DE10115439A1

DE10115439A1 - Inducing differentiation of immature dendritic cells, for use in vaccines for immunotherapy of cancer, comprises ex vivo treatment with heat-shock protein 70

Info

Publication number: DE10115439A1
Application number: DE10115439A
Authority: DE
Inventors: Maria Kuppner; Rolf D Issels; Robert Gastpar
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2002-05-16

Abstract

Ex vivo method for inducing TNF alpha (tumor necrosis factor alpha )-free differentiation of immature dendritic cells (DC) to mature DC by treatment with a protein (I) of the heat-shock protein (hsp) 70 family, or its biologically active fragment. Independent claims are also included for the following: (1) a mature DC produced this way; and (2) a therapeutic composition, containing (I) or its fragment as the only active component, for inducing maturation of immature DC.

Description

Diese Erfindung betrifft ex vivo-Verfahren zum Induzieren der TNF-α freien Differenzie rung von unreifen dendritischen Zellen zu reifen dendritischen Zellen, ebenso wie ex vivo- Verfahren zur Erzeugung der reifen dendritischen Zellen. Die Erfindung betrifft weiterhin reife dendritische Zelle, die durch das ex vivo-Verfahren gewinnbar sind. Überdies betrifft die Erfindung therapeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge an Hitze schock-Proteinen der hsp70-Familie oder der reifen dendritischen Zellen umfassen, ebenso wie deren Verwendung in der Immuntherapie von Tumorleiden.This invention relates to ex vivo methods for inducing TNF-α free difference from immature dendritic cells to mature dendritic cells, as well as ex vivo Process for the production of mature dendritic cells. The invention further relates to mature dendritic cell that can be obtained by the ex vivo method. Moreover concerns the invention therapeutic compositions containing an effective amount of heat shock proteins from the hsp70 family or mature dendritic cells include as well such as their use in the immunotherapy of tumor diseases.

Zellen reagieren auf Streßfaktoren wie beispielsweise Hitze, Hypoxie oder virale Trans formation durch die Synthese einer Gruppe von Proteinen, die als Hitzeschock-Proteine (hsp) bezeichnet werden [1]. Mitglieder der hsp70-Gruppe werden entweder konstitutiv exprimiert (hsc70) oder können durch Streßfaktoren induziert werden (hsp70) [2]. Sie die nen als molekulare Chaperone für antigene Peptide im endoplasmatischen Retikulum und im Zytoplasma und sind an der Antigen-Prozessierung bzw. -Verarbeitung und -Präsentation beteiligt [3]. Wie kürzlich von den Erfindern gezeigt wurde, wird hsp70 ebenfalls auf der Oberfläche menschlicher Tumorzellen wie beispielsweise Sarkomen, Lungenkarzinom und Kolonkarzinom exprimiert [4-7] und kann als Erkennungsstruktur für NK-Zellen dienen [8]. Es wurde vorgeschlagen, daß hsps ebenfalls die angeborene Immunantwort aktivieren können, indem sie als Gefahrensignale dienen [9-10], weil hsp70 [11] und hsp60 [9] die Erzeugung von Cytokinen aus Monocyten und Makrophagen direkt induzieren können. Es wird angenommen, daß Gefahrensignale [12] durch Mustererken nungs-Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen (antigen presenting cells = APCs) erkannt werden [13-14]. Professionelle APCs, wie beispielsweise dendritische Zellen, ini tiieren nach Aktivierung eine Immunantwort und bilden die Verbindung zwischen der an geborenen und erworbenen Immunreaktion [15]. Unreife DC's (dendritische Zellen) fangen Antigene ein und verarbeiten diese, wohingegen reife DC's potente Antigen-präsentierende Zellen sind [17]. Es ist nunmehr weithin anerkannt, daß dendritische Zellen eine bedeuten de Rolle bei der Immunantwort auf Tumoren spielen [16]. Deswegen war die Reifung von dendritischen Zellen, das heißt die Differenzierung von unreifen zu reifen dendritischen Zellen, in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschung.Cells react to stress factors such as heat, hypoxia or viral trans formation by synthesizing a group of proteins called heat shock proteins (hsp) are referred to [1]. Members of the hsp70 group either become constitutive expressed (hsc70) or can be induced by stress factors (hsp70) [2]. You the as molecular chaperones for antigenic peptides in the endoplasmic reticulum and in the cytoplasm and are involved in antigen processing or processing and -Presentation involved [3]. As recently shown by the inventors, hsp70 also on the surface of human tumor cells such as sarcomas, Lung carcinoma and colon carcinoma are expressed [4-7] and can be used as a recognition structure serve for NK cells [8]. It has been suggested that hsps are also congenital Can activate immune response by serving as danger signals [9-10] because hsp70 [11] and hsp60 [9] the generation of cytokines from monocytes and macrophages directly can induce. It is believed that hazard signals [12] are detected by patterns receptors on antigen presenting cells (APCs) can be recognized [13-14]. Professional APCs, such as dendritic cells, ini ti an immune response after activation and form the connection between the born and acquired immune response [15]. Catch immature DC's (dendritic cells) Antigens and process them, whereas mature DC's potent antigen-presenting Cells are [17]. It is now widely recognized that dendritic cells mean one de play a role in the immune response to tumors [16]. That is why the maturation of dendritic cells, i.e. the differentiation from immature to mature dendritic cells Cells have been the subject of intensive research in recent years.

Es wurde kürzlich durch Singh-Jasuja et al. (2000) gezeigt, daß das konstitutiv exprimierte hsp gp96 die Reifung dendritischer Zellen induzieren kann, die von CD14+ Monocyten abstammen [18]. Es waren jedoch hohe Konzentrationen an gp96 (im Bereich von 30-100 µg/ml Protein) zur Erzeugung reifer dendritischer Zellen notwendig. Eine gesteigerte Fä higkeit der reifen dendritischen Zellen, Peptide für spezifische T-Zellen zu präsentieren, wurde nicht beschrieben.It was recently published by Singh-Jasuja et al. (2000) showed that this constitutively expressed hsp gp96 can induce the maturation of dendritic cells by CD14 + monocytes descend [18]. However, there were high concentrations of gp96 (in the range of 30-100 µg / ml protein) necessary for the production of mature dendritic cells. An increased fa ability of mature dendritic cells to present peptides for specific T cells, was not described.

Es existierten darüber hinaus weitere Ansätze im Stand der Technik zur Induktion der Dif ferenzierung von Monocyten zu reifen dendritischen Zellen:There were also other approaches in the prior art for inducing the dif Differentiation of Monocytes to Mature Dendritic Cells:

US-Patent Nr. 5 849 589 (veröffentlicht am 12. Dezember 1998) beschreibt ein Verfahren zum Induzieren der Differenzierung einer Monocyten-Population zu einer Zellpopulation, die mehr als 50% reife DC83@+ dendritische Zellen umfaßt, wobei das Verfahren das Züchten von Monocyten in einem Induktionsmedium umfaßt, das Granulocy ten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor ("GM-CSF"), Interleukin-4 ("IL-4") und Tumornekrosefaktor-Alpha ("TNF-Alpha") umfaßt, wobei GM-CSF, IL-4 und TNF-Alpha in dem Induktionsmedium gleichzeitig in ausreichenden Mengen vorliegen, um die Diffe renzierung zu induzieren.U.S. Patent No. 5,849,589 (issued December 12, 1998) describes a method to induce the differentiation of a monocyte population into a cell population, comprising more than 50% mature DC83 @ + dendritic cells, the method being the Growing monocytes in an induction medium comprising granulocyte ten / macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF"), interleukin-4 ("IL-4") and Tumor Necrosis Factor Alpha ("TNF-Alpha") includes GM-CSF, IL-4 and TNF-Alpha are present in sufficient quantities in the induction medium to meet the differences induction.

Das französische Patent Nr. 2 777 906 (veröffentlicht am 29. Oktober 1999) beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung menschlicher dendritischer Zellen aus Monocyten in der Ge genwart von Interleukin-4 (IL-4), Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor ("GM-CSF") und Tumornekrosefaktor-Alpha ("TNF-Alpha"). Das Verfahren umfaßt mehrere entscheidende Parameter, die folgendes umfassen: (a) den Zusatz von 1-3 mg/ml Hydrogencarbonat zum Kulturmedium; (b) Halten des pH bei 7,2-7,4; (c) Züchten in Teflon-Töpfen; und (d) Verwendung von 1-25% autologem/homologem menschlichem Serum. French Patent No. 2,777,906 (published October 29, 1999) describes one Process for obtaining human dendritic cells from monocytes in the Ge present of interleukin-4 (IL-4), granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor ("GM-CSF") and tumor necrosis factor alpha ("TNF-alpha"). The process includes several key parameters that include: (a) the addition of 1-3 mg / ml Bicarbonate to the culture medium; (b) maintaining pH at 7.2-7.4; (c) breeding in Teflon pots; and (d) using 1-25% autologous / homologous human Serum.

Die vorstehenden Verfahren leiden unter den ernsten Nachteilen, die die Verwendung von TNF-α betreffen. TNF-α spielt eine herausragende Rolle bei der Initiierung der Immun antwort. Während es normalerweise für den Wirt von Vorteil ist, kann TNF-α selbst in Situationen einer Überproduktion den Wirt töten. Beispielsweise wurden akute überschüs sige Spiegel an TNF-α mit dem toxischen Schock-Syndrom in Verbindung gebracht, wo hingegen eine chronische Überproduktion mit entzündlicher Darmerkrankung, rheumatoi der Arthritis und Leberzirrhose verbunden ist.The above methods suffer from the serious disadvantages of using Affect TNF-α. TNF-α plays an outstanding role in the initiation of the immune system answer. While it is usually beneficial for the host, TNF-α can even in Overproduction situations kill the host. For example, acute surpluses were made levels of TNF-α associated with toxic shock syndrome where however, a chronic overproduction with inflammatory bowel disease, rheumatoi linked to arthritis and cirrhosis.

In der Therapie besteht die dosis-beschränkende Toxizität von TNF-α in Thrombocytope nie, Kopfschmerz, Verwirrung und Hypotonie. Somit beschränkt die Toxizität des syste misch verabreichten TNF-α in ernsthafter Weise die Anwendung zu therapeutischen Zwe cken. TNF-α war am effektivsten, wenn es für eine regionale Therapie verwendet wurde, in der Maßnahmen, wie beispielsweise eine Isolierung von Gliedmaßen zur Perfusion, vorgenommen wurde, um die systemische Dosis und folglich die Toxizität von TNF-α zu beschränken (Mittleman A., et al., 1992, Inv. New Drugs 10: 183-190).In therapy there is a dose-limiting toxicity of TNF-α in thrombocytope never, headache, confusion and hypotension. This limits the toxicity of the system mixed TNF-α administered seriously for therapeutic purposes CKEN. TNF-α was most effective when used for regional therapy in measures such as limb isolation for perfusion, was made to increase the systemic dose and consequently the toxicity of TNF-α limit (Mittleman A., et al., 1992, Inv. New Drugs 10: 183-190).

Deswegen sind TNF-α enthaltende Zusammensetzungen nicht für Zubereitungen geeignet, die beispielsweise für eine Verwendung in der klinischen Immuntherapie vorgesehen sind.For this reason, compositions containing TNF-α are not suitable for preparations which are intended for use in clinical immunotherapy, for example.

Es ist deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Reifung von dendritischen Zellen bereitzustellen, die die Verwendung von TNF-α vermeiden. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, reife dendritische Zellen bereitzustellen, die eine erhöhte Fähigkeit zum Präsentieren von Peptiden für spezifische T-Zellen zeigen.It is therefore an object of the present invention to provide methods for ripening To provide dendritic cells that avoid the use of TNF-α. It is another object of the present invention to provide mature dendritic cells, which show an increased ability to present peptides for specific T cells.

Diese Aufgaben werden durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevor zugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen dargelegt.These tasks are solved by the features of the independent claims. before drawn embodiments are set out in the dependent claims.

Durch Verwendung einer wirksamen Menge eines Hitzeschock-Proteins der hsp70-Familie oder eines biologisch wirksamen Teils hiervon wird eine Induktion der Reifung von unrei fen dendritischen Zellen (DC), die aus Monocyten-Vorläufern gewonnen wurden, zu reifen dendritischen Zellen durchgeführt. Darüber hinaus zeigen unreife DC's, die mit hsp70, bei spielsweise mit rekombinantem hsp70 (rhsp70, Definition siehe unten), zu reifen DC's sti muliert wurden, eine gesteigerte Fähigkeit, Peptide für spezifische CTL (zytotoxische T- Lymphocyten) zu präsentieren. Bereits kleine Mengen an hsp70 zeigten eine höhere Ef fektivität beim Induzieren unreifer dendritischer Zellen als das früher verwendete TNF-α. Deswegen ist hsp70 wegen seiner adjuvansartigen Eigenschaften in der Immuntherapie bestimmter Tumoren auf DC-Grundlage von Nutzen und kann als eine Alternative für das toxische Cytokin TNF-α bei der Reifung von DC's verwendet werden.By using an effective amount of a heat shock protein from the hsp70 family or a biologically active part thereof, an induction of maturation becomes immature to mature dendritic cells (DC) derived from monocyte precursors dendritic cells. In addition, immature DC's with hsp70 show for example with recombinant hsp70 (rhsp70, definition see below), to mature DC's sti increased ability to target peptides for specific CTL (cytotoxic T- Lymphocytes). Even small amounts of hsp70 showed a higher Ef effectiveness in inducing immature dendritic cells than the previously used TNF-α. That is why hsp70 is due to its adjuvant-like properties in immunotherapy certain DC-based tumors are useful and may be an alternative to that toxic cytokine TNF-α can be used in the maturation of DC's.

Die Erfindung beschreibt im allgemeinen ein ex vivo-Verfahren zum Induzieren der TNF- α-freien Differenzierung unreifer dendritischer Zellen zu reifen dendritischen Zellen, wo bei das Verfahren ein in Berührung-Bringen der unreifen dendritischen Zellen mit einer wirksamen Menge eines Hitzeschockproteins der hsp70-Familie oder eines biologisch ak tiven Teiles hiervon umfaßt.The invention generally describes an ex vivo method for inducing TNF α-free differentiation of immature dendritic cells to mature dendritic cells where in the process, bringing the immature dendritic cells into contact with one effective amount of a heat shock protein of the hsp70 family or a biologically active tive part of this includes.

Die Erfindung umfaßt zusätzlich ein ex vivo-Verfahren zur Erzeugung reifer dendritischer Zellen, wobei die Schritte durchgeführt werden, die Differenzierung von unreifen dendriti schen Zellen zu reifen dendritischen Zellen zu induzieren, indem die unreifen dendriti schen Zellen mit einer wirksamen Menge eines Hitzeschockproteins der hsp70-Familie oder eines biologisch wirksamen Teiles hiervon in Berührung gebracht wird, der frei von TNF-α ist, und die reifen dendritischen Zellen zu gewinnen. Die Gewinnung der Populati on der dendritischen Zellen schließt vorzugsweise Durchflußzytometrie oder Zellisolie rungs-Verfahren ein.The invention additionally includes an ex vivo method for producing mature dendritic Cells, where the steps are carried out, the differentiation of immature dendriti cells to induce mature dendritic cells by immature dendriti cells with an effective amount of a heat shock protein of the hsp70 family or a biologically active part thereof that is free of Is TNF-α, and the mature dendritic cells win. Obtaining the Populati The dendritic cells preferably include flow cytometry or cell isolation procedure.

Gemäß einem weiteren Aspekt ist der biologisch wirksame Teil des hsp70-Proteins als die C-terminale Domäne von hsp70 definiert. Die hsp70-Proteine enthalten zwei Haupt- Domänen. Die N-terminale ATPase Domäne ist die am höchsten konservierte (ungefähr 64% Reste-Identität zwischen eukaryotischen hsp70-Proteinen), während der C-terminale Teil durch eine variablere Peptid-Bindungsdomäne besetzt ist. Es stellte sich heraus, daß diese C-terminale Domäne eine biologische Aktivität bei der Reifung von dendritischen Zellen zeigt.In another aspect, the biologically active part of the hsp70 protein is that C-terminal domain defined by hsp70. The hsp70 proteins contain two main Domains. The N-terminal ATPase domain is the most conserved (approximately 64% residue identity between eukaryotic hsp70 proteins) during the C-terminal Part is occupied by a more variable peptide binding domain. It turned out that this C-terminal domain has biological activity in the maturation of dendritic Cells shows.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden die unreifen dendritischen Zellen durch Kultivierung von Monocyten in einem Induktionsmedium erzeugt, das Granulocy ten/Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor ("GM-CSF") und Interleukin-4 ("IL-4") enthält. Dieses Cytokin-Gemisch liefert optimale Ergebnisse, obwohl andere Gemische auch zu berücksichtigen sind. Aus diesem Grund ist die Erfindung nicht auf die Verwen dung dieser Cytokine beschränkt. Es liegt innerhalb des allgemeinen Fachwissens des Fachmanns, andere Cytokin-Gemische zu verwenden, wo dies geeignet ist. Beispiele ande rer Cytokine sind IFN-α, IFN-γ, IL1-β, IL-2, PGE2 oder IL-6.According to a preferred embodiment, the immature dendritic cells generated by culturing monocytes in an induction medium called granulocytes ten / macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF") and interleukin-4 ("IL-4") contains. This mixture of cytokines gives optimal results, although other mixtures are also to be considered. For this reason, the invention is not limited to use of these cytokines. It is within the general knowledge of the Those skilled in the art to use other cytokine mixtures where appropriate. Examples others The cytokines are IFN-α, IFN-γ, IL1-β, IL-2, PGE2 or IL-6.

Die Konzentrationen an GM-CSF und IL-4 bewegen sich von 125 bis 2000 U/ml. Die Konzentrationen an GM-CSF und IL-4 liegen vorzugsweise zwischen 500 bis 1000 U/ml.The concentrations of GM-CSF and IL-4 range from 125 to 2000 U / ml. The Concentrations of GM-CSF and IL-4 are preferably between 500 to 1000 U / ml.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Monocyten Kunststoff-adhärente (plastic- adherent) menschliche Blutmonocyten und die dendritischen Zellen sind deswegen menschliche dendritische Zellen, die zur Induktion einer T-Zell-Proliferation in der Lage sind.In a preferred embodiment, the monocytes are plastic-adherent adherent) human blood monocytes and the dendritic cells are because of that human dendritic cells capable of inducing T cell proliferation are.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die dendritischen Zellen mit einem antigenen Mittel im Anschluß an die Reifung gepulst wer den. Ein Beispiel eines derartigen antigenen Mittels ist das Tyrosinase Nonapeptid 369- 377. Weitere bevorzugte Beispiele von antigenen Mitteln sind von Tumoren stammende Peptide und virale antigene Peptide.According to a preferred embodiment, a method is provided in which the dendritic cells pulsed with an antigenic agent following maturation the. An example of such an antigenic agent is the tyrosinase nonapeptide 369- 377. Other preferred examples of antigenic agents are those derived from tumors Peptides and viral antigenic peptides.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das verwendete hsp70 rekombinantes hsp70 (rhsp70). Dieses rhsp70 kann beispielsweise durch Einfügen des menschlichen Gens für hsp70 in Bakterien erzeugt werden, die dann das Protein exprimieren würden. Bakteri elle Produkte können durch Bindunge an ATP-Agarose entfernt werden.In a preferred embodiment, the hsp70 used is recombinant hsp70 (rhsp70). This rhsp70 can, for example, by inserting the human gene for hsp70 are generated in bacteria which would then express the protein. bakteri All products can be removed by binding to ATP agarose.

Die hsp70-Proteine können in einem breiten Konzentrationsbereich verwendet werden. Jedoch schließt bei einer bevorzugten Ausführungsform das Verfahren ein Halten der rhsp70-Konzentration im Medium im Bereich von ungefähr 0,1-1,0 µg/ml und mehr be vorzugt 0,5 µg/ml ein. The hsp70 proteins can be used in a wide range of concentrations. However, in a preferred embodiment, the method includes holding the rhsp70 concentration in the medium in the range of approximately 0.1-1.0 µg / ml and more preferably 0.5 µg / ml.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine TNF-α freie therapeutische Zusammensetzung zum Induzieren der Reifung von unreifen dendritischen Zellen, die, als das einzige wirksame Reifungsmittel, eine wirksame Menge an Hitzeschockproteinen der hsp70-Familie, vor zugsweise rhsp70 oder einen biologisch aktiven Teil hiervon, umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.The invention further relates to a TNF-α free therapeutic composition for Induce the maturation of immature dendritic cells, which, as the only effective one Ripening agent, an effective amount of heat shock proteins of the hsp70 family preferably rhsp70 or a biologically active part thereof, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine therapeutische Zusammen setzung, die die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten reifen dendritischen Zellen umfaßt, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.In a further embodiment, the invention relates to a therapeutic combination setting, the mature dendritic produced by the inventive method Cells included in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

Diese Zusammensetzungen sind vorzugsweise Vakzine, bei denen das hsp70/die dendriti schen Zellen in physiologischer Salzlösung vorliegen, die zur Verabreichung durch Injek tion geeignet sind. Beispielsweise kann eine derartige Vakzine verwendet werden, um die dendritischen Zellen enthaltende Zusammensetzung einem Säugetier, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, für eine ex vivo Zelltransplantationstherapie zu verabreichen.These compositions are preferably vaccines in which the hsp70 / dendriti cells in physiological saline, which are for administration by injection tion are suitable. For example, such a vaccine can be used to Composition containing dendritic cells a mammal, preferably one human patients, for ex vivo cell transplantation therapy.

Darüber hinaus werden in einer Ausführungsform die oben erwähnten therapeutischen Zu sammensetzungen in der Immuntherapie von Tumorleiden verwendet. Diese Tumorleiden bestehen aus, sind jedoch nicht beschränkt auf, feste Tumoren und Leukämien, obwohl die Verwendung in der Therapie fester Tumoren bevorzugt wird. Feste Tumoren umfassen beispielsweise Tumoren, die mit malignem Melanom, Brustkrebs, Kolonkrebs, Pankreas krebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs, Mesotheliom, Neuroblastom, Nierenzellkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom und mit dem AIDS-assoziiertem Kaposi Sarkom ver bunden sind.In addition, in one embodiment, the therapeutic agents mentioned above compositions used in the immunotherapy of tumor diseases. These tumor diseases consist of, but are not limited to, solid tumors and leukemias, although the Use in solid tumor therapy is preferred. Solid tumors include for example tumors with malignant melanoma, breast cancer, colon cancer, pancreas cancer, prostate cancer, ovarian cancer, mesothelioma, neuroblastoma, renal cell carcinoma, non-small cell lung cancer and AIDS-related Kaposi sarcoma ver are bound.

Description of the drawings Fig. 1

FACS-Analyse der CD40, CD86 und CD83 Expression in von Monocyten stammenden DC. Die Monocyten wurden 8 Tage lang in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 alleine (graues Histogramm) enthielt oder in GM-CSF/IL-4 plus rhsp70 (0,5 µg/ml), zugesetzt zu den Kulturen am Tag 5 (schwarze Linie, oberes Feld) oder in GM-CSF/IL-4 plus rhsp70 (0,5 µg/ml), hitzedenaturiert (100°C, 20 Min.) (schwarze Line, unteres Feld), den Kulturen am Tag 5 zugesetzt, kultiviert. Die gestrichelte Linie repräsentiert Isotyp-Kontroll- Antikörper, die dieselben Fluoreszenz-Intensitäten beim Zusatz von rhsp70 oder hitzede naturiertem rhsp70 zeigten. Die Ergebnisse sind für drei getrennte Experimente repräsen tativ.FACS analysis of CD40, CD86 and CD83 expression in monocyte-derived DC. The monocytes were kept in a medium containing GM-CSF and IL-4 alone for 8 days (gray histogram) contained or added in GM-CSF / IL-4 plus rhsp70 (0.5 µg / ml) cultures on day 5 (black line, upper field) or in GM-CSF / IL-4 plus rhsp70 (0.5 µg / ml), heat denatured (100 ° C, 20 min.) (Black line, lower field), the cultures added on day 5, cultivated. The dashed line represents isotype control Antibodies that have the same fluorescence intensities when rhsp70 or heat is added naturalized rhsp70 showed. The results are representative of three separate experiments tively.

Fig. 2

Ein Vergleich der Wirkung von rhsc70 und rhsp70 auf die DC-Reifung. A) CD83 und B) CD14 Expression von DC, die 8 Tage lang in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 allei ne enthielt (weißer Balken), oder in GM-CSF/IL-4 plus rhsc70 (grauer Balken), zugesetzt am Tag 5, oder in GM-CSF/IL-4 plus zunehmenden Konzentrationen an rhsp70 (schwarzer Balken), zugesetzt am Tag 5, kultiviert wurden. Die Ergebnisse sind für zwei getrennte Experimente repräsentativ.A comparison of the effects of rhsc70 and rhsp70 on DC maturation. A) CD83 and B) CD14 expression of DC for 8 days in a medium that GM-CSF and IL-4 alone ne contained (white bar), or added in GM-CSF / IL-4 plus rhsc70 (gray bar) on day 5, or in GM-CSF / IL-4 plus increasing concentrations of rhsp70 (black Bars), added on day 5, were cultivated. The results are for two separate ones Experiments representative.

Fig. 3

Die Wirkung von Polymyxin B auf die von hsp70 induzierte DC-Reifung. Die DC wurden 8 Tage lang in GM-CSF und IL-4 enthaltendem Medium alleine (weißer Balken) oder mit rhsp70 (schwarzer Balken), zugesetzt am Tag 5, oder mit rhsp70 plus Polymyxin B (0,5 µg/ml), zugesetzt am Tag 5 (grauer Balken), kultiviert. Eine FACS-Analyse der CD40, CD86, HLA-DR und CD83-Expression wurde am Tag 8 durchgeführt. Die Ergebnisse sind für 2 getrennte Experimente repräsentativ.The effect of polymyxin B on DC maturation induced by hsp70. The DC were For 8 days in medium containing GM-CSF and IL-4 alone (white bar) or with rhsp70 (black bar), added on day 5, or with rhsp70 plus polymyxin B (0.5 µg / ml), added on day 5 (gray bar), cultivated. A FACS analysis of the CD40, CD86, HLA-DR and CD83 expression was performed on day 8. The results are representative of 2 separate experiments.

Fig. 4

Antigen-spezifische T-Zell-Stimulierung. DC's wurden 8 Tage lang in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 alleine (DC-hsp) enthielt, oder mit rhsp70 (0,5 µg/ml), zugesetzt am Tag 5 der Kultur (DC+hsp), kultiviert. Die DC's wurden dann zu 10⁴/Well in 100 µl Me dium in 96 Well Rundbodenplatten ausplattiert und dann mit Tyrosinasepeptid 1 µg/ml (weißer Balken) oder 10 µg/ml (schwarzer Balken) für 2 Stunden gepulst und dann be strahlt. 2 × 10⁴ Tyrosinase-spezifische CTL wurden dann in einem Endvolumen von 100 µl jedem Well in einem Medium zugesetzt, das 20% FCS und 100 U/ml IL2 enthielt. Kon trollkulturen, die nicht Tyrosinase-gepulste DC plus CTL (dunkelgraue Balken) oder DC alleine (hellgraue Balken) oder CTL alleine (CTL) enthielten, wurden ebenfalls einge schlossen.Antigen-specific T cell stimulation. DC's were cultured for 8 days in a medium containing GM-CSF and IL-4 alone (DC-hsp) or with rhsp70 (0.5 µg / ml) added on day 5 of the culture (DC + hsp) , The DC's were then plated at 10 ⁴ / well in 100 μl medium in 96 well round-bottom plates and then pulsed with tyrosinase peptide 1 μg / ml (white bar) or 10 μg / ml (black bar) for 2 hours and then irradiated. 2 × 10 ⁴ tyrosinase-specific CTL were then added in a final volume of 100 μl to each well in a medium containing 20% FCS and 100 U / ml IL2. Control cultures that did not contain tyrosinase-pulsed DC plus CTL (dark gray bars) or DC alone (light gray bars) or CTL alone (CTL) were also included.

A. Die Zellen wurden 72 Stunden lang kultiviert und ³H Thymidin wurde für die letz ten 24 Stunden der Kultur zugesetzt. Die Ergebnisse sind die Durchschnittswerte von drei fachen Kulturen plus oder minus der Standardabweichung. Die Ergebnisse sind für drei getrennte Experimente repräsentativ.A. The cells were cultured for 72 hours and ³ H thymidine was added to the culture for the last 24 hours. The results are the average of three cultures plus or minus the standard deviation. The results are representative of three separate experiments.

B. Kulturen wurden parallel für die IFN-γ-Erzeugung aufgestellt. Überstände (100 µl) wurden von jedem Well nach 24 Stunden entfernt und auf IFN-γ-Produktion unter Ver wendung eines ELISA-Kits, der für IFN-γ spezifisch ist, untersucht. Die Ergebnisse sind die Durchschnittswerte von dreifachen Kulturen plus oder minus der Standardabweichung. Die Ergebnisse sind für drei getrennte Experimente repräsentativ.B. Cultures were set up in parallel for IFN-γ production. Supernatants (100 µl) were removed from each well after 24 hours and assayed for IFN-γ production using Ver using an ELISA kit specific for IFN-γ. The results are the averages of triplicate cultures plus or minus the standard deviation. The results are representative of three separate experiments.

Figure 5A

Eine phänotypische Analyse von aus Monocyten gewonnenen DC, die 8 Tage lang in ei nem Medium, das GM-CSF und IL-4 alleine (graues Histogramm) enthielt, oder in GM- CSF/IL-4 plus rhsp70 (0,5 µg/ml) (schwarze Linie), kultiviert wurden. Die gestrichelte Linie repräsentiert einen Isotyp-Kontrollantikörper. Die Isotyp-Kontrollen zeigten ähnliche Fluoreszenzspiegel für alle studierten Marker. Die Ergebnisse sind für drei getrennte Expe rimente repräsentativ.A phenotypic analysis of monocyte-derived DC that was kept in egg for 8 days medium containing GM-CSF and IL-4 alone (gray histogram), or in GM- CSF / IL-4 plus rhsp70 (0.5 µg / ml) (black line). The dashed Line represents an isotype control antibody. The isotype controls showed similar ones Fluorescence levels for all studied markers. The results are for three separate expe riments representative.

Figure 5B

Die CD83-Expression in von Monocyten stammenden DC, die 8 Tage lang in einem Me dium kultiviert wurden, das GM-CSF und IL-4 alleine (schwarzes Histogramm) enthielt, oder die in GM-CSF/IL-4 plus zunehmenden Konzentrationen an rhsp70 (0,1-0,7 µg/ml) (graues Histogramm). Die gestrichelte Linie repräsentiert die Isotypkontrollfluoreszenz. Die Ergebnisse sind für drei getrennte Experimente repräsentativ.CD83 expression in monocyte derived DC, which was in a Me cultivated with GM-CSF and IL-4 alone (black histogram), or the increasing concentrations of rhsp70 (0.1-0.7 µg / ml) in GM-CSF / IL-4 plus (gray histogram). The dashed line represents the isotype control fluorescence. The results are representative of three separate experiments.

Fig. 6

Die CD83-Expression in von Monocyten abstammenden DC, die 8 Tage lang in einem Medium kultiviert wurden, das GM-CSF und IL-4 alleine (weißer Balken) enthielt oder die in einem Medium kultiviert wurden, das rhsp70 (0,5 µl/ml) (schwarzer Balken) enthielt.CD83 expression in monocyte-derived DC that was in one for 8 days Medium was cultivated which contained GM-CSF and IL-4 alone (white bar) or which were cultured in a medium containing rhsp70 (0.5 µl / ml) (black bar).

Fig. 7

Die CD40, CD86 und CD83-Expression in von Monocyten gewonnenen DC, die 8 Tage lang in einem Medium kultiviert wurden, das GM-CSF und IL-4 alleine (weißer Balken) enthielt oder die in GM-CSF und IL-4 plus rhsc70 (0,5 µg/ml) (hellgrauer Balken) oder in rhsp70 (0,5 µl/ml) 20 Minuten lang auf 100°C erhitzt (dunkelgrauer Balken), oder rhsp70 (0,5 µg/ml) (schwarzer Balken) kultiviert wurden. Die Ergebnisse sind für zwei getrennte Experimente repräsentativ.The CD40, CD86 and CD83 expression in monocyte-derived DC, the 8 days long cultured in a medium that GM-CSF and IL-4 alone (white bar) contained or in GM-CSF and IL-4 plus rhsc70 (0.5 µg / ml) (light gray bar) or in rhsp70 (0.5 µl / ml) heated to 100 ° C for 20 minutes (dark gray bar), or rhsp70 (0.5 µg / ml) (black bar) were cultivated. The results are for two separate ones Experiments representative.

Fig. 8

A. Frischisolierte Monocyten oder B. von Monocyten stammende DC, die nach 8 Tage Kultivieren in einem Medium gewonnen wurden, das GM-CSF und IL-4 alleine enthielt oder C. von Monocyten stammende DC, die in GM-CSF/IL-4 enthaltendem Medium mit einem Zytokin-Reifungscocktail kultiviert wurden, der von den Tagen 6 bis 8 zugesetzt wurde, wurden für CD14 oder CD83 gefärbt und PE-markiert. Die Zellen wurden eben falls mit FITC konjugiertem BSA (Bovine Serum Albumin = Rinderserumalbumin) oder FITC konjugiertem rhsp70 inkubiert. Das FITC konjugierte rhsp70 band an CD14+ Mono cyten und an unreife DC (CD83 gering oder negativ), jedoch nicht an reife DC (CD83 hoch). Keine der Zellen band FITC konjugiertes BSA. Die Ergebnisse sind für drei ge trennte Experimente repräsentativ.A. Freshly isolated monocytes or B. Monocyte-derived DC after 8 days Cultivation was obtained in a medium containing GM-CSF and IL-4 alone or C. DC derived from monocytes in medium containing GM-CSF / IL-4 a cytokine ripening cocktail that was added from days 6 to 8 was stained for CD14 or CD83 and PE-labeled. The cells became flat if BSA conjugated with FITC (Bovine Serum Albumin = bovine serum albumin) or FITC conjugated rhsp70 incubated. The FITC conjugated rhsp70 bound to CD14 + Mono cyten and immature DC (CD83 low or negative), but not mature DC (CD83 high). None of the cells bound FITC-conjugated BSA. The results are for three separated experiments representative.

Detailed description of the invention

1. Hsp70 induces maturation of monocyte-derived dendritic Cells when added to immature dendritic cells:

Der Phänotyp der Ausgangspopulation von kunststoffadhärenten mononukleären Zellen, die zur Erzeugung von DC verwendet wurden, wurde durch Durchflußcytometrie charakte risiert. Die Zellen bestanden durchschnittlich aus 70% Monocyten. Menschliches rhsp70 (0,5 µg/ml) wurden den von Monocyten abstammenden DC nach 5-tägiger Kultur in GM- CSF und IL-4 enthaltendem Medium zugesetzt und eine FACS-Analyse wurde am Tag 8 durchgeführt. Eine Zunahme der rhsp70 induzierten Reifung wurde im Vergleich zu Kon trollkulturen beobachtet, wie durch eine Zunahme der Expression von CD40, CD86 und CD83-Molekülen (Fig. 1) bewiesen wurde. Keine Zunahme der DC-Reifung war in paral lelen Kulturen nach dem Zusatz von hitzedenaturiertem (100°C, 20 Min.) menschlichem rhsp70 (0,5 mg/ml) (Fig. 1) ersichtlich.The phenotype of the initial population of plastic-adherent mononuclear cells used to generate DC was characterized by flow cytometry. The cells consisted of an average of 70% monocytes. Human rhsp70 (0.5 µg / ml) was added to the monocyte-derived DC after 5 days of culture in medium containing GM-CSF and IL-4, and FACS analysis was performed on day 8. An increase in rhsp70-induced maturation was observed compared to control cultures, as demonstrated by an increase in the expression of CD40, CD86 and CD83 molecules ( Fig. 1). No increase in DC maturation was seen in parallel cultures after the addition of heat-denatured (100 ° C, 20 min.) Human rhsp70 (0.5 mg / ml) ( Fig. 1).

Wenn ein Vergleich zwischen der Wirkung von rhsc70 und rhsp70 auf die DC-Zellreifung durchgeführt wurde, war die CD83 und CD14-Expression dieselbe wie bei den Kontroll werten, wenn rhsc70 zugesetzt wurde (Fig. 2A und 2B), wohingegen der Zusatz von rhsp70 in derselben Konzentration die CD83-Expression (Fig. 2A) erhöhte und die CD14- Expression (Fig. 2B) verringerte. Der Zusatz von Polymyxin B (einem potenten Hemm stoff von LPS) zu den Kulturen hatte keine Hemmwirkung auf die hsp70 induzierte DC- Reifung (Fig. 3).When a comparison was made between the effect of rhsc70 and rhsp70 on DC cell maturation, CD83 and CD14 expression were the same as the control values when rhsc70 was added ( Figures 2A and 2B), whereas the addition of rhsp70 in same concentration increased CD83 expression ( Fig. 2A) and decreased CD14 expression ( Fig. 2B). The addition of polymyxin B (a potent inhibitor of LPS) to the cultures had no inhibitory effect on hsp70-induced DC maturation ( FIG. 3).

1. Dendritic cells induced to maturity with rhsp70 show an increased ability to stimulate specific T cell clones:

Wir führten einen Proliferations-Assay unter Verwendung von HLA-A*0201 restringierten T-Zell-Klonen durch, die für das Tyrosinase 369-377 Nonapeptid spezifisch waren, ein bekanntes HLA-A*0201 restringiertes CTL-Epitop. DC von kompatiblen Spendern, die in Gegenwart von rhsp70 (0,5 µg/ml) von den Tagen 5 bis 8 kultiviert wurden, zeigten eine erhöhte Fähigkeit zur Stimulierung von Tyrosinase spezifischen T-Zell-Klonen, wenn sie mit hohen oder niedrigen Peptidkonzentrationen (1-10 µg/ml) gepulst wurden, im Ver gleich zu gepulsten DC, die nur in GM-CSF und IL-4 kultiviert wurden (Fig. 4A). In pa rallelen Kulturen, die zur Messung der IFN-γ-Produktion von dem CTL Klon errichtet wurden, zeigten die in Gegenwart von rhsp70 (0,5 µg/ml) von den Tagen 5 bis 8 kultivier ten und mit Tyrosinasepeptid gepulsten DC ebenfalls eine erhöhte Fähigkeit zur Stimulie rung der IFN-γ-Produktion von Tyrosinase spezifischen CTL (Fig. 4B). Keine IFN-γ- Produktion wurde von DC oder CTL alleine erzielt. Sehr geringe Spiegel der IFN-γ- Produktion wurden in DC/CTL-Kulturen beobachtet, in denen die DC nicht mit Tyrosina sepeptid gepulst wurden (Fig. 4B).We performed a proliferation assay using HLA-A * 0201 restricted T cell clones specific for tyrosinase 369-377 nonapeptide, a known HLA-A * 0201 restricted CTL epitope. TLC from compatible donors cultured in the presence of rhsp70 (0.5 µg / ml) from days 5 to 8 showed increased ability to stimulate tyrosinase-specific T cell clones when used with high or low peptide concentrations ( 1-10 µg / ml) were pulsed, in comparison to pulsed DC, which were only cultivated in GM-CSF and IL-4 ( FIG. 4A). In parallel cultures, which were set up to measure IFN-γ production by the CTL clone, the DC cultured in the presence of rhsp70 (0.5 µg / ml) from days 5 to 8 and pulsed with tyrosinase peptide also showed one increased ability to stimulate IFN-γ production by tyrosinase specific CTL ( Fig. 4B). No IFN-γ production was achieved by DC or CTL alone. Very low levels of IFN-γ production were observed in DC / CTL cultures in which the DC was not pulsed with Tyrosina sepeptide ( Fig. 4B).

1. Hsp70 reduces the level of DC maturation when there are monocytes at the beginning Culture is added:

Obwohl rhsp70 die DC-Reifung induzieren konnte, wenn es unreifen DC zugesetzt wurde, stellte sich heraus, daß es den gegenteiligen Effekt hatte, wenn es Monozyten-Kulturen zugesetzt wurde.Although rhsp70 could induce DC maturation when added to immature DC, turned out to have the opposite effect when monocyte cultures was added.

Menschliches rhsp70 (0,1-1 µg/ml) wurde zur selben Zeit wie GM-CSF und IL-4 zu adhä renten Monocyten zu Beginn der Kultur zugesetzt. Die nach 8 Tagen erzeugten DC zeigten reduzierte Reifungsniveaus im Vergleich zu Kontrollkulturen, wenn rhsp70 in den Kultu ren vorlag. Eine FACS-Analyse zeigte eine Abnahme in der Expression von CD1a, CD40, CD83, CD86 und HLA-DR-Molekülen und eine Zunahme in der Expression von CD14 im Vergleich zu Kontrollkulturen (Fig. 5A). Die Hemmwirkung war konzentrationsabhängig, wobei der maximale Effekt zwischen 0,5 und 0,7 µg/ml rhsp70 (Fig. 5B) zu finden war. Eine hohe oder moderate CD83-Expression war in einigen Kontrollkulturen nach 8 Tagen zu finden, jedoch verursachte in jedem Fall das Vorhandensein von rhsp70 vom Tage 0 ab eine Reduktion der Anzahl der CD83 positiven Zellen (Fig. 6). Hitzebehandelte rhsp70 (100°C für 20 Min.) und rhsc70 wurden ebenfalls zu Beginn der Kultur in derselben Kon zentration wie rhsp70 (0,5 µg/ml) zugesetzt, hatten jedoch keine Hemmwirkung auf die DC-Erzeugung (Fig. 7).Human rhsp70 (0.1-1 µg / ml) was added to adherent monocytes at the beginning of the culture at the same time as GM-CSF and IL-4. The DC generated after 8 days showed reduced ripening levels compared to control cultures when rhsp70 was present in the cultures. FACS analysis showed a decrease in the expression of CD1a, CD40, CD83, CD86 and HLA-DR molecules and an increase in the expression of CD14 compared to control cultures ( FIG. 5A). The inhibitory effect was concentration-dependent, the maximum effect being found between 0.5 and 0.7 µg / ml rhsp70 ( FIG. 5B). A high or moderate CD83 expression was found in some control cultures after 8 days, but in any case the presence of rhsp70 from day 0 onwards caused a reduction in the number of CD83 positive cells ( FIG. 6). Heat treated rhsp70 (100 ° C for 20 min.) And rhsc70 were also added at the beginning of the culture in the same concentration as rhsp70 (0.5 µg / ml), but had no inhibitory effect on DC generation ( Fig. 7).

1. Monocytes, immature DC and mature DC differ in their ability to rhsp70 to bind:

Monocyten, die nach zwei Stunden Adhärenz an Kunststoff gewonnen wurden, wurden auf ihre Fähigkeit hin untersucht, rhsp70 zu binden. Eine moderate Anzahl von CD14+Zellen band rhsp70 (Fig. 8A). Wenn von Monocyten abstammende DC, die 8 Tage lang in einem Medium, das GM-CSF und IL-4 enthielt, gezüchtet wurden, mit dem FITC-markierten rhsp70 inkubiert wurden, exprimierten die unreifen DC entweder niedrige Spiegel an CD83 oder kein CD83 band rhsp70 in einem höheren Ausmaß (Fig. 8B) als die Monocyten alleine (Fig. 8A). Wenn die DC zur Reifung stimuliert wurden, indem ein Cytokin- Reifungscocktail (enthaltend IL1-β, IL-6, TNF-α, PGE2) zu den Kulturen am Tag 6 bis Tag 8 zugesetzt wurde, zeigten die hohe Spiegel an CD83 (reif) exprimierenden DC eine minimale Bindung von rhsp70 (Fig. 8C). FITC markiertes BSA band weder unreife noch reife DC-Populationen (Fig. 8B und C).Monocytes, which were obtained after two hours of adherence to plastic, were examined for their ability to bind rhsp70. A moderate number of CD14 + cells bound rhsp70 ( Fig. 8A). When monocyte-derived DCs grown for 8 days in a medium containing GM-CSF and IL-4 were incubated with the FITC-labeled rhsp70, the immature DCs expressed either low levels of CD83 or no CD83 bound rhsp70 to a greater extent ( Fig. 8B) than the monocytes alone ( Fig. 8A). When DCs were stimulated to ripen by adding a cytokine ripening cocktail (containing IL1-β, IL-6, TNF-α, PGE2) to the cultures on day 6 to day 8, the high levels of CD83 (ripe) showed expressing DC minimal binding of rhsp70 ( Fig. 8C). FITC-labeled BSA did not bind immature or mature DC populations ( Figures 8B and C).

Diese Ergebnisse zeigen die spezifische Fähigkeit von rhsp70, die Reifung von unreifen (differenzierten) DC zu induzieren. Jedoch ist der gegenteilige Effekt anzutreffen, wenn hsp70 zu Monocyten (differenzierenden Vorläufern) zur selben Zeit wie GM-CSF und IL- 4 zugesetzt wird, so daß die DC-Reifung reduziert wird. Diese Effekte waren nur bei rhsp70 und nicht bei rhsc70 oder hitzebehandeltem rhsp70 zu finden. Wir haben weiterhin gezeigt, daß unreife DC rhsp70 binden konnten, wohingegen reife DC dies nicht konnten. Funktionelle Studien zeigten weiterhin, daß unreife DC, die mit rhsp70 stimuliert wurden, besser dazu in der Lage waren, Peptide für spezifische T-Zell-Klone zu präsentieren, im Vergleich zu DC, die alleine in GM-CSF und IL-4 kultiviert wurden.These results demonstrate the specific ability of rhsp70 to mature from immature to induce (differentiated) DC. However, the opposite effect can be found when hsp70 to monocytes (differentiating precursors) at the same time as GM-CSF and IL- 4 is added so that the DC maturation is reduced. These effects were only on rhsp70 and not found in rhsc70 or heat treated rhsp70. We still have demonstrated that immature DCs could bind rhsp70 whereas mature DCs could not. Functional studies also showed that immature DC stimulated with rhsp70 were better able to present peptides for specific T cell clones Compared to DC grown in GM-CSF and IL-4 alone.

Es wurde berichtet, daß exogenes hsp70 an die Oberfläche eines CD14 Rezeptors von menschlichen Monocyten mit nachfolgender nach-oben-Regulierung der Expression von pro-inflammatorischen Cytokinen, wie beispielsweise TNF-α, IL-6 und IL1-β binden kön nen [11]. Eine Kombination dieser Cytokine plus PGE2 wurde verwendet, um die Reifung von unreifen DC für immuntherapeutische Zwecke zu induzieren [19]. Wenn Monocyten in der Gegenwart von GM-CSF und IL-4 direkt durch hsp70 induzierte Cytokine getriggert werden könnten, um zu reifen DC zu differenzieren, würde dies, wie nahe gelegt wurde [20], nicht der effizienteste Mechanismus zur Induzierung einer Immunität sein, weil un reife DC Antigene einfangen und verarbeiten müssen. Es hat sich herausgestellt [20], daß die Gegenwart von hsp70 in Tumorzelllysaten unreife DC-Vorläufer treffen konnte und die DC-Population in einem schlechter differenzierten Zustand halten konnte. Bezüglich von Monocyten-Vorläufern reduziert, wie wir dargestellt haben, die Gegenwart von hsp70 die Reifung von dendritischen Zellen, es kann jedoch sein, daß zusätzlich zur Stimulierung der Erzeugung von IL1-β, IL-6 und TNF-α aus Monocyten [11], hsp70 die Erzeugung anderer inflammatorischer Cytokine wie beispielsweise M-CSF stimuliert, die das Gleichgewicht mehr in Richtung zu den Monocyten verschieben würden [21]. Unsere eigenen Ergebnisse haben gezeigt, daß unreife DC rhsp70 binden und durch rhsp70 zur Reife stimuliert werden können. Im Gegensatz hierzu binden reife DC nicht mehr länger rhsp70, was auf eine Down-Regulierung des Rezeptors für hsp70 zurückzuführen sein kann. Ein weiteres Streßprotein, gp96, kann die DC-Reifung [18] induzieren und die Bindung von gp96 durch seinen Rezeptor, der kürzlich als CD91 charakterisiert wurde [22] wird ebenfalls in reifen DC nach unten reguliert [18]. Somit können unreife DC, die Hitzeschockproteine wie bei spielsweise hsp70 und gp96 binden können, wahrscheinlicher Antigene einfangen und ver arbeiten, wohingegen reife DC, die die Fähigkeit zur Bindung von Hitzeschockproteinen verloren haben, besser bei der Antigen-Präsentation sein würden.Exogenous hsp70 has been reported to surface on a CD14 receptor from human monocytes with subsequent upward regulation of the expression of can bind pro-inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL1-β nen [11]. A combination of these cytokines plus PGE2 was used to help mature to induce immature DC for immunotherapeutic purposes [19]. If monocytes directly triggered by hsp70-induced cytokines in the presence of GM-CSF and IL-4 to mature DC to differentiate, this would, as was suggested [20], may not be the most efficient mechanism for inducing immunity because un need to capture and process mature DC antigens. It has been found [20] that the presence of hsp70 in tumor cell lysates could hit immature DC precursors and the Could keep DC population in poorer differentiated state. Regarding Monocyte precursors, as we have shown, reduced the presence of hsp70 Maturation of dendritic cells, however, may be in addition to stimulating the Generation of IL1-β, IL-6 and TNF-α from monocytes [11], hsp70 the generation of others inflammatory cytokines such as M-CSF that stimulates balance would move more towards monocytes [21]. Our own results have shown that immature DC bind rhsp70 and are stimulated to maturity by rhsp70 can. In contrast, mature DCs no longer bind rhsp70, which indicates a Down regulation of the receptor for hsp70 may be due. Another one Stress protein, gp96, can induce DC maturation [18] and the binding of gp96 its receptor, which was recently characterized as CD91 [22], will also mature in DC down regulated [18]. Thus immature DC, the heat shock proteins like in for example, hsp70 and gp96 can bind, more likely to capture and ver work, whereas mature DC, which has the ability to bind heat shock proteins lost, would be better at antigen presentation.

Dendritische Zellen können nach Inkubation mit dem vorverarbeiteten synthetischen Pep tid ebenfalls Antigene zu Klasse I-restringierten cytotoxischen T-Zellen [23] liefern. Mit von Tumoren abstammenden Peptiden gepulste DC wurden in Immuntherapieversuchen bestimmter Tumore wie beispielsweise dem Melanom [24] verwendet. Es wurde kürzlich berichtet, daß Peptid-gepulste reife DC besser als Peptid-gepulste unreife DC bei der Akti vierung von CD8+T-Tell-Reaktionen sind [25]. Ein von Melanom-Antigenen abstammen des Tyrosinasepeptid kann durch DC in Verbindung mit HLA-A*0201-Molekülen präsen tiert werden und stimuliert eine spezifische CD8+T-Zell-Reaktion [26]. Wenn wir einen CD8+T-Zell-Klon verwendeten, der ein Peptidepitop erkennt, das von menschlicher Tyro sinase abstammt, fanden wir heraus, daß unreife DC, die mit rhsp70 behandelt wurden, beim Präsentieren des Tyrosinasepeptids für die spezifischen CTL-Zell-Klonen wirkungs voller waren.Dendritic cells can be incubated with the preprocessed synthetic Pep tid also provide antigens to class I restricted cytotoxic T cells [23]. With DC pulsed from tumor-derived peptides were attempted in immunotherapy certain tumors such as melanoma [24]. It was recently reports that peptide-pulsed mature DC is better than peptide-pulsed immature DC in the acti CD8 + T-Tell reactions are [25]. One descended from melanoma antigens of the tyrosinase peptide can be present by DC in conjunction with HLA-A * 0201 molecules be stimulated and stimulates a specific CD8 + T cell response [26]. If we have one Used CD8 + T cell clone that recognizes a peptide epitope derived from human tyro sinase, we found that immature DC treated with rhsp70 when presenting the tyrosinase peptide for the specific CTL cell clones were fuller.

Somit sind unreife DC's, die zur Reifung mit rhsp70 stimuliert und darauf mit Tumorpepti den gemäß der Erfindung gepulst wurden, in der Steigerung einer tumorspezifischen Im munreaktion sehr von Nutzen. Thus, immature DC's are stimulated to mature with rhsp70 and then with tumor peptides which were pulsed according to the invention, in the increase of a tumor-specific Im munreaction very useful.

Weil rekombinantes hsp70 die Cytokinproduktion aus Monocyten steigern kann [11] und ebenfalls die NK-Zell-Proliferation und Cytotoxizität erhöht, wohingegen hsc70 dies nicht tut [27], scheint es, daß rhsp70 sowohl die spezifischen als auch die angeborenen Immun reaktionen steigert. Hsp70 fungiert als ein Gefahrensignal, das sowohl von DC als auch von NK-Zellen erkannt wird und somit die Aktivierung sowohl der erworbenen als auch der angeborenen Immunreaktionen induziert und eine Querkommunikation [28] zwischen den beiden Systemen unterstützt. Eine Induktion von hsp70 auf Tumoren in vivo durch Hyperthermie kann ebenfalls ein Gefahrensignal für das Immunsystem liefern, das eine Anti-Tumorreaktion in vivo unterstützt [29].Because recombinant hsp70 can increase cytokine production from monocytes [11] and also increases NK cell proliferation and cytotoxicity, whereas hsc70 does not does [27], it appears that rhsp70 has both the specific and the innate immune reactions increases. Hsp70 acts as a hazard signal, both from DC and is recognized by NK cells and thus the activation of both the acquired and of innate immune reactions and cross-communication [28] between supported the two systems. Induction of hsp70 on tumors in vivo Hyperthermia can also provide a warning signal to the immune system, the one Anti-tumor reaction supported in vivo [29].

Examples 1. Generation of dendritic cells

Mononukleäre periphere Blutzellen (PBMC) wurden aus Leukopherese-Proben durch Fi col1-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation (Pharmacia, Biotech, Freiburg, Deutschland) präpariert. Um CD14+ Monocyten zu gewinnen, wurden 30 × 10⁶ PBMN in 75 cm² Kunst stoffkolben (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) 2 Stunden lang inkubiert und die nichtadhä renten Zellen ausgewaschen. Die adhärenten Zellen wurden darauf 8 Tage lang in RPMI VLE (Biochrom, Berlin, Deutschland) kultiviert, das mit 2 mM Glutamin, 100 U/ml Pen/Strep (alles von Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland), und mit 1% autologem Serum ergänzt war. Zur Erzeugung von DC's wurden GM-CSF (500 U/ml) (Hölzel Di agnostika, Köln, Deutschland) und IL-4 (800 U/ml) (Biomol, Hamburg, Deutschland) am Tag 0 zugesetzt und GM-CSF wurde erneut am Tag 4 der Kultur zugesetzt.Mononuclear peripheral blood cells (PBMC) were prepared from leucopheresis samples by Fi col1-Hypaque density gradient centrifugation (Pharmacia, Biotech, Freiburg, Germany). In order to obtain CD14 + monocytes, 30 × 10 ⁶ PBMN were incubated in 75 cm ² plastic flasks (Nunc, Wiesbaden, Germany) for 2 hours and the non-adherent cells were washed out. The adherent cells were then cultured for 8 days in RPMI VLE (Biochrom, Berlin, Germany), with 2 mM glutamine, 100 U / ml pen / strep (all from Life Technologies, Karlsruhe, Germany) and with 1% autologous serum was added. To generate DC's, GM-CSF (500 U / ml) (Hölzel Diagnostics, Cologne, Germany) and IL-4 (800 U / ml) (Biomol, Hamburg, Germany) were added on day 0 and GM-CSF was again added to the culture on day 4.

2. Stimulation of monocytes and immature dendritic cells

Menschliches rekombinantes hsp70 (0,1-1 µg/ml) (StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) wurde zu Monocyten am selben Tag wie der Zusatz von GM-CSF und IL-4 zuge setzt, nämlich am Tag 0 (d. h. zu den differenzierenden Vorläufern) oder nachdem die Mo nocyten in GM-CSF und IL-4 5 Tage lang kultiviert wurden (d. h. zu differenzierten DC). Human recombinant hsp70 (0.1-1 µg / ml) (StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) was added to monocytes on the same day as the addition of GM-CSF and IL-4 sets, namely on day 0 (i.e. to the differentiating precursors) or after the Mon nocytes were cultivated in GM-CSF and IL-4 for 5 days (i.e. to differentiated DC).

Eine FACS-Analyse von Zelloberflächenmarkern wurde am Tag 8 durchgeführt. Kontroll kulturen wurden in Medium plus GM-CSF und IL-4 alleine oder unter Zusatz von menschlichem rekombinantem hsc70 (0,5-1 µg/ml) (StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) oder unter Zusatz von menschlichem rekombinantem hsp70, erhitzt (0,5-1 µg/ml) (100°C für 20 Min.) entweder zu Beginn der Kultur (Tag 0) oder am Tag 5 der Kultur ein gerichtet. Parallele Kontrollkulturen, enthaltend Polymyxin B (0,5 µg/ml) (Sigma, Deisen hofen, Deutschland) wurden ebenfalls eingeschlossen.A FACS analysis of cell surface markers was performed on day 8. control cultures were grown in medium plus GM-CSF and IL-4 alone or with the addition of human recombinant hsc70 (0.5-1 µg / ml) (StressGen Biotechnologies, Victoria, Canada) or with the addition of human recombinant hsp70, heated (0.5-1 µg / ml) (100 ° C for 20 min.) Either at the beginning of the culture (day 0) or on day 5 of the culture directed. Parallel control cultures containing polymyxin B (0.5 µg / ml) (Sigma, Deisen hofen, Germany) were also included.

3. FACS analysis

Die zur Bestimmung der DC-Reifung durch FACS-Analyse verwendeten Antikörper schlossen CD1a, CD40, CD86 (Pharmingen Hamburg, Deutschland), CD14 und CD83 (Immunotech Hamburg, Deutschland) und HLA-DR ein. Die Isotypkontrollen, die ver wendet wurden, schlossen IgG1, IgG2a und IgG2b (alle von Immunotech) ein. Die Zellen wurden in PBS gewaschen, das 5% FCS enthielt. Eine Färbung wurde bei 4°C für 30 Min. unter Verwendung von monoklonalen Mausantikörpern zu den oben erwähnten Markern durchgeführt. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit PE-konjugiertem Ziegen-Anti- Maus IgG (Dako, Hamburg, Deutschland) für 30 Min. bei 4°C inkubiert. Die Zellen wur den dann gewaschen und in 500 µl PBS (Life Technologies) plus 5% FCS (Biochrom) resuspendiert. Alle FACS-Analysen wurden auf einem FACScan (Becton Dickinson, Mountain View CA) unter Verwendung der Cell Quest Software durchgeführt.The antibodies used to determine DC maturation by FACS analysis included CD1a, CD40, CD86 (Pharmingen Hamburg, Germany), CD14 and CD83 (Immunotech Hamburg, Germany) and HLA-DR. The isotype controls ver IgG1, IgG2a and IgG2b (all from Immunotech) included. The cells were washed in PBS containing 5% FCS. Staining was carried out at 4 ° C for 30 min. using mouse monoclonal antibodies to the markers mentioned above carried out. The cells were then washed and treated with PE conjugated goat anti Mouse IgG (Dako, Hamburg, Germany) incubated for 30 min at 4 ° C. The cells were then washed and in 500 µl PBS (Life Technologies) plus 5% FCS (Biochrom) resuspended. All FACS analyzes were carried out on a FACScan (Becton Dickinson, Mountain View CA) using Cell Quest software.

4. T cell proliferation assay and IFN-γ production

Monocyten wurden von einem HLA-A*0201 Spender wie vorstehend beschrieben isoliert. Menschliche DC's wurden in GM-CSF und IL-4 enthaltendem Medium erzeugt. Hsp70 (0,5 µg/ml) wurde unreifen DC's von den Tagen 5 bis 8 der Kultur zugesetzt. Die Zellen wurden dann geerntet und zu 10.000 DC's/Well in 100 µl Medium in 96 Well Rundboden platten (Nunc) resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit Tyrosinase 369-377 Peptid (1-10 µg/ml) für 2 Stunden gepulst und dann bestrahlt. Tyrosinasepeptid-spezifische T-Zellen 2 × 10⁴ in 100 µl RPMI-Medium (Biochrom), das 10% FCS und 100 U/ml IL2 (Biomol) enthielt, wurden dann jedem Well zugesetzt. Kontrollwells enthielten keine mit Tyrosinase gepulsten DC und CTL oder DC alleine oder CTL alleine. Die Zellen wurden 72 Stunden lang bei 37°C inkubiert und 1 µCi von ³H-Thymidin (Amersham Pharmacia Biotech, Frei burg, Deutschland) wurde den Wells für die letzten 24 Stunden der Kultur zugesetzt. Die Menge an ³H-Thymidin, die eingebaut wurde, wurde unter Verwendung eines microBeta- Zählers (Beckman, Deutschland) nachgewiesen.Monocytes were isolated from an HLA-A * 0201 donor as described above. Human DC's were generated in medium containing GM-CSF and IL-4. Hsp70 (0.5 µg / ml) was added to immature DC's from days 5 to 8 of the culture. The cells were then harvested and resuspended at 10,000 DC's / well in 100 μl medium in 96-well round-bottom plates (Nunc). The cells were then pulsed with tyrosinase 369-377 peptide (1-10 µg / ml) for 2 hours and then irradiated. Tyrosinase peptide-specific T cells 2 × 10 ⁴ in 100 ul RPMI medium (biochrom) containing 10% FCS and 100 U / ml IL2 (Biomol) were then added to each well. Control wells contained no tyrosinase pulsed DC and CTL or DC alone or CTL alone. The cells were incubated at 37 ° C for 72 hours and 1 µCi of ³ H-thymidine (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) was added to the wells for the last 24 hours of culture. The amount of ³ H-thymidine that was incorporated was detected using a microBeta counter (Beckman, Germany).

Parallele Kulturen wurden ebenfalls errichtet und die Überstände (100 µl) wurden nach 24 Stunden Kultur entfernt. Die Menge an IFN-γ, die erzeugt wurde, wurde unter Verwen dung eines IFN-γ-spezfischen ELISA-Kits bestimmt (cytimmune, Maryland).Parallel cultures were also established and the supernatants (100 µl) were removed after 24 Hours of culture away. The amount of IFN-γ that was generated was used of an IFN-γ-specific ELISA kit (cytimmune, Maryland).

5. FITC labeling of rhsp70

Rekombinantes Hsp70 (Stressgene) und BSA-Fraktion V (Sigma) wurden mit FITC (Sig ma) in 0,1 M Carbonat-Bicarbonatpuffer über Nacht bei 4°C unter sanftem Rühren inku biert. Freies FITC und niedermolekulare Reaktionsnebenprodukte wurden durch Trennen des Gemisches durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-25 entfernt. Frakti onen, die Protein enthielten, wurden gesammelt. Die Anzahl an FITC-Molekülen wurde als zwischen 3 bis 4 pro Molekül Protein durch Vergleich der optischen Dichten bei 280, 495 und 490 nm beurteilt. Die konjugierten Proteine wurden durch SDS-PAGE auf Identität getestet und ein Immunoblotting wurde bezüglich des spezifischen Antikörpers gegen Hsp70 (SPA810, Stressgene) und mit monoklonalem Anti-FITC Antikörper (Dako, Ham burg, Deutschland) getestet.Recombinant Hsp70 (stress genes) and BSA fraction V (Sigma) were analyzed with FITC (Sig ma) in 0.1 M carbonate bicarbonate buffer overnight at 4 ° C with gentle stirring biert. Free FITC and low molecular weight reaction by-products were separated the mixture removed by gel filtration using Sephadex G-25. Frakti Those containing protein were collected. The number of FITC molecules was calculated as between 3 to 4 per molecule of protein by comparing the optical densities at 280, 495 and 490 nm judged. The conjugated proteins were identified by SDS-PAGE on identity was tested and immunoblotting was carried out for the specific antibody against Hsp70 (SPA810, stress genes) and with monoclonal anti-FITC antibody (Dako, Ham castle, Germany).

6. FACS analysis of the binding of FITC-labeled rhsp70 to monocyte-derived menden immature and mature DC

Monocyten wurden nach zweistündiger Adhärenz von PBMC an Kunststoff gewonnen. Die nichtadhärenten Zellen wurden ausgewaschen und die adhärenten Zellen wurden ge waschen. Unreife DC's wurden durch Kultivieren von Monocyten-Vorläuferzellen in GM- CSF und IL-4 enthaltendem Medium für 8 Tage, wie in Abschnitt 1 beschrieben, kultiviert. Reife DC's wurden ebenfalls durch Zusatz eines Reifungscocktails, der IL-1β, IL-6, TNF- α und PGE2 [19] enthielt, zu den DC's von Tag 6 bis 8 gewonnen. Die Zellen wurden für CD14 und CD83 gefärbt und PE markiert, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Die Zellen wur den dann mit den FITC-konjugierten Proteinen 30 Minuten lang auf Eis in einem Medium inkubiert, das 1% autologes Serum in einer Konzentration von 10 µg/ml enthielt. Nach Waschen wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und durch Durchflußcytometrie analysiert. Die Zellen wurden ebenfalls mit Propidiumiodid markiert und positive Zellen wurden ausgeschlossen.Monocytes were obtained after PBMC had adhered to plastic for two hours. The non-adherent cells were washed out and the adherent cells were ge to wash. Immature DCs were obtained by culturing monocyte progenitor cells in GM Medium containing CSF and IL-4 cultured for 8 days as described in Section 1. Mature DC's were also made by adding a ripening cocktail, the IL-1β, IL-6, TNF- α and PGE2 [19] were obtained at the DC's from day 6 to 8. The cells were made for CD14 and CD83 stained and PE labeled as described in Section 3. The cells were then with the FITC-conjugated proteins on ice in a medium for 30 minutes incubated containing 1% autologous serum in a concentration of 10 µg / ml. To The cells were washed with paraformaldehyde and fixed by flow cytometry analyzed. The cells were also labeled with propidium iodide and positive cells were excluded.

literature

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Claims

1. Ex vivo method for inducing TNF-α free differentiation from immature dendritic cells to mature dendritic cells, the method being described in Be Stir the immature dendritic cells with an effective amount of egg heat shock protein of the hsp70 family or a biologically active part includes this.

2. The method of claim 1, wherein the biologically active part is the C-terminal Domain of hsp70 is.

3. The method of claim 1 to 2, wherein the immature dendritic cells by Culturing monocytes in an induction medium, the Gra nulocyte / macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF") and Interleu kin-4 ("IL-4") contains.

4. Ex vivo methods of producing mature dendritic cells, the method comprising:

a) inducing differentiation from immature dendritic cells to mature dendritic cells by contacting the immature dendritic cells with an effective amount of a heat shock protein of the hsp70 family or a biologically active part thereof which are free of TNF-α; and
b) collecting the mature dendritic cells.

5. The method according to claim 4, wherein the biologically active part is the C-terminal Domain of hsp70 is.

6. The method of claim 4 or 5, wherein the immature dendritic cells by Culturing monocytes in an induction medium, the Gra nulocyte / macrophage colony stimulating factor ("GM-CSF") and Interleu kin-4 ("IL-4") contains.

7. The method of claim 3 and 6, wherein the monocytes human blood cell Are monocytes.

8. The method of claim 7, wherein the monocytes are plastic-adherent mono are cyten.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the mature dendritic cells len continue to be pulsed with an antigenic agent.

10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein hsp70 is recombinant (RHsp70).

11. The method of claim 10 which includes maintaining the rhsp70 concentration in the culture medium in the range of approximately 0.1-1.0 µg / ml.

12. The method of claim 11, wherein the concentration of rhsp70 is approximately 0.5 µg / ml.

13. Mature dendritic cells by the method according to any one of claims 4 to 6 can be won.

14. TNF-α free therapeutic composition for inducing maturation of immature dendritic cells, comprising, as the only active maturing agent, ei an effective amount of heat shock proteins from the hsp70 family or a biolo gisch active part thereof, in combination with a pharmaceutically acceptable len carrier.

15. The therapeutic composition of claim 14, comprising rhsp70.

16. A therapeutic composition, the mature dendritic cells according to claim 13 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.

17. A therapeutic composition according to any one of claims 14 to 16, which a Vaccine is.

18. Use of the composition according to any one of claims 14 to 17 in the Immunotherapy for tumor disorders.

19. Use of the composition according to any one of claims 14 to 17 for In reduce TNF-α free maturation of immature dendritic cells.