DE1011577B

DE1011577B - Procedure for cleaning a relaxin preparation

Info

Publication number: DE1011577B
Application number: DEW14632A
Authority: DE
Inventors: George E Phillips
Original assignee: Warner Lambert Pharmaceutical Co
Current assignee: Warner Lambert Co LLC
Priority date: 1953-08-11
Filing date: 1954-08-10
Publication date: 1957-07-04

Description

Verfahren zur Reinigung eines Relaxinpräparates Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von Relaxinpräparaten.Method for Purifying a Relaxin Preparation The invention relates to an improved method for purifying relaxin supplements.

Relaxin ist ein Schwangerschaftshormon, das in der Medizin großem Interesse begegnet. Seine chemische Natur ist nicht bekannt. Wahrscheinlich besteht es aus einem oder mehreren Eiweißstoffen. In der vorliegenden Beschreibung wird es einfach als Eiweißstoff bezeichnet.Relaxin is a pregnancy hormone that is great in medicine Encountered interest. Its chemical nature is unknown. Probably exists it from one or more proteins. In the present description, it is simply referred to as protein.

Relaxin wird bisher im allgemeinen durch Extraktion aus Ovarien trächtiger Schweine in roher Form erhalten. Die Reinigung der Relaxinextrakte erfolgt gewöhnlich mit Hilfe von Lösungs- und Fällungsmitteln. Diese Verfahren sind zeitraubend, unwirtschaftlich und ergeben schlechte Ausbeuten.So far, relaxin has generally become more pregnant by extraction from ovaries Pigs received in raw form. Purification of the relaxin extracts is usually done with the help of solvents and precipitants. These methods are time consuming, inefficient and give poor yields.

Es wurde nun gefunden, daß Relaxinpräparate (einschließlich der Extrakte und der nach den bisherigen Verfahren gereinigten Präparate) nach einem einfachen, schnellen Verfahren gereinigt werden können, das viel billiger und wirtschaftlicher ist als die bisherige Arbeitsweise. Nach dem vorliegenden Verfahren bringt man eine wäßrige Lösung eines Relaxinpräparates mit einem in geeigneter Weise gepufferten Kationenaustauschharz vom Carbonsäuretyp in Berührung.It has now been found that relaxin preparations (including the extracts and the preparations cleaned according to the previous procedures) after a simple, quick process can be cleaned that much cheaper and more economical is than the previous way of working. According to the present procedure, one brings a aqueous solution of a relaxin preparation with a suitably buffered one Carboxylic acid type cation exchange resin in contact.

Relaxin ist gewöhnlich mit verschiedenen Eiweißstoffen verunreinigt, von denen einige einen isoelektrischen Punkt aufweisen, der über dem des Relaxins liegt, während andere unter dem des Relaxins liegende isoelektrische Punkte haben. Die Eiweißstoffe in einem Relaxinpräparat, deren isoelektrische Punkte über dem des Relaxins liegen, können dadurch entfernt werden, daß eine wäßrige Lösung des Präparates auf ein etwas über dem isoelektrischen Punkt des Relaxins liegendes pjj eingestellt und die so eingestellte Lösung mit einem Kationenaustauschharz der obengenannten Art, das bis zum gleichen pZ gepuffert ist, z-asanu'nelige#bracht wird. Hierbei werden nur, die Eiweißstoffe,- deren isoelektrischer Punkt wesentlichhöher als der des Relaxins liegt und die als Kationen vorliegen, von dem Harz adsorbiert. Man kann das Relaxin dann gewinnen, indem man das Harz mit der Pufferlösung wäscht, die zur Vorbehandlung des Harzes benutzt wurde.Relaxin is usually contaminated with various proteins, some of which have an isoelectric point above that of relaxin while others have isoelectric points below that of relaxin. The proteins in a relaxin preparation whose isoelectric points are above the of relaxin can be removed by adding an aqueous solution of the Preparation to a pjj lying slightly above the isoelectric point of relaxin and the thus adjusted solution with a cation exchange resin of the above Species that is buffered up to the same pZ, z-asanu'nelige # is brought. Here only, the protein substances - their isoelectric point are considerably higher than that of the relaxin and which are present as cations, adsorbed by the resin. Man the relaxin can then be obtained by washing the resin with the buffer solution, which was used to pretreat the resin.

In der gleichen Weise kann man aus dem Relaxinpräparat diejenigen Eiweißstoffe entfernen, deren isoelektrischer Punkt unter dem des Relaxins liegt. In diesem Fall wird eine wäßrige Lösung des Präparates auf ein etwas unter dem isoelektrischen Punkt des Relaxins liegendes pl, eingestellt und die Lösung dann ebenfalls mit einem Kationenaustauschharz der genannten Art zusammengebracht,- das bis zum gleichen pl, gepuffert wurde, worauf das Relaxin von dem Harz adsorbiert wird. Die Eiweißstoffe mit wesentlich unter dem des Relaxins liegenden isoelektrischen Punkten können dann aus der Säule durcb-Waschen mit Wasser entfernt werden, weil sie in der Hauptsache gls Anionen vorliegen. Anschließend kann das adsorbierte Relaxin durch Eluieren aus dem Harz gewonnen werden, indem man letzteres mit einer verdünnten Säure behandelt. Diese beiden Operationen können getrennt voneinander durchgeführt werden. Im vorliegenden Fall werden sie bevorzugt unmittelbar nacheinander durchgeführt.In the same way you can get those from the relaxin supplement Remove proteins whose isoelectric point is below that of relaxin. In this case, an aqueous solution of the preparation is slightly below the isoelectric Point of relaxin lying pl, set and the solution then also with a Cation exchange resin of the type mentioned brought together - that up to the same pl, whereupon the relaxin is adsorbed by the resin. The protein substances with isoelectric points that are significantly below that of relaxin, then can be removed from the column by washing with water, because they are in the main gls anions are present. The adsorbed relaxin can then be eluted can be obtained from the resin by treating the latter with a dilute acid. These two operations can be performed separately from each other. In the present In this case, they are preferably carried out in immediate succession.

Als lonenaustauschharze werden vorzugsweise Mischpolymerisate von Acryl- oder Methacrylsäure mit Divinylbenzol, in denen das Divinylbenzol 2,5 bis 5 % der Harzmasse ausmacht, benutzt (vgl. z. B. die USA.-Patentschriften 2319359, 23337541 2340110, 2340111 und 2541420).The ion exchange resins used are preferably copolymers of acrylic or methacrylic acid with divinylbenzene, in which the divinylbenzene makes up 2.5 to 5% of the resin composition (cf., for example, US patents 2319359, 23337541 2340110, 2340111 and 2541420).

Wenn das Relaxinpräparat vor oder nach der Behandlung mit dem Kationenaustauschharz der genannten Art mit Elektrolyten verunreinigt ist, werden, letztere vorzugsweise entweder durch Dialvse oder durch Behandlung einer wäßrigen Lösung des Relaxinpräparates mit einem Kationenaustauschharz des Sulfonsäuretyps (Säureform) entfernt, das anorganische Kationen adsorbiert, aber praktisch alle in dem Präparat enthaltenen Eiweißstoffe unadsorbiert zurückläßt. Die in der abfließenden Flüssigkeit infolge der Abtrennung der anorganischen Kationen freigesetzten Säuren können durch Behandlung dieser Flüssigkeit mit einem Anionenaustauschharz in der üblichen Weise entfernt werden, bis das p,1 der abfließenden Flüssigkeit von dem anfangs niedrigen Wert auf 5 gestiegen ist. Die Relaxinfraktionen, aus denen die Elektrolyte auf idiese Weise entfernt worden sind, werden dann durch Ausfrieren getrocknet, wodurch gereinigtes Relaxin in fester Form anfällt, das zu pharmazeutischen Präparaten verarbeitet werden kann. Beim vorliegenden Verfahren können das Kationenaustauschharz und die Relaxinlösung miteinander in Berührung gebracht werden, indem man entweder eine Suspension des Harzes in die Relaxinlösung schüttelt (Ansatzverfahren) oder indem man die Relaxinlösung durch eine Säule des in einer Röhre enthaltenen Harzes fließen läßt (Säulenverfahren). Obwohl das Ansatzverfahren oft schneller arbeitet als das Säulenverfahren, gibt man letzterem den Vorzug, weil eine Säule bei einer gegebenen Harzmenge ein größeres Austauschvermögen besitzt.If the relaxin preparation is contaminated with electrolytes before or after the treatment with the cation exchange resin of the type mentioned, the latter are preferably removed either by dialysis or by treating an aqueous solution of the relaxin preparation with a cation exchange resin of the sulfonic acid type (acid form), which adsorbs inorganic cations, but leaves practically all of the protein substances contained in the preparation unadsorbed. The acids released in the outflowing liquid as a result of the separation of the inorganic cations can be removed by treating this liquid with an anion exchange resin in the usual manner until the p.1 of the outflowing liquid has risen from the initially low value to 5 . The relaxin fractions, from which the electrolytes have been removed in this way, are then dried by freezing, whereby purified relaxin is obtained in solid form, which can be processed into pharmaceutical preparations. In the present method, the cation exchange resin and the relaxin solution can be brought into contact with one another by either shaking a suspension of the resin in the relaxin solution (batch method) or by allowing the relaxin solution to flow through a column of the resin contained in a tube (column method). Although the batch process is often faster than the column process, the latter is preferred because a column has greater exchange capacity for a given amount of resin.

Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren in einem weiten pl,-Bereich durchgeführt werden kann, geht aus den Ergebnissen der folgenden Versuche hervor, daß die Reinigung des Relaxins bei gewissen p11-Werten gründlicher ist als bei anderen.Although the inventive method in a wide pl, range can be carried out, emerges from the results of the following experiments, that the purification of the relaxin is more thorough with certain p11 values than with others.

In den folgenden Versuchen wurden Anteile eines Ionenaustauschharzes der obengenannten Art mit gepufferten Relaxinlösungen mit verschiedenen pa-Werten gerührt. Diese Harzanteile wurden mit Wasser gewaschen, um überschüssige Pufferlösungen herauszuspülen, und dann in ein Austauscherrohr gegeben. Die Lösung des Relaxinpräparates wurde stets auf das gleiche pl, eingestellt, das die Pufferlösung aufwies, mit der das Harz behandelt worden war. Die eingestellte Lösung wurde dann durch die Harzsäule geschickt. Alle Stoffe, die nicht von der Säule adsorbiert wurden, konnten anschließend mit Wasser aus der Säule herausgewaschen werden. Wenn das pl, über 7 liegt, empfiehlt es sich, die- Säule mit der Pufferlösung zu waschen, mit der das Harz vorbehandelt wurde. Das von dem Harz adsorbierte Material konnte aus diesem eluiert werden, indem das Harz mit einer verdünnten Säure behandelt wurde.In the following experiments, portions of an ion exchange resin of the type mentioned above were stirred with buffered relaxin solutions with various pa values. These resin portions were washed with water to rinse out excess buffer solutions and then placed in an exchanger tube. The solution of the relaxin preparation was always adjusted to the same p1 that had the buffer solution with which the resin had been treated. The adjusted solution was then passed through the resin column. All substances that were not adsorbed by the column could then be washed out of the column with water. If the pI is above 7 , it is advisable to wash the column with the buffer solution with which the resin was pretreated. The matter adsorbed by the resin could be eluted therefrom by treating the resin with a dilute acid.

Während der Durchführung des Säulenverfahrens wurde die unten aus der Säule austretende Flüssigkeit in abgemessenen Mengen von 1 bis 3 ccm in einzelnen Röhren aufgefangen. Die so gesammelten Fraktionen wurden untersucht, um den Grad der Reinigung des Relaxinpräparates zu bestimmen.While the column procedure was being carried out, the liquid emerging from the bottom of the column was collected in measured amounts of 1 to 3 cc in individual tubes. The fractions collected in this way were examined in order to determine the degree of purification of the relaxin preparation.

Der Prozentsatz Ausgangsmaterial in jeder Fraktion wird in Prozent des gesamten Stickstoffgehaltes des Ausgangsmaterials ausgedrückt. Der Stickstoffgehalt jeder Fraktion wurde indirekt wie folgt bestimmt. Die optische Dichte einer gegebenen Fraktion bei 275 mp, und die des Ausgangsmaterials wurden in einem Beckman-Spektrophotometer gemessen. Das Verhältnis dieser beiden Werte mußte dem Verhältnis der Stickstoffgehalte entsprechen. Da ferner die optimale Dichte einer Eiweißlösung der Konzentration dieser Lösung proportional ist, muß der Prozentsatz an Gesamtstickstoff in einer gegebenen Fraktion praktisch gleich dem Prozentsatz des',!: Ausgangsmaterials in dieser Fraktion sein. Einzehie,1111, Fraktionen wurden ferner auf die biologische Wirksamkeit des Relaxins untersucht, indem festgestellt wurde, wieweit sie die normale Kontraktion isolierter Uterusstreifen der Maus verhindern konnten bzw. wie sie sich in bezug auf die Relaxation der Meerschweinehensymphysis in vivo verhielten. Beispiel I Eine bestimmte Menge eines kömigen Kationenaustauschharzes vom Carbonsäuretyp, das aus einem Mischpolymerisat von Methacrylsäure mit Divinylbenzol (mit etwa 511/, Divinylbenzol) bestand, wurde mit einer Pufferlösung bei pl, 4,5 verrührt; dann wurde die Puffer-, lösung abgegossen und das Harz so in ein Austauscherrohr von 2 cm Durchmesser eingefüllt, daß eine 10 cm hohe Säule erhalten wurde. Anschließend wurden 5 ccm' einer wäßrigen Lösung eines Relaxinpräparates, das 4000 Meerschweincheneinheiten Relaxin je ccm enthielt, auf pl, 4,5 eingestellt und in die Säule mit dem Ionenaustauschharz gegeben. Nach der Relaxinlösung wurden etwa 50 ccm der Pufferlösung durch die Säule geschickt", worauf diese mit etwa 100 ccm 0,5 n-Salzsäure eInii wurde.The percentage of starting material in each fraction is expressed as a percentage of the total nitrogen content of the starting material. The nitrogen content E ach group was determined indirectly as follows. The optical density of a given fraction at 275 mp and that of the starting material were measured in a Beckman spectrophotometer. The ratio of these two values had to correspond to the ratio of the nitrogen contents. Furthermore, since the optimum density of a protein solution is proportional to the concentration of that solution, the percentage of total nitrogen in a given fraction must be practically equal to the percentage of the starting material in that fraction. Individual fractions, 1111, were also examined for the biological effectiveness of relaxin by determining the extent to which they prevented the normal contraction of isolated mouse uterine strips or how they behaved in relation to the relaxation of guinea pig symphysis in vivo. EXAMPLE I A certain amount of a granular cation exchange resin of the carboxylic acid type, which consisted of a copolymer of methacrylic acid with divinylbenzene (with about 511 /, divinylbenzene), was stirred with a buffer solution at p1.4.5; then the buffer solution was poured off and the resin was poured into an exchanger tube 2 cm in diameter in such a way that a 10 cm high column was obtained. Then 5 ccm 'of an aqueous solution of a relaxin preparation containing 4,000 guinea pig units of relaxin per ccm was adjusted to p1.4.5 and placed in the column with the ion exchange resin. After the relaxin were about 50 cc of the buffer solution passed through the column "to which this 0.5 N hydrochloric acid eInii was charged with about 100 cc.

Während des ganzen Verfahrens wurde die unten aus der Säule austretende Flüssigkeit in abgemessenen Mengen von 1 bis 3 ccm in einzelnen Röhrchen aufgefangen. Diese Fraktionen wurden untersucht, um den Grad der Reinigung festzustellen.Throughout the procedure, the liquid emerging from the bottom of the column was collected in measured amounts of 1 to 3 cc in individual tubes. These fractions were examined to determine the degree of purification.

Aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen geht hervor, daß das biologisch wirksame Material von dern'! Harz adsorbiert und durch Salzsäure eluiert werden kann, daß aber auch eine kleine Menge biologisch unwirksamer, Eiweißstoffe von dem Harz adsorbiert wurde. Tabelle 1 Röhrchen In-vivo-Relaxation der Unterbindung der INTr. Gesamt-N Meerschweinchensymphysis Kontraktion von Mäuseuterusstreifen Austauschphase (pl, 4,5) ......... 2 0,50 7 0,37 inaktiv 13 0,47 inaktiv 17 0,47 inaktiv 24 0,86 Elutionsphase mit HCI ............ 32 1,1 inaktiv 40 0,76 inaktiv 43 0,31 inaktiv 48 0,41 inaktiv 54 0,35 inaktiv 61 0,74 inaktiv 70 1,9 sehr aktiv 72 3,4 sehr aktiv 73 3,7 sehr aktiv 89 1,3 sehr aktiv 1 J 93 1,4 sehr aktiv Beispiel II Es wurde wie im Beispiel I verfahren, nur wurde das p,1 der zu reinigenden Relaxinlösung und das des gepufferten Harzes auf 5,0 eingestellt.From the results shown in Table I it can be seen that the biologically active material is from dern '! Resin adsorbed and can be eluted by hydrochloric acid, but that also a small amount of biologically inactive proteins was adsorbed by the resin. Table 1 In vivo relaxation of the ligation of the tubes INTr. Total-N guinea pig symphysis contraction of Mousse of eucalyptus Exchange phase (pl, 4.5) ......... 2 0.50 7 0.37 inactive 13 0.47 inactive 17 0.47 inactive 24 0.86 Elution phase with HCI ............ 32 1.1 inactive 40 0.76 inactive 43 0.31 inactive 48 0.41 inactive 54 0.35 inactive 61 0.74 inactive 70 1.9 very active 72 3.4 very active 73 3.7 very active 89 1.3 very active 1 y 93 1.4 very active Example II The procedure was as in Example I, except that the p.1 of the relaxin solution to be purified and that of the buffered resin were set to 5.0 .

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt. Beim Vergleich mit Tabelle I ergibt sich, daß eine bessere Trennung der Eiweißstoffe in zwei Fraktionen erreicht wurde. Tabelle II Austauschphase (pH 5,0) Elutionsphase mit H CI ! 0 Röhrchen Nr. /0 G Röhrchen Nr. 1 010 Gesamt-N 4 1,12 31 1,54 6 1,61 34 0,64 10 2,22 37 1,17 13 2,09 40 1127 15 1,21 46 0,80 Austauschphase (pii 5,0) Elutionsphase nüt HCI Röhrchen Nr. Röhrchen Nr. Gesamt-N 17 0,75 48 1,48 19 0,98 50 2,41 23 2,09 54 2,41 25 2,77 57 1,31 28 2,01 60 1,19 66 6,88 Beispiel III Die Durchführung erfolgte wie im Beispiel 1, nur wurde das pH der zu reinigenden Relaxinlösung und das des gepufferten Harzes auf 5,5 eingestellt.The results are shown in Table II. A comparison with Table I shows that a better separation of the protein substances into two fractions was achieved. Table II Exchange phase (pH 5.0) elution phase with H CI ! 0 Tube No. / 0 G Tube No. 1 010 Total N 4 1.12 31 1.54 6 1.61 34 0.64 10 2.22 37 1.17 13 2.09 40 1127 15 1.21 46 0.80 Exchange phase (pii 5.0) Elution phase with HCI Tube No. Tube No. Total N 17 0.75 48 1.48 19 0.98 50 2.41 23 2.09 54 2.41 25 2.77 57 1.31 28 2.01 60 1.19 66 6.88 Example III The procedure was as in Example 1, except that the pH of the relaxin solution to be purified and that of the buffered resin were adjusted to 5.5.

Aus den in Tabelle III zusammengestellten Ergebnissen geht hervor, daß die aus dem Harz mit Salzsäure eluierten Eiweißstoffe ein Gemisch von aktiven und inaktiven Eiweißstoffen darstellten. Tabelle III Röhrchen In-vivo-Relaxation der Unterbindung der Nr. Gesamt-N Meerschweinchensymphysis Kontraktion von Mäuseuterusstreifen Austauschphase (pil 5,5) ......... 4 1,6 inaktiv 14 1,1 inaktiv 20 1,5 inaktiv 22 2,4 inaktiv 26 1,4 30 2,0 inaktiv Elutionsphase mit HCI ............ 36 0,42 48 0,65 52 1,4 inaktiv 60 0,70 inaktiv 64 1,6 inaktiv 68 0,48 78 2,2 inaktiv 80 2,4 aktiv 82 1,3 aktiv Beispiel IV Die Durchführung erfolgte wie im Beispiel I, nur wurde das p" der zu reinigenden Relaxinlösung und das des gepufferten Harzes auf 7,0 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt. Es wurde eine gute Trennung des aktiven vom inaktiven Material erreicht. Tabelle IV Röhrchen In-vivo-Relaxation der Unterbindung der Nr. Gesamt-N Meerschweinchensymphysis Kontraktion von Mäuseuterusstreifen Austauschphase (p]ä 7,0) ......... 3 0,82 5 1,81 9 3,80 inaktiv inaktiv 14 3,08 16 3,34 19 1,42 Elutionsphase mit HCI ............ 25 1,65 30 2,22 aktiv aktiv 37 1,72 40 1,12 46 1,20 inaktiv 50 1,25 Beispiel V Der Austausch wurde wie im Beispiel I durchgeführt, bis auf folgende Abänderungen: . a) Die zu reinigende Relaxinlösung enthielt vier Meerschweincheneinheiten Relaxin je ccm und wurde in einer Menge von 500 ccm angewandt.The results compiled in Table III show that the proteins eluted from the resin with hydrochloric acid were a mixture of active and inactive proteins. Table III In vivo relaxation of the ligation of the tubes No total N guinea pig symphysis contraction of Mousse of eucalyptus Exchange phase (pil 5,5) ......... 4 1,6 inactive 14 1.1 inactive 20 1.5 inactive 22 2.4 inactive 26 1.4 30 2.0 inactive Elution phase with HCI ............ 36 0.42 48 0.65 52 1.4 inactive 60 0.70 inactive 64 1.6 inactive 68 0.48 78 2.2 inactive 80 2.4 active 82 1.3 active Example IV The procedure was carried out as in Example I, except that the p "of the relaxin solution to be purified and that of the buffered resin were set to 7.0 . The results are summarized in Table IV. A good separation of the active from the inactive material was achieved. Table IV In vivo relaxation of the ligation of the tubes No total N guinea pig symphysis contraction of Mousse of eucalyptus Exchange phase (p] ä 7.0) ......... 3 0.82 5 1.81 9 3.80 inactive inactive 14 3.08 16 3.34 19 1.42 Elution phase with HCI ............ 25 1.65 30 2.22 active active 37 1.72 40 1.12 46 1.20 inactive 50 1.25 Example V The exchange was carried out as in Example I, except for the following changes:. a) The relaxin solution to be cleaned contained four guinea pig units of relaxin per ccm and was used in an amount of 500 ccm.

b) Das p), der zu reinigenden Relaxinlösung und das des gepufferten Harzes wurde auf 7,6 eingestellt. c) Das Volumen der je Röhre aufgefangenen Fraktion betrug 60 c.cm. b) The p) of the relaxin solution to be purified and that of the buffered resin were adjusted to 7.6. c) The volume of the fraction collected per tube was 60 c.cm.

d) Der Stickstoff wurde nach Kjeldahl bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle V lassen erkennen, daß eine gute Trennung von aktivem und inaktivem Material erreicht wurde. Tabelle V Unterbindung der Röhrchen In-vivo-Relaxation der Kontraktion von ilTr. Gesamt-N Meerschweinchensyniphysis Mäuseuterusstreifen Austauschphase (pl, 7,6) ......... 1 inaktiv inaktiv 2 7,55 10 9,44 schwach aktiv inaktiv (Säulenversager) Elutionsphase mit HCI ............ 1 4,68 2 1,83 3 5,69 sehr aktiv aktiv 4 7,45 5 2,22 sehr aktiv sehr aktiv 6 0,43 7 0,26 inaktiv 8 0,73 inaktiv 9 0,19 Beispiel VI Die Durchführung erfolgte wie im Beispiel I, nur wurde das p. der zu reinigenden Relaxinlösung und das des gepufferten Harzes auf pH 8,6 eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt. Das aktive Prinzip des Relaxinpräparates wurde von dem Harz nicht adsorbiert; eine gewisse Menge des inaktiven Materials wurde dagegen von dem Harz adsorbiert und daraus mit Salzsäure eluiert. Tabelle VI Unterbindung der Röhrchen 0/0 In-vivo-Relaxation der Kontraktion von Nr. Gesamt-N Meerschweinehensymphysis Mäuseuterusstreifen Austauschphase (pia 8,6) ........ 1 0,24 5 .3,0 8 45 aktiv aktiv 5,3 13 1,4 15 2,8 19 1,9 23 1,1 aktiv 30 0,69. 35 0,#i Elution90-ase lilit.;- ............ 5 1,1 is 1,0 20 1,3 inaktiv 'inaktiv 25 1,1 30 0,4 inaktiv inaktiv 35 0,57 40 0,6 inaktiv inaktiv Beispiel VII In diesem Versuch wurde eine gewisse Menge eines kömigen, aus einem Mischpolymerisat von Methacrylsäure und (5111,) Divinylbenzol bestehenden Nationenaustauschharzes,'Wi ft einer Acetatpufferlösung von pl, 6,9 gerührt. 4ccm Relaxinlösung wurden mit Wasser auf 50 ccm verdünnt und mit 30 g des Harzes (Nagg-eicht) 20 Minuten lang gerührt. Die überstehende Flüssigkeit, deren. p,1 auf 7,8 anstieg, wurde dekantiert und das Harz mit SQ ccm Wasser gewaschen. Das gewaschene Harz, das den größten -Teil des biologisch wirksamen Materials adsorbiert hatte, wurde in zwei gleiche Teile geteilt: der#,"i eine Teil wurde mit 0,5 n-Natronlauge bei p. 9 eluiert. Die basische überstehende Flüssigkeit wurde neutralisiert; sie enthielt biologisch wirksames Material. Der andere Teil des gewaschenen Harzes wurde mit 0,5 n-H Cl eluiert; dieses Eluat enthielt ebenfalls biologisch wirksames Material. Daraus geht hervor, daß Relaxin aus einer Lösung durch ein Kationenaustauschharz des Carbonsäuretyps bei einem pl, von 6 bis 8 adsorbiert werden kann und daß das biologisch aktive Material entweder mit Natriumhydroxyd bei pl, 9 oder mit Salzsäure bei pH 2 eluiert werden kann. d) The nitrogen was determined according to Kjeldahl. The results in Table V indicate that a good separation of active and inactive material was achieved. Table V Stopping the Tube in vivo relaxation of the contraction of ilTr. Total N guinea pig syniphysis mouse eutectic strips Exchange phase (pl, 7.6) ......... 1 inactive inactive 2 7.55 10 9.44 weakly active inactive (Pillar failure) Elution phase with HCI ............ 1 4.68 2 1.83 3 5.69 very active active 4 7.45 5 2.22 very active very active 6 0.43 7 0.26 inactive 8 0.73 inactive 9 0.19 Example VI The procedure was as in Example I, only the p. the relaxin solution to be cleaned and that of the buffered resin are adjusted to pH 8.6. The results are shown in Table VI. The active principle of the relaxin preparation was not adsorbed by the resin; on the other hand, a certain amount of the inactive material was adsorbed by the resin and eluted therefrom with hydrochloric acid. Table VI Stopping the Tube 0/0 in vivo relaxation of the contraction of No. Total N guinea pig symphysis mouse eutectic strips Exchange phase (pia 8.6) ........ 1 0.24 5 .3.0 8 45 active active 5.3 13 1.4 15 2.8 19 1.9 23 1.1 active 30 0.69. 35 0, # i Elution90-ase lilit.; - ............ 5 1.1 is 1.0 20 1.3 inactive 'inactive 25 1.1 30 0.4 inactive inactive 35 0.57 40 0.6 inactive inactive EXAMPLE VII In this experiment a certain amount of a granular nation-exchange resin consisting of a copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene, 0.16 in an acetate buffer solution, was stirred. 4 cc relaxin solution was diluted to 50 cc with water and stirred with 30 g of the resin (Nagg-calibrated) for 20 minutes. The supernatant liquid whose. p, 1 rose to 7.8 , was decanted and the resin was washed with 1/2 cc of water. The washed resin, which had adsorbed the greatest -part of the biologically active material was divided into two equal parts: the #, "i a part 9 was treated with 0.5 N sodium hydroxide at p eluted The alkaline supernatant was neutralized.. It contained bioactive material. The other part of the washed resin was eluted with 0.5 nH Cl; this eluate also contained bioactive material. It is understood that relaxin is released from a solution by a cation exchange resin of the carboxylic acid type at a pi of 6 to 8 can be adsorbed and that the biologically active material can be eluted either with sodium hydroxide at pl, 9 or with hydrochloric acid at pH 2.

Daraus folgt weiter, daß der isoelektrische Punkt des Relaxins im pH-Bereich zwischen 7 und 8,6 liegt. Demzufolge besteht die erste Stufe bei der bevorzugten Durchführung der Erfindung darin, das Relaxin in Form einer die Säule verlassenden Flüssigkeit aufzufangen, aus der die Verunreinigungen durch ein Kationenaustauschharz vom Carbonsäuretyp bei einem p,1 von 8,6 adsorbiert worden sind. In der zweiten Stufe wird das Relaxin in der Flüssigkeit der ersten Stufe durch ein Kationenaustauschharz vom Carbonsäuretyp bei einem p. von 7 adsorbiert, worauf das gereinigte Relaxin aus diesem Harz eluiert werden kann. In diesem Zusammenhang muß jedoch darauf aufmerksam gemacht werden, daß, wenn das Relaxin z. B. als beständiges Salz oder als Komplex mit einer anderen Substanz bei einem gegebenen pl, vorkommt, das Verhalten dieser konjugierten Form gegenüber Kationenaustauschharzen vom Carbonsäuretyp verschieden sein kann von dem des Relaxins selbst, so daß die pli-Werte, bei denen die Reinigung erfolgt, dann entsprechend modifiziert werden müssen.It also follows that the isoelectric point of relaxin lies in the pH range between 7 and 8.6 . Accordingly, the first step in the preferred practice of the invention is to collect the relaxin in the form of a liquid exiting the column from which the impurities have been adsorbed by a cation exchange resin of the carboxylic acid type at a p.1 of 8.6. In the second stage, the relaxin in the first stage liquid is replaced by a cation exchange resin of the carboxylic acid type at a p. adsorbed by 7 , whereupon the purified relaxin can be eluted from this resin. In this context, however, it must be noted that when the relaxin z. B. occurs as a stable salt or as a complex with another substance at a given pl, the behavior of this conjugated form towards cation exchange resins of the carboxylic acid type can be different from that of the relaxin itself, so that the pli values at which the purification takes place, then have to be modified accordingly.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. A method for purifying a relaxin preparation, characterized in that a cation exchange resin of the carboxylic acid type is brought to a pl, in the vicinity of the isoelectric region of the relaxin, the p. adjusts the aqueous solution of the relaxin preparation to that of the buffered resin, brings this aqueous solution into contact with the buffered resin, the relaxin being absorbed by the resin at a pli value below the isoelectric range and obtained by elution and at a pjl value within or above the isoelectric range the impurities remain absorbed by the resin and the relaxin is recovered from the solution.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin on p. 4.5 is buffered. 3. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin is buffered to pl, 5.0. 4. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin is buffered to pl, 5.5. 5. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin is buffered to p1, 7.0. 6. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin is buffered to a pl lying between 7 and 8.6. 7. The method according to claim 1, characterized in that the cation exchange resin is buffered to a pl of at least 8.6. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cation exchange resin is a copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene - with 5 l) /, divinylbenzene - is.