DE10141148A1 - Mikrodispenser und Verfahren zur Vorkonzentration - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Mikrodispenser zur Erzeugung einer Vorkonzentration geladener Teilchen in einer Flüssigkeit mit einem Hauptreservoir zur Aufnahme der Flüssigkeit, einem kleineren Vorkonzentratreservoir zur Aufnahme der vorkonzentrierten Flüssigkeit, einem Kanalelement zur Verbindung von Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir und Mitteln zum Anlegen eines elektrischen Feldes in Richtung zwischen dem Hauptreservoir und dem Vorkonzentratreservoir. Weiterhin betrifft die Erfindung einen Mehrfachdispender, mehrere erfindungsgemäße Mikrodispender umfassend, und ein Verfahren zur Vorkonzentration geladener Teilchen, das mit den erfindungsgemäßen Vorrichtungen durchgeführt werden kann.

Description

• Die Erfindung betrifft einen Mikrodispenser und einen Mehrfachdispenser zur Erzeugung einer Vorkonzentration geladener Teilchen in einer Flüssigkeit und ein Verfahren zur Vorkonzentration.
• In der Molekularbiologie werden oft Chips mit in definierter Weise präparierten Spots bestimmter Oligonukleotidsequenzen verwendet, um diese mit einer Probe unbekannter Zusammensetzung zu beladen. Die Hybridisierungsreaktion der auf diesen Chip gespotteten, d. h. bekannten Oligonukleotidsequenzen mit den entsprechenden Gegenstücken in der Probe wird dann im allgemeinen über optische Verfahren wie Fluoreszenzanalyse nachgewiesen. Zum Beispiel bei der Untersuchung von DNA (Desoxyribonukleinsäure) zeigt ein Fluoreszenzsignal auf einem bestimmten Spot das Vorhandensein der jeweils komplementären DNA in der untersuchten Probe an.
• Typische Chipmaße solcher Microarrays liegen heute im Bereich von einigen cm², die Größe der einzelnen Spots beträgt ca. 100 µm. Beim Beladen des Chips mit Probenflüssigkeit wird meist der gesamte Chip mit dieser Probe überschwemmt.
• Dabei wird der Chip im allgemeinen mit einem kleinen Volumen (ca. 10-100 µl) Probenflüssigkeit beladen. Daraufhin wird er mit einem Deckgläschen abgedeckt und in einem Wasserbad z. B. über Nacht bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, um die Hybridisierung der DNA-Fragmente von Probe und Chip zu ermöglichen. Getrieben durch die Diffusion wandern die Probenmoleküle in der Flüssigkeit an die Targetmoleküle an den Spots und binden dort. Die langsame Diffusion begrenzt dabei die Geschwindigkeit der Hybridisierung signifikant. Während der Inkubation, die z. B. etwa 16 Stunden lang durchgeführt wird, legen die DNA-Moleküle nur wenige Millimeter zurück. Ein Spot auf dem Chip kann also in einer solchen Anordnung nur mit dem Probenvolumen im unmittelbaren Umkreis wechselwirken. Die Konzentration der DNA in der Probe muß daher verhältnismäßig hoch sein, um zu gewährleisten, daß die DNA-Moleküle in der Lösung Gelegenheit haben, mit allen Spots auf dem Chip in Wechselwirkung zu treten.
• Bei einer großen Probenmenge ist oftmals angesichts des begrenzten Ausgangsmateriales zwangsläufig die Konzentration der Oligonukleotide in der Probenflüssigkeit sehr gering. Dementsprechend ist die Reaktionskinetik zwischen den Molekülen in der Probenflüssigkeit und den Molekülen auf dem Chip nicht optimal. Dies ließe sich nur durch eine deutliche Erhöhung der Probenkonzentration vermeiden, was wiederum aufgrund der ggf. hohen Kosten für Probensubstanz problematisch ist. Zur Erhöhung der Konzentration werden bei bekannten Techniken z. B. Zentrifugen eingesetzt, wodurch ein zusätzlicher aufwendiger Verfahrensschritt notwendig ist, bei dem die Probenflüssigkeit ein zusätzliches Mal umgeladen werden muß. Wünschenswert wäre dementsprechend eine Vorrichtung, die es ermöglicht, trotz einer ggf. geringen Menge an Ausgangsmaterial eine schnelle und zuverlässige Hybridisierungsreaktion zu ermöglichen.
• Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, mit denen eine genaue Dosierung kleinster Flüssigkeitsmengen hoher Konzentration an einem gewünschten Ort präzise möglich ist.
• Diese Aufgabe wird mit einem Mikrodispenser mit den Merkmalen des Anspruches 1, einem Mehrfachdispenser mit den Merkmalen des Anspruches 17 bzw. einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 22 gelöst. Eine vorteilhafte Verwendung ist Gegenstand des Anspruches 23. Die jeweiligen Unteransprüche sind auf vorteilhafte Ausgestaltungen gerichtet.
• Der erfindungsgemäße Mikrodispenser weist ein Hauptreservoir zur Aufnahme der Flüssigkeit auf. Weiterhin ist ein Vorkonzentratreservoir vorgesehen, das kleinere Ausmaße als das Hauptreservoir hat und zur Aufnahme der vorkonzentrierten Flüssigkeit dient. Die Reservoirs sind durch ein Kanalelement miteinander verbunden. Weiterhin sind Mittel vorgesehen, um ein elektrisches Feld in Richtung zwischen Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir zu erzeugen.
• Der erfindungsgemäße Mikrodispenser kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Vorzugsweise ist der erfindungsgemäße Mikrodispenser jedoch derart ausgestaltet und dimensioniert, daß er sich zur Integration in bzw. auf einem Chip eignet bzw. einen Chip umfaßt. Eine solche Ausführungsform ist kompakt und z. B. mit Techniken aus der Halbleitertechnik einfach herstellbar.
• Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung umfaßt der allgemeine Begriff "Chip" sowohl die bevorzugte Ausführungsform in bzw. auf einem Festkörperchip aus kristallinem Material als auch Strukturen aus anderen Materialien, z. B. Kunststoff. Kristalline Materialien können z. B. LiNbO₃ oder Quarz sein.
• Das Hauptreservoir kann manuell oder mit Hilfe z. B. eines Pipettierroboters mit einer Flüssigkeit befüllt werden, die geladene Teilchen, z. B. DNA-Moleküle, enthält. Die Flüssigkeit verteilt sich in Hauptreservoir, Kanalelement und Vorkonzentratreservoir. Bei typischen Ausmaßen eines entsprechenden Chips eignet sich der erfindungsgemäße Mikrodispenser z. B. zur Konzentration von 1 bis 10 µl-Mengen. Gegebenenfalls wird die Verteilung vom Hauptreservoir zum Vorkonzentratreservoir durch die Kapillarwirkung des Kanalelementes unterstützt. Mit Hilfe der Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes wird entlang des Kanalelementes ein elektrisches Feld erzeugt. Zum Beispiel wird zur Vorkonzentration von DNA-Fragmenten, die negativ geladen sind, das elektrische Feld derart erzeugt, daß die positive Elektrode der Felderzeugungsmittel auf Seiten des Vorkonzentratreservoirs ist und die negative Elektrode auf Seiten des Hauptreservoirs. So werden ähnlich wie bei der Elektrophorese die negativ geladenen Teilchen in Richtung der positiven Elektrode gezogen und sammeln sich im Vorkonzentratreservoir. Auf diese Weise wird eine Vorkonzentration erreicht, deren Stärke abhängig von dem angelegten elektrischen Feld ist.
• Aus dem Vorkonzentratreservoir kann dann die Flüssigkeit definiert und mit einer präzisen Vorkonzentration zur Weiterverarbeitung z. B. auf einen Analysechip mit entsprechenden Untersuchungsspots aufgebracht werden.
• Bei einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikrodispensers kommt ein Chip zum Einsatz, der zwei gegenüberliegende Hauptflächen aufweist. Das Vorkonzentratreservoir ist ein kleiner Hohlraum mit einer Öffnung zu einer dieser Hauptflächen. Das Hauptreservoir ist ein größerer Hohlraum mit einer größeren zweiten Öffnung zur anderen Hauptfläche. Das Kanalelement wird durch eine Kapillare zwischen Vorkonzentratreservoir und Hauptreservoir gebildet.
• Bei dieser vorteilhaften Ausgestaltung ist der Mikrodispenser also innerhalb eines Chips die beiden Hauptflächen verbindend ausgestaltet. Ein solcher Mikrodispenser läßt sich sehr leicht durch die größere Öffnung des Hauptreservoirs befüllen und erlaubt eine präzise Lokalisierung der vorkonzentrierten Flüssigkeit durch die kleine Öffnung des Vorkonzentratreservoirs. Der Mikrodispenser einer solchen Ausführungsform kann direkt mit einem Element zur Weiterverarbeitung verbunden sein, auf das präzise Mengen der vorkonzentrierten Flüssigkeit entladen werden können. Die Entleerung des Vorkonzentratreservoirs erfolgt z. B. mit Hilfe eines Luftstoßes, unter Ausnutzung von piezoelektrischen Verfahren oder thermisch, z. B. durch Erwärmen des Chips, bevorzugt am Kanal zwischen Haupt- und Vorkonzentrationsreservoir. Auch ein solcher Mikrodispenser kann aus Kunststoff gefertigt sein bzw. Kunststoffkomponenten umfassen.
• Zur Erzeugung des elektrischen Feldes sind Elektroden vorgesehen, die ein elektrisches Feld zwischen dem Hauptreservoir und dem Vorkonzentratreservoir erzeugen. Vorteilhafterweise sind solche Elektroden auf der jeweils der Kapillare entfernten Seite von Hauptreservoir bzw. Vorkonzentratreservoir vorgesehen und von außerhalb des Chips kontaktierbar. Solche Elektroden sind leicht an eine Spannungsquelle anzuschließen und gewährleisten eine optimale Ausrichtung des elektrischen Feldes zwischen Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir.
• Bei einer besonders vorteilhaften Weiterbildung ist die größere Öffnung, die sich im Hauptreservoir befindet, trichterförmig ausgestaltet, so daß eine einfache Beladung von außen möglich ist.
• Besonders günstig läßt sich ein Mikrodispenser einsetzen, der ein Volumen des Hauptreservoirs von 1 bis 10 µl aufweist und/oder ein Volumen des Vorkonzentratreservoirs von 5 bis 50 nl. Es ergeben sich charakteristische Dimensionen der Reservoirs im Bereich von 100 µm bis 1 mm, die z. B. bei Mikrolaboranwendungen im Sinne der "Lab-on-the-chip"-Technologie gut handhabbar und kompatibel sind. Es wird eine besonders präzise Vorkonzentration und Aufbringung ermöglicht.
• Ein in einem Chip integrierter Mikrodispenser ist kompakt und ermöglicht eine einfache Fertigung mit Techniken aus der Halbleitertechnik. Bei einer anderen Ausführungsform ist der Mikrodispenser jedoch nicht in einem Chip integriert und ist z. B. aus Kunststoff gefertigt. Die Elektroden sind bei einer solchen Ausführungsform z. B. an den Außenwänden des Haupt- bzw. Vorkonzentratreservoirs vorgesehen.
• Vorteilhafterweise hat bei den oben beschriebenen Ausführungsformen das Kanalelement geringere laterale Ausmaße sowohl als das Vor- als auch als das Hauptreservoir, um die Ladungstrennungsfunktion zu verbessern und die Verteilung der Flüssigkeit beim Befüllen des Mikrodispensers aufgrund der Kapillarwirkung des dünnen Kanalelementes zu verbessern.
• Die oben beschriebenen Ausführungsformen können auch die Funktion einer Mikropipette erfüllen. Die Flüssigkeit kann zur Befüllung wie bei einer Pipette aufgesaugt werden.
• Die oben erläuterten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Mikrodispensers können z. B. mit Hilfe eines x-y-Aktuators über einer Mikro-Titerplatte geführt werden, um deren einzelne Reaktionsflächen zu befüllen.
• Bei einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung des Mikrodispensers ist ein Substrat bzw. Chip, insbesondere ein Festkörperchip aus kristallinem Material, vorgesehen, auf dessen einer Hauptfläche Teilflächen ausgebildet sind, die Benetzungseigenschaften haben, die sich derart von der umgebenden Oberfläche unterscheiden, daß sich eine Flüssigkeit bevorzugt darauf aufhält. Diese Flächen bilden das Hauptreservoir, das Vorkonzentratreservoir, und das Kanalelement. Die Fläche des Hauptreservoirs ist größer als die Fläche des Vorkonzentratreservoirs. Das verbindende Kanalelement hat eine kleinere laterale Ausdehnung in der Richtung senkrecht zur Verbindung des Hauptreservoirs mit dem Vorkonzentratreservoir als die Ausdehnungen der Reservoirs.
• Eine Flüssigkeit, die auf die Fläche des Hauptreservoirs aufgebracht wird, verteilt sich über das Hauptreservoir, das Vorkonzentratreservoir und das Kanalelement. Aufgrund der Benetzungseigenschaften, die dazu führen, daß sich die Flüssigkeit bevorzugt auf den Reservoirflächen und dem Kanalelement aufhält, verläßt die Flüssigkeit in der Regel diese Flächen nicht. Sie wird durch die Oberflächenspannung auf diesen Flächen zusammengehalten, ohne die umgebende Oberfläche zu überschwemmen. Es sind keine Kanäle oder Gräben notwendig, um die Flüssigkeit zu lokalisieren. Ohne Einwirkung von äußerer Kraft verläßt die Flüssigkeit die Reservoirs und das Kanalelement nicht.
• Eine solche Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikrodispensers ist besonders leicht z. B. mit lithographischen Verfahren und Beschichtungstechnologien, wie sie aus der Halbleitertechnik bekannt sind, oder z. B. mit einer Stempeltechnik herstellbar. Es sind keinerlei Ätzprozesse oder Schichtaufbauten notwendig. Aufgrund der planaren Ausgestaltung ist eine Integration in andere chipverwendende Technologien leicht möglich. Eine Kontaktierung über flächige Elektroden ist sehr leicht durchführbar. Ein solcher erfindungsgemäßer Mikrodispenser läßt sich leicht mit anderen Chipbauteilen kombinieren, wie sie heutzutage bereits bei sogenannten "Lab-on-the-chip"-Technologien eingesetzt werden, um kleine Flüssigkeitsmengen im speziellen biologischer Natur zu untersuchen (siehe z. B. O. Müller, Laborwelt 1/2000, Seiten 36 ff.).
• Die unterschiedlichen Benetzungseigenschaften können z. B. durch eine entsprechende Beschichtung entweder des bevorzugten Aufenthaltsbereiches oder dessen Umgebung realisiert werden. Zum Beispiel können hydrophile oder hydrophobe Bereiche definiert werden. Sind die zu untersuchenden Makromoleküle z. B. in wäßriger Lösung enthalten, wird der bevorzugte Aufenthaltsbereich so gewählt, daß er hydrophiler ist als die umgebende Oberfläche. Dies kann entweder durch hydrophile Beschichtung des bevorzugten Aufenthaltsbereiches oder durch eine hydrophobe Umgebung erreicht werden. Eine hydrophobe Umgebung kann z. B. durch eine silanisierte Oberfläche realisiert werden. Die Benetzungseigenschaften können weiterhin durch Mikrostrukturierung moduliert werden, wie es beim sogenannten Lotuseffekt der Fall ist, der auf unterschiedlicher Rauhigkeit der Oberflächen beruht und so unterschiedliche Benetzungseigenschaften bewirkt. Eine solche Rauhigkeitsmodulation kann z. B. durch Mikrostrukturierung der entsprechenden Oberflächenbereiche erhalten werden, z. B. durch chemische Behandlung oder Ionenbestrahlung. Die Herstellung von Bereichen unterschiedlicher Benetzungseigenschaften ist dabei durch Verwendung bereits bekannter lithographischer Verfahren und/oder Beschichtungstechnologien einfach und kostengünstig.
• Das Kanalelement kann dabei eine einzelne Fläche sein, die Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir miteinander verbindet. Bei einer anderen Ausführungsform ist vorgesehen, daß das Kanalelement mehrere im wesentlichen parallele Streifen umfaßt, die jeweils Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir miteinander verbinden und die oben für das Kanalelement beschriebene Benetzungseigenschaften aufweisen. Zwischen den einzelnen Streifen eines derart ausgestalteten Kanalelementes befinden sich Flächen, die ähnliche Benetzungseigenschaften haben wie die Oberflächen der Umgebung des Vorkonzentratreservoirs, des Hauptreservoirs und des Kanalelementes. Eine Flüssigkeitsmenge, die zwei oder mehrere solcher Streifen eines Kanalelementes gleichzeitig berührt, wird hauptsächlich die Streifen des Kanalelementes benetzen und die Zwischenbereiche nicht oder weniger. So ist eine geführte und schnelle Bewegung in dem Kanalelement möglich. Der Zwischenbereich zwischen den einzelnen Streifen des Kanalelementes kann auch derartige Benetzungseigenschaften aufweisen, daß die Flüssigkeit dort zwar weniger gut die Oberfläche benetzt als in den Streifen des Kanalelementes, jedoch besser als mit der Oberfläche der Umgebung von Vorkonzentratreservoir, Hauptreservoir und Kanalelement.
• Vorteilhafterweise werden die Elektroden zur Erzeugung des elektrischen Feldes direkt im Bereich der Reservoirs vorgesehen, um eine möglichst direkte Einwirkung auf die geladenen Teilchen in der Flüssigkeit zu erhalten. Für die Trennung der Ladungen ist nur die Wirkung des elektrischen Feldes nötig. Die Elektroden können also auch eine z. B. biokompatible Beschichtung aufweisen, um den direkten Kontakt der Flüssigkeit mit den Elektroden zu vermeiden.
• Bei einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung dieser Ausführungsform werden die Elektroden durch metallische Oberflächen des Hauptreservoirs und des Vorkonzentratreservoirs gebildet, die ggf. jeweils durch eine dünne, z. B. biokompatible Schicht abgedeckt sind. Das verbindende Kanalelement ist dabei nicht metallisiert. Bei einer solchen Ausgestaltung ist eine optimale Wirkung des elektrischen Feldes auf die Flüssigkeit und zwischen den Reservoirs gewährleistet. Das Vorkonzentratreservoir kann mit einer Pipette oder mit entsprechenden ableitenden Kanälen entleert werden.
• Bei einer besonders vorteilhaften Weiterbildung ist eine Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung auf der Oberfläche des Chips vorgesehen, die derart ausgerichtet ist, daß sie eine Oberflächenschallwelle in Richtung des Vorkonzentratreservoirs erzeugen kann. Eine solche Oberflächenschallwelle ermöglicht durch den Impulsübertrag auf die Flüssigkeit auf der Fläche des Vorkonzentratreservoirs deren Bewegung. So kann das Vorkonzentratreservoir entleert werden. Gegebenenfalls können in Richtung des Oberflächenwellenschallpfades vom Vorkonzentratreservoir weg weisend noch zusätzliche Bereiche mit Benetzungseigenschaften vorgesehen sein, die einen bevorzugten Aufenthalt der Flüssigkeit darauf ermöglichen. Auf diese Weise läßt sich die Flüssigkeit entlang dieser Aufenthaltsbereiche mit Hilfe des Impulsübertrages einer Oberflächenschallwelle bewegen. Solche "Leiterbahnen" können ggf. zu weiteren Verarbeitungsstationen führen, die z. B. auf demselben Chip integriert sind.
• Selbstverständlich können mehrere solche Oberflächenwellenerzeugungseinrichtungen zur Erzeugung von Bewegung in verschiedenen Richtungen vorgesehen sein. Auch eine Befüllung des Hauptreservoirs mit Hilfe eines Impulsübertrages einer von einer Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung erzeugten Oberflächenschallwelle kann vorgesehen sein.
• Vorzugsweise wird die Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung von einem Interdigitaltransducer gebildet, wie er z. B. aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie bekannt ist. Ein solcher Interdigitaltransducer hat ineinander greifende Fingerelektroden und läßt sich auf einfache Weise elektronisch zur Erzeugung einer Oberflächenschallwelle in einem piezoelektrischen Substrat bzw. in einem piezoelektrisch beschichteten Substrat ansteuern. Um einen lateral begrenzten Schallpfad zu erhalten, eignet sich besonders der Einsatz eines sogenannten "getaperten" Interdigitaltransducers, bei dem der Fingerabstand der Fingerelektroden nicht konstant ist.
• Das Kanalelement zwischen Hauptreservoir und Vorkonzentratreservoir kann eine direkte gerade Verbindung sein. Soll ein größeres Volumen oder eine längere Strecke zur Vorkonzentration zur Verfügung stehen, kann sich das Kanalelement bei allen oben beschriebenen Ausführungsformen auch mäanderförmig zwischen Vorkonzentratreservoir und Hauptreservoir erstrecken.
• Ein erfindungsgemäßer Mehrfachdispenser umfaßt mehrere erfindungsgemäße Mikrodispenser in regelmäßiger Anordnung. Eine solche regelmäßige Anordnung von mehreren Mikrodispensern ermöglicht z. B. die einfache und parallele Befüllung einer Mikro-Titerplatte, in der sich entsprechende Spots bzw. Reaktionsstellen in entsprechender regelmäßiger Anordnung befinden. Felder solcher Punkte lassen sich mit einem erfindungsgemäßen Mehrfachdispenser gleichzeitig mit vorkonzentrierter Flüssigkeit befüllen.
• Soll die Ansteuerung der Vorkonzentratreservoirs für einzelne Mikrodispenser individuell vorgenommen werden können, so werden für jeden einzelnen Mikrodispenser individuelle Elektroden vorgesehen, die über entsprechende Ansteuerungseinrichtungen angesprochen werden können.
• Bei einer platzsparenden und einfachen Ausführungsform teilen sich mehrere einzelne Mikrodispenser oder alle Mikrodispenser die Elektroden zur Anlegung des elektrischen Feldes. Eine solche Ausführungsform ist leicht anzusteuern und ermöglicht ein gleichzeitiges Bearbeiten von Flüssigkeiten in den einzelnen Mikrodispensern.
• Besonders effektiv lassen sich erfindungsgemäße Mehrfachdispenser einsetzen, wenn sie eine Arrayanordnung haben, die in ihren Ausmaßen den Ausmaßen von konventionell im Laborbetrieb eingesetzten Mikro-Titerplatten entsprechen. So läßt sich ein erfindungsgemäßer Mehrfachdispenser direkt oberhalb einer Mikro- Titerplatte zur Befüllung der darunter befindlichen Reaktionsgefäße oder Spots einsetzen.
• Zum Beispiel zum Befüllen von Microarrays mit sehr kleinem Rastermaß (z. B. 500 µm) oder anderen Vorrichtungen mit nahe beieinander liegenden Reaktionsspots können die einzelnen Mikrodispenser des erfindungsgemäßen Mehrfachdispensers derart ausgestaltet sein, daß die jeweiligen Kanalelemente so ausgerichtet sind, daß sie das Rastermaß von den Vorkonzentratreservoiren zu den Hauptkonzentratreservoiren in der Arrayanordnung vergrößern. So ist auch bei sehr kleinem Rastermaß des Arrays der Vorkonzentratreservoire und der entsprechenden Ausgänge eine ausreichende Größe von Hauptreservoirs möglich, die eine Verarbeitung entsprechender Flüssigkeitsmengen erlaubt. Als Rastermaß wird dabei der laterale Abstand zweier Reservoirs bzw. Reaktionsspots bezeichnet.
• Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Vorkonzentration geladener Teilchen in kleinen Flüssigkeitsmengen wird eine kleine Flüssigkeitsmenge auf bzw. in ein Hauptreservoir gebracht, das über ein Kanalelement mit einem kleinen Vorkonzentratreservoir in Verbindung steht. Es wird ein elektrisches Feld entlang des Kanalelementes angelegt, um geladene Teilchen entsprechend ihrer Polarität in dem Vorkonzentratreservoir anzusammeln.
• Besonders vorteilhaft lassen sich die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und das erfindungsgemäße Verfahren zur Vorkonzentration von DNA in einer entsprechenden Pufferlösung einsetzen.
• Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren ermöglichen also eine präzise Vorkonzentration, die zudem eine genaue Positionierung des vorkonzentrierten Materiales ermöglicht. Auf diese Weise ist es möglich, einzelne ausgewählte Punkte und Spots mit Flüssigkeit zu beladen, ohne daß es notwendig ist, z. B. einen ganzen Chip zur Untersuchung mit Flüssigkeit zu überschwemmen. Auch bei begrenzter Menge von Ausgangsmaterial läßt sich so eine ausreichende Konzentration in der Flüssigkeit erhalten, da nur sehr wenig Flüssigkeit überhaupt notwendig ist.
• Im folgenden werden die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren anhand bevorzugter Ausgestaltungen im Detail erläutert. Die Figuren sind schematische, nicht notwendigerweise maßstabsgetreue Darstellungen. Es zeigt
• Fig. 1 den Querschnitt durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrodispensers,
• Fig. 2 den Querschnitt einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mehrfachdispensers,
• Fig. 3 die Unteransicht des Mehrfachdispensers der Fig. 2,
• Fig. 4 den Querschnitt einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mehrfachdispensers mit einer Vergrößerung des Bereiches A,
• Fig. 5 die Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrodispensers,
• Fig. 6 eine seitliche Teilschnittansicht einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrodispensers, und
• Fig. 7 eine seitliche Schnittansicht einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrodispensers.
• Fig. 1 zeigt den Querschnitt durch einen Chip 1, der aus Kunststoff gefertigt sein kann. Von der Oberfläche 21 bis zur Oberfläche 19 wird der Chip von einer durchgehenden Öffnung durchsetzt, die sich aus der trichterförmigen Befüllöffnung 9 für das Hauptreservoir 5, dem Kapillarelement 4, dem Vorkonzentratreservoir 7 und der Öffnung 3 zusammensetzt. Der Chip kann einstückig oder aus verschiedenen Schichten zusammengeklebt sein.
• Die Verbindungsöffnung zwischen dem Trichter 9 und dem Hauptreservoir 5 ist mit 17 bezeichnet. An der Unterseite des Chips 1 befindet sich vollflächig die metallische Elektrode 13. Die zweite Elektrode 11 befindet sich zwischen zwei Schichten des Chips 1 in der Höhe des Übergangs zwischen Hauptreservoir 5 und Trichter 9. Die Elektroden dienen dem Anlegen eines elektrischen Feldes E, symbolisch dargestellt durch die Batterie 15. Im dargestellten Fall liegt am Vorkonzentratreservoir 7 der positive Pol der Batterie 15 an. Die Gesamtheit des Mikrodispensers, der in Fig. 1 dargestellt ist, ist mit 2 bezeichnet.
• Ein solcher Mikrodispenser 2 wird wie folgt eingesetzt. Der Dispenser wird von oben mit ca. 1 bis 10 µl durch den Trichter 9 beladen. Dies kann z. B. mit Hilfe eines Pipettierroboters oder manuell erfolgen. Durch die Kapillarwirkung wird die Lösung in die Kapillare 4 im unteren Teil gezogen. Nach Anlegen eines elektrischen Feldes z. B. mit Hilfe der Batterie 15 wird das vorhandene Volumen bezüglich der Ladung der Inhaltsstoffe getrennt. Zum Beispiel bewegen sich bei der angedeuteten Polarität negative Teilchen nach unten. Bei der besonderen Anwendung bei der Behandlung von DNA bewegen sich z. B. negative DNA-Stränge nach unten und positive Ionen nach oben. Die Bestandteile werden so gemäß ihrer Polarität getrennt. Die negativ geladene DNA sammelt sich vorzugsweise um unteren Bereich in der Nähe der positiven Elektrode und führt so zu einer erhöhten Konzentration. Das kleinere untere Vorkonzentratreservoir (ca. 5 bis 50 nl) kann dann durch eine hier nicht näher interessierende Einrichtung z. B. auf piezoelektrischem Wege, thermisch oder durch Luftstoß auf ein geeignetes Substrat entleert werden. Ein solches Substrat kann z. B. eine Mikro-Titerplatte zur weiteren Untersuchung sein.
• In Fig. 2 ist ein erfindungsgemäßer Mehrfachdispenser gezeigt, der aus mehreren Mikrodispensern 2 zusammengesetzt ist. Die Anordnung kann eine beliebig große Anzahl von Mikrodispensern 2 enthalten, was durch die Punkte im rechten Teil der Figur angedeutet sein soll. Selbstverständlich lassen sich die einzelnen Mikrodispenser in einem einzelnen Chip 1 integrieren, der einstückig ausgebildet ist. Bei der gezeigten Ausführungsform teilen sich die einzelnen Mikrodispenser 2 die Elektroden 11 und 13, die von der Spannungsquelle 15 versorgt werden.
• Fig. 3 zeigt die entsprechende Ausführungsform von unten mit Blick auf die Oberfläche 19. Die einzelnen Öffnungen 3 der einzelnen Mikrodispenser 2 sind im Rastermaß a angeordnet. Vorteilhafterweise entspricht das Rastermaß zwischen den einzelnen Mikrodispenseröffnungen 3 dem Rastermaß einer zu befüllenden Mikro-Titerplatte, bzw. einem zu befüllenden Microarray. Typische Titerplatten haben z. B. 96 oder 384 Punkte.
• Die einzelnen Mikrodispenser 2 des Mehrfachdispensers werden wiederum z. B. mit einem Pipettierroboter befüllt. Einzelne Mikrodispenser können mit verschiedenen Flüssigkeiten bzw. mit verschiedenen zu untersuchenden DNA-Proben befüllt werden. Das elektrische Feld zur elektrophoretischen Vorkonzentration der geladenen Fragmente kann parallel an alle Reservoirs angelegt werden, da bei der gezeigten Ausführungsform die Elektroden 11 und 13 für alle Mikrodispenser eingesetzt werden. Bei einer nicht gezeigten Ausführungsform lassen sich die Elektroden der einzelnen Mikrodispenser 2 individuell ansteuern, so daß eine individuelle Steuerung der Vorkonzentration in den einzelnen Mikrodispensern 2 möglich ist.
• Fig. 4 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mehrfachdispensers. Die einzelnen Mikrodispenser 20 haben in ihrem Verlauf angepaßte Kapillarelemente 40. Der Bereich, in dem sich die Öffnungen 3 der Vorkonzentratreservoirs 7 befinden, ist mit A bezeichnet und vergrößert noch einmal in der Figur dargestellt. Mit einer solchen Anordnung, bei der die Kapillarelemente 40 auch eine laterale Distanz überwinden, ist es möglich, daß die Öffnungen 3 der Vorkonzentratreservoirs 7 ein anderes Rastermaß haben als die Öffnungen der Hauptreservoirs 5. So lassen sich die Auslässe 3 der Mehrfachdispenseranordnung an sehr kleine Mikro-Titerplatten, Microarrays oder andere Weiterverarbeitungseinrichtungen anpassen, ohne daß die Volumina der Hauptreservoirs 5 begrenzt sind.
• Eine planare Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikrodispensers ist in Fig. 5 gezeigt. Auf einer Festkörperoberfläche 200 z. B. der Oberfläche eines kristallinen Festkörperchips sind Bereiche "bevorzugten Aufenthaltes" definiert, die miteinander verbunden sind. Bei der gezeigten Ausführungsform sind dies die Bereiche 500, 400 und 700. Die Bereiche 500 und 700 sind metallisch beschichtete Oberflächenbereiche, die das Hauptreservoir 500 und das Vorkonzentratreservoir 700 bilden. Der Bereich 400 ist ein nicht metallischer Bereich, der die Bereiche 500 und 700 miteinander verbindet. Die restliche Oberfläche des Festkörpers 200 ist silanisiert und somit hydrophob, so daß für den Einsatz von wäßrigen Lösungen die Benetzungseigenschaften derart sind, daß sich die Flüssigkeit auf den Bereichen 400, 500 und 700 bevorzugter aufhält als auf dem restlichen Bereich der Festkörperoberfläche 200. Die metallischen Bereiche 500 und 700 sind über entsprechende Verbindungen mit einer Spannungsquelle 15 verbunden. Bei der gezeigten Ausführungsform liegt der positive Pol der Spannungsquelle an dem Vorkonzentratbereich 700 an. Die gesamte derartige planare Mikrodispensereinheit ist mit 22 bezeichnet. Das Hauptreservoir kann z. B. einen Durchmesser von 500 µm, das Vorkonzentratreservoir einen Durchmesser von 100 bis 200 µm und der Bereich 400 eine Breite von 50 bis 100 µm haben.
• Bei der gezeigten Ausführungsform ist zusätzlich eine Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung 600 vorgesehen. Bei der gezeigten Ausführungsform besteht die Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung 600 aus einem Interdigitaltransducer mit ineinander greifenden Fingerelektroden 603, die über flächige Elektroden 601 kontaktiert werden können. Das Substrat 200 ist piezoelektrisch (z. B. LiNbO₃) oder im Bereich der Oberflächenschallwellenerzeugungseinrichtung piezoelektrisch beschichtet. Anlegen eines elektrischen Wechselfeldes mit z. B. einigen 10 bis einigen 100 MHz erzeugt eine Oberflächenschallwelle, die sich in Richtung 605 und der entgegengesetzten Richtung ausbreitet. Die Wellenlänge dieser Oberflächenschallwelle entspricht in bekannter Weise dem Fingerabstand der Elektroden 603. Eine Oberflächenschallwelle wird erzeugt, wenn die anliegende Frequenz die Resonanzbedingung im wesentlichen erfüllt, also dem Quotienten aus Oberflächenschallgeschwindigkeit des Materiales und dem Fingerabstand entspricht. Zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen ist zumindest der Bereich der Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung 600 piezoelektrisch beschichtet oder auf einem piezoelektrischen Substrat aufgebracht.
• 607 bezeichnet einen ebenfalls in seinen Benetzungseigenschaften derart ausgestalteten Bereich, daß er bevorzugt von der Flüssigkeit benetzt wird. Er stellt eine Art "Leiterbahn" für die Flüssigkeit dar. Entweder per Hand, per Pipettierroboter oder unter Einsatz eines Mikrodispensers, wie er in Fig. 1 gezeigt ist, wird ein Tropfen DNA-Lösung auf das Hauptreservoir 500 pipettiert. Dieser Tropfen verteilt sich über die gesamte benetzende Fläche 500, 400, 700. Wird nun zwischen den als Elektroden ausgebildeten metallischen Reservoirflächen 500 und 700 eine elektrische Spannung angelegt, so bewirkt das in der Ebene gerichtete elektrische Feld eine elektrophoretische Trennung geladener Teilchen in der Flüssigkeit. Wird das Reservoir 700 z. B. positiv gegenüber dem Reservoir 500 geladen, so akkumuliert dort negative Ladung, also insbesondere DNA.
• Nachdem sich auf diese Weise eine vorkonzentrierte Lösung eingestellt hat, kann ein elektrisches Wechselfeld an den Interdigitaltransducer 600 angelegt werden. Die erzeugte Oberflächenschallwelle 605 überträgt ihren Impuls auf die vorkonzentrierte Lösung auf der Vorkonzentratfläche 700 und treibt diese aus dem Reservoirbereich. Über entsprechende Leiterbahnen 607 kann sich die Flüssigkeit zu anderen Untersuchungsorten bewegen oder von dem Chip vollständig zu einer anderen Einrichtung entleert werden.
• Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform 32, die nicht in einen Chip integriert ist. 31 bezeichnet ein Plastikröhrchen, vorzugsweise aus biokompatiblem Kunststoff, mit einer Höhe von etwa 1 cm. Daran schließt sich eine metallische nach unten offene Spitze 43 mit einer Öffnung 33 an. Das Plastikröhrchen 31 ist nach oben hin mit der Öffnung 39 geöffnet. Der obere Bereich 35 entspricht einem Hauptreservoir, während der untere Bereich 37 ein Vorkonzentratreservoir darstellt, wobei Haupt- und Vorkonzentratreservoir durch die Kanalstrecke 34 miteinander verbunden sind. 38 bezeichnet schematisch die Flüssigkeitsoberfläche während des Einsatzes. Die metallische Spitze kann innenseitig beschichtet sein, um Kontakt mit der Flüssigkeit zu vermeiden.
• 41 bezeichnet eine ringförmige Metallelektrode, die um das Plastikröhrchen 31 herum gelegt ist. Die untere Spitze 43 ist metallisch und kann direkt als Elektrode eingesetzt werden. Die Elektroden sind mit der Spannungsquelle 15 verbunden.
• Eine solche Ausführungsform kann von oben durch die Öffnung 39 mit einer Flüssigkeit befüllt werden, die zu trennende Bestandteile aufweist. Ebenso kann ähnlich wie bei einer Pipette die Flüssigkeit durch die Öffnung 33 hindurch in die Ausführungsform 32 des Mikrodispensers gesaugt werden. Anlegen einer Spannung mit Hilfe der Spannungsquelle 15 an die Elektroden 41 und 43 in der gezeigten Polarität erzeugt eine Ladungstrennung. Die positiv geladenen Teilchen 45 in der Flüssigkeit bewegen sich nach oben und die negativen Teilchen 46 nach unten. Mit Hilfe z. B. eines pneumatischen Luftstoßes durch die Öffnung 39 wird der untere Bereich 37 der erfindungsgemäßen Ausführungsform 32 des Mikrodispensers nach unten z. B. auf eine Mikro-Titerplatte oder in ein Reaktionsgefäß entleert.
• Fig. 7 zeigt eine Ausführungsform 52, bei der das Kanalelement 54 eine geringere laterale Ausdehnung hat als das Vorkonzentratreservoir 57 und das Hauptreservoir 55. Bei einer solchen Ausführungsform wird die Trennung der positiv geladenen Teilchen 65 und der negativ geladenen Teilchen 66 bei Anlegen einer Spannung in gezeigter Polarität an die Spannungsquelle 15 gegenüber einer Ausführungsform der Fig. 6 noch weiter verbessert. Ebenso wie die Ausführungsform der Fig. 6 kann die Ausführungsform der Fig. 7 auch befüllt werden, indem Flüssigkeit durch die Öffnung 53 hindurch in den Mikrodispenser 52 aufgesogen wird, oder das Hauptreservoir 52 von oben befüllt wird. 58 bezeichnet schematisch die Flüssigkeitsoberfläche während des Einsatzes. Anlegen eines pneumatischen Luftstoßes an die obere Öffnung 59 bewirkt eine Entleerung des Vorkonzentratreservoirs 57 durch die Öffnung 53, wiederum z. B. in ein Reaktionsgefäß oder auf den Punkt einer Mikro-Titerplatte.
• Die Ausführungsformen der Fig. 6 und 7 können z. B. mit Hilfe eines x-y-Aktuators oberhalb einer Mikro-Titerplatte bewegt werden, um deren einzelne Punkte spezifisch zu befüllen. Beide Ausführungsformen können auch trichterförmige Öffnungen zur einfacheren Befüllung aufweisen.
• Die Erfindung ermöglicht also eine einfache Vorkonzentration und Entleerung der vorkonzentrierten Flüssigkeit an definierten Orten. Der Aufbau ist kompakt, einfach und kostengünstig und läßt sich mit Mikrolaboratorien (Lab-on-the-chip) kompatibel verwenden bzw. integrieren. Es sind nur sehr kleine Probenmengen notwendig. Im speziellen bei der Untersuchung von DNA lassen sich auf diese Weise die Hybridisierungszeiten sehr stark verkürzen, da nur wenig Flüssigkeit gebraucht wird und die Konzentration entsprechend höher sein kann, auch wenn nur begrenzt Ausgangsmaterial vorhanden ist.

Claims (23)

1. Mikrodispenser zur Erzeugung einer Vorkonzentration geladener Teilchen in einer kleinen Flüssigkeitsmenge, mit
einem Hauptreservoir (5, 35, 55, 500) zur Aufnahme von Flüssigkeit,
einem Vorkonzentratreservoir (7, 37, 57, 700), das kleiner ist als das Hauptreservoir (5, 35, 55, 500), zur Aufnahme der vorkonzentrierten Flüssigkeit,
einem Kanalelement (4, 34, 40, 54, 400) zur Verbindung von Hauptreservoir (5, 35, 55, 500) und Vorkonzentratreservoir (7, 37, 57, 700), und
Mitteln (11, 13; 41, 43; 61, 63; 500, 700) zum Anlegen eines elektrischen Feldes über das Kanalelement (4, 34, 40, 54, 400) vom Hauptreservoir (5, 500) zum Vorkonzentratreservoir (7, 37, 57, 700).

2. Mikrodispenser nach Anspruch 1, der einen Chip (1), vorzugsweise aus kristallinem Material oder Kunststoff, umfaßt und darin bzw. darauf integriert ist.

3. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 1 oder 2, der in einem Chip (1) mit zwei Hauptflächen (19, 21) gebildet ist, wobei das Vorkonzentratreservoir einen Hohlraum (7) mit einer ersten Öffnung (3) in Richtung einer Hauptfläche (19) des Chips (1) umfaßt, das Hauptreservoir einen größeren zweiten Hohlraum (5) mit einer größeren zweiten Öffnung (17) zu der zweiten Hauptfläche (21) umfaßt und das Kanalelement eine Kapillare (4) zwischen Hauptreservoir (5) und Vorkonzentratreservoir (7) umfaßt.

4. Mikrodispenser nach Anspruch 3, bei dem die Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes Elektroden (11, 13) an der jeweils von der Kapillare (4) entfernten Seite des Hauptreservoirs (5) bzw. des Vorkonzentratreservoirs (7) umfassen und von außerhalb des Chips (1) kontaktierbar sind.

5. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei dem die zweite Öffnung einen trichterförmigen Zugang (9) umfaßt.

6. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 2 bis 5, bei dem das Hauptreservoir (5) ein Volumen von 1 bis 10 µl aufweist.

7. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei dem das Vorkonzentratreservoir (7) ein Volumen von etwa 5 bis 50 nl aufweist.

8. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 1 oder 2, der auf einer Hauptfläche (200) eines Chips zur lateralen Bewegung der Flüssigkeitsmenge gebildet ist, und bei dem das Vorkonzentratreservoir (700), das Hauptreservoir (500) und das Kanalelement (400) Flächen umfassen, deren Benetzungseigenschaften sich von den Benetzungseigenschaften der umgebenden Hauptfläche des Chips derart unterscheiden, daß sich eine Flüssigkeit bevorzugt darauf aufhält, wobei die Fläche des Hauptreservoirs (500) größer ist als die des Vorkonzentratreservoirs (700).

9. Mikrodispenser nach Anspruch 8, bei dem die Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes Elektroden im Bereich der Flächen des Hauptreservoirs (500) und des Vorkonzentratreservoirs (700) umfassen.

10. Mikrodispenser nach Anspruch 9, mit einer biokompatiblen Beschichtung zur Verhinderung des Kontaktes zwischen der Flüssigkeitsmenge und den Elektroden.

11. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 9 oder 10, bei dem das Hauptreservoir (500) und das Vorkonzentratreservoir (700) metallisierte Flächen umfassen, die die Elektroden bilden, und das Kanalelement (400) eine nicht metallisierte Fläche umfaßt.

12. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei dem das Kanalelement mehrere parallele Streifen zwischen Vorkonzentratreservoir und Hauptreservoir umfaßt.

13. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 8 bis 12, mit einer Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung (600) zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen (605) in Richtung des Vorkonzentratreservoirs (700) zur Entleerung des Vorkonzentratreservoirs (700) durch Impulsübertrag auf eine dort befindliche Flüssigkeit.

14. Mikrodispenser nach Anspruch 13, bei dem die Oberflächenwellenerzeugungseinrichtung (600) einen vorzugsweise getaperten Interdigitaltransducer umfaßt.

15. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 8 bis 14, bei dem die Flächen von Hauptreservoir (500), Vorkonzentratreservoir (700) und Kanalelement (400) derart ausgestaltet sind, daß die sie umgebende Oberfläche (200) hydrophober ist als die Flächen des Hauptreservoirs (500), des Vorkonzentratreservoirs (700) und des Kanalelementes (400).

16. Mikrodispenser nach einem der Ansprüche 1 bis 15, bei dem sich das Kanalelement (4, 40, 400) mäanderförmig zwischen Hauptreservoir (5, 500) und Vorkonzentratreservoir (7, 700) erstreckt.

17. Mehrfachdispenser mit mehreren Mikrodispensern nach einem der Ansprüche 1 bis 16 in regelmäßiger Anordnung.

18. Mehrfachdispenser nach Anspruch 17, bei dem die Mikrodispenser über individuelle Elektroden einzeln ansteuerbar sind.

19. Mehrfachdispenser nach Anspruch 17, bei dem sich mehrere Mikrodispenser (2, 20, 22) jeweils die Elektroden teilen.

20. Mehrfachdispenser nach einem der Ansprüche 17 bis 19, bei dem die Mikrodispenser (2, 20, 22) in einer Arrayanordnung angeordnet sind, vorzugsweise kompatibel zu den Ausmaßen konventioneller Mikro-Titerplatten.

21. Mehrfachdispenser nach einem der Ansprüche 17 bis 20, bei dem die Kanalelemente (40) der Mikrodispenser (20) derart geformt sind, daß die regelmäßige Anordnung des Vorkonzentratreservoirs (7, 700) ein kleineres Rastermaß als die regelmäßige Anordnung der Hauptreservoirs (5, 500) hat.

22. Verfahren zur Vorkonzentration geladener Teilchen in kleinen Flüssigkeitsmengen, bei dem die kleine Flüssigkeitsmenge in bzw. auf ein Hauptreservoir (5, 35, 55, 500) gebracht wird, das über ein Kanalelement (4, 34, 40, 54, 400) mit einem Vorkonzentratreservoir (7, 37, 57, 700) in Verbindung steht, und ein elektrisches Feld in einer Richtung erzeugt wird, die im wesentlichen parallel zur Richtung zwischen Hauptreservoir (5, 35, 55, 500) und Vorkonzentratreservoir (7, 37, 57, 700) ist.

23. Verwendung eines Mikrodispensers nach einem der Ansprüche 1 bis 16 bzw. eines Mehrfachdispensers nach einem der Ansprüche 17 bis 21 oder eines Verfahrens nach Anspruch 22 zur Vorkonzentration von Desoxyribonukleinsäure (DNA) in einer Pufferflüssigkeit.