DE10118463A1 - Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe - Google Patents
Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer ProbeInfo
- Publication number
- DE10118463A1 DE10118463A1 DE2001118463 DE10118463A DE10118463A1 DE 10118463 A1 DE10118463 A1 DE 10118463A1 DE 2001118463 DE2001118463 DE 2001118463 DE 10118463 A DE10118463 A DE 10118463A DE 10118463 A1 DE10118463 A1 DE 10118463A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- arrangement
- periodic structure
- wavelength
- sample
- splitting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0032—Optical details of illumination, e.g. light-sources, pinholes, beam splitters, slits, fibers
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0056—Optical details of the image generation based on optical coherence, e.g. phase-contrast arrangements, interference arrangements
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/0052—Optical details of the image generation
- G02B21/0064—Optical details of the image generation multi-spectral or wavelength-selective arrangements, e.g. wavelength fan-out, chromatic profiling
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
- G02B21/00—Microscopes
- G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
- G02B21/002—Scanning microscopes
- G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
- G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N2021/6463—Optics
Abstract
Verfahren zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, mit einer scannenden Bewegung von einer auf oder in DOLLAR A einer Probe erzeugten Beleuchtungslichtverteilung mindestens einer Wellenlänge über die Probe (zumindest einen Teil der Probe) und Detektion insbesondere des aufgrund von Wechselwirkung mit der Probe beeinflußten Lichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes und/oder reflektierten Lichtes und/oder Lumineszenzlichtes und/oder gestreuten und/oder transmittierten Lichtes, DOLLAR A wobei das Beleuchtungslicht eine Modulation in zumindest einer Raumrichtung aufweist DOLLAR A und die scannende Bewegung und zur Scanbewegung zugeordnete Detektion zumindest bei einer ersten und einer zweiten unterschiedlichen Phasenlage der Modulation und/oder ersten oder zweiten Frequenz der Periodizität der Modulation erfolgt und mindestens ein optisches Schnittbild durch die Probe/den Probenteil berechnet wird.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Anordnung in der
Mikroskopie, insbesondere der Fluoreszenz Laser Scanning Mikroskopie zur
Untersuchung von vorwiegend biologischen Proben, Präparaten und
zugehörigen Komponenten. Mit eingeschlossen sind auf
Fluoreszenzdetektion basierenden Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen
(High Throughput Sceening) sowie auf anderen Kontrastmechanismen
basierende Methoden der Laser Scanning Mikroskopie.
Ein klassisches Anwendungsgebiet der Lichtmikroskopie zur Untersuchung
von biologischen Präparaten ist die Fluoreszenzmikroskopie (Lit.: Pawley,
"Handbook of Biological Confocal Microscopy"; Plenum Press 1995). Hierbei
werden bestimmte Farbstoffe zur spezifischen Markierung von Zellteilen
verwendet.
Die eingestrahlten Photonen einer bestimmten Energie regen die
Farbstoffmoleküle durch die Absorption eines Photons aus dem
Grundzustand in einen angeregten Zustand an. Diese Anregung wird meist
als Einphotonen-Absorption bezeichnet (Abb. 1a). Die so angeregten
Farbstoffmoleküle können auf verschiedene Weise in den Grundzustand
zurück gelangen. In der Fluoreszenzmikroskopie ist der Übergang unter
Aussendung eines Fluoreszenzphotons am wichtigsten. Die Wellenlänge des
emittierten Photons ist aufgrund der Stokesverschiebung im Vergleich zur
Anregungsstrahlung generell rot verschoben, besitzt also eine größere
Wellenlänge. Die Stokesverschiebung ermöglicht die Trennung der
Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung.
Das Fluoreszenzlicht wird mit geeigneten dichroitischen Strahlteilern in
Kombination mit Blockfiltern von der Anregungsstrahlung abgespalten und
getrennt beobachtet. Dadurch ist die Darstellung einzelner, mit verschiedenen
Farbstoffen eingefärbten Zellteilen möglich. Grundsätzlich können jedoch
auch mehrere Teile eines Präparates gleichzeitig mit verschiedenen sich
spezifisch anlagernden Farbstoffen eingefärbt werden (Mehrfachfluoreszenz).
Zur Unterscheidung der von den einzelnen Farbstoffen ausgesendeten
Fluoreszenzsignale werden wiederum spezielle dichroitische Strahlteiler
verwendet.
Neben der Anregung der Farbstoffmoleküle mit einem hochenergetischen
Photon (Einphotonen-Absorption) ist auch eine Anregung mit mehreren
Photonen geringerer Energie möglich (Abb. 1b). Die Summe der Energien der
Einzelphotonen entspricht hierbei ungefähr der des hochenergetischen
Photons. Diese Art der Anregung der Farbstoffe wird als Mehrphotonen-
Absorption bezeichnet (Lit.: Corle, Kino; "Confocal Scanning Optical
Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996). Abb. 1b
zeigt eine Anregung mittels der simultanen Absorption von 2 Photonen im
nahen infraroten Wellenlängenbereich. Die Farbstoffemission wird durch
diese Art der Anregung jedoch nicht beeinflußt, d. h. das Emissionsspektrum
erfährt bei der Mehrphotonen-Absorption einen negativen Stokesshift, besitzt
also eine geringere Wellenlänge im Vergleich zur Anregungsstrahlung. Die
Trennung der Anregungs- von der Emissionsstrahlung erfolgt in der gleichen
Art und Weise wie bei der Einphotonen-Absorption.
Der Stand der Technik soll im folgenden beispielhaft anhand eines konfokalen
Laser-Scanning-Mikroskopes (LSM) erläutert werden (Abb. 2).
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen in 4 Module: Lichtquelle L, Scanmodul
S, Detektionseinheit DE und Mikroskop M. Diese Module werden im
folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf
DE 197 02 753 A1, US 6167173 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat
werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die
Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptions
eigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Die Anregungsstrahlung
wird im Lichtquellenmodul L erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei
verschiedene Laser A-D (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt
im Lichtquellenmodul L die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung
der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z. B. durch den Einsatz
eines akusto-optischen Modulators. Anschließend gelangt die Laserstrahlung
über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul S.
Die in der Lichtquelle L erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs
(2) beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scan Lens und die Tubuslinse in
das Präparat ((Probe 3) fokussiert. Der Fokus wird rasterförmig in x-y-
Richtung über die Probe 3 bewegt. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über
die Probe 3 liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis
zu einigen Sekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descannte Detektion) des Fluoreszenzlichtes
gelangt das Licht, das aus der Fokusebene (Probe 3) und aus den darüber-
und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen
dichroitischen Strahlteiler (MDB). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom
Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht über dichroitische
Strahlteiler DBS 1-3 und Pinholeoptiken auf eine Blende (konfokale Blende/
Pinhole) (PH 1, 2, 3, 4) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene des
Objektivs 2 konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden
Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der
Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt
werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dichroitischer Blockfilter
(EF1-4) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren
des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors
(PMT1-4) gemessen.
Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der
Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen in dem die
Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich
größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen
Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die
Detektion über T-PMT, PMT 5 kann in Detektionsrichtung direkt nach dem
Objektiv oder auf der dem Objektiv abgewandten Seite erfolgen (non
descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion (nicht dargestellt) einer durch
Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin
eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives von
der Pinholeoptik PH in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal
descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch die geschilderten
Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen
bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt)
wiedergegeben, die mit der Fokusebene des Objektivs zusammenfällt. Durch
die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in
verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein
dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die
Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen
spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissions
eigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher,
daß nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom
Punktdetektor gemessen wird.
Statt eines Punktscanners werden nach dem Stand der Technik auch so
genannte Linienscanner verwendet (Lit.: Corle, Kino; "Confocal Scanning
Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996).
Der prinzipielle Aufbau entspricht im wesentlichen dem eines LSM nach Abb.
2. Jedoch wird statt eines Punktfokus eine Linie in die Probe (3) abgebildet
und die zu untersuchende Probe nur noch in einer Richtung (x oder y)
gescannt. Die Erzeugung des Linienfokus erfolgt mit Hilfe mindestens einer in
Abb. 2 gestrichelt dargestellten Zylinderlinse (ZL) im kollimierten
Beleuchtungsstrahlengang in deren Brennweite sich eine Pupillenebene der
Mikroskopanordnung befindet. Als konfokale Blende (PH) dient in einem
solchen Aufbau eine Schlitzblende anstatt der Pinholes PH 1-4. Eine
nichtdescannte Detektion bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption
kann auch mit dieser Anordnung erfolgen. Hierzu kann wiederum die
konfokale Blende (PH) entfallen. Zur Detektion wird eine CCD-Kamera (nicht
descannt) oder Zeile (descannt) mit 1024 oder mehr Bildpunkten anstatt des
Punktdetektors (PMT) eingesetzt. Durch das Scannen einer Linie anstatt
eines Punktes kann die Bildaufnahmerate erheblich vergrößert werden. Somit
kann dieses Scanverfahren zur Beobachtung von schnell ablaufenden
Prozessen in Echtzeit (Echtzeitmikroskopie) verwendet werden.
Nachteilig bei diesem Verfahren ist, dass die Tiefenauflösung durch die
Schlitzblende um einen Faktor 1.4 schlechter ist im Vergleich zu
punktscannenden Laser Scanning Mikroskopen. Dies kommt daher, dass die
konfokale Schlitzblende nur Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des konfokalen
Schnittes senkrecht zur Scanlinie unterdrückt. Zusätzlich verschlechtert sich
die laterale Auflösung.
In einer weiteren Anordnung zur Echtzeitmikroskopie nach dem Stand der
Technik wird das komplette zu untersuchende Feld mittels einer
aufgeweiteten Lichtquelle beleuchtet. Jedoch werden nur spezielle
Punktmuster des gesamten zu scannenden Feldes durch eine sich schnell
drehende Scheibe freigegeben. Diese Verfahren werden in der Literatur meist
als Nipkow-Disk Verfahren bezeichnet (Lit.: Corle, Kino; "Confocal Scanning
Optical Microscopy and Related Imaging Systems"; Academic Press 1996).
In einem weiteren Verfahren nach dem Stand der Technik, der sogenannten
strukturierten Beleuchtung (siehe Abb. 3), nutzt man die Modulationstiefe der
optischen Abbildung einer Amplitudenstruktur (z. B. Gitter) als Kriterium für die
Tiefenschärfe. Das Bild der periodischen Struktur zeichnet sich durch die
Frequenz der Modulation und die Phasestellung (Bildphase) der Modulation
aus.
Durch eine Phasenverschiebung der Struktur senkrecht zur optischen Achse
können unterschiedliche Projektionsszenarien erhalten werden.
Um streifenfreie, tiefendiskriminierte optische Schnitte berechnen zu können,
werden im allgemeinen mindestens 3 Phasenbilder PB bei 0°, 120° und 240°
benötigt. Diese Phasenbilder (PB) werden anschließend zu einem
(konfokalen) optischen Schnittbild in einem Image Prozessor mit folgender
Formel verrechnet:
wobei I(x, Winkel) die Intensität am jeweiligen Pixel in dem entsprechenden
Phasenbild beschreibt.
Die Aufzeichnung der 3 oder mehr Phasenbilder erfolgt im einfachsten Falle
sequentiell. Dabei wird davon ausgegangen, dass sich die Probe während der
Messung der Bilder nicht bewegt. Die so aus den Phasenbildern berechneten
Schnittbilder bzw. Schnittstapel können anschließend mittels 3-D
Auswertesoftware auf einem Standard PC und Monitor dargestellt werden.
Die Ortsauflösung entlang der optischen Achse hängt von der Wellenlänge
des Lichtes, der numerischen Apertur des Objektivs und der
Modulationsfrequenz ab.
Für eine detaillierte Beschreibung des Berechnungsalgorithmus wird auf T.
Wilson et al.; "Method of obtaining optical sectioning by using structured light
in a conventional microscope"; Optics Letters 22 (24) 1997 verwiesen.
Nachteilig bei bisherigen Verfahren zur Echtzeitmikroskopie ist weiterhin,
dass bei einer simultanen Untersuchung von mehreren Farbstoffen auch
mehrere Detektionseinrichtungen vorzusehen sind. Dadurch erhöhen sich die
Anforderungen an die Datenübertragung und die Kosten für ein solches
Gerät. Deshalb werden heutzutage nur Mikroskope zur sequentiellen
Bildgebung der verschiedenen Farbstofffluoreszenzen eingesetzt. In DE 198 29 981 A1
wird ein Verfahren beschrieben, die Anregungswellenlänge und/
oder Intensität während des Scanvorgangs zu ändern.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer neuen Methode mit der
Präparate in Echtzeit und mit einer hohen optischen Auflösung abgebildet
werden können.
Dies Aufgabe wird durch Anordnungen und Verfahren gemäß den
unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche.
Die Erfindung ist zum Einsatz in Applikationen, die Mehrfachfluoreszenzen
erfordern, besonders geeignet, da diese simultan und vorteilhaft auch mit
vergleichbarer optischer Auflösung wie bei einen punktscannenden LSM,
jedoch in Echtzeit aufgezeichnet werden können.
Die Methode kann in bildgebenden Mikroskopiersystemen eingesetzt werden
wie Laser Scanning Mikroskopen zur dreidimensionalen Untersuchung von
biologischen Präparaten mit einer optischen, räumlichen Auflösung bis zu 200 nm
und in analytischen Mikroskopiersystemen wie beispielsweise
Fluoreszenzkorrelationsspektrometern eingesetzt werden.
Weiterhin sind auf Fluoreszenzdetektion basierende Verfahren zum Screenen
von Farbstoffen wie z. B. in sogenannten Chipreadern eingeschlossen, die
sich von den Verfahren der Laser Scanning Mikroskopie vor allem durch ein
deutlich größeres Bildfeld unterscheiden.
Gegenstand des Verfahrens zur Erhöhung der räumlichen
Detektionsauflösung, vorzugsweise bei einem in Echtzeit bildgebenden
Verfahren, ist eine linienförmige Anregung und Detektion der von einer Probe
reflektierten, gestreuten und/oder transmittierten Anregungsstrahlung und/
oder angeregten Fluoreszenz. Hierzu wird mittels geeigneter und weiter unten
näher beschriebener Optiken ein Linienfokus der Anregungsstrahlung in der
Probe erzeugt. Abb. 4 zeigt ein mögliches Meßablaufschema. Auf der linken
Seite ist ein Scanfeld mit dem Linienfokus dargestellt. Der Linienfokus kann
mit geeigneten Hilfsmitteln (Scannerspiegel in einer Richtung) entlang des
eingezeichneten Pfeiles verschoben werden. Die Erhöhung der axialen und
lateralen optische Auflösung erfolgt durch eine Strukturierung des
Linienfokus. Die Strukturierung erfolgt durch Überlagerung der Scanlinie mit
einer periodischen Struktur, erzeugt beispielsweise durch ein Sinusgitter im
Strahlengang. Bei einer kohärenten Beleuchtung kann eine Erzeugung der
Struktur auch durch eine Interferenz von 2 kohärenten Teilstrahlen in der
Probe erzeugt werden (Lit.: Wilson WO 98/45745). Es werden mindestens
zwei Bilder mit unterschiedlicher Phasenlage der periodischen Struktur
aufgenommen. Grundsätzlich kann der optische Schnitt auch durch die
Aufnahme von Bildern mit unterschiedlicher Modulationsfrequenz der Struktur
erfolgen.
Die Beleuchtung der Probe kann mit räumlich und zeitlich kohärenter oder
inkohärenter Beleuchtung erfolgen. Es kann beispielsweise auch eine
räumlich kohärente Laserlichtquelle durch die Verwendung einer
Streuscheibe oder durch die Aneinanderreihung mehrerer Einzelfoki in der
Probe für eine inkohärente Beleuchtung verwendet werden.
Es werden vorteilhaft mindestens 2 Phasenbilder PB mit Bildphasen von z. B.
0° und 180° bei Verwendung einer Anregungswellenlänge zur Berechnung
eines optischen Schnittbildes im Image Prozessor benötigt.
Bei n Anregungswellenlängen sind n + 1 Phasenbilder nötig.
Für eine Anregungswellenlänge hat das von der Probe emittierte Signal
entlang einer Scanlinie folgende Gestalt:
ISig(x) = C(x).cos(k.x) + B(x)
wobei C(x) die eigentliche Objektinformation (z. B. die Konzentration und der
Wirkungsquerschnitt des Farbstoffes oder der lokale Reflektionskoeffizient) an
der Position x innerhalb des konfokalen optischen Schnittes und entlang des
Linienfokus für die Anregungswellenlänge trägt und die gesuchte Größe
darstellt. B(x) trägt die Objektinformation von außerhalb des konfokalen
Bereichs. B(x) ist nicht moduliert, da die Struktur außerhalb des konfokalen
Bereiches nicht scharf abgebildet wird. k ist die inverse Modulationsfrequenz
der strukturierten Anregung. Die obige Gleichung besitzt 2 Unbekannte C(x)
und B(x). Zur Bestimmung von C(x) ist die Aufnahme von 2 Phasenbildern
nötig. Die Phasenbilder seien mit Ii(x), i = 0, 1, . . . n bezeichnet und durch eine
relative Phasenverschiebung der Modulation von i.Δϕ (Bildphasen)
charakterisiert, wobei sich folgendes Gleichungssystem ergibt.
I0(x) = C(x).cos(k.x) + B(x)
I1(x) = C(x).cos(k.x + Δϕ) + B(x)
Die gesuchte Objektinformation ergibt sich durch Auflösen des
Gleichungssystems nach C wie folgt:
Analog kann zur Bestimmung von C(x) auch die Aufnahme von 2 Bildern mit
verschiedener Modulationsfrequenz k0 und k1 erfolgen. Die Frequenzbilder
seien wieder mit Ii(x), i = 0, 1, . . . n bezeichnet, wodurch sich folgendes
Gleichungssystem ergibt.
I0(x) = C(x).cos(k0.x) + B(x)
I1(x) = C(x).cos(k1.x) + B(x)
Die gesuchte Objektinformation ergibt sich durch Auflösen des
Gleichungssystems nach C wie folgt:
C(x) kann auch durch Aufnahme mindestens zweier Bilder mit verschiedener
Phase und Frequenz der Modulation gewonnen werden.
Aus diesen linienbezogenen Objektinformationen wird ein optischer Schnitt in
mindestens einer Probenebene zusammengesetzt und kann wie im Stand der
Technik zu mindestens einem Bild mindestens eines Bildstapels
weiterverarbeitet werden.
Wenn nur eine Anregungswellenlänge benutzt wird und mindestens 3
Phasenbilder (z. B. mit relativer Phasenlage von 0°, 120° und 240°)
aufgezeichnet werden, kann auch der beim Stand der Technik erläuterte
Algorithmus zur Gewinnung der Objektinformation (Lit.: T. Wilson et al.;
"Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a
conventional microscope"; Optics Letters 22 (24) 1997) bei allen hier
beschriebenen Anordnungen zur Anwendung gelangen.
Bei einer simultanen Anregung mit mehreren Wellenlängen erfolgt die
anschließende Trennung der Signale der Probe durch eine spezielle
Phasenkodierung oder Frequenzkodierung der Modulationsstruktur für die
verschiedenen Anregungswellenlängen. Allgemein ergibt sich für n simultane
Anregungswellenlängen die Anzahl der erforderlichen Phasenbilder zu n + 1.
Dabei werden verschiedene Anregungswellenlängen durch eine definierte
wellenlängenspezifische Lageverschiebung der Modulation (Kodierphase)
und/oder eine jeweils charakteristische Modulationsfrequenz
(Kodierfrequenz) voneinander getrennt. Das von der Probe emittierte Licht
(z. B. Fluoreszenz), welches durch eine Wechselwirkung des Anregungslichts
der jeweiligen Wellenlänge mit der Probe entsteht, besitzt dann die
spezifische Kodierphase und/oder Kodierfrequenz in Abhängigkeit von der
Anregungswellenlänge und kann somit gemäß dem unten folgenden
Algorithmus separiert werden.
Wird also z. B. eine Probe, wie in Abb. 5 dargestellt, mit verschiedenen
Farbstoffen (1, 2, 3) im Scanfeld gefärbt, die unterschiedliche Wellenlängen
(L1, L2, L3) zur Anregung einer Fluoreszenz benötigen, so überträgt sich die
Kodierfrequenz (f1, f2, f3) und/oder die Kodierphasen (ϕ1, ϕ2, ϕ3) der
Anregungsscanlinie auf die detektierte Fluoreszenz in der jeweiligen Region
(1, . . . n), siehe Abb. 6.
Im bevorzugten Fall besitzen alle Anregungswellenlängen die gleiche
Kodierfrequenz, d. h. eine Modulationsfrequenz aber verschiedene
Kodierphasen. Die folgende Diskussion sei auf diesen Fall mit
Phasenkodierung beschränkt, wobei eine Kodierung mittels der
Modulationsfrequenz analog zu behandeln und Gegenstand der Erfindung ist.
Für zwei Anregungswellenlängen hat das von der Probe emittierte Signal
entlang einer Scanlinie folgenden Gestalt:
ISig(x) = C1(x).cos(k.x + ϕ1) + B1(x) + C2(x).cos(k.x + ϕ2) + B2(x)
wobei C1(x) bzw. C2(x) die gesuchte Objektinformation (z. B. Konzentration
und Wirkungsquerschnitt des Farbstoffes) an der Position x innerhalb des
konfokalen optischen Schnittes und entlang des Linienfokus für die beiden
Anregungswellenlängen darstellen. B1(x) bzw. B2(x) trägt die
Objektinformation von außerhalb des konfokalen Bereichs. B1(x) bzw. B2(x)
sind nicht moduliert, da die Struktur außerhalb des konfokalen Bereiches nicht
scharf abgebildet wird. ϕ1 und ϕ2 sind die den jeweiligen
Anregungswellenlängen zugeordneten Kodierphasen und k ist die inverse
Modulationsfrequenz (die in diesem Beispiel für beide
Anregungswellenlängen gleich ist) der strukturierten Anregung. Die obige
Gleichung besitzt 4 Unbekannte C1(x), B1(x), C2(x) und B2(x).
Zur Bestimmung von C1(x) und C2(x) ist die Aufnahme von 3 Phasenbildern
nötig. Die Phasenbilder seien mit Ii(x), i = 0, 1, . . . n bezeichnet und durch eine
relative Phasenverschiebung der Modulation von i.Δϕ (Bildphasen)
charakterisiert, wobei sich folgendes Gleichungssystem ergibt:
I0(x) = C1(x).cos(k.x + ϕ1) + B1(x) + C2(x).cos(k.x + ϕ2) + B2(x)
I1(x) = C1(x).cos(k.x + ϕ1 + Δϕ) + B1(x) + C2(x).cos(k.x + ϕ2 + Δϕ) + B2(x)
I2(x) = C1(x).cos(k.x + ϕ1 + 2.Δϕ) + B1(x) + C2(x).cos(k.x + ϕ2 + 2.Δϕ) + B2(x)
Die gesuchte Objektinformation ergibt sich durch Auflösen des
Gleichungssystems nach C1 und C2 wie folgt:
C1(x) = [-c12(x).(I2(x) - I0(x)) + c22(x).(I1(x) - I0(x))]/det(x)
C2(x) = [c11(x).(I2(x) - I0(x)) - c21(x).(I1(x) - I0(x))]/det(x)
mit cij(x) = cos(k.x + ϕj + i.Δϕ) - cos(k.x + ϕj)
und det(x) = c11(x).c22(x) - c12(x).c21(x). Die Gewinnung der Objektinformation setzt somit die Kenntnis der Kodierphasen (ϕi) und der inversen Modulationsfrequenz (k) für die einzelnen Anregungswellenlängen voraus. Für die Lösung des Gleichungssystems und damit die Trennung der Objektinformationen, die durch die jeweilige Anregungswellenlänge sichtbar gemacht wurde, werden bei einer Zweifarbenanregung 3 Phasenbilder benötigt, wobei die Bildphasenverschiebung (Δϕ) zwischen den einzelnen Bildern im einfachsten Falle 120° beträgt.
und det(x) = c11(x).c22(x) - c12(x).c21(x). Die Gewinnung der Objektinformation setzt somit die Kenntnis der Kodierphasen (ϕi) und der inversen Modulationsfrequenz (k) für die einzelnen Anregungswellenlängen voraus. Für die Lösung des Gleichungssystems und damit die Trennung der Objektinformationen, die durch die jeweilige Anregungswellenlänge sichtbar gemacht wurde, werden bei einer Zweifarbenanregung 3 Phasenbilder benötigt, wobei die Bildphasenverschiebung (Δϕ) zwischen den einzelnen Bildern im einfachsten Falle 120° beträgt.
Die Objektinformation von außerhalb des konfokalen Bereichs kann nur für
die Summe der Beiträge aller anregenden Wellenlängen gewonnen werden.
Im vorliegenden Beispiel ist dieser Hintergrund
B1(x) + B2(x) = I0(x) - C1(x).cos(k.x + ϕ1) - C2(x).cos(k.x + ϕ2)
welcher bei Kenntnis von C1 und C2 berechnet werden kann.
Die Erweiterung auf 3 Anregungswellenlängen ergibt sich äquivalent aus der
Lösung des entsprechenden Gleichungssystems, wobei C3(x) bzw. B3(x) die
Objektinformation angeregt durch die dritte Wellenlänge von innerhalb bzw.
außerhalb des konfokalen Schnittes, darstellen soll. Die Objektinformationen
für die einzelnen Wellenlängen ergeben sich wie folgt:
C1 = [(c12.c23 - c13.c22).(I3 - I0) + (c13.c32 - c12.c33).(I2 - I0) + (c22.c33 - c23.c32).(I1 - I0)]/det
C2 = [(c13.c21 - c11.c23).(I3 - I0) + (c11.c33 - c13.c31).(I2 - I0) + (c23.c31 - c21.c33).(I1 - I0)]/det
C3 = [(c11.c22 - c12.c21).(I3 - I0) + (c12.c31 - c11.c32).(I2 - I0) + (c21.c32 - c22.c31).(I1 - I0)]/det
mit ϕ3(x) als Kodierphase der Modulation bei der dritten
Anregungswellenlänge und
det(x) = c11.(c22.c33 - c23.c32) + c12.(c23.c31 - c21.c33) + c13.(c21.c32 - c22.c31).
Bei einer 3 Farbenanregung ist die Aufnahme von 4 Phasenbildern zur
Trennung der Objektinformation, angeregt durch die einzelnen Wellenlängen,
notwendig. Die Bildphasenschrittweite kann beispielsweise 90 Grad betragen.
Da die Größen cij für eine Anordnung mit vorgegebenen Kodierphasen und
Kodierfrequenzen konstant sind, ist die Gewinnung der Objektinformation
durch Signalverarbeitung eine einfache Operation. Diese Operation läßt sich
durch Transformation der normierten Bildsignale ΔIi(x) = Ii(x) - I0(x) mittels als
Konstanten abgelegter Faktoren fk(x), die sich aus den cij(x) ergeben,
angeben. Für 3 Wellenlängen ergibt sich z. B. aus den obigen Gleichungen:
C1 = f1.ΔI3 + f2.ΔI2 + f3.ΔI1
C2 = f4.ΔI3 + f5.ΔI2 + f6.ΔI1.
C3 = f7.ΔI3 + f8.ΔI2 + f9.ΔI1
In Verallgemeinerung ist es für die simultane Anregung mit n Wellenlängen
erforderlich, n + 1 Bilder I0 bis In mit jeweils eigener Phase und/oder Frequenz
der Anregungsmodulation aufzunehmen. Bei Phasenbildern (Bildphase: ϕi)
mit Phasenkodierung der Anregungswellenlänge (ϕj) ergeben sich folgende
Bilder, die die mit der jeweiligen j-ten Wellenlänge angeregten
Bildinformationen vom pseudokonfokalen Schnitt (Cj) und vom Hintergrund
(Bj) enthalten.
Das sich daraus ergebende Gleichungssystem der Form:
mit cij(x) = cos(k.x + ϕj + ϕi) - cos(k.x + ϕj)
läßt sich mit bekannten mathematischen Methoden (z. B. laut Cramerscher
Regel) nach den gesuchten Bildinformationen von innerhalb des
pseudokonfokalen Schnitt, getrennt nach den einzelnen
Anregungswellenlängen, auflösen.
Ferner läßt sich damit die von allen Wellenlängen angeregte Bildinformation
von außerhalb des pseudokonfokalen Schnittes nach
bestimmen.
Analoge Beziehungen gelten, wenn anstelle der Phase oder zusätzlich dazu
die Frequenz zur Kodierung der verschiedenen Wellenlängen und/oder der
Bilder verwendet wird. Die Koeffizienten cij sind dann geeignet zu
modifizieren.
Die Bestimmung der Koeffizienten cij kann mit dem im folgenden
beschriebenen Meßverfahren unabhängig davon, ob die Phase und/oder die
Modulationsfrequenz zur Bild- bzw. Wellenlängenkodierung eingesetzt
werden, erfolgen. Für eine Referenzwellenlänge (beispielsweise 488 nm) wird
im Sinne einer Eichung die Kodierfrequenz und die Kodierphase ermittelt
(z. B. mittels eines Testobjektes wie einer Glasplatte oder eines Spiegels).
Hierzu wird die periodische Struktur auf das Testobjekt abgebildet, mit dem
Detektor vermessen und die Kodierfrequenz sowie die Kodierphase für eine
feste Bildphase am Ort der Probe vermessen und damit bestimmt. Die
Kodierphasen bzw. Kodierfrequenzen der anderen Wellenlängen können nun
relativ zu dieser Referenz wiederum für eine feste Bildphase vermessen
werden. In einer möglichen Anordnung wird die Phasenkodierung durch
Dispersion (Parallelversatz) in einer planparallelen Platte P, die zugleich den
Träger eines in Beleuchtungsrichtung davor angeordneten Amplitudengitters
(Struktur S) darstellt, realisiert, siehe Abb. 7A. Durch den Durchgang von
polychromatischen Anregungslicht durch die hier schwach um die Achse A
geneigte planparallele Platte P (Neigung: γ, Dicke: d) ergibt sich ein
geringfügiger, wellenlängenabhängiger Parallelversatz in der Ebene
senkrecht zur Drehachse und zur optischen Achse:
Δx(λ) = d.(sin γ - cos γ.tan β(λ)) mit β(λ) = sin-1((sin γ)/n(λ)).
Wenn sich die Platte in einer Zwischenbildebene (siehe Abb. 9A) der
Mikroskopanordnung befindet, äußert sich dieser Versatz als
Phasenverschiebung zwischen den Amplitudenmodulationen der einzelnen
Anregungslinienfoki. Abb. 8 zeigt schematisch einen Linienfokus in einem
Scanfeld, wobei die Phasenlagen der Amplitudenmodulation für
beispielsweise 3 verschiedene Anregungswellenlängen im Diagramm auf der
rechten Seite dargestellt sind. Die x-Achse des Diagramms entspricht der
Koordinate entlang des Linienfokus. In der rechten Abbildung der Abb. 8 ist
nur ein Ausschnitt der Scanlinie zur Verdeutlichung der Kodierphasen
dargestellt.
Eine Phasenverschiebung von 5 Grad ist ausreichend zur sicheren Trennung
der von der entsprechenden Wellenlänge angeregten Signale. Tabelle 1 gibt
die Kodierphasen für ein konkretes Beispiel an.
Phasenverschiebung für wichtige Laserlinien durch Dispersion in einer 10 mm dicken BK7
Platte mit einem Amplitudengitter von 50 Linien/mm. Die Platte ist 5 Grad gegen die Normalen
geneigt, so daß sich für die Referenzwellenlänge von 488 nm ein Parallelversatz von ca. 300 µm
gegenüber der optischen Achse ergibt.
Eine Anordnung zur wellenlängenabhängigen Phasenverschiebung
(Phasenkodierung) verwendet ein optisches Gitter, welches in einer
Pupillenebene der Mikroskopanordnung - beispielsweise im Scanner
eingesetzt wird.
Im folgenden werden vorteilhafte Anordnungen beispielhaft für Fluoreszenz
und DIC-Bildgebung erläutert, ohne dass die Übertragbarkeit auf weitere
optische Kontrastverfahren beschränkt wird.
Eine erste Anordnung ist in Abb. 9 gezeigt. Gestrichelt eingezeichnet ist der
Pupillenstrahlengang der Mikroskopanordnung. Durchgezogene Linien stellen
den Objektstrahlengang dar. In Abb. 9A (xy-Ebene) wird Licht der Lichtquelle
(LQ) mit beispielsweise einer Zylinderlinse (ZL), in deren Brennweite sich
eine Pupillenebene der Mikroskopanordnung befindet, zu einem Linienfokus
in einer Zwischenbildebene (ZB) geformt. In einer Zwischenbildebene vor
oder hinter der Zylinderlinse (dargestellt vor der Zylinderlinse) befindet sich
ein Element (ST), das entlang der Scanlinie eine Amplitudenmodulation
hervorruft. ST ist beispielsweise ein TransmissionsgitterST ist beispielsweise
ein Transmissionsgitter. Wie in Fig. 7B/7D beispielhaft dargestellt, verläuft die
Änderung der Periodizität senkrecht zur Richtung (Y) der als schwarze
Striche schematisch dargestellten Gitterlinien in X-Richtung. Eine
Verschiebung in dieser X-Richtung, beispielsweise mit der Positioniereinheit
PE wie in den Abb. 9 dargestellt, ermöglicht eine Änderung der Phasenlage.
Eine Verschiebung der Struktur nach Abb. 7D in Y-Richtung (Verschiebung
nicht dargestellt) resultiert in einer Variation der Frequenz der
Amplitudenmodulation zur Anpassung der optischen Schnittdicke (siehe Text
weiter unten) oder zur Änderung der Modulationsfrequenz bei der Aufnahme
der Einzelbilder zur Berechnung des optischen Schnittbildes. Eine Verkippung
um einen Drehpunkt, der in der optischen Achse liegt und eine Drehachse in
Y Richtung erzeugt ebenfalls diese Verschiebung. Eine Verdrehung des
Gitters um eine Drehachse in Z-Richtung, die beispielsweise mit der
optischen Achse übereinstimmt, erzeugt (s. a. Abb. 16) ebenfalls eine
Phasenverschiebung, die bei Abbildung mehrerer räumlich getrennter Linien
auf die Probe (Linienverlauf in X Richtung) unterschiedlich ausfällt.
Die strukturierte Scanlinie wird im folgenden über den Hauptstrahlteiler
(MDB) und einen Scanner (y), der die Scanlinie senkrecht zur Linie bewegt (y-
Koordinate) und sich wiederum in einer Pupille der Mikroskopanordnung
befindet, durch die Scanoptik (SO), die Tubuslinse (TL) und das Objektiv (O)
in die Probe (PR) abgebildet. Die Relayoptik (RL) bildet hierbei den
Brennpunkt der Zylinderlinse (ZL) auf den Scanner (y) ab. Die Relayoptik
kann in speziellen Anordnungen nach dem Stand der Technik auch
weggelassen werden. Z. B. kann sie bei einer Verkürzung des Abstandes der
beiden Scanner x und y oder beim Ersetzen der Scanner x und y durch einen
kardanisch aufgehängten Einzelscanner entfallen. Die Zylinderlinse kann
prinzipiell auch durch einen Zylinderspiegel ersetzt werden, dessen
Brennpunkt auf dem Scanner (X) liegt. Der Zylinderspiegel wird unter 45° in
der in Abb. 9C gezeichneten xz-Ebene angeordnet. In dieser Ebene besitzt
der Spiegel auch seine fokussierende Wirkung. Weiterhin wird durch den
Spiegel der Strahlweg zur Lichtquelle um 90° abgewinkelt. Dies ist in Abb. 9c
schematisch dargestellt.
Das vom Objektiv (O) gesammelte Emissionslicht wird mit Hilfe
beispielsweise des Hauptfarbteilers (MDB) vom Anregungslicht abgespalten.
Im Anschluß wird das Licht der Probe mit Hilfe einer abbildenden Optik (PO)
bei konfokaler Detektion durch eine Schlitzblende (SB) (Lage-Schlitz
Längsrichtung in Z Richtung auf der Zeichnung) fokussiert, wodurch
Fluoreszenz, die außerhalb des Fokus entstand, unterdrückt wird. Bei einer
nichtdescannten Detektion kann die Blende entfallen. Hinter der Schlitzblende
befindet sich ein Zeilen- oder Flächendetektor (DE) (Lage der Zeile in Z-
Richtung) der ortsaufgelöst (entlang des Linienfokus) die Fluoreszenz
detektiert. Zusätzlich kann ein Emissionsfilter (nicht dargestellt) zur
Unterdrückung der Anregungsstrahlung im Detektionsstrahlengang nach dem
Hauptfarbteiler (MDB) angeordnet werden. Der Linienfokus wird mit dem
Galvoscanner (y) in einer Raumrichtung abgerastert. Falls der x-Scanner
nicht zur Einstellung der Bildphase verwendet wird, dann verbleibt er in seiner
Nulllage.
Abb. 9B zeigt die gleiche Anordnung jedoch diesmal um 90 Grad gespiegelt
(YZ-Ebene). Statt einer Linie auf der Probe ist in dieser Raumrichtung
aufgrund der in dieser Richtung nicht wirkenden Zylinderlinse (ZL) ein
Fokuspunkt auf der Probe zu sehen.
Prinzipiell kann auch auf den Einsatz der Schlitzblende verzichtet werden.
Dies ist vor allem dann sinnvoll, wenn die Abbildung der Fluoreszenz nicht
über die Scanner descannt wird sondern direkt auf eine CCD-Kamera oder
eine gegatete Kamera zur ortsaufgelösten Messung der
Fluoreszenzlebensdauer (LaVision, Picostar) erfolgen soll. Die CCD-Kamera
betrachtet hierbei eine Zwischenbildebene ZB z. B. in der Zwischenbildebene
zwischen TL und SO der Mikroskopanordnung. An einem Mikroskop nach
dem Stand der Technik wird sie an einen TV-Port (Abb. 19 Lage TV-Port)
angeschlossen. Zusätzlich kann eine CCD-Kamera im
Transmissionsstrahlengang der Mikroskopanordnung (z. B. Abb. 1 statt T-
PMT) eingesetzt werden. Dadurch kann die von die Probe transmittierte
Anregungsstrahlung mit konfokaler Auflösung detektiert werden. Zusätzlich
wird auch eine konfokale DIC-Abbildung möglich. Das DIC Prisma wird hierzu
nach dem Stand der Technik in der Objektivpupille zwischen TL und Objektiv
O angebracht. Das mit DIC so gewonnene Bild kann weiterhin mit den
Bildern, die durch von der Probe reflektierte, gestreute und/oder emittierte
Signale erzeugt wurden, in einem Bild überlagert dargestellt werden. Die
Berechnung des konfokalen Schnittes erfolgt beispielsweise durch die
Aufnahme von mindestens 2 Phasenbildern (siehe Abb. 4, oder im Text weiter
oben). Die Beleuchtungsintensität der Linien in den mindestens 2
Phasenbildern variiert dazu in x-Richtung periodisch - beispielsweise
sinusförmig - aufgrund der Struktur ST. Die relative Bildphase bei
Verwendung von 3 strukturierten Linien ist um jeweils 120° Phasen
verschoben. Die 3 Phasenbilder werden sequentiell erzeugt, d. h. es werden
nacheinander 3 Bilder mit Hilfe des y-Galvoscanners (y) gescannt. Die
Struktur (ST) kann beispielsweise ein Transmissionsgitter sein. Die
Verschiebung der Bildphase kann beispielsweise mit einer Positioniereinheit
(PE), an die das Transmissionsgitter gekoppelt ist, erfolgen, so dass jeder Ort
der zu untersuchenden Probe mit variierender Helligkeit betrachtet werden
kann. Die Einstellung der Bildphase kann weiterhin bei einer Wellenlänge mit
Hilfe einer drehbar gelagerten Platte (PL) wie in Abb. 7A erfolgen, der die
Struktur vorgeordnet/aufgeprägt ist. Die Platte ist hierzu in einer
Zwischenbildebene der Mikroskopanordnung anzuordnen wie in Abb. 9
dargestellt.
Die hierbei verwendete planparallele Platte befindet sich in einer
Zwischenbildebene, vorzugsweise wird die Struktur ST (dargestellt in Abb.
7B) direkt auf die Platte aufgebracht.
In einer weiteren Anordnung kann die Einstellung der Bildphase auch mit Hilfe
eines weiteren Galvoscanners (X) erfolgen. Der Scanner (X) verstellt hierbei
die Bildphase, indem er die Scanlinie in x-Richtung verschiebt. Dies hat den
Vorteil, dass durch das Zuschalten (Einschwenken oder Einschieben) der
Zylinderlinse (ZL) und des Transmissionsgitters gekoppelt mit einer
detektionsseitigen Strahlumlenkung zur Umschaltung von einem
Punktdetektor auf einen Zeilendetektor (DE) zwischen einem
punktscannenden LSM und einem linienscannenden LSM mit strukturierter
Beleuchtung umgeschaltet werden kann. Falls der Scanner X nicht zur
Einstellung der Bildphase verwendet wird, so verbleibt er in seiner
Nullstellung (ist also stromlos geschaltet).
Eine zweite Anordnung verwendet verschiedene Kodierphasen in
Abhängigkeit von der verwendeten Anregungswellenlänge bei der
Strukturierung der Scanlinie. Dadurch können die Signale der von den
einzelnen Wellenlängen angeregten Fluoreszenz digital separiert werden.
Abb. 10A zeigt einen möglichen schematischen Aufbau in der XZ-Ebene.
Licht der Lichtquelle(LQ) der verschiedenen Wellenlängen erfährt mit Hilfe
einer Struktur (ST) eine Amplitudenmodulation. Die Struktur befindet sich
hierzu in einer Zwischenbildebene der Mikroskopanordnung. Die Struktur ist
über eine Positioniereinheit (PE) verschiebbar angeordnet, so dass die
Struktur entlang der Scanlinie verschoben und verschiedene Bildphasen
eingestellt werden können. Anschließend wird das strukturierte Licht in einer
Zylinderoptik (ZL) zu einer Linie in der Pupillenebene der
Mikroskopanordnung geformt. Dazu wird die Zylinderlinse (ZL) im Abstand
ihrer Brennweite von der Pupille (Scanner X) angeordnet. Die Einstellung der
Bildphase kann weiterhin mit dem Scanner (X) erfolgen, der sich in einer
Pupillenebene der Mikroskopanordnung befindet.
Abb. 10B zeigt eine vereinfachte Anordnung mit nur einem Scanner (Y) in der
XZ-Ebene. Die Einstellung der Bildphase erfolgt hierbei durch die
Positioniereinheit PE.
Nachdem der Scanlinie eine Amplitudenmodulation aufgeprägt wurde, gelangt
die Strahlung durch ein Element in dem die Struktur wellenlängenabhängig
(ST) verschoben und damit die Kodierphase wellenlängenabhängig variiert
wird. Eine mögliche Anordnung zur Phasenkodierung wurde bereits anhand
von Abb. 7A beschrieben. Die hierbei verwendete planparallele Platte befindet
sich in einer Zwischenbildebene, vorzugsweise wird die periodische Struktur
ST (dargestellt unter anderem in Abb. 7B) direkt auf die Platte aufgebracht.
Im Anschluß an die Phasen- bzw. Frequenzkodierung der
Amplitudenmodulation gelangt die Anregungsstrahlung über den
Hauptfarbteiler (MDB), den Y-Scanner, die Scanoptik (SO), die Tubuslinse
(TL) und das Objektiv (O) in die Probe (PR). Der Y-Scanner rastert die
Scanlinie zur Aufnahme eines Phasenbildes in der y-Koordinate ab. In
Abhängigkeit von den verwendeten Farbstoffen erfolgt die
Fluoreszenzanregung mit den entsprechenden Wellenlängen. Die
Modulationsfrequenz und Modulationsphase der Scanlinie in Abhängigkeit
von der Anregungswellenlänge überträgt sich auf diese Art auf das
Fluoreszenzsignal. Bei einer descannten Detektion werden die Fluoreszenzen
vom Objektiv gesammelt und gelangen über die Tubuslinse, Scanoptik und
den Y-Scanner zum Hauptfarbteiler (MDB). Dieser trennt die Fluoreszenz von
der Anregungsstrahlung. Im Anschluß wird die Fluoreszenz durch eine
Schlitzblende auf einen Zeilendetektor (DE) abgebildet. Zur Unterdrückung
der Anregungsstrahlung können zusätzlich Blockfilter vor den Zeilendetektor
geschalten werden. Die Schlitzblende kann insbesondere bei einer
Mehrphotonenanregung entfallen. Die Trennung der einzelnen Signalanteile,
die von den verschiedenen Wellenlängen generiert wurden, und die
Berechnung der optischen Schnitte erfolgt anhand des oben beschriebenen
Algorithmus beispielsweise unter Verwendung der Kodierphasen bei gleicher
Modulationsfrequenz, wobei die Kodierphasen der einzelnen Wellenlängen
mit Testobjekten wie Planspiegeln vorher bestimmt worden sind. Es können
somit Regionen die mit verschiedenen Farbstoffen gefärbt wurden, getrennt
sichtbar gemacht werden.
Eine weitere Anordnung verwendet ein dispersives Element (DG), z. B. ein
Transmissionsgitter, das sich in einer Pupillenebene der Mikroskopanordnung
befindet. Das Optikschema ist in Abb. 11 in der XZ-Ebene dargestellt. Das
Transmissionsgitter verschiebt die einzelnen Scanlinien entsprechend ihrer
Wellenlänge innerhalb der Zeichenebene (nur eine WL dargestellt). Dadurch
wird den einzelnen Scanlinien entsprechend ihrer Wellenlänge eine
unterschiedliche Phasenlage der Modulationsstruktur ST (Kodierphase)
aufgeprägt. Die Verschiebung der Bildphase erfolgt mit Hilfe der
Positioniereinheit (PE) und der Modulationsstruktur S für jede Wellenlänge mit
einer identischen Schrittweite. Dadurch wird sichergestellt, dass die
Bildphasenverschiebung für jede Anregungswellenlänge beispielsweise bei
einer Aufnahme von 3 Phasenbildern 120° beträgt.
Im folgenden wird auf vorteilhafte Anordnungen zur Erzeugung der
Frequenzkodierung bzw. der Anpassung der optischen Auflösung näher
eingegangen.
Durch Verändern der Modulationsfrequenz für jede Anregungswellenlänge
kann die effektive Pinholegröße, d. h. die optische Schnittdicke für die
einzelnen Wellenlängen angepaßt werden.
Abb. 7C zeigt schematisch eine Vorrichtung zur wellenlängenabhängigen
Einstellung der Modulationsfrequenzen, die vorteilhaft in den Anordnungen 1
und 2 (wie zum Beispiel in Abb. 9) in eine Zwischenbildebene der
Mikroskoskopeinrichtung anstelle der Struktur ST eingebaut wird. Dabei wird
eine polychromatische Lichtquelle mit einem dispersiven Element (DG1) in
seine spektralen Anteile räumlich aufgespalten. Im Anschluß werden die
spektralen Anteile mit einer ersten Linse (Linse 1, Brennweite f) axparallel
gemacht, d. h. DG1 steht im Brennpunkt der Linse. In der abbildungsseitigen
Brennebene der Linse befindet sich die Struktur (ST) mit der die
Amplitudenmodulation erfolgt. Eine mögliche Ausbildung der Struktur mit
linearer Abhängigkeit der Frequenz in y-Richtung ist in Abb. 7D schematisch
dargestellt.
Die gemäß 7C) erfolgte Aufspaltung in Linien L1, L2, L3 erzeugt auf dieser
periodischen Struktur durch die unterschiedliche Lage der Linien in y-
Richtung unterschiedliche Modulationsfrequenzen.
Erfolgt also eine von der Wellenlänge linear abhängige räumliche Aufspaltung
der polychromatischen Lichtquelle, z. B. mit einem Transmissionsgitter, so
ändern sich bei geeigneter Gitterauslegung auch die Modulationsfrequenzen
der einzelnen spektralen Anteile in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Dadurch kann z. B. sichergestellt werden, daß die gleiche optische
Schnittdicke bei verschiedenen Wellenlängen realisiert wird. Im Anschluß
werden die einzelnen spektralen Anteile mit Hilfe einer zweiten Linse (Linse 2,
Brennweite f, die nicht identisch der Brennweite der Linse 1 sein muß) und
einem weiteren dispersiven Element (DG2, z. B. Transmissionsgitter, das nicht
identisch DG1 sein muß) wieder räumlich überlagert. Durch die Anpassung
der Brennweiten der Linsen 1 und 2 kann die Strahlaufweitung kontrolliert und
damit die Ausleuchtung des Mikroskopobjektivs optimiert werden.
Insgesamt ergeben sich mit einer solchen Struktur folgende vorteilhafte
Varianten der Erfindung:
- a) Durch eine Verschiebung in x-Richtung der Struktur ST kann für die einzelnen
Linien eine (nach vorheriger Kalibriermessung) definierte unterschiedliche
Phasenänderung erzeugt werden, wobei bei den unterschiedlichen
Phasenlagen jeweils eine vollständige Abtastung der Probe mittels der
jeweiligen Linie erfolgt und wellenlängenabhängige Schnittbilder berechnet
werden.
Die Schnittdicke dabei kann durch definierte Verschiebung der Frequenz über Verschiebung in y-Richtung verändert werden. - b) Durch (mindenstens eine) Verschiebung in y-Richtung wird die
Modulationsfrequenz definiert verändert und dadurch können durch
mehrmaliges Abscannen bei unterschieldlichen Modulationsfrequenzen für
die einzelnen Wellenlängen Schnittbilder berechnet werden.
Über die unterschiedlichen Modulationsfrequenzen der Struktur kann weiterhin eine Frequenzkodierung/Phasenkodierung für unterschiedliche Wellenlängen bei Abbildung aller Wellenlängen auf einer gemeinsamen Zeile erzeugt werden (siehe Anordnung 4).
Statt der in Abb. 7D gezeigten Struktur mit kontinuierlicher Änderung der
Modulationsfrequenz in y-Richtung kann eine Struktur (s. a. Abb. 16), die sich
aus mehreren Teilstrukturen verschiedener Modulationsfrequenz
zusammensetzt, verwendet werden. Dies hat jedoch den Nachteil, dass die
Struktur nur für feste Anregungswellenlängen abgeglichen ist. Im einfachsten
Falle können jedoch auch verschiedene Gitter ST mit jeweils verschiedener
Modulationsfrequenz in die Anordnungen 1 und 2 eingeschwenkt werden.
In einer weiteren nicht gezeigten Anordnung passiert die Strahlung nach der
Strukturierung ein Element, in dem die Struktur wellenlängenabhängig
vergrößert und damit die Modulationsfrequenz wellenlängenabhängig variiert,
d. h. eine Frequenzkodierung durchgeführt wird. In einer ersten Anordnung
wird die Scanlinie mittels dichroitischen Strahlteilern in ihre einzelnen
Wellenlängenanteile zerlegt und im Anschluß in den Teilstrahlengängen eine
wellenlängenabhängige Vergrößerung mit jeweils einem Teleskop mit
Zoomoptik zur Einstellung der Vergrößerung aufgeprägt. Mit Hilfe weiterer
Dichroiten werden die einzelnen Scanlinien wieder überlagert. Als Alternative
können in einer weiteren Anordnung auch spezielle diffraktive Elemente, die
eine wellenlängenabhängige Vergrößerung der Scanlinie generieren,
verwendet werden.
Am Ausgang besitzt die Scanlinie in Abhängigkeit von der verwendeten
Wellenlänge eine spezifische Kodierfrequenz der Amplitudenmodulation. Die
Verschiebung der Bildphase erfolgt mit Hilfe der Positioniereinheit (PE) und
der verschieblichen Struktur ST für jede Wellenlänge mit einer identischen
Schrittweite. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bildphasenverschiebung
für jede Anregungswellenlänge beispielsweise bei einer Aufnahme von 3
Phasenbildern 120° beträgt. Statt der Aufnahme von Phasenbildern kann der
optische Schnitt auch aus 2 Bildern berechnet werden, bei denen die
Modulationsfrequenz pro Anregungslinie in den beiden Bilder verschieden ist.
Die Änderung der Modulationsfrequenz für alle oder eine Wellenlänge kann
vorteilhaft durch die Aufnahme der beiden Bilder bei verschiedenen
Stellungen in y-Richtung des Transmissionsgitters nach Abb. 7D erfolgen.
Es kann durch die oben beschriebenen Anordnungen z. B. sichergestellt
werden, dass die axiale optische Auflösung des Mikroskops für verschiedene
Wellenlängen gleich ist. Dadurch werden sogenannte
Kolokalisationsmessungen mit einem Linienscanner möglich. Zusätzlich kann
z. B. bei sehr schwachen Fluoreszenzsignalen das effektive Pinhole durch
Verschiebung der Struktur in Y-Richtung siehe Abb. 7D, hier nach unten,
vergrößert werden. Dadurch verringert sich zwar die optische Auflösung,
jedoch kann das Signal- zu Rauschverhältnis verbessert werden.
Zusätzlich kann die oben beschriebene nicht dargestellte Zoomoptik dazu
dienen, den chromatischen Längsfehler der abbildenden Optik zu
kompensieren und damit sicher zu stellen, daß der optische Schnitt in der
jeweils gleichen Objektebene erfolgt. Dazu wird jeweils eine Linse der
einzelnen Zoomoptiken leicht in Abhängigkeit vom verwendeten
Mikroskopobjektiv dejustiert, so dass der Strahl für die einzelnen
Wellenlängen am Ausgang der Zoomoptik divergent oder konvergent auf die
Objektivpupille trifft und dadurch der Fokus in Abhängigkeit von der
Anregungswellenlänge in axialer Richtung verschoben, d. h. für alle
Anregungswellenlängen zur Deckung gebracht werden kann.
Zusätzlich zu Ausführung 1 und 2 kann ein weiteres dispersives Element (PR)
der zusätzlichen spektralen Aufspaltung der Fluoreszenzsignale senkrecht zur
Beleuchtungslinie dienen (multispektraler Linienscanner). Abb. 12 zeigt das
Detektionsschema einer CCD Fläche des multispektralen Linienscanners in
der XZ-Ebene. In der x-Richtung des Detektors (DE) werden die strukturierten
Emissionssignale für die jeweiligen Wellenlängen abgebildet.
Alternativ zur Verschiebung der Phasenlage mittels PE kann die Einstellung
der Bildphase auch hier durch den X-Scanner erfolgen.
Für jede Scanstellung der Scanlinie erfolgt die Aufnahme eines Bildes wie
dargestellt für unterschiedliche Wellenlängen der Detektion. Die frei
programmierbare Ansteuerung ausgewählter Detektorelemente (Zeilen) und
die Kombination von Detektorelementen einer Spalte der Detektormatrix
erlaubt eine flexible Auswahl von Spektralbereichen der Fluoreszenz-
Emission. Hierzu können mehrere Zeilen des Detektors, in die verschiedene
Fluoreszenzsignale entsprechend ihrer Wellenlänge abgebildet werden,
elektronisch zusammengeschalten werden. Die multispektrale Detektion der
Fluoreszenzemission kann wiederum mit der strukturierten Beleuchtung
kombiniert werden. Dazu wird die linienförmige Anregung zusätzlich z. B.
mittels eines Transmissionsgitters (ST) strukturiert. Hierbei erfolgt ein
kompletter Scanvorgang der Scanlinie unter Detektion jeweils der
Wellenlängenverteilung entsprechend der Abbildung in Fig. 12 und weitere
Scanvorgänge unter Änderung der Bildphase der Gitterstruktur. Da zur
Ermittlung eines wellenlängenabhängigen Versatzes beispielsweise eine
verwendete Planplatte PL definiert verkippt wurde, kann die Änderung der
Phasenlage beispielsweise durch Verschiebung mit PE bei konstantem
Kippwinkel erfolgen. Durch sequentielle Detektion von Bildern strukturierter
Objekte mit unterschiedlichen Bildphasen der Anregung und nachfolgender
Berechnung kann wieder der Tiefenkontrast optimiert werden. Abb. 12 zeigt
die Kombination eines multispektralen Linienscanners (spektrale Aufspaltung
erfolgt in der y-Ebene also in die Zeichenebene hinein) mit strukturierter
Beleuchtung über die Struktur ST, wobei die Phasenkodierung in wiederum
mit einer verkippten und in senkrecht zur optischen Achse verschobenen
planparallelen Platte (hier nicht dargestellt) oder mit einem dispersiven
Element (siehe Text oben) erfolgt. Die Bildphase wird sequentiell variiert. Die
unterschiedlichen spektralen Anteile werden parallel mittels CCD-Array
detektiert.
Die Schlitzblende (SB), die hier als Eintrittsspalt der spektralen Aufspaltung
dient, kann bei descannter Detektion im Linienscanner entfallen. Dadurch
verringert sich zwar die spektrale Auflösung, jedoch wird der technische
Aufwand erheblich erleichtert, da sonst verschiebbare Einzelschlitzblenden
verwendet werden müssen.
Abb. 13 zeigt schematisch den Aufbau der Elektronik zur Detektion der
Signale mit einem Zeilendetektor. Signale des Detektors K1-N werden hierzu
mit Hilfe eines jeweils eines Strom-Spannungs-Wandlers (A) verstärkt und
anschließend während der Pixelverweilzeit aufintegriert (I). Nach einer
weiteren Verstärkung zur Pegelanpassung an einen Analog-/Digital Wandler
(ADC) werden diese im ADC in digitale Signale gewandelt und an einen
Rechner (PC) übertragen. Die Detektion mit einer CCD Matrix ist aus der
Literatur bekannt.
Die Detektion der Streifenbilder kann auch quasi simultan geschehen, indem
statt eine Linie parallel mehrere Linien (z. B. L1, L2, L3) in die Probe
abgebildet werden, wobei die Intensitätsstruktur (Bildphase) beispielsweise
analog Abb. 4 jeweils um z. B. 120° bei Verwendung von beispielsweise drei
Linien verschoben ist (Abb. 14). Somit wird beim einmaligen Scannen der
Probe bereits die gesamte Information zur Auswertung der Daten generiert.
Abb. 15 zeigt schematisch den optischen Aufbau in der YZ-Ebene. Jeweils
eingezeichnet sind die Fokuspunkte entlang der y-Achse der Linienfoki. Das
Anregungslicht kann mit einer Strahlteileranordnung (T) aufgespalten werden.
Zwei Ausführungsformen der Strahlteileranordnung (T) sind in Abb. 16A/B,
hier der Zylinderlinse vorgeordnet, gezeigt. Die erste Anordnung im
Zusammenwirken mit der Zylinderlinse erzeugt mehrere diskrete Linienfoki
mit zwei parallel angeordneten Spiegeln, wobei der erste Spiegel ein
Vollspiegel und der zweite Spiegel ein teildurchlässiger Spiegel ist. Die
Transmission des teildurchlässigen Spiegels ist abgestimmt auf jeden
Teilstrahl (i) und ergibt sich aus 100%/(n-i), wobei n die Gesamtzahl der
Einzelfoki ist. Die Anteile (i) gelangen im Anschluß separat in eine spezielle
Gitterstruktur (ST), die schematisch in Abb. 16A dargestellt ist. Die Teilgitter
sind bei dieser Struktur definiert phasenversetzt moduliert. Anstatt der aus
Teilgittern zusammengesetzten Struktur kann auch ein Transmissionsgitter
nach Abb. 7B, wie in Abb. 16A dargestellt, verdreht verwendet werden, womit
der Phasenversatz der Struktur für die einzelnen Scanlinien bei jeweils
gleicher Modulationsfrequenz gezielt eingestellt werden kann. Die Eichung
der Vorrichtung, d. h. die Bestimmung der Modulationsfrequenz und der
Phasenlagen der Scanlinien erfolgt nach dem oben beschriebenen Verfahren.
Die Struktur befindet sich in einer Zwischenbildebene der
Mikroskopanordnung. Die Teileranordnung kann beispielsweise auch in einer
Pupillenebene der Mikroskopanordnung eingesetzt werden. Hierbei werden
beide Spiegel gegeneinander verkippt, so dass wiederum mehrere Linienfoki
entstehen.
Die zweite Anordnung in Abb. 16 (Abb. 16B) ist eine spezielle Anordnung zur
Erzeugung eines Doppellinienfokus. Die Anordnung verwendet wiederum
zwei parallel angeordnete Spiegel (SP1 und SP2), wobei ein Spiegel (SP1)
die Struktur ST selbst trägt. Die Struktur ist reflektierend an den Stellen
geringer Transmission. Die Struktur wird im Zwischenbild der
Mikroskopanordnung angeordnet. Am Ausgang des Teilers entstehen 2
Linien, deren Amplitudenmodulation genau gegenphasig ist. Die Linie 1 trägt
somit exakt eine gegenüber der Linie 2 um 180° verschobene
Amplitudenmodulation. Die Struktur ist auf Glasplatte 1 aufgebracht. Bei
Verwendung von mehreren Wellenlängen wird der wellenlängenabhängige
Parallelversatz in y-Richtung durch die planparallele Glasplatte durch eine
unter einem Winkel von 90° angeordnete 2te Glasplatte gleicher Dicke
kompensiert. Zusätzlich kann die gesamte Teilereinheit (T) zur Erzeugung der
oben beschriebenen Phasenkodierung leicht um die y-Achse verkippt werden.
Eine Verschiebung der Struktur (ST) kann bei beiden Anordnungen entfallen.
Die Scanbewegung des Y-Scanners erfolgt über das eigentliche zu
untersuchende Bildfeld hinaus, so dass jeder zu untersuchende Punkt der
Probe einmal mit jeweils einer Linie unterschiedlicher Phasenlage der Struktur
beleuchtet wird. Diese Anordnung ist besonders vorteilhaft für die
Untersuchung von sich schnell verändernden Proben, da sich Bewegungen
oder schnelle Veränderungen in der Probe nicht mehr störend auf die
Messung auswirken und die maximale Bildaufnahme-Geschwindigkeit des
Linienscanners nicht durch die sequentielle Datenaufnahme reduziert wird.
Die Detektion der parallel angeregten Linien erfolgt hierbei mit einem
Matrixdetektor, im Falle von beispielsweise 3 Linien mit einem 3-
Zeilendetektor. Alternativ kann auch ein Zeilendetektor zur Anwendung
kommen, auf dem alle auf der Probe separierten Linien simultan detektiert
werden. Die Separation der Information von jeder Linie kann durch den oben
beschriebenen Algorithmus auf der Grundlage der verschiedenen Modulation
(in Phase und 1 oder Frequenz) jeder Linie erfolgen.
In einer vierten Anordnung werden mehrere diskrete Anregungswellenlängen
räumlich getrennt in verschiedene Scanlinien (z. B. bei 3 Laserlinien: L1, L2,
L3 in x-Richtung) in die Probe abgebildet. Dazu werden durch ein dispersives
Element (PR) (z. B. Transmissionsgitter, Gitterlinien in x-Richtung) mehrere
parallele Anregungslinien unterschiedlicher Wellenlänge erzeugt (siehe Abb.
17), die mittels des y-Galvoscanners (y) und nachfolgender optischer
Abbildung so über die Probe bewegt werden, dass jeder Punkt im
interessanten Scanfeld mindestens einmal von jeder Linie gescannt wird. Der
optische Aufbau ist in Abb. 18 schematisch in der YZ-Ebene gezeigt. Jeweils
eingezeichnet sind die Strahlschwerpunkte der Linienfoki.
Die Abspaltung der Fluoreszenzsignale von der Anregung erfolgt wiederum
mit dem Hauptfarbteiler (MDB). Dabei gelangen die Fluoreszenzsignale, die
durch die verschiedenen Anregungslinien erzeugt wurden, auf
unterschiedliche Positionen L1-L3 in z-Richtung eines Matrixdetektors mit
vorgeordneten Schlitzblenden in x-Richtung, wobei die Achse senkrecht zur
Beleuchtungslinie der entsprechenden Wellenlänge der Fluoreszenz
entspricht. Die Achse entlang der Beleuchtungslinie auf dem Matrixdetektor
entspricht hierbei der Ortskoordinate.
Zusätzlich kann auch eine Phasen- bzw. Frequenzkodierung entsprechend
den Anordnungen 1 und 2 erfolgen. Beispielsweise zur Phasenkodierung wird
die Struktur (ST) um die Y-Achse verkippt. Eine Frequenzkodierung kann z. B.
mit den in Abb. 7D gezeigten speziellen Struktur erfolgen. Die spektralen
Anteile können bei Einsatz einer Phasen- bzw. Frequenzkodierung wiederum
simultan mit einer Detektormatrix, die alle Scanlinien simultan erfaßt,
detektiert werden. Dazu wird im einfachsten Falle eine CCD-Zeile mit
rechteckigen Pixeln (oder zusammengeschalteten Zeilen) verwendet, wobei
die längeren Seiten der Pixel vorteilhaft in Richtung z (siehe Abb. 18)
ausgerichtet sind, so dass beispielsweise die Scanlinien L1 bis L3 gemeinsam
mit der Detektorzeile detektiert werden. Die Trennung der Signale, die durch
die verschiedenen Scanlinienfoki angeregt wurden, erfolgt dann wiederum
nach dem oben beschriebenen Algorithmus. Der Vorteil dieser Anordnungen
liegt darin, dass die einzelnen Scanlinien nicht mehr getrennt auf einem
Detektorarray detektiert werden müssen, sondern mit einem
eindimensionalen Detektor erfaßt werden können.
Zusätzlich kann ein weiteres dispersives Element der zusätzlichen spektralen
Aufspaltung der Fluoreszenzsignale senkrecht zur Beleuchtungslinie dienen.
Hierzu kann wiederum das in Abb. 12 gezeigte Detektionsschema des
multispektralen Linienscanners eingesetzt werden. In einer Richtung des
Detektors wird eine Ortskoordinate abgebildet. Die frei programmierbare
Ansteuerung ausgewählter Detektorelemente (Zeilen) und die Kombination
von Detektorelementen einer Spalte der Detektormatrix erlaubt eine flexible
Auswahl von Spektralbereichen der Fluoreszenzemission. Hierzu können
mehrere Zeilen des Detektors, in die verschiedene Fluoreszenzsignale
entsprechend ihrer Wellenlänge abgebildet werden, elektronisch zusammen
geschalten werden. Die multispektrale Detektion der Fluoreszenzemission
kann wiederum mit der strukturierten Beleuchtung kombiniert werden. Dazu
wird die linienförmige Anregung zusätzlich z. B. mittels eines
Transmissionsgitters strukturiert. Durch sequentielle Detektion von Bildern
strukturierter Objekte mit unterschiedlichen Bildphasen und nachfolgender
Berechnung kann wieder der Tiefenkontrast optimiert werden. Abb. 18 zeigt
die Kombination eines multispektralen Linienscanners mit strukturierter
Beleuchtung. Die Bildphase wird mit verschiedenen Strukturen sequentiell
variiert. Die unterschiedlichen spektralen Anteile werden beispielsweise
parallel mittels CCD-Array detektiert. Als konfokale Schlitzblenden müssten
nach dem Stand der Technik in dieser Anordnung mehrere zu den einzelnen
Scanlinien konjugiert angeordnete und frei bewegliche Blenden verwendet
werden, die jedoch durch die Strukturierung der Scanlinien entfallen können.
Dadurch wird der technische Aufwand erheblich erleichtert.
In einer fünften Anordnung erfolgt statt einer linienförmigen Anregung der
Probe eine punktförmige Anregung der Probe. Dazu wird das Laser Scanning
Mikroskop entsprechend Abb. 1 nach dem Stand der Technik betrieben.
Jedoch wird eine Struktur (ST) entsprechend Abb. 19 in einer
Zwischenbildebene verwendet, die in Probenrichtung nach den Scannern x
und y angeordnet ist. Durch das Scannen in x- bzw. y-Richtung wird die
Struktur sukzessive in die Probe abgebildet. Die Aufnahme der Phasenbilder
erfolgt durch ein Verschieben der Struktur mit PE. Zusätzlich kann auch eine
quasisimultane Beleuchtung nach Anordnung 3 und 4 erfolgen. Eine
Phasenkodierung bzw. Frequenzkodierung mit den oben beschriebenen
Anordnungen ist ohne Einschränkung übertragbar. Der Vorteil dieser
Anordnung gegenüber einem herkömmlichen Punktscanner ist, dass das
Signal der Probe ohne descanning direkt mit einer CCD-Kamera gemessen
werden kann. In diesem Falle wird auch auf die konfokale Blende verzichtet.
Als CCD Kamera kann beispielsweise auch eine gegatete Kamera (Picostar,
La Vision) verwendet werden. Dadurch können beispielsweise zeitaufgelöste
Fluoreszenzaufnahmen von konfokalen optischen Schnitten erzielt werden.
Dies ist nach dem Stand der Technik nur durch den Einsatz nichtlinearer
Probenwechselwirkungen möglich.
Es kann jedoch auch eine descannte punktförmige Detektion bzw. partiell
descannte Detektion (Lit.: Stimson et al., Rev. Of Sc. Instr., (70), p3351,
1999) nach dem Stand der Technik erfolgen.
Durch die Phasenkodierung bzw. Frequenzkodierung können mit den
beschriebenen Detektionsvarianten weiterhin die Signale der Probe, angeregt
durch verschiedene Wellenlängen, simultan aufgezeichnet werden. Dabei ist
nur ein Detektor notwendig. Durch die Anordnung kann somit der Aufbau
eines Laser Scanning Mikroskops entscheidend vereinfacht werden ohne
dass die Flexibiltät eingeschränkt wird. Durch das Einschalten der Struktur
kann zwischen einem herkömmliches Laser Scanning Mikroskop und einem
Laser Scanning Mikroskop mit struktierter Beleuchtung hin und her
geschalten werden.
Eine Kombination der Verfahren 1-5 ist ebenfalls Teil der Erfindung. Weiterhin
ist auch eine Kombination der oben beschriebenen Verfahren mit
sogenannten parallel scannenden Verfahren nach dem Stand der Technik
ohne Einschränkung möglich. Bei diesen Verfahren erfolgt eine Abbildung
mehrerer Punkte oder Linien gleicher Intensität simultan als Matrix in die
Probe (Lit.: Buist et al., J. o. Microscopy (192), p217, 1998/Nielsen et al., J.
o. Microscopy (201), p852, 2000). Dadurch können die Bildaufnahmeraten
nochmals gesteigert werden. Weiterhin kann die Probe mit einem
Tischscanner oder einem Scanner nach dem Stand der Technik (z. B. Nipkow-
Scheibe) abgebildet werden.
Die beschriebenen vorteilhaften Anordnungen können zusätzlich auch zur
Untersuchung von makroskopischen Proben vorteilhaft eingesetzt werden.
Makroskopische Proben werden beispielsweise beim Screenen von
Wirkstoffen auf einem Chip eingesetzt. Die Kantenlänge der Scanfelder
betragen hierbei einige 10 mm. Diese Scanfelder können z. B. durch eine
Vergrößerung der Scanwinkel der Galvoscanner durch eine Anordnung der
Probe in einem Zwischenbild der Mikroskopanordnung Beispielhaft in Fig. 2
oder durch eine spezielle Objektivanordnung (Makroobjektiv), die das
Zwischenbild vergrößert auf die Probe abbildet erzielt werden.
Claims (114)
1. Verfahren zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, mit einer
scannenden Bewegung von einer auf oder in
einer Probe erzeugten Beleuchtungslichtverteilung mindestens einer Wellenlänge über die Probe oder zumindest einen Teil der Probe und Detektion insbesondere des aufgrund von Wechselwirkung mit der Probe beinflußten Lichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes und/oder reflektierten Lichtes und/oder Lumineszenzlichtes und/oder gestreuten und/oder transmittierten Lichtes
wobei das Beleuchtungslicht eine Modulation in zumindest einer Raumrichtung aufweist
und die scannende Bewegung und zur Scanbewegung zugeordnete Detektion zumindest bei einer ersten und einer zweiten unterschiedlichen Phasenlage der Modulation und/oder ersten oder zweiten Frequenz der Periodizität der Modulation erfolgt und mindestens ein optisches Schnittbild durch die Probe/den Probenteil berechnet wird.
einer Probe erzeugten Beleuchtungslichtverteilung mindestens einer Wellenlänge über die Probe oder zumindest einen Teil der Probe und Detektion insbesondere des aufgrund von Wechselwirkung mit der Probe beinflußten Lichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes und/oder reflektierten Lichtes und/oder Lumineszenzlichtes und/oder gestreuten und/oder transmittierten Lichtes
wobei das Beleuchtungslicht eine Modulation in zumindest einer Raumrichtung aufweist
und die scannende Bewegung und zur Scanbewegung zugeordnete Detektion zumindest bei einer ersten und einer zweiten unterschiedlichen Phasenlage der Modulation und/oder ersten oder zweiten Frequenz der Periodizität der Modulation erfolgt und mindestens ein optisches Schnittbild durch die Probe/den Probenteil berechnet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Modulation durch Aufprägen mindestens einer
zumindest eindimensional räumlich periodischen Struktur erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
wobei eine Abbildung der Lichtverteilung auf die Probe erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
das Schnittbild bildlich dargestellt wird.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine optische Abbildung einer periodischen Struktur erfolgt.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mindestens ein Interferenzmuster der Probe aufgeprägt wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mehrere Frequenzen und Phasenlagen der Struktur gleichzeitig auf die Probe
abgebildet werden.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mehrere Frequenzen und/oder Phasenlagen der Struktur sequentiell auf die Probe
abgebildet werden.
9. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Beleuchtung durch mindestens eine linienförmige Lichtverteilung erfolgt, die in
der schmalen Richtung eine bis zu beugungsbegrenzte Ausdehnung und in der
anderen, dazu rechtwinkligen Richtung ein Vielfaches dieser Ausdehnung aufweist.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Abtastung mittels der Scanbewegung punktweise erfolgt.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
innerhalb eines Scanfeldes eine Scanbewegung eines Linienmusters und/oder
mindestens eines ein- oder zweidimensionalen Punktmusters erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11,
wobei ein zusammengesetztes Bild aus den abgescannten Linien- und/ oder
Punktmustern erzeugt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei
ein äquidistantes Raster von Linien- und/oder Punktmustern verwendet wird.
14. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
das Beleuchtungslicht mehrere Wellenlängen enthält.
15. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
bei n Wellenlängen mindestens n + 1 Phasenlagen der Struktur detektiert werden.
16. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
Phase und/oder Frequenz für jede Wellenlänge zur Erzeugung von Kodierwerten
unterschiedlich eingestellt wird.
17. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine wellenlängenabhängige Phasenkodierung und/oder Frequenzkodierung des
Beleuchtungslichtes erfolgt und jeweils pro Wellenlänge mittels der Kodierung das
optische Schnittbild berechnet wird.
18. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
der Scanvorgang mit einer Linie mit mehreren Wellenlängen erfolgt.
19. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
der Scanvorgang mit mehreren Linien gleichzeitig erfolgt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei
mit einer oder mehreren Wellenlängen beleuchtet wird.
21. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
bei der Berechnung von Phasenbildern (Ij(x) mit der Bildphase: ϕi) mit
Phasenkodierung der Anregungswellenlänge (ϕj) Bilder berechnet werden, die für
die jeweilige j-te Wellenlänge charakteristische Bildinformatione vom
pseudokonfokalen Schnitt (Cj) und vom Hintergrund (Bj) enthalten:
wobei
mit cij(x) = cos(k.x + ϕj + ϕi) - cos(k.x + ϕj)
wobei
mit cij(x) = cos(k.x + ϕj + ϕi) - cos(k.x + ϕj)
22. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter
Verwendung einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer
Raumrichtung (Y) senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert.
23. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, unter
Verwendung einer optischen Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das
Beleuchtungslicht in spektrale Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt,
die eine Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene
aufweist, wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur
wellenlängenabhängigen Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist.
24. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Erzeugung optischer Schnittbilder mit Hilfe von strukturierter Beleuchtung
durch Aufnahme von Einzelbildern mit jeweils verschiedener Modulationsfrequenz
und/oder Bildphase erfolgt.
25. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
durch Änderung der Modulationsfrequenz die optische Schnittdicke variiert wird.
26. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine Phasenkodierung bei simultaner Abbildung verschiedener Wellenlängen und/
oder Linienfoki auf einen gemeinsamen Detektor erfolgt.
27. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
Frequenzkodierung bei simultaner Abbildung verschiedener Wellenlängen und/oder
Linienfoki auf einen gemeinsamen Detektor erfolgt.
28. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mehrere Wellenlängen zeitlich simultan auf die Probe abgebildet werden.
29. Verfahren nach Anspruch 28,
wobei die Abbildung räumlich getrennt oder auf einen gemeinsamen Ort der Probe
erfolgt.
30. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine Wellenlänge auf die Probe abgebildet wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Abbildung mehrfach räumlich getrennt oder
auf einem Ort der Probe erfolgt.
32. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Lichtverteilung auf der Probe linien- oder punktförmig ausgebildet ist.
33. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine sequentielle Aufnahme der Einzelbilder erfolgt.
34. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mehrere linien und/oder punktförmige Lichtverteilungen erzeugt werden.
35. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine parallele Aufnahme von Einzelbildern erfolgt.
36. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
bei mehreren Wellenlängen die Schnittdicken durch jeweilige Änderung der
Modulationsfrequenz vorzugsweise gleich eingestellt werden.
37. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Detektion mit Punktdetektor und/oder Zeilendetektor und/oder Matrixdetektor
erfolgt.
38. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
wellenlängenabhängige Phasenkodierung durch eine
Anordnung zur Erzeugung eines wellenlängenabhängigen Parallelversatzes entlang
der periodischen Struktur erfolgt.
39. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
wellenlängenabhängige Phasenkodierung durch eine
verkippte Platte in einem Zwischenbild erfolgt.
40. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
wellenlängenabhängige Phasenkodierung durch ein
dispersives Element erfolgt.
41. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
wellenlängenabhängige Phasenkodierung durch eine
optische Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in
spektrale Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine
Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist,
wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur
wellenlängenabhängigen Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist
wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist, erfolgt.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei die spektrale Aufspaltung in einem
Zwischenbild erfolgt.
43. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen mittels einer optischen Anordnung mit
einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in spektrale Bestandteile
aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine Abbildungsoptik zur Abbildung der
spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist, wobei in oder in der Nähe der
Brennebene eine periodische Struktur zur wellenlängenabhängigen Beeinflussung
des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist, mit
Einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert, erfolgt.
Einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert, erfolgt.
44. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen erfolgt, indem
wellenlängenabhängig der Abbildungsmaßstab verändert wird.
45. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen mit einer optische Anordnung mit einer
dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in spektrale Bestandteile aufspaltet
und wieder zusammenführt, die eine Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen
Anteile in eine Brennebene aufweist, wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine
periodische Struktur zur wellenlängenabhängigen Beeinflussung des
Beleuchtungslichtes vorgesehen ist, mit
einer aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität zusammengesetzten
Struktur erfolgt.
46. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase erfolgt.
47. Verfahren nach Anspruch 46, wobei eine Verschiebung der periodischen Struktur
senkrecht zur optischen Achse erfolgt.
48. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase durch
Lageverstellung eines Scanners erfolgt.
49. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase
durch Verkippung einer planparallelen Platte erfolgt.
50. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei jeweils geänderter Modulationsfrequenz
erfolgt.
51. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei jeweils geänderter Modulationsfrequenz
durch eine wellenlängenabhängige Änderung des Abbildungsmaßstabes erfolgt.
52. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei jeweils geänderter Modulationsfrequenz
durch Einschwenken verschiedener Strukturen mit unterschiedlicher Periodizität
erfolgt.
53. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei jeweils geänderter Modulationsfrequenz
durch eine Verschiebung einer periodische Struktur, deren Periode sich mindestens
in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert, senkrecht zur Periodizität, erfolgt.
54. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mehrere Lichtverteilungen auf der Probe erzeugt werden und eine parallele
Aufnahme der Einzelbilder erfolgt.
55. Verfahren nach Anspruch 54, mit der Erzeugung mehrerer Lichtverteilungen auf der
Probe bei einer Wellenlänge, insbesondere durch
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur die als Strahlteiler wirkt.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur die als Strahlteiler wirkt.
56. Verfahren nach Anspruch 54, unter Erzeugung mehrerer Lichtverteilungen auf der
Probe bei mehreren Wellenlängen, insbesondere durch
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einem dispersiven Element oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einem dispersiven Element oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt.
57. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
parallele Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage der
Beleuchtung erfolgt.
58. Verfahren nach Anspruch 57 bei mehreren Wellenlängen, insbesondere mittels einer
Anordnung mit einem dispersiven Element, und einer periodische Struktur die um die optische Achse verdrehbar ist, wobei das dispersive Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist und/oder einer
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodische Struktur aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität und das dispersives Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur reflektierend ausgebildet ist und als Strahlteiler wirktwirkt.
Anordnung mit einem dispersiven Element, und einer periodische Struktur die um die optische Achse verdrehbar ist, wobei das dispersive Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist und/oder einer
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodische Struktur aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität und das dispersives Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur reflektierend ausgebildet ist und als Strahlteiler wirktwirkt.
59. Verfahren nach Anspruch 57 bei einer Wellenlänge, insbesondere mittels einer
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist oder mittels
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt, wobei die Struktur aus mehreren Teilen zusammengesetzt ist.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist oder mittels
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt, wobei die Struktur aus mehreren Teilen zusammengesetzt ist.
60. Verfahren nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine
parallele Aufnahme mit unterschiedlicher Modulationsfrequenz erfolgt.
61. Verfahren nach Anspruch 60 bei mehreren Wellenlängen, insbesondere mittels
Anordnung eines dispersiven Element und einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert oder einer
Anordnung mit einem dispersiven Element, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht, wobei das dispersive Element vorzugsweise in einem Zwischenbild angeordnet ist.
Anordnung eines dispersiven Element und einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert oder einer
Anordnung mit einem dispersiven Element, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht, wobei das dispersive Element vorzugsweise in einem Zwischenbild angeordnet ist.
62. Verfahren nach Anspruch 60 bei einer Wellenlänge, insbesondere mittels
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur,
mit einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur,
mit einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht.
63. Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe, insbesondere
des aufgrund von Wechselwirkung mit einer Probe beeinflußten Lichtes einer
Beleuchtungslichtverteilung, insbesondere Fluoreszenzlichtes und/oder
reflektierten Lichtes und/oder Lumineszenzlichtes und/oder gestreuten und/oder
transmittierten Lichtes
enthaltend
Mittel zur Beleuchtung der Probe mit mindestens einer Wellenlänge
Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht
Mittel zur Abbildung des von der Probe beeinflußten Lichtes auf mindestens einen Detektor
Mittel zur Abbildung einer zumindest eindimensional räumlich periodisch veränderlichen Struktur in unterschiedlichen Phasen und/oder Frequenzen der Periodizität auf die Probe
Mittel zur Berechnung mindestens eines optischen Schnittbildes aus der Ortsinformation des von der Probe beeinflußten Lichts.
Mittel zur Beleuchtung der Probe mit mindestens einer Wellenlänge
Mittel zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen Probe und Beleuchtungslicht
Mittel zur Abbildung des von der Probe beeinflußten Lichtes auf mindestens einen Detektor
Mittel zur Abbildung einer zumindest eindimensional räumlich periodisch veränderlichen Struktur in unterschiedlichen Phasen und/oder Frequenzen der Periodizität auf die Probe
Mittel zur Berechnung mindestens eines optischen Schnittbildes aus der Ortsinformation des von der Probe beeinflußten Lichts.
64. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
Mittel zur bildlichen Darstellung des Schnittbildes vorgesehen sind.
65. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
Mittel zur Abbildung mindestens eines Interferenzmusters vorgesehen sind.
66. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Beleuchtung durch mindestens eine linienförmige Lichtverteilung erfolgt, die in
der schmalen Richtung eine bis zu beugungsbegrenzte Ausdehnung und in der
anderen, dazu rechtwinkligen Richtung ein Vielfaches dieser Ausdehnung aufweist.
67. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Abtastung mittels der Scanbewegung punktweise erfolgt.
68. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
innerhalb eines Scanfeldes eine Scanbewegung eines Linienmusters und/oder
mindestens eines ein- oder zweidimensionalen Punktmusters erfolgt.
69. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
ein zusammengesetztes Bild aus den abgescannten Linien- und/oder Punktmustern
erzeugt wird.
70. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
ein äquidistantes Raster von Linien- und/oder Punktmustern verwendet wird.
71. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
das Beleuchtungslicht mehrere Wellenlängen enthält.
72. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
der Scanvorgang mit einer Linie mit mehreren Wellenlängen erfolgt.
73. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
der Scanvorgang mit mehreren Linien gleichzeitig erfolgt.
74. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
mit einer oder mehreren Wellenlängen gescannt wird.
75. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer periodische
Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert.
76. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer optischen
Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in spektrale
Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine Abbildungsoptik zur
Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist, wobei in oder in der
Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur wellenlängenabhängigen
Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist.
77. Anordnung nach Anspruch 76, wobei die dispersive Aufspaltung in einer
Zwischenbildebene erfolgt.
78. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine Phasenkodierung bei simultaner Abbildung verschiedener Wellenlängen und 1
oder Linienfoki auf einen gemeinsamen Detektor erfolgt.
79. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei eine
Frequenzkodierung bei simultaner Abbildung verschiedener Wellenlängen und/oder
Linienfoki auf einen gemeinsamen Detektor erfolgt.
80. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei
mehrere Wellenlängen zeitlich simultan auf die Probe abgebildet werden.
81. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei die Abbildung räumlich getrennt oder auf einen gemeinsamen Ort der Probe
erfolgt.
82. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
eine Wellenlänge auf die Probe abgebildet wird.
83. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei die Abbildung mehrfach räumlich getrennt oder auf einem Ort der Probe erfolgt.
84. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
die Lichtverteilung auf der Probe linien- oder punktförmig ausgebildet ist.
85. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei eine sequentielle Aufnahme der Einzelbilder erfolgt.
86. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei mehrere linien und/oder punktförmige Lichtverteilungen vorgesehen sind.
87. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei eine parallele Aufnahme der Einzelbilder erfolgt.
88. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
wobei die Detektion mit Punktdetektor und/oder Zeilendetektor und/oder
Matrixdetektor erfolgt.
89. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur wellenlängenabhängigen
Phasenkodierung.
90. Anordnung nach Anspruch 89 zur Erzeugung eines wellenlängenabhängigen
Parallelversatzes entlang der periodischen Struktur.
91. Anordnung nach Anspruch 90, mit einer verkippten Planplatte
in einem Zwischenbild.
92. Anordnung nach Anspruch 90 mit einem in Richtung der Periodizität dispersiven
Element in einer Abbildungspupille.
93. Anordnung zur Phasenkodierung, mit einer
optischen Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in
spektrale Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine
Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist,
wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur
wellenlängenabhängigen Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist
wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist.
94. Anordnung nach Anspruch 93, wobei die spektrale Aufspaltung in einem
Zwischenbild erfolgt.
95. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen mit einer
Optischen Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in
spektrale Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine
Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist,
wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur
wellenlängenabhängigen Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist, mit
einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung
(Y) senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert.
96. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen, wobei
wellenlängenabhängig der Abbildungsmaßstab verändert wird.
97. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Frequenzkodierung mehrerer Wellenlängen mit einer
optische Anordnung mit einer dispersiven Einheit die das Beleuchtungslicht in
spektrale Bestandteile aufspaltet und wieder zusammenführt, die eine
Abbildungsoptik zur Abbildung der spektralen Anteile in eine Brennebene aufweist,
wobei in oder in der Nähe der Brennebene eine periodische Struktur zur
wellenlängenabhängigen Beeinflussung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist, mit
einer aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität zusammengesetzten
Struktur.
98. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentiellen Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase
unter Verschiebung der Struktur (PE) senkrecht zur optischen Achse.
99. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentielle Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase
durch Lageverstellung eines Scanners.
100. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentiellen Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Bildphase
durch Verkippung einer planparallelen Platte.
101. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentiellen Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Modulationsfrequenz mit
Mitteln zur wellenlängenabhängigen Änderung des Abbildungsmaßstabes.
102. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentiellen Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Modulationsfrequenz durch
Einschwenken verschiedener Gitter mit unterschiedlicher Periodizität.
103. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
sequentiellen Aufnahme der Einzelbilder bei geänderter Modulationsfrequenz
durch Verschiebung einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in
einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert, senkrecht zur Periodizität.
104. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Erzeugung mehrerer Lichtverteilungen auf der Probe und parallelen Aufnahme der
Einzelbilder.
105. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Erzeugung mehrerer Lichtverteilungen auf der Probe und paralleler Aufnahme der
Einzelbilder bei einer Wellenlänge insbesondere unter
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung
aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel
und/oder Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens
einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler
wirkt.
106. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
Erzeugung mehrere Lichtverteilungen auf der Probe und paralleler Aufnahme der
Einzelbilder
bei mehreren Wellenlängen, insbesondere unter
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einem dispersiven Element und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einem dispersiven Element und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt.
107. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage der
Beleuchtung.
108. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage der Beleuchtung
bei mehreren Wellenlängen insbesondere mit einer
Anordnung mit einem dispersiven Element, wobei die periodische Struktur um die optische Achse verdrehbar ist und das
dispersives Element vorzugsweise in einem im Zwischenbild angeordnet ist und/ oder einer Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität zusammengesetzt ist und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur reflektierend ausgebildet ist und als Strahlteiler wirkt.
parallelen Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage der Beleuchtung
bei mehreren Wellenlängen insbesondere mit einer
Anordnung mit einem dispersiven Element, wobei die periodische Struktur um die optische Achse verdrehbar ist und das
dispersives Element vorzugsweise in einem im Zwischenbild angeordnet ist und/ oder einer Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur aus mehreren Teilen unterschiedlicher Periodizität zusammengesetzt ist und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element wobei die periodische Struktur reflektierend ausgebildet ist und als Strahlteiler wirkt.
109. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage
bei einer Wellenlänge insbesondere unter
Aufspaltung der Befeuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur,
wobei die Struktur aus mehreren Teilen zusammengesetzt ist.
parallelen Aufnahme der Einzelbilder bei unterschiedlicher Phasenlage
bei einer Wellenlänge insbesondere unter
Aufspaltung der Befeuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteileranordnung aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, wobei die Struktur um die optische Achse verdrehbar ist und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur,
wobei die Struktur aus mehreren Teilen zusammengesetzt ist.
110. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme mit unterschiedlicher Modulationsfrequenz.
111. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme mit unterschiedlicher Modulationsfrequenz
bei mehreren Wellenlängen, insbesondere mit einer
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodischen Struktur, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht,
wobei das dispersive Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist.
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur Richtung der Periodizität (X) ändert und/oder
Anordnung mit einem dispersiven Element und einer periodischen Struktur, wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht,
wobei das dispersive Element vorzugsweise im Zwischenbild angeordnet ist.
112. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche zur
parallelen Aufnahme mit unterschiedlicher Modulationsfrequenz
bei einer Wellenlänge insbesondere unter
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt und/oder mit einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht.
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt und/oder mit einer periodischen Struktur, deren Periode sich mindestens in einer Raumrichtung (Y) im wesentlichen senkrecht zur
Richtung der Periodizität (X) ändert und/oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit einer Strahlteiler AO aus mindestens einem Vollspiegel und einem teildurchlässigen Spiegel oder
Aufspaltung der Beleuchtung in mehrere Teilstrahlen mit mindestens einem Spiegel und einer reflektierenden periodischen Struktur, die als Strahlteiler wirkt wobei die periodische Struktur aus Teilen unterschiedlicher Periodizität besteht.
113. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei vor der
Detektoranordnung mindestens ein dispergierendes Element vorgesehen ist.
114. Anordnung nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche
in einem Mikroskop, vorzugsweise einem Laser-Scanning-Mikroskop.
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001118463 DE10118463A1 (de) | 2001-04-07 | 2001-04-07 | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe |
US10/043,009 US7274446B2 (en) | 2001-04-07 | 2002-01-08 | Method and arrangement for the deep resolved optical recording of a sample |
DE50214827T DE50214827D1 (de) | 2001-04-07 | 2002-03-28 | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe |
AT02007111T ATE493683T1 (de) | 2001-04-07 | 2002-03-28 | Verfahren und anordnung zur tiefenaufgelösten optischen erfassung einer probe |
EP02007111A EP1248132B1 (de) | 2001-04-07 | 2002-03-28 | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe |
JP2002099436A JP4747243B2 (ja) | 2001-04-07 | 2002-04-01 | 試料の光学的深部分解による光学的把握のための方法および装置 |
HK03102529.3A HK1052220A1 (en) | 2001-04-07 | 2003-04-09 | Method and arrangement for depth resolving optical detection of a probe |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2001118463 DE10118463A1 (de) | 2001-04-07 | 2001-04-07 | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE10118463A1 true DE10118463A1 (de) | 2002-10-10 |
Family
ID=7681489
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2001118463 Withdrawn DE10118463A1 (de) | 2001-04-07 | 2001-04-07 | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE10118463A1 (de) |
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10250568A1 (de) * | 2002-10-28 | 2004-05-13 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren zur Verbesserung der Tiefendiskriminierung optisch abbildender Systeme |
EP1617268A2 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit einem Beleuchtungsmodul |
EP1617262A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | Carl-Zeiss Jena GmbH | Verfahren zur Erfassung eines Probenbereiches mit einem Lichtrastermikroskop mit punktförmiger Lichtquellenverteilung |
EP1617252A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit punktförmiger Lichtquellenverteilung und Verwendung |
EP1617253A1 (de) | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit linienförmiger Abtastung und Verwendung |
EP1767980A1 (de) * | 2005-09-22 | 2007-03-28 | Nikon Corporation | Mikroskop und System zur Erzeugung einer Bildershow |
WO2007036305A1 (de) * | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Vorrichtung und verfahren zum erzeugen eines bildes eines objektes |
WO2008125605A2 (de) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Michael Schwertner | Verfahren und anordnung zur optischen abbildung mit tiefendiskriminierung |
WO2009008838A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | National University Of Singapore | Fluorescence focal modulation microscopy system and method |
WO2009043545A1 (de) * | 2007-09-28 | 2009-04-09 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren und anordnung zur optischen erfassung einer beleuchteten probe |
DE102008024954A1 (de) * | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Carl Zeiss Microlmaging Gmbh | Mikroskop mit einer optischen Anordnung zur Strukturierung des Beleuchtungslichtes |
DE102011114500A1 (de) | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Ludwig-Maximilians-Universität | Mikroskopvorrichtung |
US9995919B2 (en) | 2007-11-26 | 2018-06-12 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Method and configuration for the optical detection of an illuminated specimen |
WO2018208687A1 (en) * | 2017-05-06 | 2018-11-15 | Howard Hughes Medical Institute | Scanned line angular projection microscopy |
CN112912782A (zh) * | 2018-09-20 | 2021-06-04 | 皇家飞利浦有限公司 | 被配置用于生成线焦点的共焦激光扫描显微镜 |
DE102005007756B4 (de) | 2005-02-16 | 2022-09-29 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Scanmikroskop |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH677972A5 (de) * | 1989-01-17 | 1991-07-15 | Kern & Co Ag | |
DE19930816A1 (de) * | 1999-07-01 | 2001-01-04 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern |
-
2001
- 2001-04-07 DE DE2001118463 patent/DE10118463A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH677972A5 (de) * | 1989-01-17 | 1991-07-15 | Kern & Co Ag | |
DE19930816A1 (de) * | 1999-07-01 | 2001-01-04 | Zeiss Carl Jena Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur Tiefenselektion von Mikroskopbildern |
Cited By (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10250568A1 (de) * | 2002-10-28 | 2004-05-13 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Verfahren zur Verbesserung der Tiefendiskriminierung optisch abbildender Systeme |
US7335866B2 (en) | 2002-10-28 | 2008-02-26 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Method for improving depth discrimination in optical reproduction systems |
EP1617268A2 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit einem Beleuchtungsmodul |
EP1617262A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | Carl-Zeiss Jena GmbH | Verfahren zur Erfassung eines Probenbereiches mit einem Lichtrastermikroskop mit punktförmiger Lichtquellenverteilung |
EP1617252A1 (de) * | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit punktförmiger Lichtquellenverteilung und Verwendung |
EP1617253A1 (de) | 2004-07-16 | 2006-01-18 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit linienförmiger Abtastung und Verwendung |
EP1617268A3 (de) * | 2004-07-16 | 2006-03-15 | CARL ZEISS JENA GmbH | Lichtrastermikroskop mit einem Beleuchtungsmodul |
US7271382B2 (en) | 2004-07-16 | 2007-09-18 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Process for the observation of at least one sample region with a light raster microscope with light distribution in the form of a point |
DE102005007756B4 (de) | 2005-02-16 | 2022-09-29 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Scanmikroskop |
US7518790B2 (en) | 2005-09-22 | 2009-04-14 | Nikon Corporation | Microscope and virtual slide forming system |
EP1767980A1 (de) * | 2005-09-22 | 2007-03-28 | Nikon Corporation | Mikroskop und System zur Erzeugung einer Bildershow |
US7864414B2 (en) | 2005-09-22 | 2011-01-04 | Nikon Corporation | Microscope and virtual slide forming system |
WO2007036305A1 (de) * | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Vorrichtung und verfahren zum erzeugen eines bildes eines objektes |
US8570625B2 (en) | 2005-09-29 | 2013-10-29 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Device and method for generating an image of an object |
US7977625B2 (en) | 2007-04-13 | 2011-07-12 | Michael Schwertner | Method and assembly for optical reproduction with depth discrimination |
WO2008125605A2 (de) * | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Michael Schwertner | Verfahren und anordnung zur optischen abbildung mit tiefendiskriminierung |
WO2008125605A3 (de) * | 2007-04-13 | 2009-02-26 | Michael Schwertner | Verfahren und anordnung zur optischen abbildung mit tiefendiskriminierung |
WO2009008838A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | National University Of Singapore | Fluorescence focal modulation microscopy system and method |
EP2557451A1 (de) * | 2007-09-28 | 2013-02-13 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung einer beleuchteten Probe |
WO2009043545A1 (de) * | 2007-09-28 | 2009-04-09 | Carl Zeiss Microimaging Gmbh | Verfahren und anordnung zur optischen erfassung einer beleuchteten probe |
US9995919B2 (en) | 2007-11-26 | 2018-06-12 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Method and configuration for the optical detection of an illuminated specimen |
DE102008024954A1 (de) * | 2008-05-23 | 2009-11-26 | Carl Zeiss Microlmaging Gmbh | Mikroskop mit einer optischen Anordnung zur Strukturierung des Beleuchtungslichtes |
WO2013049646A1 (en) | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Fei Company | Microscope device |
DE102011114500B4 (de) | 2011-09-29 | 2022-05-05 | Fei Company | Mikroskopvorrichtung |
DE102011114500A1 (de) | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Ludwig-Maximilians-Universität | Mikroskopvorrichtung |
EP4354118A2 (de) | 2011-09-29 | 2024-04-17 | Fei Company | Mikroskopvorrichtung |
WO2018208687A1 (en) * | 2017-05-06 | 2018-11-15 | Howard Hughes Medical Institute | Scanned line angular projection microscopy |
US10830701B2 (en) | 2017-05-06 | 2020-11-10 | Howard Hughes Medical Institute | Scanned line angular projection microscopy |
CN112912782A (zh) * | 2018-09-20 | 2021-06-04 | 皇家飞利浦有限公司 | 被配置用于生成线焦点的共焦激光扫描显微镜 |
CN112912782B (zh) * | 2018-09-20 | 2024-03-05 | 皇家飞利浦有限公司 | 被配置用于生成线焦点的共焦激光扫描显微镜 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1248132B1 (de) | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe | |
DE10257237B4 (de) | Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/oder rückgestreuter Lichtstrahlung | |
EP2137488B1 (de) | Verfahren und anordnung zur optischen abbildung mit tiefendiskriminierung | |
EP1264169B1 (de) | Verbesserung der spektralen und/oder räumlichen auflösung in einem laser-scanning mikroskop | |
DE10241472B4 (de) | Verfahren und Anordnung zur einstellbaren Veränderung von Beleuchtungslicht und/oder Probenlicht bezüglich seiner spektralen Zusammensetzung und/oder Intensität | |
DE102012023024B4 (de) | Lichtmikroskop und Mikroskopieverfahren | |
EP2195697B1 (de) | Verfahren zur untersuchung einer probe | |
DE102013001238B4 (de) | Lichtmikroskop und Mikroskopieverfahren | |
DE102011055294B4 (de) | Mikroskopische Einrichtung und Verfahren zur dreidimensionalen Lokalisierung von punktförmigen Objekten in einer Probe | |
DE102006007172B4 (de) | Verfahren und Anordnung zur schnellen, ortsaufgelösten, flächigen, spektroskopischen Analyse, bzw. zum Spectral Imaging oder zur 3D-Erfassung mittels Spektroskopie | |
DE10038526B4 (de) | Verfahren und Anordnung zur Erfassung des wellenlängenabhängigen Verhaltens einer beleuchteten Probe | |
EP0977069A2 (de) | Verfahren und Anordnung zur konfokalen Mikroskopie | |
DE10155002A1 (de) | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe | |
WO2013171309A1 (de) | Lichtmikroskop und verfahren zur bildaufnahme mit einem lichtmikroskop | |
EP1420281A2 (de) | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe | |
DE102005020545A1 (de) | Vorrichtung zur Steuerung von Lichtstrahlung | |
EP1302804A2 (de) | Verfahren zur optischen Erfassung von charakteristischen Grössen einer beleuchteten Probe | |
DE10033180B4 (de) | Verfahren zur Detektion von Farbstoffen in der Fluoreszenzmikroskopie | |
DE10043992B4 (de) | Verfahren zur Untersuchung einer Probe und konfokales Scan-Mikroskop | |
DE102005020543A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur einstellbaren Veränderung von Licht | |
DE10118463A1 (de) | Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe | |
EP1882970A1 (de) | Laser-Scanning-Mikroskop zur Fluoreszenzuntersuchung | |
WO2015032497A1 (de) | Verfahren zum erstellen eines mikroskopbildes mikroskopiervorrichtung und umlenkeinrichtung | |
WO2018050888A1 (de) | Lichtmikroskop | |
DE10227111A1 (de) | Spektralmikroskop und Verfahren zur Datenaufnahme mit einem Spektralmikroskop |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OM8 | Search report available as to paragraph 43 lit. 1 sentence 1 patent law | ||
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
R081 | Change of applicant/patentee |
Owner name: CARL ZEISS MICROSCOPY GMBH, DE Free format text: FORMER OWNER: CARL ZEISS JENA GMBH, 07745 JENA, DE Effective date: 20130206 |
|
R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee | ||
R119 | Application deemed withdrawn, or ip right lapsed, due to non-payment of renewal fee |
Effective date: 20141101 |