DE10133308A1 - Identifying target cells, useful e.g. for prenatal diagnosis, comprises hybridizing a cellular nucleic acid with energy-transfer donor and acceptor probes - Google Patents
Identifying target cells, useful e.g. for prenatal diagnosis, comprises hybridizing a cellular nucleic acid with energy-transfer donor and acceptor probesInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft den Nachweis von Nukleinsäuren, insbesondere einen in situ Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen zur Identifikation und Separierung der Zellen. The invention relates to the detection of nucleic acids, in particular one in situ detection of nucleic acids in cells for identification and Separation of the cells.
Für wissenschaftliche oder diagnostische Zwecke ist es häufig notwendig, definierte Zelltypen aus einer Gewebeprobe, die überwiegend ein Gemisch verschiedener Zellen darstellt, zweifelsfrei zu identifizieren und nachfolgend - als sog. Zielzellen oder target Zellen - von den übrigen zu separieren. So müssen ggf. Tumorzellen aus peripherem Blut oder Gewebe-Proben zunächst nachgewiesen und anschließend separiert werden. Gleiches gilt für den Nachweis Virus-infizierter oder von Parasiten befallener Zellen. For scientific or diagnostic purposes, it is often necessary Defined cell types from a tissue sample that are predominantly a mixture different cells, can be identified beyond doubt and subsequently - as so-called target cells - to be separated from the rest. So may need tumor cells from peripheral blood or tissue samples first detected and then separated. The same applies to detection of virus-infected or parasite-infected cells.
Die Notwendigkeit der Zellseparierung stellt sich insbesondere bei fötalen
Zellen, wenn diese zu Zwecken der Pränatal-Diagnostik aus perpherem Blut
zunächst von mütterlichen Zellen getrennt werden müssen. Diese
Vorgehensweise wird alternativ zu invasiven Verfahren gewählt, die nicht selten
zur körperlichen Schädigung des Fötus und sogar zu Spontanaborten führen
können:
Beweggründe für eine pränatale Diagnostik liegen z. B. in der Sorge um das
altersbedingte erhöhte Risiko unbalancierter und struktureller
Chromosomenanomalien oder in der Erhebung auffälliger Sonographiebefunde
während der Schwangerschaftsvorsorge, die z. B. von einem ungünstigen
Befund bei der Hautdickenmessung des fötalen Nackenbereichs (nuchal
translucency) (SNIJDERS UND NICOLAIDES, 1996) oder einem Serumscreening
(WALD ET AL., 1995) unterstützt werden. Heute werden allerdings nur 25%
(MINY ET AL., 1999) aller Aneuploidien von Neugeborenen bereits pränatal
diagnostiziert.
The need for cell separation arises in particular in the case of fetal cells if they have to be separated from the mother's blood from peripheral blood for the purpose of prenatal diagnosis. This procedure is chosen as an alternative to invasive procedures, which can often lead to physical damage to the fetus and even to spontaneous abortion:
The reasons for prenatal diagnostics are e.g. B. in the concern about the age-related increased risk of unbalanced and structural chromosomal abnormalities or in the collection of abnormal sonographic findings during prenatal care, which, for. B. supported by an unfavorable finding in the skin thickness measurement of the fetal neck area (nuchal translucency) (SNIJDERS AND NICOLAIDES, 1996) or a serum screening (WALD ET AL., 1995). Today, however, only 25% (MINY ET AL., 1999) of all aneuploidies in newborns are diagnosed prenatally.
Abhängig vom Zeitpunkt der Indikationstellung werden derzeit routinemäßig invasive Verfahren eingesetzt, um fötale Zellen für die weitere Diagnose zu gewinnen. Dabei wird die Amniozentese, d. h. die Punktion der Fruchtblase durch die Bauchwand und Gebärmutterwand, und die Chorionzottenbiopsie, bei der fötale Zellen des Choriongewebes, das sich durch Ausbildung von Zotten in die Schleimhaut der Gebärmutter eingesenkt hat, entnommen werden, eingesetzt. Die Amniozentese, die auf das Erlangen von Amnionflüssigkeit und darin befindlicher fötaler Zellen abzielt, wird im zweiten Trimenon der Schwangerschaft durchgeführt. Die sich anschließende Chromosomenuntersuchung der Fruchtwasserzellkulturen gilt heute als Standardverfahren pränataler cytogenetischer Untersuchung, deren Ergebnisse aber nicht vor dem Ablauf von 7 bis 14 Tagen erwartet werden können. Zur Aufdeckung bestimmter Aneuploidien bei spezifischem Risiko wird häufig die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) eingesetzt (EBEN ET AL., 1998). Depending on the time of indication, are currently becoming routine invasive procedures are used to fetal cells for further diagnosis win. The amniocentesis, i.e. H. puncture of the amniotic sac through the abdominal wall and uterine wall, and the chorionic villus, in the fetal cells of the chorionic tissue, which is formed by the formation of Villi have sunk into the lining of the uterus be used. Amniocentesis, which is based on the attainment of Amniotic fluid and fetal cells located therein is targeted in the second trimester pregnancy. The subsequent one Chromosome examination of amniotic fluid cell cultures is the standard procedure today prenatal cytogenetic examination, but the results are not available can be expected within 7 to 14 days. For detection Fluorescence is often certain aneuploidies at specific risk in situ hybridization (FISH) used (EBEN ET AL., 1998).
Neben den unmittelbaren Risiken der invasiven Eingriffe für das Wohl des Kindes stellt der späte Zeitpunkt der möglichen Diagnosestellung einen wesentlichen Nachteil des Verfahrens dar, da mögliche Schwangerschaftsabbrüche in Folge der negativen Ergebnisse erst im späten zweiten Trimenon erfolgen können. In addition to the immediate risks of invasive surgery for the good of the Child sets the late point in time of the possible diagnosis essential disadvantage of the method, since possible Abortions due to the negative results only in the late second trimester can be done.
Um diese Nachteile der invasiven Methoden zu vermeiden, wird seit langem versucht, gezielt auf die im maternalen Blut zirkulierenden fötalen Zellen zuzugreifen, so z. B. unter anderem durch Proliferation und Selektion erythroider Zellen in Kultur (STAMATOYANNOPOULOS ET AL., 1997). To avoid these disadvantages of invasive methods has been around for a long time tries to target the fetal cells circulating in the maternal blood to access so z. B. inter alia by proliferation and selection erythroid cells in culture (STAMATOYANNOPOULOS ET AL., 1997).
Daneben sind seit mehr als zwei Jahrzehnten Bemühungen bekannt, nukleierte fötale Zellen immunologisch aus maternalem Blut zu separieren (HERZENBERG ET AL., 1979). Der diesen Bemühungen zugrundeliegende Ansatz besteht überwiegend darin, Antikörper oder Liganden an fötale Zellen zu koppeln, die meist mit Fluorophoren (SEKIZAWA, 1999) oder Eisen (TROEGER ET AL., 1999) markiert werden. Nach der Kopplung dieser markierten Sonden an die gesuchten fötalen Zellen werden die Zellen über eine fluoreszenz oder magnetisch aktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting (FACS), magnetic activated cell sorting (MACS)) separiert und stehen diagnostischen Methoden zur Verfügung. In addition, efforts have been known for more than two decades to Separate nucleated fetal cells from maternal blood immunologically (HERZENBERG ET AL., 1979). The basis of these efforts Approach mainly consists of attaching antibodies or ligands to fetal cells to couple, mostly with fluorophores (SEKIZAWA, 1999) or iron (TROEGER ET AL., 1999). After pairing this labeled probes to the searched fetal cells, the cells are passed through a fluorescence or magnetically activated cell sorting (fluorescence activated cell sorting (FACS), magnetic activated cell sorting (MACS)) separated and diagnostic methods are available.
Nach wie vor gibt es jedoch keine Routinemethode, um nukleierte fötale Zellen aus maternalem Blut (HOLZGREVE ET AL., 1992: BIANCHI, 1999) zu isolieren. Ursächlich dafür ist vor allem die Tatsache, daß die Anzahl nukleierter fötaler Zellen im maternalen Blut abhängig ist vom Stadium der Schwangerschaft und von individuellen Faktoren und somit starken Schwankungen (HAMADA ET AL., 1993) unterworfen ist. Bei der Verwendung von Antikörpern besteht ein zusätzliches Problem zudem häufig in der mangelhaften Verfügbarkeit und Spezifität der Antikörper. Diese binden nämlich meist auch unspezifisch an Fc-Rezeptoren anderer Zellen. Außerdem treten unerwünschte Kreuzreaktionen mit anderen Antigenen auf. However, there is still no routine method for isolating nucleated fetal cells from maternal blood (HOLZGREVE ET AL., 1992: BIANCHI, 1999). The main reason for this is the fact that the number of nucleated fetal cells in the maternal blood is dependent on the stage of pregnancy and on individual factors and thus fluctuations (HAMADA ET AL., 1993). An additional problem with the use of antibodies is often the poor availability and specificity of the antibodies. These usually bind non-specifically to F c receptors in other cells. There are also undesirable cross-reactions with other antigens.
Eine Verbesserung der Spezifität wird durch die Verwendung von Liganden erreicht (SERLACHIUS ET AL., 2000), die aufgrund eines langen evolutionären Prozesses für ihren Rezeptor spezifisch sind. Somit sinkt die Wahrscheinlichkeit von unspezifischen Bindungen deutlich im Vergleich mit Antikörpern. Die derart erreichte Spezifität bleibt aber dennoch unzureichend. An improvement in specificity is achieved through the use of ligands achieved (SERLACHIUS ET AL., 2000) due to a long evolutionary Are specific to their receptor. So the sinks Probability of nonspecific binding clearly compared to antibodies. However, the specificity achieved in this way remains insufficient.
Ein weiterer Ansatz basiert auf dem unterschiedlichen Hämoglobinprofil adulter und fötaler erythroider Vorläuferzellen aus maternalem peripheren Blut (BOHMER ET AL., 1998). Doch auch dabei werden fluoreszenzmarkierte Antikörper, nämlich PE-anti-HbF (Phycoerythrin) und FITC-anti-HbA (Fluorescein Isothiocyanate), eingesetzt, um die Zielzellen zu markieren. Another approach is based on the different hemoglobin profile adult and fetal erythroid progenitor cells from maternal peripheral Blood (BOHMER ET AL., 1998). But even here, fluorescence is marked Antibodies, namely PE-anti-HbF (phycoerythrin) and FITC-anti-HbA (Fluorescein isothiocyanate), used to label the target cells.
Eine theoretische Möglichkeit zur Identifikation einer Zielzelle und ihrer anschließenden Isolation liegt in dem Nachweis einer für diese Zelle spezifischen Nukleinsäure. Dazu könnte die Hybridisierung mit einer markierten komplementären Sonde dienen. Diese Vorgehensweise eignet sich in der Praxis allerdings nicht, da bei einem in situ Nachweis nicht-gebundene, d. h. überschüssige Sonden, nicht aus der Zelle ausgewaschen werden können. Sie würden anschließend bei Detektion der Markierung zu unspezifischen und falsch positiven Ergebnissen führen. A theoretical way of identifying a target cell and its subsequent isolation lies in the detection of one for this cell specific nucleic acid. To do this, the hybridization could be marked with a serve complementary probe. This procedure is suitable in the In practice, however, not, because in the case of an in situ detection, H. Excess probes cannot be washed out of the cell. They would then become non-specific when the marking was detected and give false positive results.
Der Erfindung liegt demnach das Problem zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Zellen bereitzustellen. The invention is therefore based on the problem of a method for Provide detection of cells.
Dieses Problem wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand jeweiliger Unteransprüche. This problem is solved with a method according to the Main claim. Advantageous further developments are the subject of each Dependent claims.
Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, eine Nukleinsäure durch die gleichzeitige Hybridisierung mit mindestens zwei markierten Oligonukleotidsonden nachzuweisen, bei denen die Markierung nur detektiert werden kann, wenn beide Sonden in räumlicher Nachbarschaft zueinander liegen. Sofern nur eine Sonde hybridisiert, erzeugt die Markierung in dem erfindungsgemäßen Verfahren dagegen kein Signal. Durch eine in-situ Hybridisierung kann mit dem Nachweis der Hybridisierung gleichzeitig die Identifikation der Zelle erfolgen, die die hybridisierten Nukleinsäuren anschließt. The invention is based on the idea of using a nucleic acid simultaneous hybridization with at least two labeled Detect oligonucleotide probes in which the label can only be detected can, if both probes are in spatial proximity to each other. If only one probe hybridizes, the label creates in the In contrast, the method according to the invention has no signal. Through an in-situ Hybridization can coincide with the detection of hybridization Identification of the cell that connects the hybridized nucleic acids.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem strahlungslosen Energie-
Transfer von einem Fluorophor auf einen anderen. Dieser sog. Fluoreszenz-
Resonanz-Energie-Transfer (FRET) wird auch häufig nach seinem
Entdecker Förster-Resonanz-Energie-Transfer benannt. Hierbei kann ein
angeregter Fluoreszenzfarbstoff (Donor) Energie auf ein räumlich benachbartes
anderes Farbstoffmolekül (Akzeptor) übertragen und dieses zur Fluoreszenz-
Emission anregen. Voraussetzung ist, daß Emissionsspektrum des Donors
und Anregungsspektrum des Akzeptors überlappen. Die Effizienz des
Transfers hängt im hohen Maß vom Abstand der beiden
Fluorophor-Moleküle ab.
EFRET = (1 + (R/R0)6)-1 (Murchie et al., 1989; Masuko et al., 2000)
The method according to the invention is based on the radiationless transfer of energy from one fluorophore to another. This so-called fluorescence resonance energy transfer (FRET) is also often named after its discoverer Förster resonance energy transfer. Here, an excited fluorescent dye (donor) can transfer energy to a spatially adjacent other dye molecule (acceptor) and stimulate it to emit fluorescence. The prerequisite is that the emission spectrum of the donor and the excitation spectrum of the acceptor overlap. The efficiency of the transfer depends to a large extent on the distance between the two fluorophore molecules.
E FRET = (1 + (R / R 0 ) 6 ) -1 (Murchie et al., 1989; Masuko et al., 2000)
EFRET ist die Energie-Transfer-Effizienz, R ist der Abstand zwischen Donor und Akzeptor und R0 ist der charakteristische Abstand für ein Donor-Akzeptor-Paar, bei dem EFRET 0,5 beträgt. EFRET nimmt demnach mit dem Abstand sehr schnell ab und kann für Messungen des Abstands auf molekularer Ebene eingesetzt werden (de Souza et al., 2000, Andrew und Barns, 2000; Norman et al., 2000). E FRET is the energy transfer efficiency, R is the distance between donor and acceptor and R 0 is the characteristic distance for a donor-acceptor pair in which E FRET is 0.5. E FRET therefore decreases very rapidly with distance and can be used to measure distance at the molecular level (de Souza et al., 2000, Andrew and Barns, 2000; Norman et al., 2000).
Zum Nachweis einer Nukleinsäure (Ziel-Nukleinsäure) können zwei für diese Nukleinsäure spezifische Oligonukleotide als Sonden mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, wobei sich das Emissionsspektrum des einen Farbstoffs mit dem Absorptionsspektrum des anderen Farbstoffs überschneidet. Die Sonden sind so gewählt, daß sie bei einer Hybridisierung an ein und dieselbe Nukleinsäure in räumlicher Nachbarschaft zueinander liegen. Dadurch wird ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET, Förster-Resonanz-Energie-Transfer), d. h. ein strahlungsloser Energietransfer, von einem Fluorophor (Donor-Fluorophore) zum anderen (Akzeptor-Fluorophore) möglich. Wird nachfolgend der Donor selektiv angeregt, regt seine Emission seinerseits die Akzeptor-Fluorophore an. Die Emission der Akzeptor-Fluorophore kann anschließend nachgewiesen werden. To detect a nucleic acid (target nucleic acid) two can be used for this Nucleic acid specific oligonucleotides as probes with two different fluorescent dyes are marked, the Emission spectrum of one dye with the absorption spectrum of the other Dye overlaps. The probes are selected so that they Hybridization to one and the same nucleic acid in spatial proximity lie to each other. This will create a Fluorescence resonance energy transfer (FRET, Förster resonance energy transfer), d. H. a radiationless Energy transfer, from one fluorophore (donor fluorophore) to another (Acceptor fluorophores) possible. Subsequently, the donor becomes selective excited, its emission in turn stimulates the acceptor fluorophores. The Emission of the acceptor fluorophores can then be detected.
Der Nachweis der Hybridisierung - und somit indirekt der Nachweis der Ziel- Nukleinsäure - über das Erfassen der Akzeptor-Fluoreszenz nach einer selektiven Anregung der Donor-Fluorophore ermöglicht einen Nukleinsäure spezifischen Nachweis auch in situ, d. h. auch innerhalb der Zelle. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die Akzeptorfluoreszenz nur nach einer tatsächlich erfolgten Hybridisierung beider Sonden durch die Donor-Emission angeregt werden kann. Findet dagegen keine Hybridisierung oder aber die Hybridisierung nur einer Sonde statt, ist die Akzeptorfluoreszenz nicht durch die selektive Anregung der Donor-Fluorophore anregbar. Damit wird - das bei der in situ Hybridisierung - Auswaschen nicht gebundener Sonden - überflüssig. Somit wird der erfindungsgemäße Nachweis hochspezifisch. Proof of hybridization - and thus indirectly proof of target - Nucleic Acid - by detecting acceptor fluorescence after one selective excitation of the donor fluorophores enables a nucleic acid specific detection also in situ, d. H. also inside the cell. This The method has the advantage that the acceptor fluorescence only after one in fact, both probes were hybridized by the donor emission can be stimulated. In contrast, does not find any hybridization or that Hybridization instead of only one probe, the acceptor fluorescence is not through the selective excitation of the donor fluorophores can be excited. So that - that in in situ hybridization - washing out unbound probes - superfluous. The detection according to the invention thus becomes highly specific.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann der Identifikation von Zielzellen dienen. Dazu kann als Ziel-Nukleinsäure eine für die Zielzelle spezifische exprimierte mRNA ausgewählt werden. Die für die Ziel mRNA spezifischen Sonden können beispielsweise mit Fluorescein als Donor-Fluorophor und mit Rhodamin als Akzeptor-Fluorophor markiert werden. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Identifikation fötaler Zellen in maternalem Blut. The method according to the invention can identify target cells serve. For this purpose, a specific one for the target cell can be used as the target nucleic acid expressed mRNA can be selected. The specific for the target mRNA Probes can be used, for example, with fluorescein as the donor fluorophore and with Rhodamine be labeled as an acceptor fluorophore. This approach is suitable for the identification of fetal cells in maternal blood.
In weiteren möglichen Ausführungsformen können die in der nachfolgenden
Tabelle 1 aufgeführten "Fluorophoren-Pärchen" verwendet werden:
In further possible embodiments, the "fluorophore pairs" listed in Table 1 below can be used:
Durch Anregungs-Emissions-Spektroskopie (AES) kann anschließend ein spezifischer FRET in einer Zellsuspensionen nachgewiesen werden und somit der eindeutige Nachweis der Zielzellen erfolgen. Vorteilhafterweise kann dazu eine Zellsuspension in einer Küvette im Anregungs-Emissions-Spekrometer analysiert werden. Die Anregung erfolgt dabei beispielsweise durch eine Xenon-Lichquelle mit Anregungs-Monochromator oder alternativ durch geeignete Laser (z. B. Argon-Laser zur Fluorescein-Anregung). Die Emission kann durch eine CCD-Kamera mit vorgeschaltetem Nachweismonochromator analysiert werden. An excitation emission spectroscopy (AES) can then be used specific FRET can be detected in a cell suspension and thus the clear detection of the target cells. Can advantageously a cell suspension in a cuvette in the Excitation emission spectrometers are analyzed. The suggestion is made by, for example a xenon light source with excitation monochromator or alternatively by suitable lasers (e.g. argon lasers for fluorescein excitation). The emission can by a CCD camera with upstream Detection monochromator to be analyzed.
Ein FRET kann in einer alternativen Ausführunsgform des erfindungsgemäßen Verfahrens auch im Fluoreszenzmikroskop (z. B. Axiovert 135, Zeiss) bei einer geeigneten Filterkombination aus einem Anregungs-Filter und einem Emissions-Filter untersucht werden. Einzelne Zellen können somit im Mikroskop aufgrund einer Akzeptorfluoreszenz nach selektiver Donoranregung identifiziert werden. An FRET can be in an alternative embodiment of the The inventive method also in the fluorescence microscope (z. B. Axiovert 135, Zeiss) a suitable filter combination of an excitation filter and a Emission filters are examined. Individual cells can thus Microscope based on acceptor fluorescence after selective donor excitation be identified.
Darüber hinaus ist es vorteilhaft, das Verfahren mit weiteren Fluoreszenz- Untersuchungen beispielsweise einer DAPI-Färbung der Zeltkerne, oder mit Antikörper-Färbungen oder einer weiteren mRNA-FRET-in situ-Hybridisierung zu kombinieren, um eine sehr hohe Zellspezifität zu erreichen. In addition, it is advantageous to use additional fluorescence Investigations, for example, of a DAPI staining of the tent cores, or with Antibody stains or another mRNA FRET-in Combine situ hybridization to achieve a very high cell specificity.
Eine Identifikation und Auftrennung von Zielzellen aus einem Zellgemisch kann auch mittels eines Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometers (FACS) erfolgen. Diese sind besonders geeignet für die selektive Anregung und Emissions-Analyse auf Einzelzellebene. Hierbei kann die Anregung durch eine Xenon-Lichtquelle mit vorgeschaltetem Anregungsmonochromator oder durch einen geeigneten Laser (z. B. Argon-Laser zur Fluorescein- Anregung) erfolgen. Die Emission im Bereich der Akzeptor-Fluoreszenz wird als Separationskriterium eingesetzt. Nur Zellen mit Akzeptorfluoreszenz, mit einem FRET als Nachweis der spezifischen Nukleinsäure werden aussortiert. Weitere Kriterien, wie z. B. Zell-Größe (Forwardscatter) können zusätzlich zur Separation eingesetzt werden. An identification and separation of target cells from a cell mixture can also be done using a fluorescence-based flow cytometer (FACS). These are particularly suitable for selective excitation and emission analysis at the single cell level. Here, the suggestion by a xenon light source with upstream Excitation monochromator or by a suitable laser (e.g. argon laser for fluorescein Suggestion). The emission in the area of acceptor fluorescence is used as a separation criterion. Only cells with acceptor fluorescence, with a FRET as proof of the specific nucleic acid sorted out. Other criteria, such as B. cell size (forward scatter) can can also be used for separation.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur spezifischen Detektion und Separierung fötaler Zellen (nukleierte Erythrozyten oder Trophoblasten) aus dem peripheren Blut schwangerer Frauen. Als fötalspezifische ZielmRNA eignet sich insbesondere die mRNA des g-Globingens (für fötale Erythrozyten) oder Trophoblasten-spezifische mRNAs (für Trophoblasten). The method according to the invention is also suitable for specific Detection and separation of fetal cells (nucleated erythrocytes or Trophoblasts) from the peripheral blood of pregnant women. As fetal specific The mRNA of the g-globin gene (for fetal Erythrocytes) or trophoblast-specific mRNAs (for trophoblasts).
Dazu kann das periphere Blut der Schwangeren zunächst vorgereinigt werden, um anschließend die Fraktion mit fötalen Zellen mit den markierten Oligonukleotiden zu inkubieren. Anschließend werden die Zellen im Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometer (FACS) separiert. Hierbei wird spezifisch der Donor-Fluoreszenz-Farbstoff angeregt und die Emission des Akzeptors analysiert. Es können nur die Zellen, welche die Ziel mRNA hybridisiert mit beiden Oligonukleotiden enthalten, eine FRET-bedingte Akzeptor- Fluoreszenz zeigen. For this purpose, the peripheral blood of the pregnant woman can first be pre-cleaned to subsequently label the fraction with fetal cells with the Incubate oligonucleotides. Then the cells in the Fluorescence-based flow cytometer (FACS) separated. Here will specifically the donor fluorescent dye is stimulated and the emission of the Acceptors analyzed. Only the cells that target the mRNA can hybridized with both oligonucleotides containing a FRET-related acceptor Show fluorescence.
Auf diese Weise können hochspezifisch die fötalen Zellen (mit Akzeptorfluoreszenz) aussortiert werden. Um die Empfindlichkeit der Methode zu steigern kann zur Anregung ein Laser eingesetzt werden. In this way, the fetal cells (with Acceptor fluorescence) are sorted out. To increase the sensitivity of the method a laser can be used for excitation.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Fig. 1 bis 4 sowie anhand eines Ausführungsbeispiels des näheren erläutert. The invention is explained below with reference to FIGS. 1 to 4 and with the aid of an embodiment of the closer.
Fig. 1 Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens:
Die Oligonukleotide (Sonden) mit dem Donor-Fluoreszenzfarbstoff
(F = Flourescein) bzw. dem Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff
(R = Rhodamin) hybridisieren mit der Ziel-Nukleinsäure (hier mRNA
eines Zielgens) und erreichen damit eine enge räumliche
Nachbarschaft. Wird der Donor selektiv angeregt, kommt es zu einem FRET,
der eine meßbare Emission des Akzeptorfarbstoffs erzeugt.
Fig. 1 Principle of the method:
The oligonucleotides (probes) with the donor fluorescent dye (F = fluorescein) or the acceptor fluorescent dye (R = rhodamine) hybridize with the target nucleic acid (here mRNA of a target gene) and thus achieve close spatial proximity. If the donor is selectively excited, a FRET is produced, which produces a measurable emission of the acceptor dye.
Fig. 2 Fluoreszenzspektren und FRET-Messung
- a) Anregungs- und Emissionsspektrum von Flurescein und Rhodamin. Der Bereich in dem Emissions-Spektrum von Fluorescein, der mit dem Anregungsspektrum von Rhodamin überlappt, ist grau hinterlegt. Die Pfeile zeigen die Anregung und Detektion der FRET-Messung.
- b) Anregungs-Emissions-Spektroskopie (AES)
- a) Excitation and emission spectrum of flurescein and rhodamine. The area in the emission spectrum of fluorescein that overlaps with the excitation spectrum of rhodamine is highlighted in gray. The arrows show the excitation and detection of the FRET measurement.
- b) Excitation Emission Spectroscopy (AES)
Fig. 3, 3a) Zweidimensionale Darstellung der FRET-Spektroskopie links: positiver FRET-Nachweis (siehe Pfeil); rechts: Kontrolle ohne Ziel-mRNA Fig. 3, 3a) Two-dimensional representation of FRET spectroscopy left: positive FRET detection (see arrow); right: control without target mRNA
3b) FRET-Spektroskopie Emissions- und Anregungs-Spektren links: Emissions-Spektrum bei Anregung bei 468 nm, positiver FRET mit Ziel-Transkript und Kontrolle ohne Ziel mRNA. Der FRET-Effekt zeigt sich in der Verschiebung der Emssion, der Reduktion der Fluorescein-Emission bei 520 nm um 35% und dem Anstieg der Rhodamin-Emission bei 620 nm gegenüber dem Kontrollexperiment. Rechts ist das Anregungsspektrum gezeigt, optimaler FRET wird bei Anregung mit 468 nm erreicht und nicht, wie erwartet, beim Anregungs-Optimum von Fluorescein (490 nm). Bei Anregung mit dem Argon-Laser (488 nm) ist ein sehr guter FRET nachweisbar. 3b) FRET spectroscopy emission and excitation spectra left: emission spectrum with excitation at 468 nm, more positive FRET with target transcript and control without target mRNA. The FRET effect manifests itself in the shift of the emission, the Reduce fluorescein emission at 520 nm by 35% and against the increase in rhodamine emission at 620 nm the control experiment. The excitation spectrum is on the right shown, optimal FRET is achieved with excitation at 468 nm and not, as expected, the excitation optimum of Fluorescein (490 nm). When excited with the argon laser (488 nm) a very good FRET is detectable.
Fig. 4 Flußdiagramm für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der nicht-invasiven Pränataldiagnostik Fig. 4 flow chart for the application of the method according to the invention in non-invasive prenatal diagnostics
Nachweis und Deparation fötaler Zellen aus dem peripheren Blut von Schwangeren. Detection and separation of fetal cells from the peripheral blood of Pregnant women.
Als fötalspezifische Ziel-mRNAs eignet sich insbesondere die mRNA des γ- Globingens (für fötale Erythrozyten) oder Trophoblasten-spezifische mRNAs (für Trophoblasten). The mRNA of the γ- is particularly suitable as fetal-specific target mRNAs. Globingens (for fetal erythrocytes) or trophoblast-specific mRNAs (for trophoblasts).
Das periphere Blut der Schwangeren wird zunächst vorgereinigt, um anschließend die Fraktion mit fötalen Zellen mit den markierten Oligonukleotiden (Sonden) zu inkubieren. The peripheral blood of the pregnant woman is first pre-cleaned to then the fraction with fetal cells with the marked ones Incubate oligonucleotides (probes).
Geeignete Oligonukleotide sind:
Suitable oligonucleotides are:
Die Oligonukleotide können nach Vorgabe der Firma MWG-Biotech AG,
Ebersberg hergestellt werden.
Fötaler DNA-Seguenzabschnitt Homo sapiens Gamma-Globin am ersten
Intron (SEQ. ID No. 3. SEQ. ID No. 4)
mRNA Gamma-Globin mit Markierung für 5 bp-Abstand (SEQ. ID. No. 5)
The oligonucleotides can be produced according to the specifications of MWG-Biotech AG, Ebersberg. Fetal DNA segment of Homo sapiens gamma globin on the first intron (SEQ. ID No. 3. SEQ. ID No. 4)
mRNA gamma globin labeled for 5 bp spacing (SEQ. ID. No. 5)
Die Zellinie K-562 (Chronische myelogene Leukämie, human) stammt von einer 53 jährigen, an chronischer myelogener Leukämie erkrankten Frau. Die Zellen wurden aus einer pleuralen Effusion (Lozzo und Lozzio, 1975) isoliert. Sie exprimieren fötales Hämoglobin (Hb F). The cell line K-562 (chronic myelogenic leukemia, human) comes from a 53 year old woman suffering from chronic myelogenous leukemia. The Cells were made from a pleural effusion (Lozzo and Lozzio, 1975) isolated. They express fetal hemoglobin (Hb F).
Die Zellinie dient als Modell für fötale Erythrozyten und kann von American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA bezogen werden. The cell line serves as a model for fetal erythrocytes and can be used by American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA.
Zur Transfektion der Zellen mit den Oligonukleotiden (Sonden) wurde nach
der Calciumphosphat-Methode gearbeitet. Der Standardansatz gestaltet sich
wie folgt:
The calcium phosphate method was used to transfect the cells with the oligonucleotides (probes). The standard approach is as follows:
Als Kontrolle dient jeweils ein Ansatz mit nur je einer Sonde (γ-Globin-D und γ-Globin-A). An approach with only one probe each (γ-globin-D and γ-globin A).
Die Oligonukleotide und Wasser werden gemischt und mit 2 M CaCl2 versetzt. Unter ständigem Vortexen werden anschließend 150 µl 2 × HBS Phosphatpuffer langsam hineinpipettiert. Die Lösung sollte danach leicht trüb sein, verursacht durch das Calciumphosphat-DNA-Präzipitat. Dieser Ansatz wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transfektionslösung wird nachfolgend langsam zu den zu transfizierende Zellen (Zeltzahl: 106) zugeben. The oligonucleotides and water are mixed and 2 M CaCl 2 are added. 150 µl of 2 × HBS phosphate buffer are then slowly pipetted in with constant vortexing. The solution should then be slightly cloudy, caused by the calcium phosphate DNA precipitate. This approach is incubated for 30 minutes at room temperature. The transfection solution is then slowly added to the cells to be transfected (number of tents: 10 6 ).
Die Transfektionszeit beträgt 8 bis 16 Stunden. Die K-562-Zellen befinden sich in suspensorischer Lösung und müssen nicht trypsiniert werden. Die K-562-Zellen werden in Greinerröhrchen überführt und mit 1000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 5 ml PBS resuspendiert. Der Ansatz wird erneut für 3 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert. Noch einmal wird der Überstand verworfen und das Pellet in 1,5 ml PBS (Phosphate Buffered Saline: 137 mM NaCL, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, pH 7,1) resuspendiert. Die resuspendierten transflzierten K-562-Zellen werden im Anregungs-Emissionsspektrometer oder alternativ im Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometer analysiert. The transfection time is 8 to 16 hours. The K-562 cells are in suspensory solution and do not need to be trypsinized. The K-562 cells are transferred to Greiner tubes and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes. The supernatant is discarded and the pellet is resuspended with 5 ml PBS. The mixture is centrifuged again for 3 minutes at 1000 rpm. The supernatant is again discarded and the pellet in 1.5 ml PBS (phosphate buffered saline: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 , 1.47 mM KH 2 PO 4 , pH 7 , 1) resuspended. The resuspended, transfected K-562 cells are analyzed in the excitation emission spectrometer or alternatively in the fluorescence-based flow cytometer.
Der gewaschene Transfektionsansatz mit 106 K-562-Zellen wird direkt in die Messküvette des AE-Spektrometers überführt. The washed transfection batch with 10 6 K-562 cells is transferred directly into the measuring cuvette of the AE spectrometer.
Die Anregungs-Emissions-Spektroskopie ist eine Fortführung und Erweiterung der etablierten statischen Fluoreszenz-Spektroskopie. Bei der AES wird beim Durchlaufen eines gewünschten Wellenlängenbereichs zur Anregung eines Fluorophors gleichzeitig für jede Anregungswellenlänge ein Emissionsspektrum im gewünschten Wellenlängenbereich aufgenommen. Die AE- Spektren enthalten wesentlich mehr Information über die statischen Fluoreszenzeigenschaften als herkömmliche Fluoreszenz-Spektren. The excitation emission spectroscopy is a continuation and Extension of the established static fluorescence spectroscopy. At AES when going through a desired wavelength range for excitation of a fluorophore simultaneously for each excitation wavelength Emission spectrum recorded in the desired wavelength range. The AE Spectra contain much more information about the static Fluorescence properties than conventional fluorescence spectra.
Der hier zugrunde liegende Aufbau des Meßsystems ist in Abb. 2b dargestellt. Licht mit einem kontinuierlichem Spektrum wird über Linsen auf den Eintrittsspalt des Anregungsmonochromators fokussiert. In diesem wird das Licht durch ein Plangitter spektral zerlegt und das Spektrum auf den Austrittsspalt abgebildet. Dessen Breite bestimmt den Ausschnitt des Spektrums, das durch den Spalt hindurchtreten kann. Von dort austretend wird das Licht über eine Fokussierlinse auf die Meßküvette gelenkt, welche durch eine verschiebbare Probenhalterung so eingestellt ist, daß das effektive Meßvolumen in der vorderen Ecke und der dem Nachweismonochromator zugewandten Seite liegt. Der gesamte Meßbereich liegt während der Messung unter einem mattschwarzen Gehäuse, welches nur Öffnungen für den Eintritts- und Austrittsstrahl besitzt. The structure of the measuring system on which this is based is shown in Fig. 2b. Light with a continuous spectrum is focused on the entrance slit of the excitation monochromator via lenses. In this, the light is spectrally broken down by a plane grating and the spectrum is mapped onto the exit slit. Its width determines the section of the spectrum that can pass through the gap. Leaving from there, the light is directed via a focusing lens onto the measuring cuvette, which is adjusted by means of a sliding sample holder so that the effective measuring volume lies in the front corner and the side facing the detection monochromator. The entire measuring range lies under the matt black housing during the measurement, which has only openings for the entrance and exit beam.
Die Detektion des emittierten Lichts erfolgt rechtwinklig zum eintretenden Lichtstrahl und wird durch eine zwischengeschaltete Optik auf die Eintrittsöffnung des Nachweismonochromators fokussiert. In diesem wird das Licht wiederum durch ein Gitter spektral zerlegt. In der Austrittsebene des Nachweismonochromators ist ein Bildverstärker nachgeschaltet. Das Fluoreszenzlicht wird dann mit Hilfe einer CCD-Kamera detektiert. The light emitted is detected at right angles to the incoming light Light beam and is interposed on the optics Detection monochromator entrance opening focused. In this is the light again spectrally decomposed by a grating. In the exit plane of the Detection monochromator is followed by an image intensifier. The Fluorescence light is then detected using a CCD camera.
Aus der mit Hilfe des Programms DaVis 5.1.2 rechnergesteuerten Bildaufnahme errechnet das Programm die Falschfarbendarstellung der Bilder. Um genügend Intensität zu erhalten wird ein Rohdatenbild über 300-500 Einzelbilder summiert. Aus diesen wird dann ein gemitteltes horizontales Profil erstellt, welches dem statischen Spektrum dieser Anregungswellenlänge entspricht. Durch das Aneinanderreihen der Profile verschiedener Anregungswellenlängen erhält man dann ein AE-Spektrum. Diese so erhaltenen Bilder enthalten die statischen Anregungsspektren in vertikaler Richtung und die statischen Emissionsspektren in horizontaler Richtung. Somit enthält ein AE-Spektrum (Abb. 3) aufgrund seiner Zweidimensionalität wesentlich mehr Informationen. Anhand des Nachweises eines FRET können somit die Zielzellen (z. B. 562-Zellen) qualitativ und hochspezifisch nachgewiesen werden. The program calculates the false color representation of the images from the computer-controlled image acquisition using the DaVis 5.1.2 program. In order to obtain sufficient intensity, a raw data image is summed up over 300-500 individual images. An averaged horizontal profile is then created from these, which corresponds to the static spectrum of this excitation wavelength. An AE spectrum is then obtained by lining up the profiles of different excitation wavelengths. These images thus obtained contain the static excitation spectra in the vertical direction and the static emission spectra in the horizontal direction. An AE spectrum ( Fig. 3) therefore contains considerably more information due to its two-dimensionality. Based on the detection of an FRET, the target cells (e.g. 562 cells) can be detected qualitatively and highly specifically.
Der gewaschene Transfektionsansatz mit 106 K-562-Zellen wird mit anderen
Zellen gemischt oder direkt zur Separation im PASIII-FACS-Gerät (PARTEC,
Münster) eingesetzt. Die Anregung erfolgt durch einen 488 nm Argon-Laser.
Die Emission wird bei 613 nm analysiert. Zusätzlich kann DAPI-Färbung der
Zellkerne analysiert werden. Routinemäßig kann die Partikel bzw. Zellgröße
bestimmt werden (Forewardscatter). Die FRET-positive Zeilpopulation wird
gezählt und im Fraktionssammler aufgefangen. Die im Hüllstrom verdünnten
Zellen werden je nach Zellzahl per Cytospin auf einen Objektträger
zentrifugiert und im Fluoreszenzmikroskop kontrolliert. Die separierten Zellen
können nun jeder gewünschten Diagnostik unterzogen werden.
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The washed transfection batch with 10 6 K-562 cells is mixed with other cells or used directly for separation in the PASIII-FACS device (PARTEC, Münster). The excitation is carried out by a 488 nm argon laser. The emission is analyzed at 613 nm. DAPI staining of the cell nuclei can also be analyzed. The particles or cell size can be determined routinely (forewards scatter). The FRET positive line population is counted and collected in the fraction collector. Depending on the number of cells, the cells diluted in the enveloping stream are centrifuged on a slide using cytospin and checked in a fluorescence microscope. The separated cells can now be subjected to any desired diagnosis. References Andrew P, Barnes WL. (2000) Förster energy transfer in an optical microcavity. Science. 290: 785-788.
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