgemäße Verbindung verwendet, bei der in der Formel (I) Y² 7-Amido-3-methylcumarin oder Paranitroanilid ist.The use of one or more of the compounds for the preparation of a diagnostic composition is also provided by the invention. In one of the particularly preferred embodiments, a compound according to the invention is used for the preparation of the diagnostic composition in which Y ^{2 is} 7-amido-3-methylcoumarin or paranitroanilide in the formula (I).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen gegenüber bisher bekannten Thrombininhibitoren vielfältige Vorteile auf. Insbesondere sind die Peptide leicht synthetisierbar, bereits wenig modifiziert wirksam und weisen eine hohe Wirksamkeit bei gleichzeitig hoher Spezifität und geringer Toxizität auf. Darüber hinaus dienen die kleinen Peptide, anders als Hirudin und Hirolog als Leitstrukturen für vorzugsweise oral verfügbare Wirkstoffe.The Compounds of the invention opposite Heretofore known thrombin inhibitors have many advantages. Especially The peptides are easily synthesized, already slightly modified effective and have high efficacy at the same time high specificity and low toxicity. About that In addition, the small peptides, unlike hirudin and hirolog, serve as lead structures for preferably orally available Agents.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese einzuschränken.The The following examples illustrate the invention without limiting it.

Beispiel 1example 1

N-Acetyl-D-Val-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-Acetyl-D-Val-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Dieses Peptid wurde durch eine Festphasen-Synthese mithilfe eines ABIMED-Synthesizers AMS 96 (ABIMED Analysen-Technik GmbH, Langenfeld, Deutschland) hergestellt. Im Detail ließ man 1 meq Rink Amid-Harz sequentiell mit 2 × 5 meq geschützter Aminosäure reagieren. Die Aktivierung erfolgte mit 2 × 5 meq TBTU (O-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat. Nach bis zu 6 Zyklen der Synthese wurde der N-Terminus mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Dann wurde der Schutz des Peptids durch eine Behandlung mit 90% TFA, 2,5% Triisopropylsilan, 2,5% H₂O und 5% Dichlormethan aufgehoben. Im selben Schritt erfolgte die Entkopplung des Peptids von seinem Träger. Die Testverbindung wurde anschließend an einen Trocknungsschritt in 20 μl Trifluoressigsäure angelöst, und dann mit 2 × 750 μl kaltem Butylether bei –20 °Celsius inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und der Rest Ether verdunstet. Die Identität der Produkte wurde stichprobenartig durch Massenspektroskopie bestätigt.This peptide was prepared by solid-phase synthesis using an ABIMED AMS 96 synthesizer (ABIMED Analysen-Technik GmbH, Langenfeld, Germany). In detail, 1 meq Rink amide resin was sequentially reacted with 2 x 5 meq of protected amino acid. The activation was carried out with 2 × 5 meq of TBTU (O-benzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate. After up to 6 cycles of synthesis, the N-terminus was acetylated with acetic anhydride. Then the protection of the peptide was abolished by treatment with 90% TFA, 2.5% triisopropylsilane, 2.5% H ₂ O and 5% dichloromethane. In the same step, the decoupling of the peptide was carried out by its carrier. The test compound was then solubilized in 20 μl of trifluoroacetic acid following a drying step and then incubated with 2 × 750 μl cold butyl ether at -20 ° C. After centrifugation, the supernatant was removed and the remainder ether evaporated. The identity of the products was randomly confirmed by mass spectroscopy.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 53%. Die Werte der hemmenden Konstante K_i wurden aus Assays gewonnen, in denen Thrombin das fluorogene Substrat Tos-Gly-Pro-Arg-(7-amino-4-Methylcumarin) hydrolisiert. Die Assays wurde in 30 μl Assaypuffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,1% PEG 8000, pH 7,6) mit 10 μl humaner Thrombinlösung (10^–5 U/μl im Assaypuffer) und 140 μl einer Lösung des fluorogenen Substrats in einem Assaypuffer bei einer Konzentration von 30 μM durchgeführt. Lösungen der Testverbindung (10 μl) wurden bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt. Die Raten der Hydrolyse des Substrats wurden durch Überwachung der Reaktionen bei 460 nm der Freisetzung von 7-Amino-4-Methylcumarin unter Verwendung von AMC gemessen. Die Reaktion erreichte einen Gleichgewichtszustand innerhalb von drei Minuten, nachdem Thrombin mit dem Substrat und einem Hemmer vermischt wurden. Die kinetischen Daten der konkurrierenden Hemmung (K_m, V_max und K_i) wurden mittels der Darstellung nach Hanes analysiert (A/V gegen A bei verschiedenen Werten von A, dabei ist A die Substratkonzentration und V die Reaktionsgeschwindigkeit).Inhibition of thrombin was determined by in vitro inhibition of thrombin amidase activity and is 53% at a peptide concentration of 1 μM. The inhibitory constant K _i values were obtained from assays in which thrombin hydrolyzes the fluorogenic substrate Tos-Gly-Pro-Arg- (7-amino-4-methylcoumarin). The assays were performed in 30 μl of assay buffer (0.05 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.1% PEG 8000, pH 7.6) with 10 μl of human thrombin solution (10 ^-5 U / μl in assay buffer) and 140 μl a solution of the fluorogenic substrate in an assay buffer at a concentration of 30 μM. Solutions of the test compound (10 μl) were added at various concentrations. The rates of hydrolysis of the substrate were measured by monitoring the reactions at 460 nm of the release of 7-amino-4-methylcoumarin using AMC. The reaction reached equilibrium within three minutes after thrombin was mixed with the substrate and an inhibitor. The kinetic data of the competitive inhibition (K _m , V _max and K _i ) were analyzed by the Hanes plot (A / V versus A at different values of A, where A is the substrate concentration and V is the reaction rate).

Beispiel 2Example 2

N-Acetyl-L-Asp-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Asp-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.This Peptide was synthesized as described in Example 1 and for use prepared in the assay.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 51%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 51%.

Beispiel 3Example 3

N-Acetyl-L-Ile-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ile-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für die den Einsatz im Assay vorbereitet.This Peptide was synthesized as described in Example 1 and for the Use prepared in the assay.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 48%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 48%.

Beispiel 4Example 4

N-Acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-Acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 46%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 46%.

Beispiel 5Example 5

N-Acetyl-L-Ser-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-Ser-L-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 49%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 49%.

Beispiel 6Example 6

N-Acetyl-D-Lys-D-Pro-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-D-Lys-D-Pro-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1μM 53%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 53%.

Beispiel 7Example 7

N-Acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-Acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Beispiel 8Example 8

N-Acetyl-L-Ser-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Beispiel 9Example 9

N-Acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Beispiel 10Example 10

N-Acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 67%.The inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of thrombin amidase activity bins as determined in Example 1 and is at a peptide concentration of 1 uM 67%.

Beispiel 11Example 11

N-Acetyl-L-Ser-L-Cha-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-L-Cha-Cha-L-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 43%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 43%.

Beispiel 12Example 12

N-Acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 44%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 44%.

Beispiel 13Example 13

N-Acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 38%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 38%.

Beispiel 14Example 14

N-Acetyl-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 31%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 31%.

Beispiel 15Example 15

N-Acetyl-L-Ser-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-L-Ser-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 21%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 21%.

Beispiel 16Example 16

N-Acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amidN-acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 μM 27%.The Inhibition of thrombin was confirmed by in vitro inhibition of the amidase activity of thrombin as in embodiment 1 determines and amounts at a peptide concentration of 1 μM 27%.

Beschreibung der AbkürzungenDescription of the abbreviations

AlaAla: = Alanin= Alanine
ValVal: = Valin= Valine
LeuLeu: = Leucin= Leucine
IleIle: = Isoleucin= Isoleucine
ProPer: = Prolin= Proline
PhePhe: = Phenylalanin= Phenylalanine
ChaCha: = Cyclohexylalanin= Cyclohexylalanine
TrpTrp: = Tryptophan= Tryptophan
Metmead: = Methionin= Methionine
GlyGly: = Glycin= Glycine
SerSer: = Serin= Serine
ThrThr: = Threonin= Threonine
CysCys: = Cystein= Cysteine
TyrTyr: = Tyrosin= Tyrosine
AsnAsn: = Asparagin= Asparagine
GlnGln: = Glutamin= Glutamine
AspAsp: = Asparaginsäure= Aspartic acid
GluGlu: = Glutaminsäure= Glutamic acid
LysLys: = Lysin= Lysine
Argbad: = Arginin= Arginine
HisHis: = Histidin= Histidine
NleNle: = Norleucin= Norleucine
OrnOrn: = Ornithin= Ornithine
CitCit: = Citrullin= Citrulline

Claims

A compound of the formula (I) Y ¹ - (NH-X ¹ -C =O) - (NH-X ² -C =O) - (NH-X ³ -C =O) - (NH-X ⁴ -C = O) - (NH ³ ) X ⁵ -C = O) - (NH-X ⁶ -C =O) -Y ² (I), where Y ^{1 is} either a) a hydrogen or b) a methyl group or c) an acetyl group or d) is characterized by a backbone of a chain of 1 to 32 carbon atoms, where (NH-X ¹ -C = O) represents a or L-amino acid, in particular a) valine or b) alanine or c) leucine or d) isoleucine or e) norleucine or f) aspartic acid or g) glutamic acid or h) serine or i) threonine or j) tyrosine or k) arginine or l) lysine or m) ornithine is n) or is replaced by a chemical bond, where (NH-X ² -C = O) a D- or L-amino acid, in particular a) alanine or b) valine or c) leucine or d) isoleucine or e) norleucine or f) serine or g) threonine or h) tyrosine or i) proline or j) citrulline or k) arginine or l) lysine or m) ornithine or n) cyclohexylalanine or o) cyclohexylglycine p) or is replaced by a chemical bond, wherein (NH-X ³ -C = O) any amino acid, in particular a) L-cyclohexylalanine or b) D-cyclohexylalanine or c) L-cyclohexylglycine or d) D-cyclohexylglycine, where (NH-X ⁴ -C = O) is a small amino acid, in particular a) L-proline or b) D-proline c) or replaced by a chemical bond where (NH-X ⁵ -C = O) is any amino acid, in particular a) L-tyrosine or b) D-tyrosine or c) L-phenylalanine or d) D-phenylalanine e) or replaced by a chemical bond wherein (NH-X ⁶ -C = O) is an amino acid having a basic side chain, in particular a) L-arginine or b) D-arginine or c) L-lysine or d) D-lysine or e) L-ornithine or f) D-ornithine, wherein Y ^{2 is} either a) an OH group (the C-terminal amino acid has a terminal carboxylic acid group) or b) an amino group (in the C-terminal amino acid is the carboxylic acid by an amide) Replaced group) or c) a hydrogen (in the C-terminal amino acid, the carboxylic acid is replaced by an aldehyde group) or d) 7-amido-4-methylcoumarin or (via the carboxylic acid combine t) or e) paranitroanilide (combined via the carboxylic acid group) or f) is replaced by a linking chain of one to 35 atoms, or a molecule shortened at the C-terminus and / or at the N-terminus by not less than one amino acid, and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl- (NH-X ¹ -C = O) - (NH-X ² -C = O) -L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg amide with the meanings indicated and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-D-Val-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Asp-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ile-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-D-Lys-D-Pro-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-L-Cha-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-L-Ser-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

A compound according to claim 1, characterized by the composition N-acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amide and pharmaceutically acceptable salts thereof.

Compound mixture, characterized by a content at least two compounds according to at least one of claims 1 to 18th

A compound according to any one of claims 1 to 19, wherein the compound as a pharmaceutically acceptable salt formed with an inorganic acid becomes.

A compound according to claim 20, wherein the compound is present as a pharmaceutically acceptable salt, which with hydrochloric acid, bromic acid and / or another halogen acid is formed.

A compound according to claim 20, wherein the compound is present as a pharmaceutically acceptable salt with sulfuric acid and / or phosphoric acid is formed.

A compound according to any one of claims 1 to 19, wherein the compound is a pharmaceutically acceptable salt, that with an organic acid is formed.

A compound according to claim 23, wherein the compound is present as a pharmaceutically acceptable salt with acetic acid, propionic acid, malonic acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, maleic acid, benzoic acid, fumaric acid and / or a similar one carboxylic acid is formed.

Medicinal products characterized by their content to one or more compounds according to at least one of claims 1 to 24 next to usual Carriers, Aids and / or additives.

Diagnostic composition characterized by their content of one or more compounds after at least one of the claims 1 to 24.

Use of one or more compounds according to at least one of the claims 1 to 24 for the manufacture of a medicament for thrombin inhibition, Inhibition of fibrin formation and / or inhibition of formation one coagulation plug.

Use of one or more compounds according to at least one of the claims 1 to 24 for the preparation of a diagnostic composition.

Use according to claim 28, characterized in that in the compound of formula (I) Y ^{2 is} 7-amido-4-methylcoumarin.

Use according to claim 28, characterized in that in the compound of formula (I) Y ^{2 is} paranitroanilide.

A method for thrombin inhibition of humans and Animal that claims an effective amount of a compound 1 to 19 includes.

A Pharmaceutical Compilation That A effective plug-inhibiting amount of a compound of claim 1 to 19 and a pharmaceutically acceptable carrier. The connections can also be the substrate.

A diagnostic method that links the claim 1 to 19 for thrombin inhibition in humans and mammals used.