DE10120835C2 - Process for the production of monoclonal antibodies - Google Patents
Process for the production of monoclonal antibodiesInfo
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- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikör pern, in einem Batchverfahren, wobei Zellen, insbeson dere Säugetierzellen, welche die Antikörper exprimie ren, in einem Reaktor unter definierten Wachstumsbe dingungen in einer Suspension enthaltend Nährstoffme dium kultiviert werden und wobei mittels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Ausschlußgrenze unterhalb des Molekulargewichts der monoklonalen Antikörper auf weisen, Austauschmedium mit Nährstoffen der Suspension zugeführt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden.The invention relates to a method for manufacturing of antibodies, especially monoclonal antibodies pern, in a batch process, cells, in particular other mammalian cells that express the antibodies ren, in a reactor under defined growth zones conditions in a suspension containing nutrients dium are cultivated and whereby means for Mass exchange, which has an exclusion limit below the molecular weight of the monoclonal antibodies indicate exchange medium with nutrients of the suspension fed and metabolic waste products of the cells be withdrawn from the suspension.
Zur Expression von monoklonalen Antikörpern hergerich tete Zellen sind typischerweise Hybridomzellen. Ein Batchverfahren ist ein Verfahren, in welchem eine Zellkultur eingerichtet wird, wobei die Zellen der Zellkultur für eine definierte Zeitspanne kultiviert werden und wobei produzierte monoklonale Antikörper nach der definierten Zeitspanne, typischerweise späte stens nach Eintritt in die Absterbephase (starker Ab fall der Lebensfähigkeit bzw. Viability), aus der Zellkultur gewonnen werden. Die Zellen werden dabei verworfen. Eine Ausschlußgrenze gibt eine Obergrenze für die Größe von Molekülen, gemessen mittels des Mo lekulargewichtes, an, welche eine Membran oder Barriere zu passieren vermögen. Moleküle mit höherem Molekulargewicht sind nicht in der Lage die Membran oder Barriere zu permeieren. Nährstoffmedium enthält die wesentlichen Komponenten, die für das Zellwachstum bzw. die Proliferation wichtig sind. Nährstoffmedium in der hier verwendeten Terminologie kann auch Protei ne, beispielsweise FCS (fetal calf serum), enthalten. Austauschmedium in der hier verwendeten Terminologie wird in der Regel keine Proteine mit einem Molekular gewicht über der Ausschlußgrenze enthalten, da diese nicht in die Suspension übertreten können. Eine Kulti vierung in Suspension bezeichnet Zellkulturen, deren Zellen nicht oder nur schwach adhärent sind. Bei einer Suspensionskultur sind typischerweise mehr als 90% der Zellen in Suspension, i. e. haften nicht an einer Ober fläche des Reaktors. Definierte Wachstumsbedingungen sind einrichtbar insbesondere durch Steuerung und/oder Regelung der Parameter Temperatur, pH und O2-Gehalt. Diese Parameter werden auf vorgegebene Werte einge stellt nach Maßgabe von optimalen Kultivierungseffek ten. Die Parameter werden meist konstant gehalten, es ist aber auch möglich, diese Parameter im Laufe eines Batches gezielt zu variieren. Mittel zum Stoffaus tausch sind Membranen oder Barrieren, durch die ein Stoffaustausch im Wege diffusiver und/oder konvektiver Prozesse stattfinden kann. Eine solche Membran oder Barriere trennt ansonsten das Austauschmedium von der Suspension in definierte Volumenräume. Antikörper in der hier gewählten Terminologie umfassen neben Anti körpern im eigentlichen Sinne auch andere pharmazeu tisch brauchbare Stoffe, die von Zellen produziert werden können. Cells prepared for the expression of monoclonal antibodies are typically hybridoma cells. A batch process is a process in which a cell culture is set up, the cells of the cell culture being cultivated for a defined period of time and monoclonal antibodies being produced after the defined period of time, typically at the very latest after the onset of the death phase (sharp drop in viability or Viability), can be obtained from cell culture. The cells are discarded. An exclusion limit specifies an upper limit for the size of molecules, measured by means of the molecular weight, which are able to pass through a membrane or barrier. Molecules with a higher molecular weight are unable to permeate the membrane or barrier. Nutrient medium contains the essential components that are important for cell growth or proliferation. Nutrient medium in the terminology used here can also contain proteins, for example FCS (fetal calf serum). Exchange medium in the terminology used here will generally not contain proteins with a molecular weight above the exclusion limit, since these cannot pass into the suspension. A cultivation in suspension denotes cell cultures whose cells are not or only weakly adherent. In the case of a suspension culture, typically more than 90% of the cells are in suspension, ie they do not adhere to a surface of the reactor. Defined growth conditions can be set up, in particular by controlling and / or regulating the parameters of temperature, pH and O 2 content. These parameters are set to predetermined values in accordance with optimal cultivation effects. The parameters are usually kept constant, but it is also possible to vary these parameters in a targeted manner in the course of a batch. Means of mass exchange are membranes or barriers through which a mass exchange can take place by means of diffusive and / or convective processes. Such a membrane or barrier otherwise separates the exchange medium from the suspension into defined volume spaces. Antibodies in the terminology chosen here include not only antibodies in the strict sense, but also other pharmaceutically usable substances that can be produced by cells.
Insbesondere monoklonale Antikörper gewinnen in zuneh mendem Maße an Bedeutung als Wirkstoffe in pharmazeu tischen Zusammensetzungen. Daher werden monoklonale Antikörper in großen Mengen benötigt, und zwar zu mög lichst geringen Herstellungskosten. Beides wird in hohem Maße von der Effektivität der Kultivierung der produzierenden Zellen bestimmt.Monoclonal antibodies in particular are increasingly gaining in importance Increasing importance as active ingredients in pharmaceuticals table compositions. Therefore, become monoclonal Antibodies needed in large quantities, and that too possible lowest possible manufacturing costs. Both are in highly of the effectiveness of cultivating the producing cells.
Von besonderer Bedeutung in diesen Zusammenhängen ist, wie lange die Zellen eines Batches zur Produktion von Antikörpern in der Lage sind. Dies hängt insbesondere von der Dauer der Lebensfähigkeit der eingesetzten Zellen unter den Kulturbedingungen ab. Diese Kulturbe dingungen unterliegen jedoch hinsichtlich der Zusammen setzung der Suspension schwer kontrollierbaren Krite rien, insbesondere biochemischen Prozessen, die die Lebensfähigkeit der Zellen negativ beeinflussen und/oder Apoptose der Zellen induzieren. Hierbei können beispielsweise Nährstoffmangel und/oder Stoffwech selabfallprodukte, aber auch Signale, die von Zellen nach Maßgabe der Wachstumsphase, des Zell/Zell-Kontak tes, der Zelldichte usw. erzeugt werden, eine Rolle spielen.Of particular importance in this context is how long the cells of a batch take to produce Antibodies are capable. This depends in particular on the viability of the deployed Cells under the culture conditions. This cultural heritage however, conditions are subject to together setting the suspension difficult to control criteria rien, especially biochemical processes that the Negatively affect cell viability and / or Induce cell apoptosis. Here you can for example, lack of nutrients and / or metabolism sel waste products, but also signals from cells according to the growth phase, the cell / cell contact tes, the cell density, etc. are generated, a role play.
Aus der Literaturstelle EP 0 224 800 B1 ist ein Ver fahren zur Kultivierung von Zellen bekannt, welches der Gewinnung beispielsweise von monoklonalen Antikör pern dient. Hierbei handelt es sich um ein Batchverfahren, wobei Zellen in Suspension kultiviert wer den. Im Rahmen der insofern bekannten Maßnahmen sind in dem Reaktor semipermeable Membranhohlfasern einge richtet, durch welche ein durch die Hohlfaserwandungen von der Suspension getrenntes Austauschmedium in einem Kreislauf geführt wird. Durch die Hohlfaserwandungen treten Nährstoffe aus dem Austauschmedium in die Sus pension und Stoffwechselabfallprodukte aus der Suspen sion in das Austauschmedium ein.From the reference EP 0 224 800 B1 a Ver drive to cultivate known cells, which the production of, for example, monoclonal antibodies pern serves. This is a batch process where cells are cultivated in suspension the. Within the scope of the measures known in this respect semipermeable membrane hollow fibers inserted in the reactor directs through which one through the hollow fiber walls exchange medium separated from the suspension in one Cycle. Through the hollow fiber walls nutrients from the exchange medium enter the sus pension and metabolic waste products from the Suspen sion in the exchange medium.
Aus der Literaturstelle JP-A-60/207581 ist ein nahezu identisches Verfahren bekannt, welches sich lediglich dadurch unterscheidet, daß das Austauschmedium nicht im Kreislauf geführt wird. Vielmehr wird das Aus tauschmedium in Membranhohlfasern, welche keine Aus strömöffnung aufweisen, hineingeleitet und druckbeauf schlagt. Hierdurch treten Nährstoffe in die Suspension über. Nach einer vorgegebenen Zeitspanne werden die Druckverhältnisse umgekehrt, wodurch u. a., Stoffwech selabfallprodukte aus der Suspension entnommen werden. Dieser Vorgang wiederholt sich.From JP-A-60/207581 is an almost identical method known, which is only differs in that the exchange medium is not is circulated. Rather, the end Exchange medium in hollow membrane fibers, which are no off have flow opening, introduced and pressurized beat. This causes nutrients to enter the suspension about. After a specified period of time, the Reverse pressure ratios, which u. a., metabolism sel waste products are removed from the suspension. This process is repeated.
Mit beiden vorstehenden Methoden werden vergleichbare Zelldichten und vergleichbare Ausbeuten an Antikörpern erhalten. Beiden Methoden ist weiterhin gemeinsam, daß ein Batch typischerweise unmittelbar nach Ende der logarithmischen Proliferationsphase oder spätestens einige wenige Tage hiernach abgebrochen wird, da die Zunahme der Antikörper-Konzentration abnimmt oder die Konzentrationsänderung gar auf 0 fällt aufgrund des Eintritts in die Absterbephase. The two methods above are comparable Cell densities and comparable yields of antibodies receive. Both methods still have in common that a batch typically immediately after the end of the logarithmic proliferation phase or at the latest is canceled a few days after that because the Antibody concentration increases or decreases Concentration change even to 0 falls due to the Entry into the death phase.
Aus der Literaturstelle Gori, G. B., Applied Microbio logy, 13: 93-98 (1965), ist ein Bioreaktor bekannt, welcher mit einem Dialyseschlauch, der von einem FCS enthaltenden Nährmedium durchströmt wird, ausgestattet ist. Bei dem mit diesem Reaktor durchgeführten Verfah ren wird chemostatisch gearbeitet und es werden nur recht niedrige Zelldichten erreicht.From Gori, G.B., Applied Microbio logy, 13: 93-98 (1965), a bioreactor is known which with a dialysis tube made by an FCS containing nutrient medium is flowed through is. In the process carried out with this reactor Ren is worked chemostatically and it will only reached quite low cell densities.
Aus der Literaturstelle DE 689 25 971 T2 ist ein Ver fahren zur Herstellung von Antikörpern bekannt, wobei die die Antikörper herstellenden Zellen bis zu maximal 14 Tage in einer stationären Phase gehalten werden können. Die Zellzahl, lebend, fällt typischerweise bereits nach ca. 4 bis 6 Tagen ab. Aus den Literatur stellen DE 689 13 962 T2 und DE 692 13 695 T2 sind Mittel zum Austausch von frischem und verbrauchten Medium in einem Kreislauf bei einem Reaktor zur Anti körperherstellung bekannt. Aus der Literaturstelle US-4,983,517 sind Mittel zur kontinuierlichen Zufüh rung von Nährstoffen und Entfernung von toxischen Me taboliten bekannt.From document DE 689 25 971 T2 a Ver drive known for the production of antibodies, wherein the cells producing the antibodies up to a maximum 14 days in a stationary phase can. The cell count, alive, typically drops already after about 4 to 6 days. From the literature are DE 689 13 962 T2 and DE 692 13 695 T2 Means for the exchange of fresh and used Medium in a circuit in a reactor for anti body manufacturing known. From the literature US 4,983,517 are continuous feeding means Nutrient removal and removal of toxic me known tabolites.
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Batchverfahren zur Herstellung von Antikörpern mittels einer Zellsuspension anzugeben, welches pro Batch eine erhöhte Menge an Antikörpern liefert.The invention is based on the technical problem a batch process for the production of antibodies to indicate by means of a cell suspension, which per Batch delivers an increased amount of antibodies.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er findung ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einem Batchverfahren, wobei Zellen, welche die An tikörper exprimieren, in einem Reaktor unter definier ten Wachstumsbedingungen in einer Suspension enthal tend Nährstoffmedium kultiviert werden und wobei mit tels Mitteln zum Stoffaustausch, welche eine Aus schlußgrenze unterhalb des Molekulargewichts der Anti körper aufweisen, Austauschmedium der Suspension zuge führt und Stoffwechselabfallprodukte der Zellen der Suspension entzogen werden mit den folgenden Verfah renstufen: a) in einer Anfahrphase wird der Reaktor angeimpft und durch stufenweise Zufuhr von Nährstoff medium über Mittel zur Mediumzufuhr exponentielles Wachstum der Zellen initiiert, wobei die Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, in einem Be reich von 1 × 105 bis 5 × 106 Zellen/ml gehalten wird, b) in einer Aufbauphase werden die Mittel zum Aus tausch betrieben, wobei Austauschmedium mit definier tem Volumen durch die Mittel zum Austausch in einem Kreislauf gepumpt wird, mit der Maßgabe, daß die Zell dichte, bezogen auf das Volumen der Suspension zuzüg lich dem Mediumvolumen im Kreislauf, einen Wert von 1 × 105/ml nicht unterschreitet, und wobei im Verlauf der Aufbauphase eine Zelldichte, bezogen auf das Volu men der Suspension, von zumindest 5 × 106/ml erreicht wird, c) nach Erreichen einer Zelldichte von zumindest 5 × 106/ml in Stufe b) wird eine stationäre Phase ein geleitet, wobei durch Einrichtung und taktweiser Um kehr eines Druckgradienten zwischen Kreislauf und Re aktor ein Stofftransport durch die Mittel zum Stoffaustausch entlang des Druckgradienten eingestellt wird, wodurch Nährstoffe aus dem Austauschmedium in den Reaktor ein- und Stoffwechselabfallprodukte aus dem Reaktor in das Austauschmedium ausgetragen werden, wobei der Volumenaustausch das 0,01- bis 1fache des Suspensionsvolumens/Tag entspricht, und d) nach Absin ken der Antikörper-Freisetzungsrate wird die Stufe c) abgebrochen und werden die Antikörper aus der Suspen sion gewonnen.In order to solve this technical problem, the invention teaches a process for the production of antibodies in a batch process, cells which express the antibodies being cultivated in a reactor under defined growth conditions in a suspension containing nutrient medium and using means for mass transfer Which have an exclusion limit below the molecular weight of the anti-body, exchange medium supplied to the suspension and metabolic waste products of the cells of the suspension are removed using the following process steps: a) in a start-up phase, the reactor is inoculated and by means of gradual supply of nutrient medium for the medium supply, exponential growth of the cells is initiated, the cell density, based on the volume of the suspension, being kept in a range from 1 × 10 5 to 5 × 10 6 cells / ml, b) in a build-up phase, the agents are exchanged operated, exchange medium mi t defined volume is pumped through the exchange means in a circuit, with the proviso that the cell density, based on the volume of the suspension plus the medium volume in the circuit, does not fall below a value of 1 × 10 5 / ml, and wherein in the course of the build-up phase a cell density, based on the volume of the suspension, of at least 5 × 10 6 / ml is reached, c) after reaching a cell density of at least 5 × 10 6 / ml in stage b), a stationary phase is reached conducted, by means of means and intermittent reversal of a pressure gradient between the circuit and the reactor, a mass transfer through the means for mass transfer along the pressure gradient is set, whereby nutrients from the exchange medium are fed into the reactor and metabolic waste products are discharged from the reactor into the exchange medium, wherein the volume exchange corresponds to 0.01 to 1 times the suspension volume / day, and d) after the antibody fr Step c) is terminated and the antibodies are obtained from the suspension.
Das Volumen der Suspension setzt sich aus dem Volumen des Nährstoffmediums und der Zellen zusammen. Das Animpfen eines Reaktors erfolgt dadurch, daß in den Reaktor Nährstoffmedium und Zellen eingebracht werden. Dabei werden typischerweise Zelldichten von 1 × 105 bis 3 × 106 Zellen/ml eingestellt. Der Ausdruck der Zelldichte bezieht sich stets auf die Dichte lebender Zellen. Die stationäre Phase ist dadurch gekennzeich net, daß die Zelldichte praktisch unverändert ist und die Zellen mit praktisch konstanten Freisetzungsraten Antikörper produzieren. Mittel zur Mediumzufuhr arbei ten ohne Ausschlußgrenze und sind typischerweise Ein laßöffnungen oder Einlaßschleusen in einer Reaktorwan dung. Mittel zum Stoffaustausch sind typischerweise zumindest zum Teil permanent (bezogen auf die Dauer des Stoffaustausches) in die Suspension eingetaucht und mit einer Wandung somit in Kontakt mit der Suspen sion. Die gegenüberliegende Wandung steht in Kontakt mit dem Austauschmedium.The volume of the suspension is made up of the volume of the nutrient medium and the cells. A reactor is inoculated by introducing nutrient medium and cells into the reactor. Typically, cell densities of 1 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / ml are set. The expression of cell density always refers to the density of living cells. The stationary phase is characterized in that the cell density is practically unchanged and the cells produce antibodies with practically constant release rates. Medium supply means work without an exclusion limit and are typically inlet openings or inlet locks in a reactor wall. Substances for mass transfer are typically at least partially permanently (based on the duration of the mass exchange) immersed in the suspension and thus in contact with the suspension with a wall. The opposite wall is in contact with the exchange medium.
Im Kern wird in der Stufe a) die absolute Anzahl der Zellen expandiert, und zwar einhergehend mit einer Volumenzunahme der Suspension, so daß die Zelldichten trotz der Proliferation im wesentlichen konstant blei ben. In der Stufe b) findet dagegen sowohl eine Erhö hung des Volumens der Suspension als auch der Zell dichten statt. Es lassen sich zum Ende der Stufe b) bis zu 3 × 107 Zellen/ml und mehr erreichen.In the core in stage a), the absolute number of cells is expanded, and this is accompanied by an increase in volume of the suspension, so that the cell densities remain essentially constant despite the proliferation. In step b), on the other hand, both an increase in the volume of the suspension and in the cell densities takes place. Up to 3 × 10 7 cells / ml and more can be achieved at the end of stage b).
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die Le bensfähigkeit der Zellen sich beachtlich fördern bzw. über einen langen Zeitraum konservieren läßt, wenn die Zelldichten einerseits und die Zufuhr von Austauschme dium andererseits in den angegebenen Grenzen gehalten werden. Hierbei ist insbesondere überraschend, daß eine beliebige Erhöhung der Zufuhr von Nährstoffen nicht etwa die Lebensfähigkeit der Zellen fördert, vielmehr daß bei Überschreiten einer Obergrenze der Zufuhr die Lebensfähigkeit sogar irreversibel und dra stisch abnimmt, i. e. Apoptose induziert wird. The invention is based on the knowledge that the Le viability of the cells promotes or can be preserved over a long period of time if the Cell densities on the one hand and the supply of exchange meas dium on the other hand kept within the specified limits become. It is particularly surprising that any increase in the supply of nutrients doesn't promote cell viability, rather that when an upper limit is exceeded Feeds the viability even irreversible and dra decreases stisch i. e. Apoptosis is induced.
Mit der Erfindung wird erreicht, daß eine eine ausge dehnte stationäre Phase an die Aufbauphase angeschlos sen werden kann, die bis zu 30 Tage und mehr währen kann. Somit wird mit einem einzigen Batch ein Vielfa ches der Menge an Antikörpern produziert, verglichen mit dem Stand der Technik, wo eine allenfalls nur an satzweise stationäre Phase gefahren werden kann. Somit wird für eine vorgegebene Menge an Antikörper beacht lich weniger Aufwand bei der Bereitstellung von Zellen und dem Betrieb der technischen Einrichtungen benö tigt. Von besonderer Bedeutung für die pharmazeutische Zwecke der Antikörper ist aber auch, daß mit dem Stand der Technik auch nicht annäherungsweise erreichbare Konzentrationen der Antikörper erreicht werden.With the invention it is achieved that a one out stretched stationary phase connected to the construction phase that can last up to 30 days or more can. Thus, with a single batch, a variety ches the amount of antibodies produced compared with the state of the art, where at most only stationary phase can be driven. Consequently is considered for a given amount of antibody much less effort in the provision of cells and the operation of the technical facilities Untitled. Of particular importance for the pharmaceutical The purpose of the antibodies is also that with the state not nearly achievable in technology Antibody concentrations can be reached.
Bevorzugt ist es zur effektiven Rückhaltung der Anti körper und universeller Einsetzbarkeit der Mittel zum Stoffaustausch bei unterschiedlichen zu produzierenden Antikörpern, wenn die Ausschlußgrenze im Bereich von 2000 bis 20 000 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 3000 bis 10 000 Dalton liegt.It is preferred for effective retention of the anti body and universal applicability of the means for Mass exchange in different to be produced Antibodies if the exclusion limit is in the range of 2000 to 20,000 daltons, preferably in the range of 3000 to 10,000 daltons.
Die Zelldichte in der Stufe a) wird bevorzugterweise in einem Bereich von 5 × 105 bis 3 × 106 Zellen/ml ge halten. Die Untergrenze der Zelldichte in der Stufe b) unterschreitet zweckmäßigerweise einen Wert von 3 × 105/ml bis 3 × 106/ml nicht. Die Aufbauphase wird vor teilhafterweise bis zu einer Zelldichte von zumindest 1 × 107/ml gefahren. The cell density in step a) is preferably kept in a range from 5 × 10 5 to 3 × 10 6 cells / ml ge. The lower limit of the cell density in stage b) expediently does not fall below a value of 3 × 10 5 / ml to 3 × 10 6 / ml. The build-up phase is advantageously carried out up to a cell density of at least 1 × 10 7 / ml.
Einen optimalen Stoffaustausch sowohl der Nährstoffe als auch der Stoffwechselabfallprodukte erhält man, wenn die Takte in Stufe c) periodisch mit einer Peri odenlänge von 10 bis 3000 s eingerichtet sind. Die Takte können durch den Füllstand im Reaktor gesteuert werden, wobei bei Erreichen eines definierten maxima len Füllstandes der Druckgradient zum Kreislauf hin abfällt und bei Abfall auf einen definierten minimalen Füllstand zum Reaktor hin abfällt. In dieser Ausfüh rungsform ist ein Füllstandsmesser eingerichtet und mit einer Steuerung der Druckverhältnisse verbunden, wel cher zwei Schaltgrenzen aufweist, den minimalen und den maximalen Füllstand. Diese beiden Grenzen bilden dann die regelungstechnische Hystereseschleife. Die Steuerung kann dann beispielsweise den Druck des Aus tauschmediums in den Mitteln zum Austausch so steuern, daß er bei Erreichen des maximalen Füllstandes auf eine vorgegebene Druckdifferenz unterhalb des Druckes im Reaktor und bei Erreichen des minimalen Füllstandes auf eine vorgegebene Druckdifferenz oberhalb des Druckes im Reaktor gesteuert wird. Es kann auch mit mit dem Füllstand in Beziehung stehenden Meßgrößen gearbeitet werden, beispielsweise einem maximalen Druck im Reak tor und einem minimalen Druck im Reaktor. Denn der Reaktor ist typischerweise ein geschlossenes System, in welchem die Druckverhältnisse definiert steuerbar sind.An optimal mass exchange of both the nutrients as well as the metabolic waste products, if the bars in stage c) periodically with a peri floor length of 10 to 3000 s are set up. The Cycles can be controlled by the level in the reactor be, whereby when reaching a defined maxima len level the pressure gradient towards the circuit drops and in the case of waste to a defined minimum Level drops to the reactor. In this version form a level meter is set up and with a control of the pressure ratios, wel cher has two switching limits, the minimum and the maximum level. Form these two borders then the control hysteresis loop. The Control can then, for example, the pressure of the off control the medium of exchange in the means of exchange, that it reaches when the maximum level is reached a predetermined pressure difference below the pressure in Reactor and when the minimum fill level is reached to a predetermined pressure difference above the pressure is controlled in the reactor. It can also be used with the Level-related measurands worked maximum pressure in the reac tor and a minimum pressure in the reactor. Because the Reactor is typically a closed system, in which the pressure conditions are controllable are.
Es kann optional auch in der Stufe b) Nährstoffmedium über die Mittel zur Mediumzufuhr zugeführt werden. Dann findet ein Nährstoffeintrag sowohl über die Medi umzufuhr als auch über die Mittel zum Stoffaustausch statt. Die Stufe b), in welcher Variante auch immer, wird bis zum Erreichen eines definierten maximalen Füllstandes im Reaktor durchgeführt. Hierbei kann Aus tauschmedium in einer Menge von 1 bis 50 ml/108 Zellen und Tag, vorzugsweise von 5 bis 30 ml/108 Zellen und Tag, dadurch mit dem Reaktor korrespondieren, daß vor zugsweise zwischen dem Kreislauf und dem Reaktor ein zum Reaktor hin abfallender Druckgradient eingestellt wird.Optionally, nutrient medium can also be supplied in stage b) via the medium supply means. Then a nutrient entry takes place both via the medi supply and via the means of mass exchange. Step b), in whatever variant, is carried out until a defined maximum fill level is reached in the reactor. Here, exchange medium in an amount of 1 to 50 ml / 10 8 cells and day, preferably 5 to 30 ml / 10 8 cells and day, thereby correspond to the reactor in that preferably between the circuit and the reactor to the reactor decreasing pressure gradient is set.
In der Stufe c ist vorteilhafterweise eine Geschwin digkeit des (konvektiven) Stoffaustausches (bzw. Volu menaustausch) eingestellt, die pro 24 h das 0,05- bis 0,5fache des Suspensionsvolumens beträgt.In stage c there is advantageously a speed of the (convective) mass exchange (or vol menu exchange), the 0.05 to 0.5 times the suspension volume.
Insbesondere im Hinblick auf sich im Austauschmedium akkumulierende Stoffwechselabfallprodukte und damit einem abnehmenden Konzentrationsgradienten durch die Mittel zum Stoffaustausch kann es sich empfehlen, das Austauschmedium des Kreislaufes nach einer definierten Zeitspanne gegen frisches Austauschmedium auszutauschen.Especially with regard to yourself in the exchange medium accumulating metabolic waste products and thus a decreasing concentration gradient through the Means of mass exchange can recommend that Exchange medium of the circuit according to a defined Time period against fresh exchange medium exchange.
Die Mittel zum Stoffaustausch können grundsätzlich beliebig in Hinblick auf Materialien und Größe der Oberflächen ausgebildet sein, sofern sich die o. g. Austauschraten einstellen lassen und die Ausschluß grenze eingerichtet ist. Es ist dem Fachmann ohne wei teres möglich, die Werkstoffauswahl sowie die geome trische Ausbildung nach diesen Maßgaben auszubilden. Es kommen beispielsweise eine handelsübliche Dialyse membran, vorzugsweise in Schlauchform, oder ebenfalls handelsübliche Mikrohohlfasern, wie beispielsweise in der Literaturstelle EP 0 224 800 B1 beschrieben, in Frage. In beiden Fällen wird die Austauschrate außer von den geometrischen Eigenschaften (Oberfläche, Struktur des Materials, wie Oberflächenstruktur und/oder Porenstruktur) auch von der Strömungsgeschwindig keit des Austauschmediums durch den Schlauch bzw. die Mikrohohlfaser abhängen sowie von dem Druckgradienten durch die Membran, der neben diffusiven Prozessen auch konvektive Prozesse durch die Membran induziert.Fundamentally, the means of mass exchange can any in terms of materials and size of the Surfaces are formed, provided that the above-mentioned. Exchange rates set and exclusion limit is set up. It is the specialist without white teres possible, the choice of materials and the geome training according to these standards. There is, for example, a commercial dialysis membrane, preferably in tubular form, or likewise commercially available hollow micro fibers, such as in the literature reference EP 0 224 800 B1, in Question. In both cases, the exchange rate is excluded from the geometric properties (surface, Structure of the material, such as surface structure and / or Pore structure) also from the flow rate exchange medium through the hose or the Micro hollow fiber depend as well as on the pressure gradient through the membrane, which in addition to diffusive processes convective processes induced by the membrane.
Die Stufe c) wird nach Absinken der Antikörper-Freisetzungsrate (Abnahme des Anstiegs der Antikörperkonzentration als Funktion der Zeit) abge brochen und die Antikörper werden aus der Suspension gewonnen. Die Details einer Gewinnung der Antikörper aus der Suspension sind dem Fachmann gut vertraut und brauchen daher nicht näher erläutert zu werden. Als Abbruchkriterium kann beispielsweise ein Vergleich der Steigung einer Kurve Konzentration Antikörper in der Suspension (Ordinate) gegen Zeit (Abszisse) in 24 h Abstand verwendet werden. Nimmt die Steigung um einen definierten relativen Betrag ab, beispielsweise 20%, so wird planmäßig abgebrochen. Alternativ kann ein absoluter Grenzwert der Steigung bei Unterschreitung als Abbruchkriterium dienen.Stage c) is after the Antibody release rate (decrease in the increase in Antibody concentration as a function of time) broken and the antibodies are removed from the suspension won. The details of obtaining the antibodies from the suspension are well known to the expert and therefore need not be explained in more detail. As The termination criterion can be compared, for example Slope of a curve concentration in the antibody Suspension (ordinate) versus time (abscissa) in 24 h Distance can be used. Takes the slope by one defined relative amount, for example 20%, it is canceled as scheduled. Alternatively, a absolute limit of the slope when falling below serve as a termination criterion.
Neben der Einstellung definierter Kultivierungsbedin gungen, wie oben beschrieben, wird es sich empfehlen, die Suspension vorzugsweise kontinuierlich umzuwälzen, damit die Suspension die Oberfläche der Mittel zum Stoffaustausch umfließt und so der Stoffaustausch ge fördert und besser kontrolliert werden kann. Auch ist eine praktisch homogene Zusammensetzung der Suspension wünschenswert. Eingesetzte Mittel zum Umwälzen sollten möglich zellschonend arbeiten. Bewährt hat sich bei spielsweise ein Segelblattrührer.In addition to setting defined cultivation conditions As described above, it will be recommended preferably circulating the suspension continuously, so that the suspension covers the surface of the agent Mass flow flows around and so the mass transfer ge can be promoted and better controlled. Is too a practically homogeneous composition of the suspension desirable. Means used to circulate should possible to work gently. Has proven itself in for example a sail blade stirrer.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert. Es zeigen:In the following, the invention is based on only Examples illustrating embodiments are explained in more detail. It demonstrate:
Fig. 1 ein Diagramm mit Zeitfunktionen der Zelldichte sowie der Konzentration monoklonaler Antikör per für ein erfindungsgemäßes Verfahren, und Fig. 1 shows a diagram with time functions of the cell density and the concentration of monoclonal Antikör by a method of the invention, and
Fig. 2 ein Diagramm eines Vergleichsversuches mit demgegenüber erhöhtem Austausch. Fig. 2 is a diagram of a comparative experiment with the increased exchange.
Die Zelldichte lebender Zellen in der Suspension läßt sich anhand einer entnommenen Probe bestimmen. In ei ner Neubauer Zählkammer werden von der mit 1% Trypan blau versetzten und ggf. vorverdünnten Suspension (Endkonzentration: 0,2%) 4 große Quadrate ausgezählt. Als lebend werden die ungefärbten Zellen und als tot die gefärbten Zellen bewertet. Anhand des eingesetzten Suspensionsvolumens, ggf. des Verdünnungsfaktors sowie dem Volumen Trypanblau läßt sich die Zahl der lebenden Zellen je ml berechnen.The cell density of living cells in the suspension leaves determine themselves on the basis of a sample taken. In egg ner Neubauer counting chamber with 1% Trypan blue offset and possibly pre-diluted suspension (Final concentration: 0.2%) 4 large squares counted. The unstained cells become living and dead the stained cells rated. Based on the used Suspension volume, possibly the dilution factor and the volume of trypan blue lets the number of living Calculate cells per ml.
Die Antikörperkonzentration läßt sich mit verschiede nen Standardmethoden messen. Dies sind beispielsweise Enzyme Immuno Assay, Immunturbidimetrische Bestimmung monoklonaler IgG Antikörper, Photometrische Ermitte lung des reziproken Titers und Bestimmung des serolo gischen Titers, visuell bewertet als Agglutination von bakteriellen Prüfstämmen, jeweils nach Vorschrift der Kit-Hersteller.The antibody concentration can be different measure a standard method. These are, for example Enzyme Immuno Assay, immuno-turbidimetric determination monoclonal IgG antibody, photometric determination the reciprocal titer and the serolo tic, visually rated as agglutination of bacterial test strains, each according to the regulations of Kit manufacturers.
Der Volumenaustausch läßt sich mittels einer Prüfver fahrenstufe mit einem Leerreaktor bestimmen. Hierfür wird der Reaktor wie im Normalbetrieb betrieben, nur ohne Zellen und nicht bis zum maximalen Füllstand mit Nährmedium befüllt. Es versteht sich, daß die Mittel zum Stoffaustausch praktisch vollständig in dem Nähr medium eintauchen. Es wird eine Reihe von definierten Druckdifferenzen zwischen Nährmedium im Reaktor und Austauschmedium im Kreislauf eingestellt (Gradient zum Nährmedium hin abfallend) und dann in Abhängigkeit von der Zeit die Volumenzunahme im Reaktor gemessen. Man erhält eine Kurvenschar, die spezifisch für die einge setzten Mittel zum Stoffaustausch ist, und aus welcher sich ein definierter Stoffaustausch durch Einstellung der Druckdifferenz einstellen läßt. Wenn Mittel zum Stoffaustausch eingesetzt werden, die aufgrund kapil larähnlichem Aufbau einen nennenswerten Druckabfall aufweisen, wird der Druck im Kreislauf eingangsseitig gemessen. The volume exchange can be done using a test ver Determine speed level with an empty reactor. Therefor the reactor is operated as in normal operation, only without cells and not up to the maximum level Culture medium filled. It is understood that the means for mass transfer practically completely in the nutrient Immerse medium. There are a number of defined ones Pressure differences between the nutrient medium in the reactor and Exchange medium set in the circuit (gradient to Growing medium) and then depending on the time the volume increase in the reactor was measured. you receives a family of curves that are specific to the turned is a means of mass exchange, and from which a defined mass exchange through adjustment the pressure difference can be set. If means to Mass transfer are used, which due to kapil lar-like structure a significant pressure drop the pressure in the circuit is on the inlet side measured.
Im Falle von Mittel zum Stoffaustausch, deren Poren struktur in Transportrichtung veränderlich ist (soge nannte asymmetrischen Membranen, wie beispielsweise Hohlfasern mit schaumartiger Membranstruktur aus Poly sulfon), kann es sich empfehlen, die vorstehenden Mes sungen zu Kontrollzwecken mit reversem Druckgradienten durchzuführen. Ggf. kann dann im Betrieb mit entspre chenden asymmetrischen Druckgradienten gearbeitet wer den, wenn die Volumenströme bei verschiedenen Takten bzw. Stromrichtungen gleich sein sollen. In der Regel werden jedoch praktisch keine Unterschiede festzustel len sein.In the case of agents for mass transfer, their pores structure can be changed in the direction of transport (so-called called asymmetric membranes, such as Hollow fibers with a foam-like membrane structure made of poly sulfone), it may be advisable to measure the above solutions for control purposes with reverse pressure gradient perform. Possibly. can then correspond in operation suitable asymmetrical pressure gradients when the volume flows at different cycles or current directions should be the same. Usually however, practically no differences will be found len be.
Ein in einem erfindungsgemäßen Verfahren beispielswei se einsetzbarer Reaktor weist die folgenden Bauelemen te auf. Es ist ein Reaktorgefäß eingerichtet, welches ein Volumen beispielsweise im Bereich von 1 bis 5 l aufweisen kann. Das Reaktorgefäß weist Sensoren für die Messung von Füllstand, Temperatur, pH und O2 auf. Es sind Anschlüsse zur Zufuhr von Nährstoffmedium so wie ggf. zur Begasung, Probenentnahme und Suspension sentnahme (Entleerung) eingerichtet. Im Inneren des Reaktors ist ein Stoffaustauschmodul eingerichtet, welches an einen Kreislauf weiterhin aufweisend eine Kreislaufpumpe, beispielsweise peristaltische Schlauchpumpe, anschließbar ist. Dabei kann der Kreis lauf so eingerichtet sein, daß die Mittel zum Stoffaustausch im Durchfluß betrieben werden. In die sem Falle sind in den Mitteln zum Stoffaustausch zu mindest jeweils eine Eingangs- und eine Ausgangsöffnung vorgesehen. Es ist aber auch möglich, einen Kreislauf einzurichten, an welchem die Mittel zum Stoffaustausch lediglich einseitig angeschlossen sind. Dann wird Austauschmedium einseitig in die Mit tel zum Stoffaustausch hinein gedrückt bzw. herausge drückt, jeweils nach Maßgabe des Vorzeichens des ange legten Druckgradienten. In jedem Fall strömt Aus tauschmedium durch die Mittel zum Stoffaustausch, da das Austauschmedium die Membran durchströmt bzw. hin durch diffundiert.A reactor which can be used, for example, in a process according to the invention has the following components. A reactor vessel is set up, which can have a volume, for example, in the range from 1 to 5 l. The reactor vessel has sensors for measuring level, temperature, pH and O 2 . Connections for the supply of nutrient medium as well as for fumigation, sampling and suspension removal (emptying) are set up. In the interior of the reactor, a mass transfer module is set up, which can also be connected to a circuit having a circuit pump, for example a peristaltic hose pump. The circuit can be set up so that the means for mass transfer are operated in the flow. In this case, at least one entrance and one exit opening are provided in the mass transfer means. However, it is also possible to set up a cycle to which the means for mass transfer are only connected on one side. Then the exchange medium is pressed on one side into the medium for mass transfer or pushed out, in each case in accordance with the sign of the applied pressure gradient. In any case, exchange medium flows through the means for mass transfer, since the exchange medium flows through the membrane or diffuses through.
Der Füllstandssensor ist mit einer elektronischen Steuerungsvorrichtung verbunden, mittels welche die Druckdifferenz zwischen Reaktor und Kreislauf ansteu erbar ist.The level sensor is with an electronic Control device connected by means of which Control the pressure difference between the reactor and the circuit is noticeable.
Die weiteren Sensoren sind mit üblichen Steuerungs- und Regelungsvorrichtungen verbunden, die entweder die gemessenen Parameter konstant halten oder definierte Programme (zeitliche Verläufe) der Parameter steuern und regeln.The other sensors are equipped with conventional control and control devices connected to either the keep measured parameters constant or defined Control programs (time profiles) of the parameters and regulate.
Die Suspension wird beispielsweise mittels eines Se gelblattrührers umgewälzt.The suspension is, for example, by means of a Se Gelblattrirrers circulated.
Als Mittel zum Stoffaustausch ist ein Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 eingerichtet, wobei die geometrischen Dimensionen so gewählt sind, daß sich in einer Prüfverfahrenstufe gemäß Beispiel 3 die gewünschten Austauschraten erzielen lassen. Dies ist ohne weiteres durch einfache Versuche ermittelbar. Alternativ ist es möglich Mikrohohlfasern, beispiels weise aus Polysulfon einzusetzen. Für deren Geometrie gilt das Vorstehende analog. Da sterilisierbare Mikro hohlfasern mit Ausschlußgrenzen unterhalb 10 000 ohne weiteres käuflich erwerbar sind, die Sterilisierung von Dialyseschläuchen mit sehr niedrigen Ausschluß grenzen demgegenüber nicht immer unkompliziert ist, kann sich der Einsatz von Mikrohohlfasern lohnen, wenn niedrige Ausschlußgrenzen bei einfacher Sterilisier barkeit gefragt sind.A dialysis tube is used as a means of mass exchange set up with an exclusion limit of 10,000, the geometric dimensions are chosen so that in a test method stage according to Example 3 achieve the desired exchange rates. This can be easily determined by simple experiments. Alternatively, it is possible to use hollow micro fibers, for example wise use of polysulfone. For their geometry the above applies analogously. Because sterilizable micro hollow fibers with exclusion limits below 10,000 without Other items that are commercially available are sterilization dialysis tubing with very low exclusion limit is not always straightforward, the use of hollow micro fibers can be worthwhile if low exclusion limits with simple sterilization availability are required.
Weiterhin ist eine übliche Begasungeinheit zur Einlei tung von Luft, O2 und/oder CO2 in die Suspension einge richtet.Furthermore, a conventional gassing unit for introducing air, O 2 and / or CO 2 into the suspension is set up.
Vor dem Einsatz des Bioreaktors werden alle Komponen ten nach Vorschrift sterilisiert und die Sensoren ggf. kalibriert. Das Mittel zum Stoffaustausch wird auf Dichtheit geprüft (Blasenbildung bei innenseitiger Beaufschlagung mit Gas und Eintauchen in eine Flüssig keit). Dann werden alle vorstehend beschriebenen Kom ponenten montiert und der komplette Aufbau durch Auto klavierung nachsterilisiert. Der insofern sterile Re aktor wird dann positioniert und die elektrischen An schlüsse sowie die Fluidanschlüsse und Gasanschlüsse werden steril hergestellt.Before using the bioreactor, all components are sterilized according to regulations and the sensors calibrated. The means of mass exchange is on Tightness checked (blistering on the inside Exposure to gas and immersion in a liquid ness). Then all the com components assembled and the complete assembly by car piano sterilized. The sterile Re The actuator is then positioned and the electrical connections connections as well as the fluid connections and gas connections are manufactured sterile.
Das Animpfen erfolgt dadurch, daß Nährstoffmedium (handelsübliches DMEM, supplementiert mit Natrium bikarbonat, L-Glutamin, Gentamycin, Pyruvat, Glucose und FCS) und Zellen in den Reaktor eingebracht werden, wobei die Zelldichte auf etwa 1 × 105/ml, bezogen auf das Volumen der Suspension, eingestellt wird.The inoculation takes place by introducing nutrient medium (commercial DMEM, supplemented with sodium bicarbonate, L-glutamine, gentamycin, pyruvate, glucose and FCS) and cells into the reactor, the cell density being about 1 × 10 5 / ml, based on the volume of the suspension is adjusted.
Anschließend wird stufenweise Nährstoffmedium zuge führt, wobei die Menge zugegebenen Nährstoffmediums nach Maßgabe von Messungen der Zelldichte so gewählt wird, daß die Zelldichte annähernd konstant bleibt. Die Zugabe erfolgt bis zu einem vorgegebenen Füllstand.Then nutrient medium is gradually added leads, the amount of nutrient medium added chosen in accordance with measurements of cell density is that the cell density remains approximately constant. The addition takes place up to a predetermined Level.
Nach Erreichen des vorgegebenen Füllstandes der An fahrphase, ggf. bereits zuvor, werden die Mittel zum Stoffaustausch in Betrieb genommen. In dieser Auf bauphase wird die Zelldichte auf zumindest 5 × 106/ml (bezogen auf das Volumen der Suspension) erreicht. Eine Volumenzunahme der Suspension erfolgt durch Zu fluß von Austauschmedium. Dieser Zufluß wird (über einen Druckgradienten) so gesteuert und überwacht, daß die Zelldichte einen vorgegebenen Mindestwert nicht unterschreitet. Im Rahmen der Aufbauphase wird Aus tauschmedium in einer Menge von ca. 37 ml/108 Zellen und Tag in den Reaktor eingetragen.After reaching the specified filling level of the start-up phase, if necessary previously, the means for mass transfer are put into operation. In this construction phase, the cell density is at least 5 × 10 6 / ml (based on the volume of the suspension). An increase in volume of the suspension occurs due to the flow of exchange medium. This inflow is controlled and monitored (via a pressure gradient) so that the cell density does not fall below a predetermined minimum value. In the course of the construction phase, exchange medium is introduced into the reactor in an amount of approx. 37 ml / 10 8 cells and day.
Nach Erreichen der Mindestzelldichte der Aufbauphase wird die stationäre Phase eingeleitet. Hierbei wird taktweise ein vorgegebener Druckgradient zwischen Sus pension und Kreislauf umgekehrt, wobei die Umkehrpunk te durch eingestellte minimale und maximale Füllstän de, gemessen mittels des Füllstandssensors, angesteu ert werden. Die Taktdauer kann, je nach gewünschter Austauschrate, zwischen 10 und 3000 s betragen. Sie hängt auch von veränderlichen Eigenschaften der Mittel zum Stoffaustausch (z. B. blocking) ab, wenn mit kon stantem Druckgradient gearbeitet wird.After reaching the minimum cell density in the build-up phase the stationary phase is initiated. Here will a predetermined pressure gradient between Sus pension and circulation reversed, the reversal point through the set minimum and maximum fill levels de, measured by means of the level sensor be heard. The cycle time can, depending on the desired Exchange rate, between 10 and 3000 s. she also depends on changing properties of the funds for the exchange of materials (e.g. blocking), if with con constant pressure gradient is worked.
Im Zuge des vorstehenden Verfahrens wird in definier ten Zeitabständen die Zelldichte gemessen, ebenso wie die Antikörperkonzentration. In der Fig. 1 sind die Ergebnisse für die käuflich frei verfügbare Zelllinie AntiA-A003 dargestellt. Man erkennt zunächst, daß sich hohe Zelldichten, wie beim eingangs genannten Stand der Technik erreichen lassen. Erfindungswesentlich ist aber, daß die Antikörperproduktion bis 30 Tage ab An fahrphase und mehr anhält, ohne daß ein Abflachen des Anstiegs der Konzentrationskurve erkennbar ist. Im Er gebnis wird pro Volumeneinheit Suspension eine um ein Vielfaches höhere Antikörperkonzentration dadurch er reicht, daß nicht im Bereich von Tag 10 bis 12 abge brochen werden muß, wie im Stand der Technik, sondern eine ausgedehnte stationäre Phase (konstante maximale Zelldichte) gefahren werden kann.In the course of the above method, the cell density is measured at defined time intervals, as is the antibody concentration. In Fig. 1 the results are shown for the commercially freely available cell line Antia-A003. It can first be seen that high cell densities can be achieved, as in the prior art mentioned at the beginning. It is essential to the invention, however, that the antibody production lasts up to 30 days from the start-up phase and more, without a flattening of the increase in the concentration curve being discernible. In the result, a volume concentration of antibody which is many times higher per volume unit of suspension is sufficient that it is not necessary to abort in the range from day 10 to 12, as in the prior art, but an extended stationary phase (constant maximum cell density) can be driven ,
Es werden regelmäßig Antikörperkonzentrationen von 1 bis 4 mg/ml Suspension und mehr erreicht. Gemäß bei spielsweise EP 0 224 800 B1 sind nicht mehr als 300 µg/ml erzielbar. Gleichzeitig wird zur Herstellung derselben absoluten Antikörpermenge lediglich 40-60% der Menge an Medium, verglichen mit einem klassischen Batchverfahren, benötigt. Die Integrität der erfin dungsgemäß hergestellten Antikörper (Quotient aus ak tiver und passiver mAK-Bestimmung) genügt dabei allen Anforderungen. Antibody concentrations of 1 up to 4 mg / ml suspension and more reached. According to at for example EP 0 224 800 B1 are not more than 300 µg / ml achievable. At the same time it is used to manufacture same absolute amount of antibody only 40-60% the amount of medium compared to a classic Batch process, needed. The integrity of the inventor Antibodies produced in accordance with the invention (quotient from ac tive and passive MAK determination) is sufficient for everyone Conditions.
In diesem Vergleichsversuch wurde grundsätzlich analog dem Beispiel 5 verfahren, wobei jedoch in der Verfah rensstufe b) 100 ml/108 Zellen und Tag an Aufbaumedium eingetragen wurden durch geeignete Erhöhung des Druck gradienten. Die so gewonnen Daten sind in der Fig. 2 dargestellt.In this comparative experiment, the procedure was basically analogous to that of Example 5, except that in process stage b) 100 ml / 10 8 cells and day of build-up medium were introduced by a suitable increase in the pressure gradient. The data obtained in this way are shown in FIG. 2.
In der Fig. 2 erkennt man, daß die Stufe b) sich bis ca. Tag 5 erstreckt. In der Stufe b) erkennt man zwar einen starken Anstieg der Zahl lebender Zellen/ml, diese fällt jedoch kurz nach Einleitung der Stufe c) wieder ab. Gleichzeitig steigt die Zahl der toten Zel len stark an, mit entsprechender Abnahme der Viabili ty, und man erkennt, daß bei ca. Tag 9, i. e. bereits am Tag 4 der Stufe c) kaum noch lebende Zellen präsent sind. Entsprechend findet auch keine Zunahme der Anti körperkonzentration mehr statt mit entsprechend nied riger Endkonzentration. Offenbar existiert auch eine Obergrenze bei der Nährstoffzufuhr, bei deren deutli cher Überschreitung Apoptose unter physiologischen Bedingungen, i. e. nicht toxisch bedingt, induziert, und zwar irreversibel. Die Irreversibilität ist bei spielsweise daran erkennbar, daß eine Reduktion des Austausches in Stufe c) nicht zu einem Erholungseffekt führt. In Beispiel 6 ist somit die Ursächlichkeit in dem Überaustausch in Stufe b) demonstriert. Es ist davon auszugehen, daß ein Überaustausch in Stufe c) analoge Effekte bewirkt, nur entsprechend zeitlich verzögert.In FIG. 2 it can be seen that the step b) extends up to approximately Day 5. In stage b) there is a sharp increase in the number of living cells / ml, but this drops again shortly after initiation of stage c). At the same time, the number of dead cells rises sharply, with a corresponding decrease in viability, and it can be seen that by about day 9, ie already on day 4 of stage c), there are hardly any living cells left. Accordingly, there is no longer an increase in the antibody concentration with a correspondingly low final concentration. Apparently there is also an upper limit on the nutrient supply, which, if significantly exceeded, induces apoptosis under physiological conditions, ie non-toxic, irreversibly. The irreversibility can be recognized for example from the fact that a reduction in the exchange in stage c) does not lead to a recovery effect. In example 6 the causation in the exchange in step b) is thus demonstrated. It can be assumed that an exchange in step c) causes analog effects, only with a corresponding delay.
Claims (13)
- a) in einer Anfahrphase wird der Reaktor angeimpft und durch stufenweise Zufuhr von Nährstoffmedi um über Mittel zur Mediumzufuhr exponentielles Wachstum der Zellen initiiert, wobei die Zell dichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, in einem Bereich von 1 × 105 bis 5 × 106 Zei len/ml gehalten wird,
- b) in einer Aufbauphase werden die Mittel zum Aus tausch betrieben, wobei Austauschmedium mit definiertem Volumen durch die Mittel zum Aus tausch in einem Kreislauf gepumpt wird, mit der Maßgabe, daß die Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension zuzüglich dem Mediumvo lumen im Kreislauf, einen Wert von 1 × 105/ml nicht unterschreitet, und wobei im Verlauf der Aufbauphase eine Zelldichte, bezogen auf das Volumen der Suspension, von zumindest 5 × 106/ml erreicht wird,
- c) nach Erreichen einer Zelldichte von zumindest 5 × 106/ml in Stufe b) wird eine stationäre Phase eingeleitet, wobei durch Einrichtung und takt weiser Umkehr eines Druckgradienten zwischen Kreislauf und Reaktor ein Stofftransport durch die Mittel zum Stoffaustausch entlang des Druckgradienten eingestellt wird, wodurch Nähr stoffe aus dem Austauschmedium in den Reaktor ein- und Stoffwechselabfallprodukte aus dem Reaktor in das Austauschmedium ausgetragen wer den, wobei der Volumenaustausch das 0,01- bis 1fache des Suspensionsvolumens/Tag entspricht, und
- d) nach Absinken der Antikörper-Freisetzungsrate wird die Stufe c) abgebrochen und werden die Antikörper aus der Suspension gewonnen.
- a) in a start-up phase, the reactor is inoculated and initiated by gradual supply of nutrient medium to exponential growth of the cells by means of medium supply, the cell density, based on the volume of the suspension, in a range from 1 × 10 5 to 5 × 10 6 lines / ml is held
- b) in a set-up phase, the means for exchange are operated, exchange medium with a defined volume being pumped through the means for exchange in a circuit, with the proviso that the cell density, based on the volume of the suspension plus the medium volume in the circuit , does not fall below a value of 1 × 10 5 / ml, and a cell density, based on the volume of the suspension, of at least 5 × 10 6 / ml being achieved in the course of the build-up phase,
- c) after reaching a cell density of at least 5 × 10 6 / ml in stage b), a stationary phase is initiated, mass transfer by means of mass transfer along the pressure gradient being set by establishing and cyclically reversing a pressure gradient between the circuit and the reactor, whereby nutrients from the exchange medium into the reactor and metabolic waste products are discharged from the reactor into the exchange medium, the volume exchange being 0.01 to 1 times the suspension volume / day, and
- d) after the antibody release rate has dropped, step c) is terminated and the antibodies are obtained from the suspension.
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