DE10125188A1 - Vorrichtung zum in vivo-Nachweis von oxidativem Stress durch Bestimmung von Aldehyden auf Thiobarbitursäure beschichteten Oberflächen - Google Patents

Abstract

Es konnte gezeigt werden, daß Malondialdehyd im nano- und micromolaren Bereich zu einer dosisabhängigen Bindung an Thiobarbitursäure führt. Auch ein durch Wasserstoffperoxid induzierter oxidativer Stress in Zellen (Rattengliomzellen) führt zu einer konzentrationsabhängigen Bildung von Malondialdehyd-Thiobarbitursäure-Konjugaten. Darüber hinaus binden noch andere Substanzen, die bei oxidativem Stress entstehen, an Thiobarbitursäure, weshalb sie auch als "Thiobarbitursäure Reaktive Substanzen" (TBARS) bezeichnet werden. Durch diese Kreuzreaktion von Thiobarbitursäure mit zahlreichen Aldehyden und anderen OS-modifizierten Makromolekülen kann der oxidative Stress über die Bildung von TBA-TBARS-Konjugaten äußerst sensitiv detektiert werden. Bei der neuartigen Vorrichtung zum in vivo-Nachweis von oxidativem Stress werden die TBARS auf Thiobarbitursäure-beschichteten Festphasen wie vor allem Mikrotiterplatten und Teststreifen quantifiziert. Zur weiteren Erhöhung der Sensitivität können diese immobilisierten TBA-TBARS-Konjugate zusätzlich mit Antikörpern detektiert werden, die spezifisch die Thioesterbindung erkennen. Somit stellt dieser neuartige Thiobarbitursäuretest ein äußerst sensitives Nachweisverfahren für den oxidativen Stress in biologischen Proben dar.

Description

Diese Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zum in vivo-Nachweis von oxidativem Stress in biologischen Proben. Dazu werden Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) auf Thiobarbitursäure (TBA)-beschichteten Oberflächen, wie vor allem Mikrotiterplatten, Röhrchen, Sticks oder Streifen nachgewiesen. Bei den TBARS handelt es sich um verschiedene nicht-enzymatische Spaltungsprodukte von leicht oxidierbaren Makromolekülen (vor allem Lipide), die während oxidativem Stress entstehen, wobei primär und sekundär entstehende Aldehyde (vor allem Malonaldehyd) erfasst werden. Zusätzlich können die auf den Festphasen-Oberflächen immobilisierten TBA-TBARS-Konjugate durch Antikörper detektiert werden, die spezifisch die Thioesterbindung erkennen, wodurch die Sensitivität deutlich gesteigert wird. Durch diesen Nachweis der TBA-TBARS-Konjugate kann der oxidative Stress in biologischen Proben (Organen, Geweben, Zellen und Körperflüssigkeiten (Urin, Serum, Liquor, Lymphe, Galle, Lungen-Lavage usw.)) äußerst spezifisch in physiologischen und pathologischen Bereichen durch Vergleich mit einem TBA-TBARS- Standard quantifiziert werden.

Der oxidative Stress (OS) entsteht bei einem Ungleichgewicht zwischen der Bildung und dem Abbau von sogenannten reaktiven oxidativen Spezies (ROS), die aus molekularem Sauerstoff hervorgehen (Pryor, Free radicals in biology 1, 1976, Academic Press, London). Ausgehend vom Sauerstoffmolekül (O₂) entstehen folgende zunehmend reduzierte ROS-Verbindungen: das Superoxidanionradikal (^.O₂ ^-), Wasserstoffperoxid (H₂O₂), das Hydroxylanion (OH^-) und das Hydroxylradikal (^.OH). Dabei ist das Hydroxylradikal wegen seiner äußerst starken Oxidationskraft die reaktivste ROS-Verbindung (Halliwell and Gutteridge, Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease, 1984, Biochem. J., 219, 1-14). Das membranpermeable Wasserstoffperoxid ist eine zentrale ROS-Verbindung, die im Körper bei vielen enzymatischen Stoffwechselprozessen entsteht und relativ stabil ist.

Die bei weitem größte Entstehungsquelle von intrazellulärem Wasserstoffperoxid sind die Mitochondrien, die fast den gesamten Sauerstoff umsetzen. Dabei entstehen Superoxidanionradikale und nachfolgend Wasserstoffperoxid durch die aus der Atmungskette stets entweichenden Elektronen (Elektronenleckage). Bei Entzündungsprozessen werden von phagozytierenden Zellen, wie Macrophagen und Microglia, Superoxidanionradikale bzw. Wasserstoffperoxid über das NADPH-Oxidase-System produziert und dann zur Immunabwehr genutzt. Darüberhinaus entstehen Superoxidanionradikale bzw. Wasserstoffperoxid durch die Aktivität Sauerstoff-verarbeitender Enzyme (v. a. Xanthin- Oxidase), bei der Entgiftung toxischer Substanzen durch das Cytochrom p450-System und der peroxisomalen Oxidation von Fett- und Aminosäuren (Davies, Oxidative stress: the paradox of aerobic life, 1995, Biochem. Soc. Symp., 61, 1-31). Neben diesem endogenen oxidativen Stress, der mit Erhöhung der Stoffwechselaktivität oder Überernährung zunimmt, führen zahlreiche exogene Stressoren, wie UV-Strahlung, Röntgenstrahlen, Elektrosmog, Schwermetalle, Ozon und verschiedene Umweltgifte zur Entstehung dieser äußerst reaktiven Sauerstoffverbindungen, wobei auch Hitze und Ansäuerung zum oxidativen Stress zu führen scheinen. Durch zunehmende Belastung sowohl der Umwelt als auch des Körpers (Sport, psychischer Stress, Rauchen, Überernährung) stehen wir zunehmend unter oxidativem Stress.

Zum Schutz vor oxidativem Stress verfügen die Zellen über umfangreiche Abwehrsysteme, die auf den Ebenen der Prävention und Unterbrechung eingreifen (Sies, Strategies of antioxidant defense, 1993, Eur. J. Biochem. 215, p 213-219). Die Prävention verringert den OS durch Chelatierung oder Inaktivierung von Substanzen, die zur Bildung von ROS führen (vor altem Schwermetalle). Bei der Unterbrechung werden die ROS entweder durch antioxidativ wirkende Enzyme reduktiv entgiftet, die teilweise Antioxidantien als Cofaktoren benötigen, oder die ROS werden nicht-enzymatisch durch Antioxidantien direkt reduziert. Dabei spielen die beiden antioxidativen Vitamine E und C, sowie das selbst synthetisierte Glutathion eine Hauptrolle bei der reduktiven Entgiftung von Lipidradikalen in den Zellmembranen und von ROS im Cytosol.

Nur bei einer unzureichenden antioxidativen Abwehr kommt es zu einer Anreicherung von ROS und damit zum oxidativen Stress in der Zelle. Die stabile ROS-Verbindung Wasserstoffperoxid ist erst nach Sekundärreaktionen durch die Produktion des sehr reaktiven Hydroxylradikals (^.OH) in der "Eisen-katalysierten Haber-Weiss-Reaktion" (^.O₂ ^- + H₂O₂ ^Fe → O₂ + OH^- + ^.OH) zelltoxisch (Halliwell and Gutteridge, 1984). Diese Reaktion setzt sich aus 2 Einzelreaktionen zusammen. In der ersten Reaktion reduziert das Superoxidanionradikal Fe³⁺ zu Fe²⁺ (Fe³⁺ + ^.O₂ ^- → Fe²⁺ + O₂). In der zweiten Reaktion kommt es in der Fenton Reaktion zur reduktiven Spaltung von Wasserstoffperoxid durch reduziertes Eisen (Fe²⁺), wodurch das Hydroxylradikal, sowie Hydroxylanion (OH^-) und oxidiertes Eisen (Fe³⁺) entsteht (Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + OH^- + ^.OH). Dabei ist zu erwähnen, daß die reduktive Spaltung von H₂O₂ in der Fenton-Reaktion nicht nur mit Fe²⁺, sondern auch mit anderen reduzierten Übergangsmetallen abläuft, wie z. B. Kupfer, Chrom und Vanadium. Ein weiteres sehr reaktives Molekül stellt das Peroxynitrit-Ion (ONOO^-) dar, welches durch die Verbindung von NO mit ^.O₂ ^- entsteht. Hydroxylradikale und Peroxynitrit, wie auch andere Radiale, können durch ihre starke Elektronegativität alle Makromoleküle oxidieren und dadurch starke Zellschädigungen verursachen.

Die Lipide stellen einen wichtigen Angriffspunkt von ROS dar, wobei vor allem die mehrfach ungesättigten Fettsäuren der Phospholipide von Zellmembranen sehr sensibel gegenüber Oxidationen sind. Dieser Prozeß wird als Lipidperoxidation bezeichnet und ist durch Radikal- Kettenreaktionen charakterisiert (Buettner, The pecking order of free radicals and antioxidants, 1993, Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543). Durch die Lipidradikalkettenreaktionen entstehen Schäden in Plasma- und Organellmembranen, welches wiederum membrangebundener Proteine beeinflußt und eine Veränderung der Membranpermeabilität bewirkt. Dieses führt z. B. zu einem Ca²⁺-Einstrom ins Cytosol, wodurch es zu einer weiteren ROS-Produktion durch Aktivierung der NO-Synthetase und der Xanthin-Oxidase, aber auch zu degenerativen Prozessen durch Ca²⁺-abhängige Aktivierung von Phospholipasen, Proteasen und Endonukleasen kommt. Dadurch entstehen Störungen der Zellfunktion und Zellintegrität, die letztendlich zum Zelltod führen können.

Bei den Proteinen stellen vor allem die Thiolgruppen der Cysteinreste eine Achillesferse gegenüber reaktiven Sauerstoffverbindungen dar, wodurch es zur Bildung intra- als auch intermolekularer Disulfidbrücken kommt. Zusätzlich können Dimerisierungen über Tyrosinreste entstehen. Weitere besonders OS-sensitive Aminosäuren sind Histidin, Prolin, Arginin und Lysin. Fragmentierungen von Proteinen entstehen durch Oxidation der Peptidbindung, die dann über die Bildung von Peroxylintermediaten gespalten wird. Diese Schädigungen führen zu Konformationsänderungen und enzymatischen Funktionsstörungen von verschiedenen Proteinen. Ein Addukt aus ROS-geschädigten Proteinen und Lipiden ist das Lipofucsin, ein Alterspigment, das im Laufe des Lebens zusammen mit oxidierten Proteinen akkumuliert.

Die Nucleinsäuren (DNA und RNA) werden ebenfalls durch oxidativen Stress geschädigt. Dabei kommt es zu Einzel- und Doppel-Strangbrüchen, Bildung von DNA-DNA-, DNA- Protein und DNA-Lipid-Addukten, als auch zur Entstehung von Basenmodifikationen. Die Strangbrüche entstehen durch Oxidation der Ribose. Vermutlich gibt es mehr als 100 verschiedene oxidative Basenmodifikationen, am häufigsten 8-Hydroxyguanin, 5- Hydroxymethyluracil und Thyminglykol. Schätztungsweise wirken in der Zelle zwischen 10⁵ und 10⁶ ROS-Reaktionen pro Tag auf die DNA ein, die nicht alle durch DNA- Reparatursysteme beseitigt werden können, so daß es altersabhängig zu einer Akkumulierung von DNA-Schäden kommt.

Die durch OS verursachten Prozesse führen zu starken Zellschädigungen und schließlich zum Zelltod (Gosslau et al., Heat shock and oxidative stress-induced exposure of hydrophobic protein domains as common signal in the induction of hsp68, 2001, J. Biol. Chem., 276, 1814-­ 1821). Über Lipidradikalkettenreaktionen in den Plasma- und Organellmembranen kommt es zu starken Störung der Zellhomöostase. Durch Akkumulierung von oxidativen DNA-Schäden ergibt sich eine hohe Mutagenität, wodurch das Krebsrisiko altersabhängig zunimmt. OS- induzierte Schädigungen von Proteinen korrelieren mit einer Beeinträchtigung vieler Synthese- und Reparaturprozesse oder der Veränderung vieler Strukturproteine. Diese Schädigungen können zu verfrühten Alterungsprozessen und degenerativen Krankheiten führen wie Krebs, Arteriosklerose, grauer Star, Herzinfarkt, Sterilität, Diabetis melittus, Rheuma, chronische Entzündungen, Degenerierung des Immunsystems bzw. neuronalen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Huntington, Wilson und multiple Sklerose (Knight, The biochemistry of aging, 2000, Adv. Clin. Chem., 35, 1-62).

Es existieren verschiedene Nachweismethoden für den oxidativen Stress, die entweder auf den direkten Nachweis von freien Radikalen durch Oxidation spezifischer Fluoreszenzfarbstoffe basieren oder auf den indirekten Nachweis von oxidierten Makromolekülen bzw. deren Spaltungsprodukten, wie Nucleinsäuren (8-Oxoguanin, 8- Oxoadenin, 8-Hydroxy-2-Desoxyguanosin, 8-Hydroxyadenin, 7-Methyl-8-Hydroxyguanin, Thymin-Glycol), Proteinen (3-Nitrotyrosin, 3-Chlorotyrosin, ortho- und meta-Tyrosin, 2- Oxo-Histidin, Dityrosin, Methionin-Sulfoxid, Valin-Hydroxid, Carbonyl-Nachweis) und Lipiden (Malonaldehyd, 4-Hydroxyalkenal, n-Pentanal, n-Hexanal, n-Heptanal, 2-Octenal, n- Nonenal, 4-Hydroxynonenal, 4-Hydroxydecanal, F₂-Isoprostane, Ethan, Pentan, Ethylen) oder der Bestimmung an reduzierten oder oxidierten Antioxidantien (Glutathion, Vitamin E und C etc.). Die Bestimmung dieser oxidierten Moleküle erfolgt über mehr oder weniger komplizierte Nachweismethoden (Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie, Gas- Chromatographie-Massenspektroskopie, radioaktive Markierung, Chemolumineszenz, Elektronenspinresonanz-Analyse), die in der Diagnostik schwer anwendbar sind. Daher ist der Bedarf für eine einfache in vivo-Bestimmung von oxidativem Stress sehr groß (Halliwell, Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimisation of nutritional antioxidant intake in humans, 1996, Free Radic. Res. 25, p 57-74).

Der indirekte Nachweis von leicht oxidierbaren Membranlipiden ist für die Quantifizierung von oxidativem Stress in biologischen Proben sehr gut geeignet. In nicht-enzymatischen Kettenreaktionen kommt es während der Lipidperoxidation zur Bildung verschiedener stabiler Oxidationsprodukte sowohl in Zellen als auch im Blut und Urin. Das auslösende Ereignis der Lipidperoxidation (Fig. 1) ist die Oxidation durch ROS (vor allem ^.OH-Radikale) am C-Atom zwischen 2 Doppelbindungen von ungesättigten Fettsäuren (a), wodurch ein Lipidradikal entsteht (b). Innerhalb des Lipidradikalmoleküls kommt es durch Umformung zur Entstehung von konjugierten Doppelbindungen (c). Das Lipidradikal reagiert sehr leicht mit O₂ zum Lipidperoxylradikal (d), welches benachbarte Lipide zu Lipidradikalen oxidiert, wodurch das Lipidhydroperoxid entsteht (e). Durch reduktive Spaltung mittels Fe²⁺ in einer Fenton­ ähnlichen Reaktion wird das Lipidhydroperoxid zum Lipidhydroxylradikal umgeformt (f). Weitere Kettenreaktionen fuhren zur Entstehung des Lipidhydroxids (g). Durch reduktive β- Spaltung innerhalb des Lipidhydroxylradikals kommt es zur Entstehung von Alkylradikalen und Aldehyden, wobei häufig Malonaldehyd entsteht (h). Die Alkylradikale oxidieren wiederum in Kettenreaktionen benachbarte Lipide, wobei nach weiteren Oxidationsprozessen als häufige Produkte Ethan und Pentan entstehen (i). Alternativ kommt es mit O₂ zur Bildung von Lipidperoxylradikalen (d), die wieder Lipidkettenreaktionen auslösen (e).

Die Entstehung nicht-enzymatischer Spaltungsprodukte von Lipidhydroperoxiden in Form von Aldehyden (vor allem Malonaldehyd) wird bei der Bestimmung der Lipidperoxidation durch den Thiobarbitursäuretest herangezogen (Slater, Free radical mechanisms in tissue injury, 1972, Pion Limited, London, 38-43). Dieses wurde 1916 erstmals beschrieben, da eine Hitzebehandlung aromatischer Aldehyde mit Thiobarbitursäure zu einer rötlichen Färbung führte (Dox and Plaisance, Condensation of thiobarbituric acid with aromatic aldehydes, 1916, J. Am. Chem. Soc., 38, 2164-2166). Später wurde festgestellt, daß oxidierte Gewebesuspensionen ebenfalls mit Thiobarbitursäure reagieren (Kohn und Liversedge, On a new aerobic metabolite whose production by brain is inhibited by apomorphine, emetine, ergotamine, epinephrine, and menadione, 1944, J. Pharmocol. Exp. Ther., 82, 292-300). 1948 haben Bernheim und Mitarbeiter dann einen C3-Körper als Spaltungsprodukt von Lipiden postuliert, der mit TBA reagiert (Bernheim, The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipids, 1948, J. Biol. Chem. 174, 257-264). Dieser C3-Körper wurde dann als Malonaldehyd identifiziert und schließlich eine stöchiometrische Beziehung der Bindung von einem Molekül Malonaldehyd an zwei Moleküle Thiobarbitursäure gezeigt (Sinnhuber et al., Characterization of the red pigment formed in the 2-thiobarbituric acid determination of oxidative rancidity, 1958, Food Res., 23, 626-633). Durch Bildung einer kovalenten Thioesterbindung zwischen Malondialdehyd (MDA) und Thiobarbitursäure (TBA) entstehen rote MDA-TBA-Konjugate, die photometrisch bei 535 nm bestimmt werden können. Durch einen Vergleich mit einem MDA-Standard kann die Malonaldehyd-Generierung somit in biologischen Proben quantifiziert werden und als Gradmesser von oxidativem Stress herangezogen werden (Liu et al., Assay of aldehydes from lipid peroxidation: gas chromatograph-mass spectrometry compared to thiobarbituric acid, Anal. Biochem., 1997, 161-166).

Neben Malonaldehyd bilden noch andere Aldehyde, wie z. B. Acetaldehyd und Hexanal mit TBA rote Konjugate. Zudem wurde gezeigt, daß auch oxidative Schädigungen von Aminosäuren, Basen oder Kohlenhydraten zur Bildung von Protein- und Nucleinsäure- Intermediaten führen, die mit Thiobarbitursäure reagieren. Dieses beruht wahrscheinlich auf einer Fragmentierung der Makromoleküle mit entsprechender Malonaldehyd-Bildung (Knight et al., Specifity of the thiobarbituric acid reaction: its use in studies of lipid peroxidation, 1988, Clin. Chem., 34, 2433-2438). Zudem reagieren Malonaldehyd und andere Aldehyde auch mit Nucleinsäuren und Proteinen, wodurch es zur Bildung von Aggregaten kommt (z. B. Lipofucsin). Durch den Thiobarbitursäuretest können also Aldehyde nachgewiesen werden, die vor allem während der Lipidkettenreaktionen primär entstehen als auch bei OS­ induzierten Fragmentierungen von Nucleinsäuren und Proteinen sekundär gebildet werden. Daher werden alle Substanzen, die mit Thiobarbitursäure eine kovalente Bindung eingehen, auch als Thiobarbitursäure reaktive Substanzen oder "Thiobarbituric Acid Reactive Substances" (TBARS) bezeichnet (Esterbauer et al. Chemistry and biochemistry of 4- Hydroxynonenal, malonaldehyde and other related aldehydes, 1991., Free Radic. Biol. Med., 11, 81-128). Diese TBARS akkumulieren in verschiedenen biologischen Proben, wie Zellen, Geweben, Organen und Körperflüssigkeiten, womit der Thiobarbitursäuretestes eine zuverlässige Meßmethode für den oxidativen Stress im Körper darstellt.

Versuchsbedingungen und Ergebnisse

Zuerst wurde ein Malondialdehyd-Standard (10 mM) durch Hydrolyse von 5 mM 1,1,3,3 Tetramethoxypropan in 0,25 N HCl bei 100°C für 15 min in verschlossenen Reaktionsgefäßen hergestellt. Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe von Malondialdehyd (0,1-10 µM) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung erstellt. Die Eichlösungen wurden jeweils im Verhältnis von 1 : 1 (Vol/Vol) mit einer Thiobarbitursäurestammlösung (25 mM 2-Thiobarbitursäure in 0,25 N HCl und 15% Trichloressigsäure) gemischt. Danach wurden die Reaktionsgefäße bei 95° Celsius für 45 min inkubiert und auf Eis abgekühlt. Die optische Dichte (OD) wurde bei 535 nm photometrisch bestimmt. Anschließend wurde eine Eichgerade erstellt (Fig. 2A). Dargestellt sind die Mittelwerte aus 3 unabhängigen Versuchen +/-Standardabweichung (SD). Die gemessenen OD-Werte liegen nur leicht unterhalb der durch den Extinktionskoeffizient für Malondialdehyd-TBA-Konjugat (ε = 1.56 × 10⁵/M/cm) berechneten Werte (Fig. 2B) und sind wohl auf einer nicht ganz vollständigen Hydrolyse von Tetramethoxypropan zurückzuführen. Somit kommt es im Bereich von 0,1-10 µM Malondialdehyd zu einer dosisabhängigen Bindung an Thiobarbitursäure, die sich im starken Überschuß gegenüber Malondialdehyd (MDA) befindet und somit kein limitierender Faktor bei diesen MDA-Konzentrationen ist.

Danach wurde durch den Thiobarbitursäuretest untersucht, ob oxidativer Stress (H₂O₂) zur Oxidation von Zellmembranen (Lipidperoxidation) führt, die mit einer Bildung von Malondialdehyd korreliert. Dazu wurden C6 Rattengliomzellen, die einem durch Nitroharnstoff-induziertem Astrozytom entstammen (Benda et al., Differentiated rat glial cell strain in tissue culture, 1968, Science, 161, 370-371), für 3 Tage in Dulbecco's Modified Eagles Medium kultiviert. Die Zellkultivierung erfolgte in einem Inkubator bei konstanten Bedingungen (37°C, 10% CO₂, wasserdampfgesättigte Atmosphäre). Vor Versuchsbeginn wurden die Zellen in 1 ml eiskalt Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung abgeschabt, anschließend in 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt, und der Proteingehalt gemäß der Methode von Neuhoff und Mitarbeitern bestimmt (Neuhoff et al., A simple, versatile, sensitive and volume-independent method for quantitative protein determination which is independent of other external influences, 1979, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360, 1657-­ 1670). Der oxidative Stress wurde durch eine einstündige Inkubation mit steigenden Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (mM H₂O₂) induziert. Anschließend wurden sowohl H₂O₂-behandelte Zellen als auch Kontrollzellen (0 mM H₂O₂) mit 1 ml der Thiobarbitursäurestammlösung versetzt und bei 95° Celsius für 45 min inkubiert. Anschließend wurden die Zelllysate auf Eis abgekühlt und bei 18000 × g für 2 min zentrifugiert. Die Extinktion des Überstandes wurde bei 535 nm photometrisch bestimmt. Die Höhe der Malondialdehyd-Bildung ist dargestellt als nmol TBARS (bzw. TBA-MDA- Konjugate) pro mg Protein (Ordinate), die mittels des Extinktionskoeffizienten berechnet wurde. Dargestellt sind die Mittelwerte aus 5 unabhängigen Versuchen +/-SD (Fig. 3). Schon niedrige H₂O₂-Konzentrationen (125 µM) führen zur signifikanten (p < 0,05) Bildung von TBARS. Ab einer Konzentration von 250 µM H₂O₂ zeigt sich eine hochsignifikante (p < 0,001) Erhöhung der TBARS-Bildung im Vergleich zu unbehandelten Zellen, die dosisabhängig bis 8 mM H₂O₂ ansteigt.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse eine eindeutige Proportionalität bei der Bindung von Thiobarbitursäure an Malondialdehyd sowohl im nanomolaren als auch micromolaren Bereich (Fig. 2). Thiobarbitursäure befindet sich in diesem Konzentrationsbereich im starken Überschuß gegenüber Malondialdehyd und stellt somit keinen limitierenden Faktor dar. Bei einem durch Wasserstoffperoxid induzierten oxidativen Stress in C6-Rattengliomazellen (Fig. 3) zeigt sich ebenfalls eine dosisabhängige Bildung der Malondialdehyd- Thiobarbitursäure-Konjugate (TBARS). Schon Wasserstoffperoxid-Konzentrationen im micromolaren Bereich, welche den physiologischen Konzentrationen im Körper entsprechen, führen zu einer signifikanten Bildung der TBARS-Konjugate. Auch pathophysiologische Wasserstoffperoxid-Konzentrationen (im millimolarem Bereich) führen zu einer dosisabhängigen Bildung von TBARS-Konjugaten. Jedoch zeigt sich im Gegensatz zum Malondialdehyd-Standard bei der H₂O₂-induzierten MDA-Produktion in Zellmembranen eine schwächere Korrelation der Bindung von Malondialdehyd an TBA. Dieses ist darauf zurückzuführen, daß Thiobarbitursäure neben MDA noch mit anderen Aldehyden bzw. OS­ modifizierten Makromolekülen interagiert, weshalb diese Substanzen als "Thiobarbituric Acid Reactive Substances" (TBARS) bezeichnet werden.

Bei dem neuen Verfahren werden die TBARS auf speziell mit Thiobarbitursäure­ beschichteten Oberflächen nachgewiesen. Anschließend können diese immobilisierten TBA- TBARS-Konjugate dann mittels Antikörper immunologisch nachgewiesen werden, wodurch die Sensitivität deutlich gesteigert wird. Bislang war ein immunologischer Nachweis von TBARS nur mittels Antikörper möglich, die gegen Malonaldehyd-modifizierte Aminosäuren oder Basen gerichtet sind. Dabei wurden zuerst monoklonale Antikörper gegen Malondialdehyd-modifiziertes LDL hergestellt (Gonen et al., Immunogenicity of malondialdehyde-modified low density lipoproteins. Studies with monoclonal antibodies, 1987, Atherosclerosis, 65, 265-272). Durch Kopplung von Malondialdehyd (MDA) an Lysozym und Poly-Lysin wurden im humanen Serum Immunoglobuline isoliert, die spezifisch gegen die verbindene 1-Amino-3-Imino-Propen-Gruppe gerichtet sind (Kergonou et al., Immunological relevance of malonic dialdehyde (MDA): III. Immuno-enzymatic determination of human immunoglobulin binding to MDA-crosslinked proteins, 1988, Biochem. Intern., 16, 845-852). Dann wurden polyklonale Antikörper produziert, die spezifisch gegen MDA-modifiziertes Albumin gerichtet sind (Lung et al., Immunochemical properties of malondialdehyde-protein adducts, 1990, J. Immunol. Meth., 128, 127-132) oder Proteinkomplexe erkennen, die durch Malondialdehyd (MDA) und Acetaldehyd (AA) modifiziert sind (Tuma et al., Acetaldehyde and malonaldehyde react together to generate distinct protein adducts in the liver during long-term ethanol administration, 1996, Hepatology, 23, 872-880). Mit monoklonalen Antikörpern, die MDA-Desoxyguanosin- Addukte detektieren, konnte schließlich auch MDA-modifizierte DNA im ELISA spezifisch nachgewiesen werden (Sevilla et al., Development of monoclonal antibodies to the malondialdehyde-deoxyguanosine adduct, pyrimidopurinone, 1997, Chem. Res. Toxicol., 10, 172-180).

Beim neuen Verfahren zum immunologischen Nachweis der TBA-TBARS-Konjugate werden Antikörper produziert und eingesetzt, die spezifisch die Thioesterbindung zwischen den TBARS (z. B. Malonaldehyd) und der Thiobarbitursäure erkennen. Dieser immunologische Nachweis hat den Vorteil, daß die zuvor auf den Festphasen-Oberflächen angereicherten TBA-TBARS-Konjugate äußerst sensitiv detektiert werden können. Die Antikörper, die die TBA-TBARS-Konjugate spezifisch erkennen, sollen durch Immunisierung mit einem Antigen bestehend aus einem Konjugat aus Thiobarbitursäure bzw. dessen Derivaten und einer Thiobarbitursäure-reaktiven Substanz (z. B. Malonaldehyd) hergestellt werden. Normalerweise ist die Herstellung von Antikörpern gegen diese sehr kleinen Moleküle schwierig. Dieses Problem kann jedoch umgangen werden, indem man die TBA-TBARS- Konjugate vor der Immunisierung an Haptene kovalent bindet. Dieses kann durch Kopplung der Carboxyl- oder Thiolgruppe und den Aldehydgruppen der Thiobarbitursäure bzw. des Malondialdehyds an das Hapten erreicht werden. Die Kopplung des TBA-TBARS-Konjugats über die Carboxylgruppe kann mittels der Diclohexyl-Carbodiimid-Methode durchgeführt werden (Rich et al., The carbodiimide method, 1979, The Peptides, 1, 241-261). Durch Immunisierung von Kaninchen wird dann das Antisenum hergestellt. Anschließend werden durch Aufreinigung polyklonale Antikörper gewonnen und über das Hybridoma-Verfahren hochspezifische monoklonale Antikörper hergestellt. Poly- und monoklonale Antikörper können dann in den verschiedenen Immunoassays zur Detektion von TBA-TBARS- Konjugaten eingesetzt werden, wobei Western-Blot-Techniken, Enzym-gebundene Immunoassays (ELISAs), Fluoreszenzimmunoassays (IFMAs und FIAs) oder Radioimmunoassays (RIAs) verwendet werden können.

Claims (9)

1. Vorrichtung zum in vivo-Nachweis von oxidativem Stress in biologischen Proben durch Bestimmung von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) auf Festphasen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß der TBARS-Nachweis auf festen Oberflächen von Mikrotiterplatten und -modulen, Röhrchen, Sticks oder Streifen erfolgt, die mit Thiobarbitursäure (TBA) bzw. dessen verwandten Substanzen beschichtet sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die auf den festen Oberflächen gebundenen TBARS-TBA-Konjugate durch Vergleich mit einem TBARS- Standard quantifiziert werden.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der TBARS-Standard aus einer Thiobarbitursäure-reaktiven Substanz (insbesondere Aldehyde bzw. Aldehyd­ modifizierte Moleküle) besteht.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die TBA-TBARS- Konjugate auch durch spektroskopische Verfahren, insbesondere Fluoreszenzspektroskopie, nachgewiesen werden.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die TBA-TBARS- Konjugate auf den Oberflächen immunologisch durch einen spezifischen Antikörper nachgewiesen werden.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper durch Immunisierung mit einem Antigen bestehend aus einem Konjugat aus Thiobarbitursäure bzw. dessen verwandten Substanzen und einer Thiobarbitursäure-reaktiven Substanz (insbesondere Aldehyde bzw. Aldehydmodifizierte Moleküle) hergestellt wird.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6-7, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen das Antigen-Konjugat entweder direkt an ein Markermolekül gekoppelt ist oder durch sekundäre Antikörper detektiert wird.

9. Vorrichtung nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die TBA-TBARS- Konjugate durch verschiedene Immunoassays, insbesondere Western-Blot, ELISA, IFMA, FIA und RIA detektiert werden.