DE10118160A1

DE10118160A1 - Microparticles for delayed release of drugs, especially proteins or peptides, from polymer matrix, prepared by encapsulation under controlled conditions to maximize drug loading and minimize initial burst phase release

Info

Publication number: DE10118160A1
Application number: DE2001118160
Authority: DE
Inventors: Thomas Kissel; Ruland Fridrich; Peter Schneider
Original assignee: Merckle GmbH
Current assignee: Merckle GmbH
Priority date: 2001-04-11
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2002-10-17

Abstract

Microparticles (A) for delayed release of active agent(s) (I), comprising (I) and a polymer matrix (II), have an in vitro release profile such that less than 25% of the total amount of (I) is released during the first 24 hours and at least 80% is released during the first 900 hours. Independent claims are included for: (1) preparation of delayed release microparticles (A'), comprising: (a) dispersing a composition containing (I) in an organic solution of (II); (b) adding the obtained emulsion or dispersion to, and dispersing it in, an external phase at 0-20 (preferably 0-10, especially 3-7) deg C; and (c) removing the organic solvent by passing an inert gas through the mixture or subjecting it to a pressure of less than 1000 mbar; and (2) (A') obtained by the above process.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines physiologisch aktiven Wirkstoffs, die neben einem Wirkstoff und einer polymeren Matrix Chitosan enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung derartiger Mikropartikel.The present invention relates to microparticles for delayed release of a physiologically active Active ingredient, in addition to an active ingredient and a polymer Contain matrix chitosan. The invention also relates Process for the production of such microparticles.

Bei der Verabreichung von Arzneimitteln ist es oftmals wünschenswert, über einen längeren Zeitraum einen möglichst konstanten Plasmaspiegel des Wirkstoffs zu erhalten. Dies ist insbesondere dann schwer zu erreichen, wenn der entsprechende Wirkstoff im Körper schnell abgebaut oder ausgeschieden wird. Um wiederholte Applikationen in kurzen Zeitabständen zu vermeiden, wurden verschiedene Depotarzneiformen vorgeschlagen, die zum Ziel haben, über einen längeren Zeitraum eine möglichst konstante Menge an Wirkstoff freizusetzen. Derartige Depotarzneiformen haben oftmals die Form von Mikropartikeln, die parenteral verabreicht werden können, beispielsweise als Implantat oder durch subkutane Injektion. In der Regel umfassen derartige Arzneiformen eine Polymermatrix, in der der Wirkstoff verteilt ist ("microspheres"), oder einen wirkstoffhaltigen Kern, der von einer polymerhaltigen Schicht umgeben ist (Mikrokapseln).It is often when administering drugs desirable, if possible over a longer period of time to maintain a constant plasma level of the active ingredient. This is especially difficult to reach when the appropriate one Active ingredient is quickly broken down or excreted in the body. To repeat applications at short intervals Avoid using different forms of depot proposed that aim over a longer period Period a constant amount of active ingredient as possible release. Such depot drug forms often have the Form of microparticles that are administered parenterally can, for example as an implant or by subcutaneous Injection. As a rule, such pharmaceutical forms comprise one Polymer matrix in which the active ingredient is distributed ("microspheres"), or an active substance - containing core, which is surrounded by a polymer-containing layer (microcapsules).

EP 0 052 510 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung in Mikrokapselform für die verzögerte Freigabe eines Arzneistoffes, worin die Zusammensetzung ein wasserlösliches Polypeptid, gegebenenfalls ein Polymerhydrolyse- Modifizierungsmittel und ein bioabbaubares Verkapselungspolymer umfaßt. Als Polymer wird Poly(lactid-co glykolid)-copolymer eingesetzt.EP 0 052 510 discloses a pharmaceutical composition in Microcapsule shape for the delayed release of a Medicament, wherein the composition is a water-soluble Polypeptide, optionally a polymer hydrolysis Modifier and a biodegradable Encapsulation polymer. Poly (lactide-co glycolide) copolymer used.

EP 0 145 240 offenbart eine Mikrokapsel mit verlängerter Freisetzung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Demnach wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion zubereitet, die eine innere wäßrige Schicht, die ein wasserlösliches Arzneimittel und eine dasselbe zurückhaltende Substanz enthält und eine Ölschicht umfaßt, die eine hochpolymere Substanz enthält, dann wird die genannte innere wäßrige Schicht auf eine Viskosität von nicht weniger als 5.000 Centipoise verdickt und schließlich die entstandene Emulsion einer "Trocknung in Wasser" unterworfen. EP 0 145 240 offenbart damit das sogenannte W/O/W-Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln.EP 0 145 240 discloses an elongated microcapsule Release and a process for their preparation. Therefore a water-in-oil emulsion is prepared that has an inner aqueous layer containing a water-soluble drug and a contains the same reserved substance and an oil layer comprises, which contains a highly polymeric substance, then the mentioned inner aqueous layer to a viscosity of not less than 5,000 centipoise and finally thickened the resulting emulsion is subjected to "drying in water". EP 0 145 240 thus discloses the so-called W / O / W process for the production of microparticles.

Beim W/O/W-Verfahren wird zunächst eine den Wirkstoff enthaltende wäßrige Phase (W1) in einer organischen Lösung des Polymers (O) dispergiert, die entstehende W1/O-Emulsion wird dann in einer weiteren wäßrigen Phase (die sogenannte äußere Phase; W2) dispergiert. Das Polymer wird durch das Entfernen des organischen Lösungsmittels koazerviert und bildet Mikropartikel. Durch das jeweilige Dispergierverfahren kann die Partikelgröße beeinflußt werden. Die Entstehung der Mikropartikel hängt schließlich noch von der Möglichkeit des Abdampfens des Lösungsmittels ab. Deshalb wird das W/O/W- Doppelemulsionsverfahren auch als "solvent evaporation/ extraction method/technique" bezeichnet. Nach Aushärten der Mikropartikel und Entfernen der Lösungsmittel erhält man Mikropartikel, die den Wirkstoff enthalten. Oft enthalten derartige Mikropartikel viskositätserhöhende Substanzen wie z. B. Gelatine.In the W / O / W process, one is the active ingredient containing aqueous phase (W1) in an organic solution of Polymers (O) dispersed, the resulting W1 / O emulsion then in another aqueous phase (the so-called outer Phase; W2) dispersed. The polymer is removed by removing of the organic solvent coacervates and forms Microparticles. Through the respective dispersion process the particle size can be influenced. The emergence of the Finally, microparticles depend on the possibility of Evaporation of the solvent. Therefore the W / O / W- Double emulsion process also as "solvent evaporation / extraction method / technique ". After the Microparticles and solvent removal are obtained Microparticles that contain the active ingredient. Often included such microparticles viscosity-increasing substances such z. B. gelatin.

Im Stand der Technik sind ebenfalls S/O/W-Verfahren bekannt, bei denen der Wirkstoff nicht in einer wäßrigen Lösung vorliegt, sondern als Feststoff (S). Der Feststoff wird dann direkt in der organischen Phase (O) dispergiert. Die weiteren Schritte entsprechen dem W/O/W-Verfahren.S / O / W methods are also known in the prior art, where the active ingredient is not in an aqueous solution is present, but as a solid (S). The solid then becomes dispersed directly in the organic phase (O). The others Steps correspond to the W / O / W procedure.

Schließlich gibt es sogenannte S/O/O-Verfahren, bei denen die äußere Phase keine wäßrige Phase ist, sondern eine nicht wäßrige Phase, die ein Schutzkolloid oder einen Emulgator enthält.Finally, there are so-called S / O / O processes in which the outer phase is not an aqueous phase, but not one aqueous phase containing a protective colloid or an emulsifier contains.

Es ist wünschenswert, die an den Patienten zu verabreichende Menge an Mikropartikeln möglichst gering zu halten. Beispielsweise sollte das zu injizierende Volumen an Mikropartikeln möglichst gering sein, damit unter anderem die Schmerzen bei der Injektion geringer sind. Daher sollte der Wirkstoffgehalt in den Mikropartikeln möglichst hoch sein. Die Wirkstoffbeladung ist ein wichtiges Charakteristikum von Mikropartikeln. Man unterscheidet zwischen praktischem und theoretischem Beladungsgrad. Als Synonyme für den praktischen Beladungsgrad werden auch die Ausdrücke effektiver Beladungsgrad oder effektiver Wirkstoffgehalt verwendet. Der theoretische Beladungsgrad ist wie folgt definiert:
It is desirable to keep the amount of microparticles to be administered to the patient as small as possible. For example, the volume of microparticles to be injected should be as small as possible so that, among other things, the pain during the injection is less. The active ingredient content in the microparticles should therefore be as high as possible. The drug loading is an important characteristic of microparticles. A distinction is made between practical and theoretical loading levels. The terms effective loading level or effective active substance content are also used as synonyms for the practical loading level. The theoretical degree of loading is defined as follows:

Dabei handelt es sich um die Masse der während der Herstellung eingesetzten Bestandteile. Der effektive Wirkstoffgehalt ist wie folgt definiert:
This is the mass of the components used during manufacture. The effective drug content is defined as follows:

Das Verhältnis aus effektivem Wirkstoffgehalt und theoretischem Beladungsgrad wird als Verkapselungsausbeute bezeichnet. Die Verkapselungsausbeute ist ein wichtiger Prozeßparameter und ein Maß für die Effektivität des Verfahrens:
The ratio of the effective active ingredient content to the theoretical degree of loading is called the encapsulation yield. The encapsulation yield is an important process parameter and a measure of the effectiveness of the process:

Ebenfalls ein bedeutendes Kriterium ist das Freisetzungsprofil der Mikropartikel. Die Wirkstofffreisetzung kann zeitlich grob in drei Phasen unterteilt werden. In einer anfänglichen "Burst"-Phase werden üblicherweise in relativ kurzer Zeit etwa 20 bis 30%, gegebenenfalls auch deutlich höhere Raten des in den Mikropartikeln enthaltenen Wirkstoffs freigesetzt. Zum Teil handelt es sich hierbei um Wirkstoff, der sich auf der oder nahe der Oberfläche der Partikel befindet. In der sich anschließenden "Lag"-Phase ist bei den bisher im Stand der Technik bekannten Zubereitungen die Wirkstofffreisetzung vernachlässigbar gering, insbesondere beim Einsatz von PLGA- Polymeren als Matrixbildner. Es wäre wünschenswert, daß während der "Lag"-Phase eine gewisse über den Freisetzungszeitraum konstante Wirkstoffabgabe erfolgt. In der abschließenden Phase der Bioerosion werden die Partikel hydrolysiert und geben so durch starken Massenverlust und Molekulargewichtsverlust verstärkt Wirkstoff frei.The release profile is also an important criterion the microparticle. The drug release can be rough in time can be divided into three phases. In an initial "Burst" phase are usually around in a relatively short time 20 to 30%, possibly also significantly higher rates of in the active ingredient contained in the microparticles is released. To the Part of this is an active ingredient that is based on the or near the surface of the particles. In which subsequent "lag" phase is in the state of the Technology known preparations the drug release negligible, especially when using PLGA Polymers as matrix formers. It would be desirable that during the "lag" phase some over the Release period constant drug release takes place. In the final phase of bioerosion are the particles hydrolyzed and give through heavy mass loss and Molecular weight loss increases drug-free.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mikropartikel bereitzustellen, die vorteilhafte Eigenschaften bezüglich Wirkstoffbeladung und Freisetzungsprofil aufweisen.It is an object of the present invention to microparticles to provide the beneficial properties regarding Have drug loading and release profile.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Chitosan in Mikropartikeln signifikant höhere Beladungsgrade an Wirkstoff ermöglicht, als bei Mikropartikeln des Standes der Technik. Chitosan ist ein Polymer, das durch Deacetylierung von Chitin, einem in Insekten und Krebsen vorkommenden Polysaccharid, erhältlich ist. Es ist üblicherweise ein Polysaccharid mit einer linearen Kette, die aus 2-Amino-2-desoxy-β-D-glucopyranose (GlcN) aufgebaut ist, wobei die Monomere β-(1,4)-verknüpft sind (100% Deacetylierung). Bei einer unvollständigen Deacetylierung entstehen aber Chitosanpräparationen, die noch unterschiedliche Anteile an 2-Acetamido-2-desoxy-β-D- glucopyranose (GlcNAc) in der Polysaccharidkette aufweisen.Surprisingly, it was found that the presence of Chitosan in microparticles significantly higher levels of loading of active ingredient than with microparticles of the state of the technique. Chitosan is a polymer that passes through Deacetylation of chitin, one in insects and crabs occurring polysaccharide is available. It is usually a polysaccharide with a linear chain that is composed of 2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose (GlcN), where the monomers are β- (1,4) linked (100% Deacetylation). In the event of incomplete deacetylation but chitosan preparations are still created different proportions of 2-acetamido-2-deoxy-β-D- have glucopyranose (GlcNAc) in the polysaccharide chain.

Polk et al. (1994) J. Pharm. Sci. 83, 178-185 offenbaren Mikrokapseln, die einen BSA-haltigen Kern aufweisen, der von einem Alginat-Chitosan-Polyelektrolytkomplex umhüllt ist. Die Mikrokapseln setzen das BSA aber bereits innerhalb von Stunden frei und besitzen einen großen Durchmesser. Sie sind daher beispielsweise für eine subkutane Anwendung ungeeignet.Polk et al. (1994) J. Pharm. Sci. 83, 178-185 Microcapsules that have a core containing BSA that is from an alginate-chitosan polyelectrolyte complex is encased. The Microcapsules already set the BSA within hours free and have a large diameter. You are therefore for example unsuitable for subcutaneous use.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Mikropartikel zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs, enthaltend eine Polymermatrix, wenigstens einen physiologisch aktiven Wirkstoff und Chitosan, wobei die Polymermatrix nicht aus Chitosan, einem Derivat davon oder einem Chitosan-Alginat- Komplex besteht.The present invention thus relates to microparticles for delayed release of an active substance containing a Polymer matrix, at least one physiologically active Active ingredient and chitosan, whereby the polymer matrix is not made Chitosan, a derivative thereof, or a chitosan alginate Complex exists.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel haben üblicherweise einen Durchmesser von 1 bis 500 µm, vorzugsweise von 1 bis 200 µm, noch bevorzugter von 1 bis weniger als 150 µm, am bevorzugtesten von 1 bis 100 µm. Sie können im wesentlichen kugelförmig sein oder eine andere Form aufweisen. Falls die Partikel nicht kugelförmig sind, ist unter dem Durchmesser die größte räumliche Ausdehnung eines Partikels zu verstehen. Die Polymermatrix kann dabei als Hülle ausgebildet sein, die einen Kern umgibt, oder als ein den gesamten Partikel durchziehendes "Gerüst". Die Mikropartikel der vorliegenden Erfindung umfassen daher sowohl Partikel, die einen wirkstoffhaltigen Kern, umgeben von einer polymeren Schicht, aufweisen (Mikrokapseln), als auch Partikel, die eine Polymermatrix aufweisen, in der der Wirkstoff verteilt ist ("microspheres").The microparticles according to the invention usually have one Diameters from 1 to 500 µm, preferably from 1 to 200 µm, more preferably from 1 to less than 150 µm, am most preferred from 1 to 100 µm. You can essentially be spherical or have another shape. if the Particles are not spherical, the diameter is below that to understand the greatest spatial extent of a particle. The The polymer matrix can be designed as a shell, the one Core surrounds, or as a permeating the entire particle "Framework". The microparticles of the present invention therefore include both particles that contain an active ingredient Have core surrounded by a polymeric layer (Microcapsules), as well as particles that have a polymer matrix have in which the active ingredient is distributed ("microspheres").

Bevorzugt besitzt das in den Mikropartikeln enthaltene Chitosan ein Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da, besonders bevorzugt von 40.000 bis 400.000 Da. Erfindungsgemäß kann das Chitosan in den Mikropartikeln verschiedene Deacetylierungsgrade aufweisen. Ein zu praktisch 100% deacetyliertes Chitosan enthält im wesentlichen nur noch GlcN und kein GlcNAc mehr. Vorzugsweise hat das erfindungsgemäße Chitosan einen Deacetylierungsgrad von 25 bis 100%, am bevorzugtesten von 50 bis 100%.It preferably has that contained in the microparticles Chitosan a molecular weight of 10,000 to 2,000,000 Da, particularly preferably from 40,000 to 400,000 Da. According to the invention The chitosan can be different in the microparticles Have degrees of deacetylation. A too practical 100% Deacetylated chitosan essentially only contains GlcN and no more GlcNAc. Preferably has the invention Chitosan a degree of deacetylation of 25 to 100%, am most preferred from 50 to 100%.

Das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan in den Mikropartikeln ist vorzugsweise 1 : 0,01 bis 1 : 25, bevorzugter 1 : 0,01 bis 1 : 10, am bevorzugtesten 1 : 1. Das Verhältnis ist angegeben in Gew./Gew.The weight ratio of physiologically active ingredient to Chitosan in the microparticles is preferably 1: 0.01 to 1:25, more preferably 1: 0.01 to 1:10, most preferably 1: 1 Ratio is given in w / w.

Als Polymere, die die Polymermatrix der Mikropartikel bilden, kommen alle bioabbaubaren und biologisch verträglichen Polymere in Frage. Diese können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Beispiele für Polymere natürlichen Ursprungs sind Albumin, Gelatine, Carragen. Beispiele für synthetische Polymere, die in den erfindungsgemäßen Mikropartikeln enthalten sein können, sind Polymere aus Fettsäuren (z. B. Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Polyzitronensäure, Polyäpfelsäure, Polymilchsäurecaprolacton, usw.), Poly-α- cyanoacrylsäureester, Poly-β-hydroxybuttersäure, Polyalkylenoxalate (z. B. Polytrimethylenoxalat, Polytetramethylenoxalat; usw.), Polyorthoester, Polyorthocarbonate und andere Polycarbonate (z. B. Polyethylencarbonat, Polyethylenpropylencarbonat, usw.), Polyaminosäuren (z. B. Poly-γ-benzyl-L-glutaminsäure, Poly-L- alanin, Poly-γ-methyl-L-glutaminsäure, usw.), und Hyaluronsäureester, usw. Weitere bioverträgliche Copolymere sind Polystyrol, Polymethacrylsäure, Copolymere aus Acrylsäure und Methacrylsäure, Polyaminosäuren, Dextranstearat, Ethylcellulose, Acetylcellulose, Nitrocellulose, Maleinsäureanhydrid-Copolymere, Ethylen-Vinylacetat- Copolymere, wie Polyvinylacetat, Polyacrylamid, usw. Die genannten Polymere können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden. Sie können in Form von Copolymeren oder als eine Mischung von zwei oder mehreren der Polymere verwendet werden. Auch ihre Salze können eingesetzt werden. Unter den genannten Polymeren sind Milchsäure/Glykolsäure-Copolymere (PLGA) bevorzugt. Bevorzugt sind PLGA-Polymere mit einer Zusammensetzung von 0 : 100 bis 100 : 0 Milchsäure zu Glykolsäure und einem Molekulargewicht von 2.000 bis 2.000.000 Da. Besonders bevorzugt sind PLGA-Polymere mit einem Molekulargewicht von 2.000 bis 200.000 Da und einem Verhältnis Milchsäure zu Glykolsäure von 25 : 75 bis 75 : 25 oder 50 : 50. Es können dabei auch L-PLA oder D,L-PLA oder Mischungen dieser oder Copolymere davon eingesetzt werden.As polymers that form the polymer matrix of the microparticles, come all biodegradable and biologically compatible Polymers in question. These can be natural or synthetic Be of origin. Examples of polymers of natural origin are albumin, gelatin, carragen. Examples of synthetic Polymers in the microparticles of the invention may be contained are polymers of fatty acids (e.g. Polylactic acid, polyglycolic acid, polycitric acid, Poly malic acid, polylactic acid caprolactone, etc.), poly-α- cyanoacrylic acid ester, poly-β-hydroxybutyric acid, Polyalkylene oxalates (e.g. polytrimethylene oxalate, polytetramethylene; etc.), polyorthoesters, Polyorthocarbonates and other polycarbonates (e.g. Polyethylene carbonate, polyethylene propylene carbonate, etc.), Polyamino acids (e.g. poly-γ-benzyl-L-glutamic acid, poly-L- alanine, poly-γ-methyl-L-glutamic acid, etc.), and Hyaluronic acid esters, etc. Other biocompatible copolymers are polystyrene, polymethacrylic acid, copolymers of acrylic acid and methacrylic acid, polyamino acids, dextran stearate, Ethyl cellulose, acetyl cellulose, nitrocellulose, Maleic anhydride copolymers, ethylene-vinyl acetate Copolymers such as polyvinyl acetate, polyacrylamide, etc. The The polymers mentioned can be used alone or in combination can be used together. They can be in the form of Copolymers or as a mixture of two or more of the Polymers are used. Their salts can also be used become. Among the polymers mentioned are Lactic acid / glycolic acid copolymers (PLGA) preferred. Prefers are PLGA polymers with a composition from 0: 100 to 100: 0 lactic acid to glycolic acid and a molecular weight of 2,000 to 2,000,000 da. PLGA polymers are particularly preferred with a molecular weight of 2,000 to 200,000 Da and one Lactic acid to glycolic acid ratio from 25:75 to 75:25 or 50: 50. L-PLA or D, L-PLA or mixtures can also be used this or copolymers thereof are used.

Als Wirkstoffe in den Mikropartikeln können alle physiologisch aktiven Wirkstoffe eingesetzt werden. Bevorzugt sollte es sich um wasserlösliche Substanzen handeln. Beispiele für Wirkstoffe, die verwendet werden können, sind Antibiotika, Impfstoffe, blutdrucksenkende Mittel, Substanzen zur Beeinflussung des Herz-Kreislauf-Systems, Substanzen gegen die Blutplättchenaggregation, Antitumormittel, Antipyretika, Analgetika, antiinflammatorische Substanzen, Antitussiva, Sedativa, Muskelrelaxantien, Antiulcerativa, Psychopharmaka, ZNS-Mittel, Antidepressiva, Antiallergika, Cardiotonika, Vasodilatatoren, blutdrucksenkende Diuretika, antidiabetische Substanzen, Antikoagulantien, Hämostatika, Antituberkulosemittel, Hormonpräparate, Kontrazeptiva, Hemmstoffe der Knochenresorption, Angiogeneseinhibitoren, usw. Üblicherweise werden als Wirkstoffe Peptide oder Proteine verwendet. Beispiele für mögliche Peptid- oder Proteinwirkstoffe sind Salmon-Calcitonin (sCT), Lysozym, Cytochrom C, Erythropoietin (EPO), luteinizing hormone releasing hormone (LHRH), Buserelin, Goserelin, Triptorelin, Leuprorelin, Vasopressin, Gonadorelin, Felypressin, Carbetocin, Rinderserumalbumin (BSA), Oxytocin, Tetanustoxoid, Bromocriptin, growth hormone releasing hormone (GHRH), Somatostatin, Insulin, tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), Bradykinin, Urokinase, Asparaginase, Neurotensin, Substanz P, Kallikrein, gastric inhibitory polypeptide (GIP), growth hormone releasing factor (GRF), Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), thyrotropin releasing hormone (TRH), thyroid stimulating hormone (TSH), melanocyte stimulating hormone (MSH), Parathormon (LH), Gastrin, Glucagon, Enkephalin, bone morphogenetic protein (BMP), α-, β-, γ-Interferon, Angiotensin, Thymopoetin und thymic humoral factor (THF). Wirkstoffe, die Peptide bzw. Proteine sind, können aus einer natürlichen Quelle stammen oder aber rekombinant hergestellt und isoliert werden. Rekombinant hergestellte Wirkstoffe können sich von den entsprechenden nativen Wirkstoffen unterscheiden, beispielsweise in der Art und dem Umfang der posttranslationalen Modifikationen, aber auch in der Primärsequenz. Derart veränderte Wirkstoffe können andere Eigenschaften besitzen, wie veränderte pharmakologische Wirksamkeit, verändertes Ausscheidungsverhalten, usw. Alle derartigen "Varianten" natürlicher Wirkstoffe sind von der Erfindung umfaßt. Weitere mögliche Wirkstoffe sind Heparin und Nukleinsäuren wie DNA- und RNA-Moleküle. Die DNA-Moleküle können in linearer oder zirkulärer Form vorliegen. Es kann sich auch um Plasmide oder Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren handeln. Ein Beispiel ist der in WO 98/51321 beschriebene Expressionsvektor pcDNA3. Schließlich sind auch virale Vektoren umfaßt, die zur Gentherapie eingesetzt werden. Dabei können auch Komplexe aus Chitosan, Natrium-Alginat oder anderen kationischen Polymeren, wie Polyethylenimin oder Poly(Lysin) oder anderen kationischen Aminosäuren eingesetzt werden. Die eingesetzte Nukleinsäure kann einzel- oder doppelsträngig sein. Einzelsträngige DNA kann beispielsweise in Form von Antisense-Oligonukleotiden verwendet werden. Es können auch "nackte" Nukleinsäurefragmente eingesetzt werden; in diesen Fällen ist die Nukleinsäure nicht mit anderen Stoffen verbunden.The active ingredients in the microparticles can all be physiological active ingredients are used. It should be preferred are water-soluble substances. examples for Active ingredients that can be used are antibiotics, Vaccines, antihypertensive agents, substances for Influencing the cardiovascular system, substances against the Platelet aggregation, antitumor agents, antipyretics, Analgesics, anti-inflammatory substances, antitussives, Sedatives, muscle relaxants, antiulceratives, psychotropic drugs, CNS agents, antidepressants, antiallergics, cardiotonics, Vasodilators, hypotensive diuretics, antidiabetic Substances, anticoagulants, hemostats, Anti-tuberculosis agents, hormone preparations, contraceptives, Bone resorption inhibitors, angiogenesis inhibitors, etc. Peptides or proteins are usually used as active ingredients used. Examples of possible peptide or Protein active ingredients are salmon calcitonin (sCT), lysozyme, Cytochrome C, erythropoietin (EPO), luteinizing hormone releasing hormone (LHRH), buserelin, goserelin, triptorelin, Leuprorelin, vasopressin, gonadorelin, felypressin, Carbetocin, bovine serum albumin (BSA), oxytocin, tetanus toxoid, Bromocriptine, growth hormone releasing hormone (GHRH), Somatostatin, insulin, tumor necrosis factor (TNF), colony stimulating factor (CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), epidermal growth factor (EGF), nerve growth factor (NGF), bradykinin, urokinase, asparaginase, Neurotensin, substance P, kallikrein, gastric inhibitory polypeptides (GIP), growth hormone releasing factor (GRF), Prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), thyrotropin releasing hormone (TRH), thyroid stimulating hormone (TSH), melanocyte stimulating hormone (MSH), parathyroid hormone (LH), Gastrin, glucagon, enkephalin, bone morphogenetic protein (BMP), α-, β-, γ-interferon, angiotensin, thymopoetin and thymic humoral factor (THF). Active substances that contain peptides or Proteins can come from a natural source or can be produced and isolated recombinantly. Active ingredients produced recombinantly can differ from the differentiate between corresponding active ingredients, for example in the type and scope of post-translational modifications, but also in the Primary sequence. Drugs modified in this way can be changed by others Possess properties such as modified pharmacological Effectiveness, changed excretion behavior, etc. All Such "variants" of natural active ingredients are from the Invention includes. Other possible active ingredients are heparin and Nucleic acids such as DNA and RNA molecules. The DNA molecules can be in linear or circular form. It can plasmids or vectors, in particular Act expression vectors. An example is that in WO 98/51321 expression vector pcDNA3 described. Finally also include viral vectors used for gene therapy be used. Complexes of chitosan, Sodium alginate or other cationic polymers such as Polyethyleneimine or poly (lysine) or other cationic Amino acids are used. The nucleic acid used can be single or double stranded. Single-stranded DNA can, for example, in the form of antisense oligonucleotides be used. It can also "naked" Nucleic acid fragments are used; in these cases the nucleic acid is not linked to other substances.

Die Wirkstoffkonzentration in den Mikropartikeln ist unter anderem abhängig vom jeweiligen Wirkstoff und der Art der Behandlung, für die sie verwendet werden sollen. Peptid-/ Proteinwirkstoffe werden in der Regel in einer Konzentration von 0,01 bis 30% eingesetzt, bevorzugt von 0,5 bis 15%, vor allem 2,5 bis 7,5%, bezogen auf die eingesetzte Polymermasse. Wirkstoffe zum Einsatz in der Gentherapie, vornehmlich DNA/RNA und entsprechende Komplexe dieser Wirkstoffe, werden in der Regel in einer Konzentration von 0,001% bis 15% eingesetzt, bevorzugt 0,001% bis 7,5%, vor allem 0,001 bis 2,5%.The drug concentration in the microparticles is below other depending on the respective active ingredient and the type of Treatment for which they are to be used. peptide / Protein active ingredients are usually concentrated from 0.01 to 30%, preferably from 0.5 to 15%, before all 2.5 to 7.5%, based on the polymer mass used. Active substances for use in gene therapy, primarily DNA / RNA and corresponding complexes of these active ingredients are described in the Usually used in a concentration of 0.001% to 15%, preferably 0.001% to 7.5%, especially 0.001 to 2.5%.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zur verzögerten Freisetzung eines Wirkstoffs. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung bereitgestellt wird, die den Wirkstoff und Chitosan enthaltende Zusammensetzung dann zu einer organischen Lösung eines Polymers gegeben wird und darin dispergiert wird. Die daraus entstehende Emulsion oder Dispersion wird in die äußere Phase gegeben und darin dispergiert.The invention also relates to a method for producing Microparticles for delayed release of an active ingredient. The inventive method is characterized in that a composition containing the active ingredient and chitosan is provided, the active ingredient and chitosan containing composition then to an organic solution of a polymer is given and dispersed therein. The resulting emulsion or dispersion is in the outer Given phase and dispersed therein.

Üblicherweise wird Chitosan mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 Da verwendet, vorzugsweise mit 40.000 bis 400.000 Da. Meist wird das Chitosan in einer 0,001% bis 70%igen Essigsäure gelöst, bevorzugt in einer 0,01% bis 10%igen Essigsäure (m/m). Erfindungsgemäß können die Partikel durch W/O/W-, S/O/W- oder S/O/O-Verfahren hergestellt werden. Die Konzentration von Chitosan in der inneren Phase beim W/O/W-Verfahren ist im allgemeinen 0,01% bis 50% Chitosan, bezogen auf die Polymermasse, bevorzugt aber 0,01% bis 25% Chitosan, bezogen auf die Polymermasse. Das Gewichtsverhältnis von physiologisch aktivem Wirkstoff zu Chitosan sollte 1 : 0,01 bis 1 : 25, bevorzugt 1 : 0,1 bis 1 : 10, am bevorzugtesten 1 : 1, sein. Wird das S/O/W-Verfahren angewendet, sollte eine Konzentration von Chitosanwirkstoffkomplex von 0,01% bis 50%, bevorzugt 0,1% bis 25%, bezogen auf die Polymermasse, eingesetzt werden.Chitosan with a molecular weight of 10,000 to 2,000,000 Da used, preferably 40,000 to 400,000 da. Mostly the chitosan is in a 0.001% to 70% acetic acid dissolved, preferably in a 0.01% to 10% acetic acid (m / m). According to the invention, the particles by W / O / W, S / O / W or S / O / O processes. The concentration of chitosan in the inner phase in W / O / W process is generally 0.01% to 50% chitosan, based on the polymer mass, but preferably 0.01% to 25% Chitosan, based on the polymer mass. The weight ratio of physiologically active ingredient to chitosan should be 1: 0.01 to 1:25, preferably 1: 0.1 to 1:10, most preferably 1: 1, his. If the S / O / W method is used, one should Concentration of chitosan active ingredient complex from 0.01% to 50%, preferably 0.1% to 25%, based on the polymer mass, be used.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren als W/O/W-Verfahren durchgeführt, dann ist die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, eine wäßrige Lösung. Hierbei wird das Chitosan üblicherweise in Essigsäure vollständig gelöst. Das Peptid oder der Wirkstoff wird entweder simultan mit dem Chitosan zusammen in Essigsäure gelöst oder zunächst in Wasser gelöst und dann mit dem gelösten Chitosan dispergiert. Dieses Chitosanwirkstoffgel wird dann direkt in die organische Polymerlösung dispergiert. Die entstehende W1/O- oder Primäremulsion wird dann in die gegebenenfalls ein Schutzkolloid enthaltende äußere wäßrige Phase (W2) eingespritzt und mit üblichen Hilfsmitteln dispergiert. Nach diesem Schritt entsteht die Doppelemulsion oder W1/O/W2- Emulsion. Nach einer Aushärtungsphase meist unter Rühren und Atmosphärendruck, werden die entstandenen Mikropartikel von der äußeren wäßrigen Phase separiert und können danach lyophilisiert werden. Bei großem W1-Volumen und niedriger Viskosität der Polymerlösung werden beim W/O/W-Verfahren Mikrokapseln erhalten. Beispielsweise würde ein Volumenverhältnis W1 : O : W2 von 1 : 10 : 1000 zur Bildung von "microspheres" führen, ein Volumenverhältnis von 9 : 10 : 1000 zur Bildung von Mikrokapseln.The method according to the invention is used as a W / O / W method performed, then the composition is the active ingredient and contains chitosan, an aqueous solution. Here is the Chitosan usually completely dissolved in acetic acid. The Peptide or the active ingredient is either simultaneously with the Chitosan dissolved together in acetic acid or first in water dissolved and then dispersed with the dissolved chitosan. This Chitosan drug gel is then directly into the organic Dispersed polymer solution. The emerging W1 / O- or The primary emulsion is then optionally incorporated into the Outer aqueous phase containing protective colloid (W2) injected and dispersed with conventional aids. To this step creates the double emulsion or W1 / O / W2- Emulsion. After a hardening phase, usually with stirring and Atmospheric pressure, the resulting microparticles are from the outer aqueous phase separated and can then be lyophilized. With large W1 volume and lower Viscosity of the polymer solution are in the W / O / W process Get microcapsules. For example, a Volume ratio W1: O: W2 of 1: 10: 1000 to form "microspheres" lead to a volume ratio of 9: 10: 1000 Formation of microcapsules.

Die Zusammensetzung, die den Wirkstoff und Chitosan enthält, kann aber auch in Feststofform vorliegen. Dabei wird der Wirkstoff in fester Form direkt in die organische Polymerlösung dispergiert. Die weiteren Herstellungsschritte entsprechen denen des W/O/W-Verfahrens. In einer besonderen Ausführungsform werden der Wirkstoff und Chitosan zunächst in Essigsäure gelöst und sprühgetrocknet. Dieses feste Pulver kann dann direkt in die organische Polymerlösung dispergiert werden. Durch weitere Verfahrensschritte kann somit entweder ein S/O/W- oder ein S/O/O-Verfahren zur Anwendung kommen. The composition that contains the active ingredient and chitosan but can also be in solid form. The Active ingredient in solid form directly in the organic Dispersed polymer solution. The further manufacturing steps correspond to those of the W / O / W process. In a special one Embodiment, the active ingredient and chitosan are first in Acetic acid dissolved and spray dried. This solid powder can then be dispersed directly into the organic polymer solution become. Through further process steps, either an S / O / W or an S / O / O process are used.

Als Wirkstoffe können die oben angeführten Wirkstoffe in den entsprechenden Konzentrationen verwendet werden.The active ingredients listed above can be used as active ingredients in the appropriate concentrations are used.

Die organische, nicht mit Wasser mischbare Phase dient zum Lösen des biologisch abbaubaren Polymers. Dabei wird das Polymer in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst, in dem der Wirkstoff nicht löslich ist. Beispiele für derartige organische Lösungsmittel sind Ethylacetat, Aceton, Dimethylsulfoxid, Toluol, Chloroform, Ethanol, Methanol, usw. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan. Die Konzentration des Polymers in der organischen Phase ist üblicherweise höher als 5% (w/v), bevorzugt 5 bis 50%, am bevorzugtesten 15 bis 40%. Als Polymere können die obenstehend genannten, biologisch abbaubaren und verträglichen Polymere eingesetzt werden. Die organische Phase kann auch mehrere verschiedene Polymere enthalten.The organic, water-immiscible phase is used for Dissolve the biodegradable polymer. It will Polymer dissolved in a suitable organic solvent, in which the active ingredient is not soluble. examples for such organic solvents are ethyl acetate, acetone, Dimethyl sulfoxide, toluene, chloroform, ethanol, methanol, etc. Dichloromethane is particularly preferred. The concentration of the Polymer in the organic phase is usually higher than 5% (w / v), preferably 5 to 50%, most preferably 15 to 40%. The polymers mentioned above can be used as biological degradable and compatible polymers are used. The organic phase can also use several different polymers contain.

In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die äußere Phase eine wäßrige Lösung (W2). Diese wäßrige Lösung kann einen Emulgator oder ein Schutzkolloid enthalten. Beispiele für Schutzkolloide sind Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, usw. Bevorzugt ist Polyvinylalkohol. Beispielsweise können verschiedene von der Firma Clariant erhältliche Polyvinylalkohole eingesetzt werden wie Mowiol® 18-88, Mowiol® 4-88, Mowiol® 47-88 oder Mowiol® 20-98. Die Schutzkolloide werden üblicherweise in einer Konzentration von 0,01% bis 10% eingesetzt, bevorzugt sind 0,01% bis 5%. Das Molekulargewicht der Schutzkolloide kann zwischen 2.000 und 1.000.000 Da, bevorzugt zwischen 2.000 und 200.000 Da, liegen. Die Volumina von W1/O-Primäremulsion und äußerer Phase sollten ein Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 1.000 zueinander aufweisen.In certain embodiments of the invention The outer phase is an aqueous solution (W2). This aqueous solution can be an emulsifier or a Protective colloid included. Examples of protective colloids are Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, etc. Polyvinyl alcohol is preferred. For example various available from Clariant Polyvinyl alcohols such as Mowiol® 18-88, Mowiol® are used 4-88, Mowiol® 47-88 or Mowiol® 20-98. The protective colloids are usually used in a concentration of 0.01% to 10% used, preferably 0.01% to 5%. The molecular weight the protective colloid can be between 2,000 and 1,000,000 Da, preferably between 2,000 and 200,000 Da. The volumes of W1 / O primary emulsion and outer phase should be one Have a ratio of 1: 5 to 1: 1,000 to each other.

Alternativ kann als äußere Phase auch eine sogenannte "ölige" Phase zum Einsatz kommen, die nicht mit der Primäremulsion mischbar ist ("W/O/O- bzw. S/O/O-Verfahren"). Beispielsweise können Silikonöl oder Paraffinöl eingesetzt werden, die einen Emulgator und/oder ein Schutzkolloid enthalten. Im Gegensatz zum Einsatz einer wäßrigen äußeren Phase muß bei Verwendung einer "öligen" äußeren Phase ein Emulgator oder Schutzkolloid enthalten sein. Beispiele für Emulgatoren in der äußeren öligen Phase sind Span, Tween oder Brij, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01 bis 10 Gew.-%.Alternatively, a so-called "oily" can also be used as the outer phase. Phase that are not used with the primary emulsion is miscible ("W / O / O or S / O / O process"). For example can be used silicone oil or paraffin oil, which a Contain emulsifier and / or a protective colloid. In contrast to use an aqueous outer phase must be used an "oily" outer phase is an emulsifier or protective colloid be included. Examples of emulsifiers in the outer oily phase are Span, Tween or Brij, preferably in one Concentration from 0.01 to 10 wt .-%.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, das die erfindungsgemäßen Mikropartikel, gegebenenfalls mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen, umfaßt.Another aspect of the present invention is a Medicament containing the microparticles according to the invention, optionally with pharmaceutically acceptable excipients, includes.

Die erfindungsgemäßen Mikropartikel haben nicht nur den Vorteil, daß der Beladungsgrad mit Wirkstoff gegenüber Mikropartikeln aus dem Stand der Technik signifikant erhöht ist, auch das Freisetzungsprofil ist positiv beeinflußt. Durch die Zugabe von Chitosan kommt es zu Beginn der Freisetzung zu einem geringeren "Burst" als bei Mikropartikeln ohne den Zusatz von Chitosan und im weiteren Verlauf der Freisetzung kommt es zu einer konstanten Wirkstoffabgabe. Durch die erfindungsgemäßen Mikropartikel ist eine Wirkstofffreisetzung über Wochen und sogar Monate möglich. Sie eignen sich daher insbesondere für eine subkutane/intramuskuläre Applikation.The microparticles of the invention not only have that Advantage that the degree of loading with active ingredient compared Microparticles from the prior art significantly increased is, the release profile is also positively influenced. By Chitosan is added at the start of the release a lower "burst" than for microparticles without the Addition of chitosan and in the further course of the release there is a constant release of active ingredient. Through the Microparticles according to the invention is an active ingredient release possible for weeks and even months. They are therefore suitable especially for subcutaneous / intramuscular application.

Fig. 1a) zeigt die kumulative Freisetzung von Lysozym in Prozent des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms (Beispiel 6a)). Fünf verschiedene Mikropartikelpräparationen wurden miteinander verglichen. Es wurden Chitosan enthaltende Mikropartikel untersucht, die nach dem W/O/W- oder dem S/O/W-Verfahren hergestellt waren. Diese wurden verglichen mit auf gleiche Weise, aber ohne Chitosanzusatz hergestellten Mikropartikeln und mit Mikropartikeln, die gemäß dem in EP 0 145 240 offenbarten Verfahren hergestellt waren und Gelatine enthielten. Fig. 1a) the cumulative release of lysozyme as a percentage of the total lysozyme contained in the microparticles (Example 6a)). Five different microparticle preparations were compared. Microparticles containing chitosan which were produced by the W / O / W or the S / O / W process were investigated. These were compared with microparticles produced in the same way but without the addition of chitosan and with microparticles which were produced according to the process disclosed in EP 0 145 240 and contained gelatin.

Fig. 1b) zeigt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1a). Fig. 1b) shows an enlarged section of Fig. 1a).

Fig. 1c) zeigt die kumulative Freisetzung von Lysozym in Prozent des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms (Beispiel 6b)). Es wurden vier Mikropartikelpräparationen mit hohen Chitosangehalten miteinander verglichen, die durch das W/O/W-Verfahren hergestellt worden waren. Fig. 1c) the cumulative release of lysozyme as a percentage of the total lysozyme contained in the microparticles (Example 6b)). Four microparticle preparations with high chitosan contents, which were produced by the W / O / W process, were compared with one another.

Fig. 2 zeigt die nach 100 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das W/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit Chitosan, mit Gelatine und ohne Zusatz untersucht. Fig. 2 shows the amount of lysozyme released after 100 h in µg. Microparticles produced by the W / O / W process with chitosan, with gelatin and without additives were examined.

Fig. 3 zeigt die nach 100 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das S/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit und ohne Chitosan untersucht. Fig. 3 shows the amount of lysozyme released after 100 h in µg. Microparticles produced with the S / O / W process with and without chitosan were examined.

Fig. 4 zeigt die nach 500 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das W/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit Chitosan, mit Gelatine und ohne Zusatz untersucht. Fig. 4 shows the amount of lysozyme released after 500 h in µg. Microparticles produced by the W / O / W process with chitosan, with gelatin and without additives were examined.

Fig. 5 zeigt die nach 500 h freigesetzte Menge an Lysozym in µg. Es wurden durch das S/O/W-Verfahren hergestellte Mikropartikel mit und ohne Chitosan untersucht. Fig. 5 shows the amount of lysozyme released in µg after 500 h. Microparticles produced with the S / O / W process with and without chitosan were examined.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.The following examples are intended to illustrate the invention explain.

example 1 W / O / W process with chitosan

Verschiedene Konzentrationen an Chitosan wurden in Essigsäure gelöst, und das entstandene Chitosangel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an Lysozym oder sCT mittels W/O/W-Verfahren verkapselt. Die Chitosanwirkstofflösung wurde in 5,7 ml Dichlormethanlösung, die 35% (2 g) PLGA-Polymer (RG 503 H von der Firma Boehringer Ingelheim) enthält, gegeben und für 60 Sekunden bei 13.500 U/min mit einem SN-10 G Ultraturraxwerkzeug emulgiert. Die so hergestellte W1/O- oder Primäremulsion wurde dann zu 300 ml 0,1% wäßriger PVA-Lösung (temperiert auf 5°C) gegeben und für 60 Sekunden bei 13.500 U/min in einem SN-18 G Ultraturraxwerkzeug emulgiert. Anschließend erfolgte eine dreistündige Aushärtung der Mikropartikel in einem 600 ml Becherglas bei 240 U/min (Rührwerk mit Propellerrührer). Die Mikropartikel wurden 3 Minuten bei 2.500 U/min zentrifugiert und die W2-Phase abdekantiert. Die Mikropartikel wurden durch Filtration über eine Nutsche mit einer Glasfritte Pore 4 gewonnen. Schließlich wurden die Mikropartikel mindestens 72 Stunden bei -80°C und 0,01 mbar Vakuum und Nachtrocknung bei 10°C lyophilisiert. Die lyophilisierten Mikropartikel können bei -30°C mit Blaugel in eine PE-Folie eingeschweißt gelagert werden.Different concentrations of chitosan were found in acetic acid solved, and the resulting chitos angel was with various concentrations of lysozyme or sCT W / O / W process encapsulated. The chitosan drug solution was in 5.7 ml dichloromethane solution containing 35% (2 g) PLGA polymer (RG 503 H from Boehringer Ingelheim) contains and for 60 seconds at 13,500 rpm with an SN-10 G Ultraturrax tool emulsified. The W1 / O- or The primary emulsion then became 300 ml of 0.1% aqueous PVA solution (tempered to 5 ° C) and for 60 seconds at 13,500 rpm emulsified in an SN-18 G Ultraturrax tool. This was followed by a three-hour hardening of the Microparticles in a 600 ml beaker at 240 rpm (Agitator with propeller stirrer). The microparticles were 3 Centrifuged at 2500 rpm for minutes and the W2 phase decanted. The microparticles were filtered through won a nutsche with a pore 4 glass frit. Finally the microparticles were stored at -80 ° C and at least 72 hours 0.01 mbar vacuum and post-drying at 10 ° C lyophilized. The Lyophilized microparticles can be mixed with Blaugel in at -30 ° C a PE film can be stored sealed.

a) 100 mg of low molecular chitosan (MW = 150,000) were in 4 ml of 1% acetic acid dissolved and 1.33 g of this chitosan dispersed in 0.5 ml of a 200 mg / ml calcitonin solution. A theoretical active ingredient content of 5.82% used and an encapsulation yield of 63% achieved a practical active ingredient content of 3.66%.
b) There were 110 mg low molecular chitosan and 110 mg Lysozyme lyophilisate in 12 ml 1% acetic acid until Clarity resolved and 3 g of this chitosan lysozyme gel directly dispersed in the organic phase. This matches with based on the mass of a theoretical load Chitosan of 4.85%. It became a theoretical one Active ingredient content of 4.94% used and a Encapsulation yield of 90.8% with a practical Active ingredient content of 4.48% achieved.
c) 33 mg of high molecular chitosan (MW = 600,000) and 33 mg lysozyme dissolved in 12 ml 1% acetic acid and 1 g this chitosan lysozyme gel directly into the organic phase dispersed. This corresponds to one in terms of mass theoretical loading of chitosan of 1.6%. It became a theoretical active ingredient content of 1.54% and an encapsulation yield of 100% with a practical Active ingredient content of 1.57% achieved.
d) 100 mg high molecular chitosan (MW = 600,000) dissolved in 4 ml of 1% acetic acid, and in 2 g of this Chitosan was 124 mg salmon calcitonin (sCT) dispersed. It became a theoretical drug content of 5.68% and an encapsulation yield of 72.42% with a practical active ingredient content of 4.11% reached.
e) There were 25 mg low molecular chitosan and 85 mg Lysozyme lyophilisate dissolved in 1% acetic acid and 2 g of this Chitosanlysozymgels directly into the organic phase dispersed. This corresponds to one in terms of mass theoretical loading of chitosan of 1.18%. It was a theoretical active ingredient content of 3.7% and an encapsulation yield of 80% with a practical Active ingredient content of 2.95% reached.

Bei allen Chargen zeigten sich schon durch den Zusatz von Chitosan in der W1-Phase sehr hohe effektive Wirkstoffbeladungen, sowohl beim Lysozym als auch beim sCT, die sehr viel höher liegen, als die vergleichbaren W/O/W- Ansätze ohne Chitosanzusatz oder auch Ansätze mit dem Zusatz an Gelatine (vgl. Beispiele 2 und 3).In all batches, the addition of Chitosan very effective in the W1 phase Drug loads, both for lysozyme and for sCT, which are much higher than the comparable W / O / W Approaches without the addition of chitosan or approaches with the addition on gelatin (see Examples 2 and 3).

Es wurden weitere Mikropartikel mit noch höherem Chitosanzusatz hergestellt:
Further microparticles with an even higher chitosan addition were produced:

a) 500 mg of low molecular chitosan (Mw = 150000) and 500 mg lysozyme dissolved in 12.5 g 2% acetic acid. 2.75 g this chitosan with the active ingredient it contains dispersed directly in the organic polymer solution and this primary emulsion into an outer phase Double emulsion dispersed. The double emulsion becomes one subjected to water drying. It was a theoretical active ingredient content of 4.6% and an encapsulation yield of 86% with a practical Active ingredient content of 3.95% reached (approach "Lys 230300A ").
b) 1 g of low molecular chitosan (Mw = 150000) and 1 g lysozyme dissolved in 25 g 2% acetic acid. 5.4 g of this Chitos fishing with the active ingredient contained was direct dispersed in the organic polymer solution and this Primary emulsion into the outer phase Double emulsion dispersed. The double emulsion becomes one subjected to water drying. It was a theoretical active ingredient content of 8.3% and an encapsulation yield of 60% with a practical Active ingredient content of 4.98% reached (approach "Lys 230300B ").
c) 500 mg of low molecular chitosan (Mw = 150000) and 500 mg lysozyme dissolved in 12.5 g 2% acetic acid. 8.2 g this chitosan with the active ingredient it contains dispersed directly in the organic polymer solution and this primary emulsion into an outer phase Double emulsion dispersed. The double emulsion becomes one subjected to water drying. It was a theoretical active ingredient content of 11.53% and an encapsulation yield of 74% with a practical Active ingredient content of 8.53% reached. This corresponds to one theoretical loading of chitosan of 11.53% (approach "Lys 230300C").
d) 400 mg of low molecular chitosan (Mw = 150,000) and 135 mg lysozyme dissolved in 12.5 g 2% acetic acid. 6.6 g this chitosan with the active ingredient it contains dispersed directly in the organic polymer solution and this primary emulsion into an outer phase Double emulsion dispersed. The double emulsion becomes one subjected to water drying. It was a theoretical drug content of 8.89% used and an encapsulation yield of 74% with a practical Active ingredient content of 6.57% reached (approach "Lys 230300D ").

Method for determining the drug loading of the microparticles

Die Bestimmung der Wirkstoffbeladung der Mikropartikel erfolgte nach der modifizierten Methode von Sah et al. (A new strategy to determine the actual Protein Content of Poly(lactide-co-glycolide) Microspheres; Journal of Pharmac. Sciences; 1997; 86; (11); S. 1315-1318). Die Mikropartikel werden in einer Lösung von DMSO/0,5% SDS/0,1 N NaOH gelöst, anschließend wird aus dieser Lösung ein BCA-Assay (Lowry et al. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent; J. Biol. Chem.; 193; S. 265-275; 1951) durchgeführt. Damit wird der effektive Beladungsgrad der Mikropartikel bestimmt.Determining the drug loading of the microparticles was carried out according to the modified method of Sah et al. (A new strategy to determine the actual protein content of Poly (lactide-co-glycolide) microspheres; Journal of Pharmac. Sciences; 1997; 86; (11); Pp. 1315-1318). The microparticles are dissolved in a solution of DMSO / 0.5% SDS / 0.1 N NaOH, a BCA assay (Lowry et al. Protein measurement with the Folin Phenol Reagent; J. Biol. Chem .; 193; Pp. 265-275; 1951). So that will the effective degree of loading of the microparticles is determined.

Example 2 W / O / W process with gelatin

Gelöstes Peptid in Wasser oder Puffer wird zu einer Gelatinelösung gegeben und gemischt. Diese Peptid-haltige Gelatinelösung wird zu dem gelösten Polymer in Dichlormethan gegeben und mit herkömmlichen Zahnkranz-Dispergiermaschinen (Utraturrax) oder Hochdruckhomogenisatoren dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.Dissolved peptide in water or buffer becomes one Gelatin solution added and mixed. This peptide-containing Gelatin solution becomes the dissolved polymer in dichloromethane given and with conventional gear rim dispersing machines (Utraturrax) or high-pressure homogenizers dispersed. The further processing is carried out as described in Example 1.

Beispielsweise wurden 0,5 ml einer 20%igen Gelatinelösung mit 0,5 ml einer 200 mg/ml wäßrigen Lysozymlösung gemischt. Zur Herstellung der Gelatinelösung wurde die Gelatine 4 h bei 60°C gelöst und vor der Mikroverkapselung auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Lysozym-haltige Gelatinelösung wurde dann zu dem gelösten Polymer in der organischen Lösung gegeben und wie unter Beispiel 1 beschrieben weiterverarbeitet.For example, 0.5 ml of a 20% gelatin solution was used 0.5 ml of a 200 mg / ml aqueous lysozyme solution mixed. to Preparation of the gelatin solution was the gelatin for 4 h at 60 ° C dissolved and before microencapsulation to room temperature let cool. The lysozyme-containing gelatin solution was then added to the dissolved polymer in the organic solution and processed as described in Example 1.

Hieraus ergab sich bei einer theoretischen Wirkstoffbeladung von 2% Lysozym eine Verkapselungsausbeute von 92% und ein effektiver Wirkstoffgehalt von 1,85%.This resulted in a theoretical drug loading of 2% lysozyme, an encapsulation yield of 92% and a effective drug content of 1.85%.

Example 3 W / O / W process without chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln ohne Chitosanzusatz wurden verschiedene Konzentrationen an Wirkstoff mittels W/O/W- Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben verkapselt, wobei aber kein Chitosan hinzugefügt wurde. Beispielsweise wurden 2 g PLGA-Polymer in 5,7 ml Dichlormethan gelöst und diese Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben weiterverarbeitet.For the production of microparticles without the addition of chitosan different concentrations of active ingredient by means of W / O / W Process encapsulated as described in Example 1, but with no chitosan was added. For example, 2 g PLGA polymer dissolved in 5.7 ml dichloromethane and this solution processed as described in Example 1.

a) 100 mg of lysozyme were dissolved in 1 ml of water and in the dispersed organic polymer solution. It was at a theoretical degree of loading of 5% Encapsulation yield of 57% with an effective one Degree of loading of 2.88% found.
b) 40 mg of lysozyme were dissolved in 1 ml of water and in the dispersed organic polymer solution. It was at a theoretical degree of loading of 2% Encapsulation yield of 95% and an effective one Active ingredient content of 1.9% achieved.

Example 4 B / O / W process with chitosan Approach A

2 g LMW Chitosan (ca. 150.000 Da) und 1 g Lysozym wurden 4 Stunden in 265 ml 2% Essigsäure gelöst. Diese wurden dann mit einem Büchi 190 Mini Spray Dryer versprüht (Flow Indicator: 700, Pump Control: 5, Aspirator Control: 20, Heating Control: 8,5).2 g LMW chitosan (approx. 150,000 Da) and 1 g lysozyme became 4th Hours dissolved in 265 ml of 2% acetic acid. These were then included sprayed with a Büchi 190 Mini Spray Dryer (flow indicator: 700, Pump Control: 5, Aspirator Control: 20, Heating Control: 8.5).

Bei Ansatz A wurden 300 mg des sprühgetrockneten Komplexes in 5,7 ml organische Polymerlösung (2 g RG 503 H in Dichlormethan) dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt.In batch A, 300 mg of the spray-dried complex were in 5.7 ml organic polymer solution (2 g RG 503 H in Dichloromethane) dispersed. The further processing took place as shown for the W / O / W process in Example 1.

Approach B

Bei Ansatz B wurden 1 g LMW Chitosan und 1 g Lysozym in 350 ml 2% Essigsäure gelöst und anschließend unter den gleichen Bedingungen versprüht wie bei Ansatz A. In approach B 1 g LMW chitosan and 1 g lysozyme in 350 ml 2% acetic acid dissolved and then under the same Conditions sprayed as in approach A.

200 mg des sprühgetrockneten Komplexes wurden in die Polymerphase dispergiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren dargestellt.200 mg of the spray-dried complex were placed in the Polymer phase dispersed. The further processing was done as shown for the W / O / W process.

Bei den nach Ansatz A hergestellten Mikropartikeln ergab sich ein effektiver Wirkstoffgehalt von 1,86% Lysozym und eine theoretische Beladung von 8,7% LMW Chitosan. Für die nach Ansatz B hergestellten Mikropartikel ergab sich ein effektiver Wirkstoffgehalt von 2,72% Lysozym und eine theoretische Beladung von 4,54% LMW Chitosan. Die Mikropartikel nach Ansatz A zeigten einen höheren "Burst", eine höhere kontinuierliche Freigabe und höhere Freigaberaten in freigesetzter Peptidmenge pro Zeiteinheit.The microparticles produced according to approach A resulted an effective drug content of 1.86% lysozyme and a theoretical loading of 8.7% LMW chitosan. For the after B-prepared microparticles resulted in an effective Active ingredient content of 2.72% lysozyme and a theoretical Loading of 4.54% LMW chitosan. The microparticles by approach A showed a higher "burst", a higher continuous Release and higher release rates in the amount of peptide released per unit of time.

Vergleicht man den sprühgetrockneten Chitosan-Lysozymkomplex im S/O/W-Verfahren gegen den Chitosanzusatz im W/O/W- Verfahren, so sieht man, daß es hier zu einer vergleichbaren initialen Freisetzung kommt, aber der sprühgetrocknete Komplex ca. 6% Wirkstoff zusätzlich freisetzt bis zu einer Marke von 600 h (siehe Fig. 1a) S/O/W mit Chitosan und W/O/W mit Chitosan), obwohl hier der effektive Wirkstoffgehalt nur bei 1,86% gegenüber 4,48% beim Chitosanzusatz im W/O/W liegt. Um die Zunahme der Beladung beim S/O/W-Verfahren beurteilen zu können, muß man dies mit Chargen ohne Chitosan vergleichen. Dort liegen die Verkapselungsausbeuten beim Standard-S/O/W nur zwischen 20 und 50%, und es wurden keine effektiven Beladungsgrade über 1% erzielt. Dies ist bedingt durch die hohen Verluste während der Herstellung. Mit dem Zusatz von sprühgetrocknetem Chitosan-Lysozym konnten hier die Verkapselungsausbeuten auf 69% gesteigert werden, bei Erzielung einer effektiven Wirkstoffbeladung von bis zu 2,72%. Vergleicht man die Zusätze von Chitosan in Bezug auf die Gesamtmasse an Polymer und Wirkstoff, so ergibt sich für den 300 mg Chitosan-Lysozymkomplex eine theoretische Beladung von 8,7% Chitosan und für den 200 mg Chitosan-Lys-Komplex eine theoretische Beladung von 4,54%. Im W/O/W-Verfahren waren dies ca. 6% Chitosan. If you compare the spray-dried chitosan-lysozyme complex in the S / O / W process with the chitosan additive in the W / O / W process, you can see that there is a comparable initial release, but the spray-dried complex has about 6% active ingredient additionally releases up to a mark of 600 h (see FIG. 1a) S / O / W with chitosan and W / O / W with chitosan), although here the effective active substance content is only 1.86% compared to 4.48% with the addition of chitosan lies in the W / O / W. To be able to assess the increase in loading in the S / O / W process, this must be compared with batches without chitosan. There, the encapsulation yields for standard S / O / W are only between 20 and 50%, and no effective loading levels above 1% were achieved. This is due to the high losses during manufacture. With the addition of spray-dried chitosan lysozyme, the encapsulation yields could be increased to 69%, while achieving an effective drug loading of up to 2.72%. If you compare the additions of chitosan in relation to the total mass of polymer and active ingredient, the theoretical loading for the 300 mg chitosan-lysozyme complex is 8.7% chitosan and the theoretical loading for the 200 mg chitosan-lys complex , 54%. In the W / O / W process, this was approximately 6% chitosan.

Example 5 B / O / W process without chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln nach dem S/O/W-Verfahren ohne Chitosanzusatz würde der Wirkstoff in lyophilisierter bzw. sprühgetrockneter Form wie in Beispiel 4 beschrieben in eine organische Polymerlösung dispergiert, wobei aber kein Chitosanzusatz erfolgte.For the production of microparticles using the S / O / W process Without the addition of chitosan, the active ingredient would be lyophilized or spray-dried form as described in Example 4 in dispersed an organic polymer solution, but none Chitosan was added.

Es wurden 40 mg Lysozym in 2 g RG 503 H (5,7 ml Dichlormethan) dispergiert. Die weitere Verarbeitung erfolgt wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt. Dabei wurde bei einer theoretischen Beladung von 2% eine Verkapselungsausbeute von 39% und eine effektive Wirkstoffbeladung von 0,8% erzielt. Diese niedrigen Verkapselungsausbeuten sind durch die hohen Verluste bei dieser Herstellungsvariante bedingt.40 mg of lysozyme in 2 g of RG 503 H (5.7 ml of dichloromethane) dispersed. The further processing is the same as for the W / O / W method shown in Example 1. It was at an encapsulation yield of a theoretical loading of 2% of 39% and an effective drug load of 0.8%. These low encapsulation yields are due to the high ones Losses caused by this manufacturing variant.

Example 6 ( Fig. 1)

a) Five different microparticle preparations were made with lysozyme:

- According to the W / O / W process with chitosan according to Example 1b)

- According to the W / O / W process without chitosan according to Example 3b)

- According to the W / O / W process with gelatin according to Example 2

- According to the S / O / W process with chitosan according to Example 4, approach A

- According to the S / O / W process without chitosan according to Example 5

Es wurde die kumulative Freisetzung von Lysozym in % des gesamten in den Mikropartikeln enthaltenen Lysozyms untersucht.The cumulative release of lysozyme in% of the total lysozyme contained in the microparticles examined.

Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den Mikropartikeln wurden je 20 mg Mikropartikel eingewogen (je Charge ein Dreifachansatz). Die Mikropartikel wurden in Pyrexgläser, die einen Schottstopfen GL18-Gewinde mit Teflondichtung aufweisen, gegeben. Die Mikropartikel wurden mit je 5 ml Mac.Ilvaine- Whiting Freisetzungspuffer (Zusammensetzung s. u.) versetzt. To determine the drug release from the microparticles 20 mg microparticles were weighed out (one for each batch Triplicate). The microparticles were in pyrex glasses that have a bulkhead plug GL18 thread with Teflon seal, given. The microparticles were each with 5 ml Mac.Ilvaine- Whiting release buffer (composition see below) added.

Anschließend wurden die Proben in das Freisetzungsgerät gesetzt (6 U/min. 37°C). Die erste Probe wurde nach circa zwei Stunden entnommen, die zweite nach circa sechs Stunden, die dritte nach circa 24 Stunden, die vierte nach 48 Stunden und die weiteren im Abstand von jeweils drei Tagen. Die Pyrexgläser wurden in der Heraeuszentrifuge bei 3000 U/min 3 Minuten zentrifugiert, anschließend wurde mit einer Pasteurpipette der überstehende Puffer möglichst vollständig abgezogen. Danach wurde wiederum 5 ml Puffer in die Gläser gegeben, und die Proben wurden wieder ins Freisetzungsgerät eingesetzt. Der Puffer sollte vor Licht geschützt und bei 4°C im Kühlschrank gelagert werden.The samples were then placed in the release device set (6 rpm. 37 ° C). The first sample was made after about two Hours taken, the second after about six hours, the third after approximately 24 hours, fourth after 48 hours and the others every three days. The Pyrex glasses were placed in the Heraeus centrifuge at 3000 rpm 3 Centrifuged for minutes, followed by a Pasteur pipette of the protruding buffer as completely as possible deducted. Then 5 ml of buffer was again in the glasses and the samples were returned to the release device used. The buffer should be protected from light and at 4 ° C be stored in the refrigerator.

Zusammensetzung des Mac.Ilvaine-Whiting Freisetzungspuffers:
94 ml 0,1 M Zitronensäure + 906 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat
0,01% Tween 20 für die Molekularbiologie
0,025% Natriumazid
ad 1,0 l destilliertes WasserComposition of the Mac.Ilvaine-Whiting release buffer:
94 ml 0.1 M citric acid + 906 ml 0.2 M disodium hydrogen phosphate
0.01% Tween 20 for molecular biology
0.025% sodium azide
ad 1.0 l distilled water

Der pH muß gegebenenfalls mit 0,1 M NaOH auf pH 7,4 eingestellt werden.The pH may have to be adjusted to 7.4 with 0.1 M NaOH can be set.

Die abpipettierte Peptidlösung aus den Eppendorf-Gefäßen oder den Pyrexgläsern wurde in 4 ml HPLC-Vials mit durchstechbarer Teflondichtung und Drehverschluß überführt und entweder sofort per HPLC analysiert oder bei -30°C aufbewahrt. Die Proben wurden dann vor der HPLC-Analyse zwei Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut und dabei mehrfach per Hand kurz geschüttelt. Es wurde auf eine vollständig klare Lösung nach dem Auftauen geachtet.The pipetted peptide solution from the Eppendorf tubes or the Pyrex glasses were pierced in 4 ml HPLC vials Teflon seal and twist lock transferred and either immediately analyzed by HPLC or stored at -30 ° C. Samples were then two hours before HPLC analysis Room temperature thawed and briefly several times by hand shaken. It was followed by a completely clear solution paid attention to thawing.

Die HPLC-Analyse erfolgte auf einer Waters HPLC mit W600- Pumpe, 717 Autosampler, Satin 474 Fluoreszenzdetektor und Millenium 3.15 Software. Die Einstellungen für Lysozym waren:
The HPLC analysis was carried out on a Waters HPLC with W600 pump, 717 autosampler, Satin 474 fluorescence detector and Millenium 3.15 software. The settings for lysozyme were:

- flow rate 1 ml / min
Buffer A = 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) in water,
Buffer B = 0.1% TFA in acetonitrile
- Gradient: 80% A, 20% B in 10 minutes to 60% A, 40% B; up to 12 minutes on 80% A, 20% B
Excitation wavelength = 280 nm,
Emission wavelength = 340 nm at gain = 100,
256 Attention and STD
- Column oven temperature control 40 ° C
- Column: TSK Gel RP 18, NP; 5 µm; 35 mm × 4.6 mm
- The fluxes were previously made using helium or ultrasound degassed and degassed during analysis.
- Standard series of 0.05 to 4 µg were used for each sample set Lysozyme / ml release buffer at 100 µl Injection volume and 10 to 100 µg lysozyme / ml Release buffer at 10 µl injection volume analyzed as standard

Bei der Analyse von Calcitonin wurde entsprechend vorgegangen, mit folgenden Modifikationen:
The analysis of calcitonin was carried out accordingly, with the following modifications:

Excitation wavelength = 280 nm,
Emission wavelength = 330 nm, gain = 1000
Gradient: 80% A, 20% B; to 60% A, 40% B in 5 minutes; Hold for 1 minute; up to 7.5 minutes on 50% A, 50% B

Das Ergebnis ist in den Fig. 1a) und 1b) dargestellt. Fig. 1b) zeigt einen vergrößerten Ausschnitt von Fig. 1a). Durch den Zusatz von Chitosan zu den Mikropartikeln ist die Wirkstofffreisetzung während der sogenannten "Burst"-Phase im Vergleich zu Mikropartikeln mit Gelatine oder ohne Zusatz deutlich erniedrigt (Fig. 1b)). Außerdem findet im weiteren Verlauf der Freisetzung während der sogenannten "Lag"-Phase eine konstante Wirkstoffabgabe mit einer Kinetik erster Ordnung aus den Mikropartikeln mit Chitosanzusatz statt (Fig. 1a)). Demgegenüber ist die Wirkstofffreisetzung bei Mikropartikeln ohne Zusatz von Chitosan während der "Lag"- Phase vernachlässigbar gering. Es findet nahezu keine meßbare Wirkstofffreisetzung statt. The result is shown in FIGS. 1a) and 1b). Fig. 1b) shows an enlarged section of Fig. 1a). By adding chitosan to the microparticles, the active substance release during the so-called "burst" phase is significantly reduced compared to microparticles with gelatin or without addition ( FIG. 1b)). In addition, during the further course of the release during the so-called "lag" phase, there is a constant release of active substance with first-order kinetics from the microparticles with the addition of chitosan ( FIG. 1a)). In contrast, the active ingredient release in microparticles without the addition of chitosan during the "lag" phase is negligible. There is almost no measurable release of active substance.

a) The cumulative release of active ingredient in% of the total active ingredient contained in the microparticles was also determined for the microparticles prepared according to Example 1f) to 1). The result is shown in Fig. 1c). Here, too, the microparticles according to the invention exhibit first-order release kinetics in the "lag phase".

Example 7 ( Figs. 2, 3, 4 and 5)

Es wurden fünf verschiedene Mikropartikelpräparationen wie in Beispiel 6a) beschrieben hergestellt.There were five different microparticle preparations as in Example 6a) prepared.

Es wurde die insgesamt freigesetzte Menge an Wirkstoff nach 100 h (Fig. 2 und 3) und nach 500 h (Fig. 4 und 5) bestimmt.The total amount of active ingredient released was determined after 100 h ( FIGS. 2 and 3) and after 500 h ( FIGS. 4 and 5).

Beim Vergleich der durch W/O/W-Verfahren hergestellten Mikropartikel zeigt sich, daß Mikropartikel mit Chitosan nach 100 h (Fig. 2) und nach 500 h (Fig. 4) eine größere Wirkstoffmenge freigesetzt haben als Mikropartikel ohne Chitosan oder Mikropartikel mit Gelatine.A comparison of the microparticles produced by W / O / W processes shows that microparticles with chitosan released a larger amount of active substance after 100 h ( FIG. 2) and after 500 h ( FIG. 4) than microparticles without chitosan or microparticles with gelatin ,

Auch bei nach dem S/O/W-Verfahren hergestellten Mikropartikeln zeigen die Partikel mit Chitosan eine höhere Menge an insgesamt freigesetztem Wirkstoff als Partikel ohne Chitosan. Das gilt sowohl für die Freisetzung nach 100 h (Fig. 3) als auch nach 500 h (Fig. 5).Even with microparticles produced by the S / O / W process, the particles with chitosan show a higher amount of active substance released overall than particles without chitosan. This applies both to the release after 100 h ( FIG. 3) and after 500 h ( FIG. 5).

Example 8 W / O / W process with chitosan

Verschiedene Konzentrationen an Chitosan wurden in Essigsäure gelöst, und das entstandene Chitosangel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an DNA-Lösung mittels W/O/W- Verfahren verkapselt. Es wurden 1 g Chitosan und 100 mg Plasmid in 25 g 1% Essigsäure und/oder Pufferlösung, wie z. B. TRIS-Puffer oder TRIS-EDTA-Puffer, gelöst. 5 g dieses Chitosangels mit dem enthaltenen Wirkstoff wurde direkt in die organische Polymerlösung dispergiert und diese Primäremulsion in die äußere Phase zu einer Doppelemulsion dispergiert, entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 1.Different concentrations of chitosan were found in acetic acid solved, and the resulting chitos angel was with different concentrations of DNA solution using W / O / W Process encapsulated. There were 1 g chitosan and 100 mg Plasmid in 25 g of 1% acetic acid and / or buffer solution, such as. B. TRIS buffer or TRIS-EDTA buffer, solved. 5 g of this Chitosangels with the active ingredient contained was directly in the dispersed organic polymer solution and this primary emulsion dispersed in the outer phase to form a double emulsion, according to the procedure of Example 1.

Example 9 B / O / W process with chitosan

Zur Herstellung von Mikropartikeln nach dem S/O/W-Verfahren mit Chitosanzusatz wurde DNA zusammen mit Chitosan gelöst und anschließend versprüht. Die weitere Verarbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren in Beispiel 1 dargestellt. Dabei kamen die Einstellungen des Büchi Mini Spray Dryers aus Beispiel 4 Ansatz A zum Einsatz. Es wurden 1 g Chitosan und 100 mg Plasmid in 350 ml 2% Essigsäure gelöst und anschließend unter den gleichen Bedingungen versprüht, wie in Beispiel 4, Ansatz A. 200 mg des sprühgetrockneten Komplexes wurden in die organische Polymerphase dispergiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für das W/O/W-Verfahren dargestellt.For the production of microparticles using the S / O / W process with the addition of chitosan, DNA was dissolved together with chitosan and then sprayed. The further processing was done as for the W / O / W process shown in Example 1. It came the settings of the Büchi Mini Spray Dryer from example 4 Approach A for use. There were 1 g chitosan and 100 mg Plasmid dissolved in 350 ml of 2% acetic acid and then under sprayed under the same conditions as in Example 4, approach A. 200 mg of the spray-dried complex were in the dispersed organic polymer phase. The further processing was carried out as shown for the W / O / W process.

Claims

1. Microparticles for the delayed release of a Active ingredient containing a polymer matrix, at least one physiologically active ingredient and chitosan, the Polymer matrix not from chitosan, a derivative thereof, or a chitosan-alginate complex.

2. Microparticles according to claim 1, characterized in that that chitosan with a molecular weight of 10,000 to 2,000,000 da is included.

3. Microparticles according to claim 1 or 2, characterized characterized in that chitosan with a molecular weight of 40,000 to 400,000 Da is included.

4. Microparticle according to one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the weight ratio of physiologically active ingredient to chitosan is 1: 0.01 to 1:25.

5. Microparticles according to one of claims 1 to 4, characterized characterized in that the weight ratio of physiologically active ingredient for chitosan is 1: 0.1 to 1:10.

6. Microparticles according to one of the preceding claims, characterized in that the polymer matrix essentially from polylactic acid, polyglycolic acid, a lactic acid Glycolic acid copolymer or a mixture of at least two of the components mentioned.

7. Microparticles according to one of the preceding claims, characterized in that as physiologically more active Active ingredient heparin, a nucleic acid or a peptide or Protein is included.

8. Microparticles according to one of the preceding claims, characterized in that the active ingredient is calcitonin, Erythropoietin, LHRH or NGF is included.

9. A process for the preparation of microparticles for the delayed release of an active ingredient, characterized in that

a) a composition containing the active ingredient and chitosan is provided,
b) the composition containing the active ingredient and chitosan is added to an organic solution of a polymer and is dispersed therein,
c) the resulting emulsion or dispersion is placed in an outer phase and dispersed therein.

10. The method according to claim 9, characterized in that Chitosan with a molecular weight of 10,000 to 2,000,000 Da is used.

11. The method according to claim 9 or 10, characterized characterized in that the weight ratio of physiologically active ingredient to chitosan is 1: 0.01 to 1:25.

12. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized characterized in that the polymer is polylactic acid, Polyglycolic acid or a lactic acid-glycolic acid copolymer is used.

13. The method according to any one of claims 9 to 12, characterized characterized in that the organic solution of a polymer as Contains solvent dichloromethane.

14. The method according to any one of claims 9 to 13, characterized characterized in that the polymer concentration in the organic solution of a polymer is 5 to 50% (w / v).

15. The method according to any one of claims 9 to 14, characterized characterized in that an aqueous solution as the outer phase is used.

16. The method according to claim 15, characterized in that the aqueous outer phase is an emulsifier and / or Contains protective colloid.

17. The method according to claim 16, characterized in that the protective colloid is selected from the group consisting of Polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone and polyethylene glycol.

18. The method according to any one of claims 9 to 17, characterized characterized in that the composition containing the active ingredient and Chitosan contains, is an aqueous solution.

19. The method according to any one of claims 9 to 17, characterized characterized in that the composition containing the active ingredient and Chitosan contains, consists of solids.

20. The method according to claim 19, wherein the composition, which contains the active ingredient and chitosan is that a solution containing the active ingredient and chitosan is spray dried.

21. The method according to any one of claims 18 to 20, characterized characterized in that the outer phase is a non-aqueous phase which contains an emulsifier and / or a protective colloid.

22. The method according to claim 21, characterized in that the outer phase contains Span, Tween or Brij.

23. Medicament containing microparticles according to one of the Claims 1 to 8.