DE10130172A1

DE10130172A1 - New oxonol derivatives, used as fluorescent dyes for detecting cell membrane potential, especially in high throughput screening, are optionally bridged alpha,omega-bis-barbitur-5-yl-mono- and poly-methine compounds

Info

Publication number: DE10130172A1
Application number: DE2001130172
Authority: DE
Inventors: Eloisa Lopez-Calle; Joachim Fries
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2001-06-22
Publication date: 2003-01-09

Abstract

New oxonol derivatives are optionally bridged and/or substituted symmetric and asymmetric alpha ,w-bis-barbitur-5-yl-mono- and poly-methine compounds (I). New oxonol derivatives are optionally bridged and/or substituted symmetric and asymmetric alpha ,w-bis-barbitur-5-yl-mono- and poly-methine compounds of formula (I). R<1>-R<9> = R or in pairs form an optionally substituted, saturated or unsaturated bridge; R = H, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxy, alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyano, carbonyl, acyl, acyloxy or carbonylamido; and n, m = 0 or positive integer.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fluoreszenz-Farbstoffderivate, insbesondere Oxonol-Farbstoffderivate und ihre Anwendung als Fluoreszenzfarbstoffe zur Detektion des Membranpotentials von Zellen. The present invention relates to Fluorescent dye derivatives, especially oxonol dye derivatives and their Application as fluorescent dyes for the detection of Membrane potential of cells.

Seit den späten 60er Jahren sind Fluoreszenzfarbstoffe, die in der Lage sind, das Membranpotential in lebenden Zellen zu detektieren, in der Wissenschaft etabliert. Das Membranpotential in Zellen wird durch die Ungleichverteilung von Ionen, insbesondere Kalium-, Natrium- und Chloridionen sowie intrazellulären Bestandteilen, insbesondere Proteinen, hervorgerufen und kann durch Ionenkanäle und Ionenpumpen moduliert werden. Since the late 1960s, fluorescent dyes have been used in are able to increase the membrane potential in living cells detect, established in science. The membrane potential in cells due to the uneven distribution of ions, especially potassium, sodium and chloride ions as well intracellular components, especially proteins, and can be modulated by ion channels and ion pumps.

Zur Untersuchung des Membranpotentials, das u. a. bei Aktionspotentialen während der Reizweiterleitung im Nervengewebe oder im Herzen sowie bei der Proliferation von Zellen eine wesentliche Rolle spielt, wurden verschiedene Farbstoffklassen entwickelt, die sich in langsame oder schnelle Farbstoffe unterteilen lassen (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). Schnelle Farbstoffe zeichnen sich durch eine Veränderung ihrer Elektronenverteilung nach Veränderung des Membranpotentials aus, was schließlich zu veränderten Fluoreszenzeigenschaften führt. Die Änderungen in der Fluoreszenz sind allerdings gering. Bei langsamen Farbstoffen führt eine Veränderung des Membranpotentials zu einer Umverteilung zwischen dem Inneren und dem Äußeren der Zelle. Innerhalb der Zelle binden diese Farbstoffe an intrazelluläre Bestandteile, wodurch die Fluoreszenzausbeute erhöht wird (Plásek, J. und Sigler K. To investigate the membrane potential, which u. a. at Action potentials during the transmission of stimuli in nerve tissue or in the heart as well as in the proliferation of cells Different classes of dyes play an important role Developed into slow or fast dyes subdivide (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). Fast dyes are characterized by a Change in their electron distribution after changing the Membrane potential from what eventually changed Fluorescence properties leads. The changes in fluorescence are however slight. With slow dyes one leads Change in membrane potential to redistribute between Inside and outside of the cell. Tie inside the cell these dyes to intracellular components, causing the Fluorescence yield is increased (Plásek, J. and Sigler K.

1996. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 33, 101-124). Die Veränderung der Fluoreszenz (und somit das Signal in Abhängigkeit einer bestimmten Veränderung des Membranpotentials) ist deutlich größer verglichen mit den Änderungen der schnellen Farbstoffe. Aus diesem Grund eignen sich langsame Farbstoffe besser für Testverfahren, insbesondere Hochdurchsatz-Screening-Verfahren, in denen eine hohe Dynamik des Meßsignals gewährleistet sein muß. Diese Hochdurchsatz- Screening-Verfahren können beispielsweise zur Identifizierung von Substanzen, die beispielsweise Ionenkanäle modulieren, verwendet werden. Solche Verfahren sind insbesondere für die Suche nach biologisch aktiven oder pharmazeutisch wirksamen Verbindungen relevant. 1996. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 33, 101-124). The change in fluorescence (and thus the Signal depending on a specific change in the Membrane potential) is significantly larger compared to the Changes in fast dyes. For this reason, are suitable slow dyes better for test procedures, in particular High-throughput screening procedures in which high dynamics the measurement signal must be guaranteed. This high throughput Screening methods can be used for identification, for example substances that modulate ion channels, for example, be used. Such procedures are particularly useful for Search for biologically active or pharmaceutically active Connections relevant.

Unter den langsamen Farbstoffen zeichnen sich die bis- Oxonolderivate durch ihre vergleichbar hohe Änderung ihrer Fluoreszenz aufgrund der membranpotentialabhängigen Transmembranverteilung aus (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). Bei einer Depolarisierung der Zelle dringen sie durch die Membran in die Zellen ein und binden dort an intrazelluläre Bestandteile, was zu einer erhöhten Fluoreszenzausbeute, einer erhöhten Fluoreszenzlebensdauer sowie einer leichten Rotverschiebung der Emissionswellenlänge führt (Epps, D. E., Wolfe, M. L. and Groppi, V. 1994. Chemistry and Physics of Lipids, 137-150). Unter den bis-Oxonolen wiederum ist DiBAC(4)3 am weitesten verbreitet, da es neben hohen Änderungen der Fluoreszenz bei einer Verschiebung des Membranpotentials, verglichen mit strukturell verwandten Molekülen wie DiBAC(4)5, weniger toxisch für lebende Zellen ist. Zudem interagiert DiBAC(4)3 aufgrund seiner negativen Ladung, im Gegensatz zu positiv geladenen Farbstoffen wie beispielsweise den Rhodaminen, weniger stark mit intrazellulären Organellen wie den Mitochondrien und ist deswegen besonders für eine Detektion des Membranpotentials an der Plasmamembran geeignet. Among the slow dyes, the bis- Oxonol derivatives due to their comparably high change in their Fluorescence due to the membrane potential dependent Transmembrane distribution from (Molecular Probes, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Chapter 25, sixth edition, 1996). They penetrate when the cell is depolarized the membrane into the cells and bind there intracellular components, which leads to an increased fluorescence yield, an increased fluorescence lifetime as well as a slight Red shift of the emission wavelength leads (Epps, D.E., Wolfe, M.L. and Groppi, V. 1994. Chemistry and Physics of Lipids, 137-150). Among the bis-oxonols is in turn DiBAC (4) 3 most widely used as it is high Changes in fluorescence when the Membrane potential compared to structurally related molecules such as DiBAC (4) 5, is less toxic to living cells. moreover DiBAC (4) 3 interacts due to its negative charge, in Contrary to positively charged dyes such as the rhodamines, less strongly with intracellular organelles like the mitochondria and is therefore special for one Detection of the membrane potential on the plasma membrane is suitable.

Die Fluoreszenzquantenausbeute der bekannten bis-Oxonole ist stark temperaturabhängig und steigt bei niedrigeren Temperaturen. Da in zellulären Hochdurchsatz-Screening-Verfahren eine physiologische Temperatur von 37°C angestrebt wird, ist es wichtig, bis-Oxonolderivate zur Hand zu haben, deren Fluoreszenzquantenausbeute auch bei physiologischen Temperaturen hoch genug ist, um eine optimale Dynamik bei der Messung zu gewährleisten. Es zeigt sich weiterhin, daß das Signal-Rausch Verhältnis welches durch Einsatz der bekannten bis-Oxonole bei Membranpotentialänderungen, beispielsweise nach Blockade eines Ionenkanals, zu erzielen ist, in einer Größenordnung liegt, die nach gängigen Kriterien (Z'-Faktor) nur begrenzt für Hochdurchsatz-Screening-Verfahren geeignet ist. The fluorescence quantum yield of the known bis-oxonols is strongly temperature-dependent and increases at lower ones Temperatures. Because in cellular high-throughput screening methods one physiological temperature of 37 ° C is aimed for, it is important to have bis-oxonol derivatives on hand, whose Fluorescence quantum yield high even at physiological temperatures is enough to get optimal dynamics when measuring guarantee. It also shows that the signal noise Ratio which by using the known bis-oxonols Changes in membrane potential, for example after a blockade Ion channel that can be achieved is of the order of magnitude which according to common criteria (Z'-factor) only limited for High throughput screening method is suitable.

Durch den kostengünstigen Zugang zu rotemittierenden Laser- Lichtquellen sowie der geringen Hintergrundfluoreszenz von biologischem Material bei roter Anregung gegenüber energiereicheren Anregungswellenlängen kommt dem Einsatz von rotanregbaren Fluoreszenzfarbstoffen steigende Bedeutung zu. Darüber hinaus ist beim Hochdurchsatz-Screening die Fluoreszenz der im Assay zugesetzten Komponenten bei möglichst langwelliger Anregung weniger problematisch. Besonders der rote Spektralbereich (z. B. mit HeNe-Lasern der Wellenlänge 633 nm oder Diodenlasern) ist hierbei interessant, da die herkömmlichen Analysegeräte mit diesen Anregungswellenlängen ausgerüstet sind bzw. sehr kostengünstig ausgerüstet werden können. With inexpensive access to red-emitting laser Light sources and the low background fluorescence of biological material with red excitation opposite higher energy excitation wavelengths comes from the use of red excitable fluorescent dyes are becoming increasingly important. In addition, in high throughput screening is fluorescence the components added in the assay if possible long-wave excitation less problematic. Especially the red one Spectral range (e.g. with HeNe lasers with a wavelength of 633 nm or Diode lasers) is interesting because the conventional ones Analyzers equipped with these excitation wavelengths are or can be equipped very inexpensively.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, langsame fluoreszierende Farbstoffderivate zur Verfügung zu stellen, die eine hohe Dynamik der Messungen, insbesondere bei physiologischen Temperaturen und eine geringe Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeute, aufweisen. Die Verteilung der Fluoreszenz-Farbstoffderivate in Bezug auf die Membran soll membranpotentialsensitiv sein. Das Signal-Rausch-Verhältnis soll verbessert werden und die Anregungs- und Emissionswellenlängen sollen besser an bestehende Auslesesysteme angepasst sein als die der bekannten Farbstoffe und im Zusammenhang mit kostengünstigen Analysesystemen verwendet werden können. The object of the present invention is slow to provide fluorescent dye derivatives, which have a high dynamic of the measurements, especially at physiological temperatures and a low temperature dependence the fluorescence quantum yield. The distribution of the Fluorescent dye derivatives with respect to the membrane are said to be sensitive to membrane potential. The signal-to-noise ratio should be improved and the stimulus and Emission wavelengths should be better adapted to existing readout systems be than that of the known dyes and related inexpensive analysis systems can be used.

Diese Aufgabe wird mit den Oxonol-Derivaten gelöst, die in Anspruch 1 definiert sind. This problem is solved with the oxonol derivatives, which in Claim 1 are defined.

Gegenstand der Anmeldung sind Oxonol-Derivate der allgemeinen Formel I

worin:

a) die Reste R1, R2, R3 und R4 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;
b) n und m gleich oder verschieden sind und Null oder ganze Zahlen größer als Null bedeuten;
c) R1 mit R2 und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind);
d) die Reste R5, R6, R7, R8 und R9 voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid bedeuten;
e) R5 mit R6 und/oder R5 mit R7 und/oder R5 mit R8 und/oder R5 mit R9 und/oder R6 mit R7 und/oder R6 mit R8 und/oder R6 mit R9 und/oder R7 mit R8 und/oder R7 mit R9 und/oder R8 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden kann (können), die ggf. substituiert ist (sind).

The application relates to oxonol derivatives of the general formula I.

wherein:

a) the radicals R1, R2, R3 and R4 independently of one another are hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyano, carbonyl, acyl, acyloxy or carboxylamide;
b) n and m are the same or different and are zero or integers greater than zero;
c) R1 with R2 and / or R3 with R4 and / or R1 with R3 and / or R2 with R4 can form one or more saturated or unsaturated bridges (bridges) which may or may not be substituted;
d) the radicals R5, R6, R7, R8 and R9 independently of one another hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyan, carbonyl, acyl, acyloxy or carboxylamide mean;
e) R5 with R6 and / or R5 with R7 and / or R5 with R8 and / or R5 with R9 and / or R6 with R7 and / or R6 with R8 and / or R6 with R9 and / or R7 with R8 and / or R7 with R9 and / or R8 with R9 can form one or more saturated or unsaturated bridges (bridges) which may or may not be substituted.

Die Reste Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Alkylaryl, Alkoxy und Alkoxycarbonyl weisen in der Regel 1 bis 20, bevorzugt 1 bis 14 Kohlenstoffatome auf. Die Reste können verzweigt oder unverzweigt sein. The residues alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, alkylaryl, Alkoxy and alkoxycarbonyl generally have 1 to 20, preferably 1 to 14 carbon atoms. The residues can be branched or be unbranched.

In bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oxonol- Derivate handelt es sich bei den Resten R1, R2, R3 und R4 um Alkylreste mit 4 bis 5 Kohlenstoffatomen. In preferred embodiments of the oxonol according to the invention Derivatives are the R1, R2, R3 and R4 radicals Alkyl radicals with 4 to 5 carbon atoms.

In den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten ist n vorzugsweise im Bereich von 0 bis 6, besonders bevorzugt 0 bis 4. Unabhängig von n ist in den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten m vorzugsweise im Bereich von 0 bis 6, besonders bevorzugt 1 bis 4. Die Werte von n und m können gleich oder verschieden sein. In the oxonol derivatives according to the invention, n is preferred in the range from 0 to 6, particularly preferably 0 to 4. Regardless of n, in the oxonol derivatives according to the invention, m preferably in the range from 0 to 6, particularly preferably 1 to 4. The values of n and m can be the same or different.

Die jeweiligen Reste R5/R6 von aufeinanderfolgenden, mit n gekennzeichneten, repetitierenden Einheiten können gleich oder verschieden sein. Analoges gilt für die Reste R7/R8 der mit m gekennzeichneten Einheiten. The respective residues R5 / R6 of successive, with n marked, repeating units can be the same or to be different. The same applies to the residues R7 / R8 with m labeled units.

In bevorzugten Oxonolderivaten bildet (bilden) R1 mit und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken). Die Brücke (Brücken) ist (sind) ggf. substituiert. Die Brücken umfassen vorzugsweise Alkinketten mit 4 bis 15, vorzugsweise 8 bis 12 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt umfassen die Alkinketten mindestens 2, vorzugsweise mindestens 3 Dreifachbindungen. Besonders bevorzugt bildet R1 mit R3 eine Brücke mit 8 bis 12 Kohlenstoffatomen und vorzugsweise 3 Dreifachbindungen. In preferred oxonol derivatives, R1 forms with and / or R3 with R4 and / or R1 with R3 and / or R2 with R4 one or several saturated or unsaturated bridges (bridges). The bridge (Bridges) is (are) optionally substituted. The bridges include preferably alkyne chains with 4 to 15, preferably 8 to 12 Carbon atoms. Particularly preferably, the Alkyne chains at least 2, preferably at least 3 triple bonds. R1 with R3 particularly preferably forms a bridge with 8 to 12 Carbon atoms and preferably 3 triple bonds.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Brücke von R1 mit R2 und/oder R3 mit R4 und/oder R1 mit R3 und/oder R2 mit R4 Cykloakyl-Systeme, insbesondere Cyclopentyl- und Cyclohexylringe, besonders bevorzugt Cyclohexylringe. Die Cycloalkyl-Systeme sind ggf. substituiert. Besonders bevorzugt bildet R1 mit R3 eine Brücke, die 2 Cyclohexylringe umfasst. In further preferred embodiments, the bridge comprises from R1 with R2 and / or R3 with R4 and / or R1 with R3 and / or R2 with R4 cycloakyl systems, especially cyclopentyl and Cyclohexyl rings, particularly preferably cyclohexyl rings. The Cycloalkyl systems are optionally substituted. Particularly preferred R1 forms a bridge with R3, which comprises 2 cyclohexyl rings.

Bei anderen bevorzugten Oxonolderivaten bildet (bilden) R5 mit R6 und/oder R5 mit R7 und/oder R5 mit R8 und/oder R5 mit R9 und/oder R6 mit R7 und/oder R6 mit R8 und/oder R6 mit R9 und/oder R7 mit R8 und/oder R7 mit R9 und/oder R8 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken), die ggf. substituiert ist (sind). In other preferred oxonol derivatives, R5 also forms R6 and / or R5 with R7 and / or R5 with R8 and / or R5 with R9 and / or R6 with R7 and / or R6 with R8 and / or R6 with R9 and / or R7 with R8 and / or R7 with R9 and / or R8 with R9 one one or more saturated or unsaturated bridges (bridges), which may or may not be substituted.

In verschiedenen weiteren Ausführungsformen können R1 mit R5 und/oder R1 mit R6 und/oder R1 mit R7 und/oder R1 mit R8 und/oder R1 mit R9 und/oder R2 mit R5 und/oder R2 mit R6 und/oder R2 mit R7 und/oder R2 mit R8 und/oder R2 mit R9 und/oder R3 mit R5 und/oder R3 mit R6 und/oder R3 mit R7 und/oder R3 mit R8 und/oder R3 mit R9 und/oder R4 mit R5 und/oder R4 mit R6 und/oder R4 mit R7 und/oder R4 mit R8 und/oder R4 mit R9 eine oder mehrere gesättigte oder ungesättigte Brücke (Brücken) bilden. In various other embodiments, R1 can be connected to R5 and / or R1 with R6 and / or R1 with R7 and / or R1 with R8 and / or R1 with R9 and / or R2 with R5 and / or R2 with R6 and / or R2 with R7 and / or R2 with R8 and / or R2 with R9 and / or R3 with R5 and / or R3 with R6 and / or R3 with R7 and / or R3 with R8 and / or R3 with R9 and / or R4 with R5 and / or R4 with R6 and / or R4 with R7 and / or R4 with R8 and / or R4 with R9 one or more saturated or Form unsaturated bridge (bridges).

Beispiele für die Substituenten umfassen Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy oder Carboxylamid. Examples of the substituents include alkyl, cycloalkyl, Alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxyl, Alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyan, carbonyl, Acyl, acyloxy or carboxylamide.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind in den Formeln II bis VI dargestellt.

Particularly preferred embodiments are shown in the formulas II to VI.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Oxonol-Derivate erfolgt unter Verwendung üblicher Synthesemethoden. The oxonol derivatives according to the invention are synthesized using conventional synthetic methods.

Eine Erhöhung der Quantenausbeute, insbesondere bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 37°C, wurde bei den erfindungsgemäßen Oxonol-Derivaten durch eine Rigidisierung der Molekülstruktur erreicht. Es ist auf diesem Wege möglich, die Rate der strahlungslosen Relaxation aus dem 1. angeregten Zustand in den Grundzustand zugunsten der Relaxation unter Emission eines Photons (Fluoreszenz) zurückzudrängen. Die Erhöhung der Quantenausbeute ermöglicht es, Untersuchungen mit sehr guten Ergebnissen bei physiologischen Temperaturen durchzuführen. An increase in quantum yield, especially at Temperatures in the range of 20 to 37 ° C, were at the Oxonol derivatives according to the invention by rigidifying the Molecular structure reached. It is possible in this way, the rate the radiationless relaxation from the 1st excited state in the ground state in favor of relaxation under emission of a photon (fluorescence). The increase in Quantum yield enables studies with very good ones Perform results at physiological temperatures.

Eine weitere Maßnahme zu Erhöhung des Signal-zu- Hintergrundverhältnisses bei Untersuchungen unter Beteiligung von Ionenkanälen besteht darin, weitere Farbstoffe als Fluoreszenzlöscher zu nutzen. Diese Farbstoffe weisen eine den erfindungsgemäßen anionischen Oxonolen entgegengesetzte Ladung auf und zeigen dementsprechend ein entgegengesetztes Diffusionsverhalten im Falle der Depolarisation der Zellmembran. Aufgrund der Änderung der Ladungsverteilung durchdringen diese Löscherfarbstoffe die Zellmembran nach außen, während die Oxolon-Moleküle elektroosmotisch in die Zelle eindringen. Dies bewirkt, dass vor der Depolarisation möglicherweise in der Zelle vorhandener Oxolon-Farbstoff gelöscht wird, während nach der Depolarisation der noch im Überstand befindliche Oxolon- Farbstoff gelöscht wird. In Summe kommt es zu einer Erhöhung des Signal-zu-Hintergrundverhältnisses. Diese kationischen Farbstoffe besitzen keine Fluoreszenzeigenschaften und sind von ihrer Absorptionswellenlänge so abgestimmt, dass sie die Fluoreszenz des entsprechenden eingesetzten Oxolon-Derivates über einen Energietransfer aufnehmen können und membrangängig sind. Another measure to increase the signal to Background ratio in investigations with participation of ion channels is more dyes than Use fluorescence quencher. These dyes have a anionic oxonols according to the invention of opposite charge and accordingly show an opposite Diffusion behavior in the case of depolarization of the cell membrane. Due to the change in the charge distribution, they penetrate Extinguishing dyes the cell membrane to the outside, while the Oxolon molecules enter the cell electroosmotically. This causes possibly before depolarization in the Cell's existing Oxolon dye is cleared while after the depolarization of the oxolone still in the supernatant Dye is deleted. In total there is an increase of the signal-to-background ratio. This cationic Dyes have no fluorescent properties and are of their absorption wavelength so that they have the Fluorescence of the corresponding oxolone derivative used can absorb via an energy transfer and cross-membrane are.

Die erfindungsgemäßen Oxonol-Derivate eignen sich hervorragend für die Untersuchung von Membranpotentialen von Zellen. Sie eignen sich somit sehr gut für chemische und biotechnologische Untersuchungen zur Suche nach biologisch aktiven Stoffen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, die an der Regulierung des Membranpotentials, insbesondere durch Ionenkanäle, beteiligt sind. Auf diesem Weg ist es möglich, nach Wirkstoffen zu suchen, die in Bezug auf Krankheiten wirken, die in Zusammenhang mit Ionenkanälen stehen. The oxonol derivatives according to the invention are outstandingly suitable for the investigation of membrane potentials of cells. she are therefore very suitable for chemical and biotechnological Studies on the search for biologically active substances and / or active pharmaceutical ingredients that participate in the regulation membrane potential, especially through ion channels, involved. This way it is possible to search for active ingredients looking for diseases that work in Linked to ion channels.

Die genannten Untersuchungen lassen sich bevorzugt in Kombination mit Laserlichtanalytik und Fluoreszenzdetektion durchführen. Die dabei angewandten Verfahren schließen praktisch alle Verfahren ein, mit denen die Oxonol-Derivate gemessen werden können. Zu diesen Verfahren zählen die Spektrometrie, Mehrphotonenanregung, insbesondere Zwei-Photonen-Anregung, Laser- Scanning-Anregung, Nahfeldspektroskopie, Photonenverteilungsanalysen, insbesondere FIDA- und 2-D-FIDA, Fluoreszenz- Lebensdauer-Analyse und Fluoreszenz-Polarisationsanalyse. Die Messungen werden vorzugsweise unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops oder anderen konfokalen Optiken durchgeführt. Die Auswertung der Daten erfolgt schließlich vorzugsweise durch Autokorrelationsanalyse und/oder Kreuzkorrelationsanalyse. The investigations mentioned can preferably be found in Combination with laser light analysis and fluorescence detection carry out. The procedures used close practically all of them A method by which the oxonol derivatives are measured can. These methods include spectrometry, Multi-photon excitation, especially two-photon excitation, laser Scanning excitation, near-field spectroscopy, Photon distribution analysis, especially FIDA and 2-D FIDA, fluorescence Lifetime analysis and fluorescence polarization analysis. The Measurements are preferably made using a confocal microscope or other confocal optics. Finally, the data is preferably evaluated through autocorrelation analysis and / or Cross-correlation analysis.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Untersuchung von Membranpotentialen, insbesondere der Untersuchung von Ionenkanälen. Dieses Kit umfasst, neben üblichen Bestandteilen, ein Oxonol-Derivat nach der allgemeinen Formel I. Übliche Bestandteile sind beispielsweise Analysegefäße und Instruktionen zur Durchführung der Untersuchungen. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Kit ein Oxonol-Derivat der Formeln II-VI. The present invention also relates to a kit for Investigation of membrane potentials, especially the investigation of ion channels. This kit includes, besides usual ones Ingredients, an oxonol derivative according to the general formula I. Common components are, for example, analysis vessels and Instructions for carrying out the examinations. In preferred embodiments, the kit contains an oxonol derivative of Formulas II-VI.

Claims

1. Oxonol derivatives of the general formula I

wherein:

a) the radicals R1, R2, R3 and R4 independently of one another are hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyano, carbonyl, acyl, acyloxy or carboxylamide;

b) n and m are the same or different and are zero or integers greater than zero;

c) R1 with R2 and / or R3 with R4 and / or R1 with R3 and / or R2 with R4 can form one or more saturated or unsaturated bridges (bridges) which may or may not be substituted;

d) the radicals R5, R6, R7, R8 and R9 independently of one another hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, aryl, aryldiazo, alkylaryl, arylalkoxyl, alkoxy, alkoxycarbonyl, hydroxy, halogen, cyan, carbonyl, acyl, acyloxy or carboxylamide mean;

e) R5 with R6 and / or R5 with R7 and / or R5 with R8 and / or R5 with R9 and / or R6 with R7 and / or R6 with R8 and / or R6 with R9 and / or R7 with R8 and / or R7 with R9 and / or R8 with R9 can form one or more saturated or unsaturated bridges (bridges) which may or may not be substituted.