DE10111083A1

DE10111083A1 - Chitin deacetylase and process for its preparation

Info

Publication number: DE10111083A1
Application number: DE10111083A
Authority: DE
Inventors: Hayssam Zakaria; Bernd Otto; Christian Schmalz
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2001-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2021-03-09
Also published as: WO2002070712A3; AU2002254936A1; DE10111083B4; WO2002070712A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Chitindeacetylasesequenzen und davon codierte Proteine, die für die Umsetzung von Biopolymeren zu Glucosamin geeignet sind.The present invention relates to chitin deacetylase sequences and proteins encoded thereby, which are suitable for the conversion of biopolymers to glucosamine.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit der Aktivität einer Chitindeacetylase, dieses Pro tein codierende Nucleotidsequenzen, Verfahren zur Herstellung sowie der Verwendung derselben.The present invention relates to a protein the activity of a chitin deacetylase, this pro encoding nucleotide sequences, methods for Manufacture and use of the same.

Chitin besteht aus linear β-1,4-verknüpften 2-Ace toamido-2-Desoxyglucose (N-Acetyl-glucosamin) und besitzt strukturelle Ähnlichkeit zu Cellulose. Ge reinigtes Chitin ist makroskopisch ein amorpher, farbloser Feststoff, der stets 5 bis 10 Gew.-% Was ser enthält und untoxisch ist. Chitin ist in Wasser unlöslich, ebenso in verdünnten Säuren, Laugen, Al koholen und anderen organischen Lösungsmitteln. In wässrigen organischen Säuren, inklusive Ameisen- und Essigsäure, ist Chitin löslich (Feofilova et al., 1984, Hirano, 1986). Chitosan, also 2-Amino-2- desoxy-D-glucose, ist das deacetylierte Derivat des Chitins. Die Bezeichnung Chitosan bezeichnet keinen einzelnen Stoff, sondern ein Stoffgemisch. Chitosan liegt definitionsgemäß dann vor, wenn ein Deacyte lisierungsgrad von < 50% vorliegt. Dabei ist die Kettenlänge nicht definiert und von dem zur Her stellung verwendeten Material und Verfahren abhän gig. Chitosan ist ein amorpher Feststoff mit circa 5 Gew.-% Wasseranteil, der in wässrigen, organi schen Säuren löslich, in Wasser hingegen nicht lös lich ist. Chitosan weist mit einer LD₅₀ < 16 g/kg in Mäusen eine sehr geringe Toxizität auf. Überdies gehört es zu den wenigen, natürlich vorkommenden kationisch vorkommenden Polyelektrolyten (Hirano, a.a.O.) und besitzt dementsprechend gute Komplexie rungseigenschaften.Chitin consists of linear β-1,4-linked 2-acetoamido-2-deoxyglucose (N-acetyl-glucosamine) and is structurally similar to cellulose. Ge purified chitin is macroscopically an amorphous, colorless solid that always contains 5 to 10 wt .-% What water and is non-toxic. Chitin is insoluble in water, as well as in dilute acids, alkalis, alcohols and other organic solvents. Chitin is soluble in aqueous organic acids, including formic and acetic acid (Feofilova et al., 1984, Hirano, 1986). Chitosan, i.e. 2-amino-2-deoxy-D-glucose, is the deacetylated derivative of chitin. The term chitosan does not refer to a single substance, but a mixture of substances. By definition, chitosan is present when there is a degree of deacytization of <50%. The chain length is not defined and depends on the material and process used to manufacture it. Chitosan is an amorphous solid with a water content of approx. 5% by weight, which is soluble in aqueous, organic acids but not soluble in water. Chitosan has a very low toxicity in mice with an LD ₅₀ <16 g / kg. Furthermore, it is one of the few naturally occurring cationically occurring polyelectrolytes (Hirano, loc. Cit.) And accordingly has good complexation properties.

Chitin ist in der Natur das nach Cellulose am zweithäufigsten vorkommende Biopolymer. Dieses Bio polymer kommt hauptsächlich in Insekten, marinen Invertebraten und Pilzen vor. Der Anteil an Chitin beträgt in der Cuticula von Crustaceen, Insekten beziehungsweise der Zellwand von Pilzen circa 20 bis 40 Gew.-% der Trockenmasse. Der Rest besteht aus Proteinen sowie bei Crustaceen aus Calciumcar bonat, bei Insekten aus phenolischen Verbindungen und bei Pilzen aus anderen Polysacchariden. Im bio logischen Kreislauf werden jährlich schätzungsweise 109 Tonnen Chitin und Chitosan umgesetzt. Es werden dabei zwei in der Natur vorkommende Wege des biolo gischen Chitinabbaus postuliert.In nature, chitin is the most like cellulose second most common biopolymer. This bio polymer mainly comes from insects, marine Invertebrates and mushrooms. The percentage of chitin is in the cuticle of crustaceans, insects or the cell wall of fungi around 20 up to 40% by weight of the dry matter. The rest are there from proteins and from crustaceans from calcium car bonat, for insects made from phenolic compounds and mushrooms from other polysaccharides. In the bio Logical cycle are estimated annually 109 tons of chitin and chitosan converted. It will two ways of biolo occurring in nature post-chemical chitin breakdown.

Gemäß eines ersten experimentell gut belegten Ab bauweges wird zunächst das makromolekulare Chitin durch extrazellulär sezernierte Chitinasen zerklei nert, wobei als Produkte Chitin-Oligomere und unter weiterer Einwirkung der Chitinase schließlich Dime re, also Chitobiose (GlcNAc)₂ entstehen. Letztere werden nach Aufnahme in die Zelle durch Chitobiasen (N-Acetyl-Glucosamidase) zu N-Acetyl-glucosamin ge spalten, das nach Deacetylierung durch N-Acetyl- glucosamin-Deacetylase in den weiteren Stoffwechsel eingeht. Gemäß eines zweiten, weniger gut unter suchten Abbauweges, der auch als Chitosanweg be zeichnet wird, wird das durch einen Deacetylie rungsschritt mittels einer Chitindeacetylase gewonnene Produkt Chitosan durch eine Chitosanase in Oligo- und Disaccharide ((GlcN)₂) und durch eine Glucosamidase anschließend in das Monosaccharid Glucosamin umgewandelt, das dann in die Zelle auf genommen und verstoffwechselt werden kann.According to a first experimentally well-proven degradation pathway, the macromolecular chitin is first comminuted by extracellularly secreted chitinases, chitin oligomers being produced as products and finally dime re, i.e. chitobiose (GlcNAc) _{2, being} produced under the further influence of the chitinase. The latter are cleaved into the cell by chitobiases (N-acetyl-glucosamidase) to form N-acetyl-glucosamine, which after deacetylation by N-acetyl-glucosamine deacetylase goes into further metabolism. According to a second, less well-researched degradation route, which is also referred to as the chitosan route, the product chitosan obtained by a deacetylation step using a chitin deacetylase is converted into oligo- and disaccharides ((GlcN) ₂ ) and subsequently by a glucosamidase by a chitosanase converted the monosaccharide glucosamine, which can then be taken up into the cell and metabolized.

Erst in den 70er Jahren wurde nach Möglichkeiten gesucht, zum Beispiel anfallende Krabben-Abfälle als natürliche Rohstoffquelle zu nutzen. Im Zuge dieser Entwicklung wurden die Eigenschaften und das Potential von Chitin und seinen Derivaten, wie Chi tosan, als natürliche Polymere untersucht. Diese finden Anwendung in den unterschiedlichsten Berei chen, wie der Nahrungsmittelherstellung, der Land wirtschaft und der pharmazeutischen Industrie (Muz zarelli, 1977).It wasn't until the 1970s that opportunities were found wanted, for example crab waste to use as a natural source of raw materials. In the course of this development became the properties and that Potential of chitin and its derivatives, such as chi tosan, studied as natural polymers. This are used in a wide variety of areas like the food production, the country economy and the pharmaceutical industry (Muz Zarelli, 1977).

Obgleich Chitindeacetylasen anderer Organismen, zum Beispiel Mucor rouxii, Colletotrichium lindemuthia num, Streptomyces coelicolor, Deinococus radiodu rans oder Saccharomyces cerevisiae, bekannt sind (Tokuyasu et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.; 60(10); 1598-603 (1996) und Kafetzopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 90 (17); 8005-8 (1993)) besteht ein ständiger Bedarf nach weiteren Chitin deycetylasen.Although chitin deacetylases from other organisms to Example Mucor rouxii, Colletotrichium lindemuthia num, Streptomyces coelicolor, Deinococus radiodu rans or Saccharomyces cerevisiae, are known (Tokuyasu et al., Biosci. Biotechnol. Biochem .; 60 (10); 1598-603 (1996) and Kafetzopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UNITED STATES; 90 (17); 8005-8 (1993)) there is a constant need for more chitin deycetylasen.

Die Herstellung von Chitosan aus chitinhaltigen Krabbenabfällen der Fischereiindustrie erfolgte bislang durch eine ineffizienten und umweltbelas tenden thermochemischen Prozess. Das daraus gewon nene Chitosan ist für medizinische Applikationen nur bedingt geeignet und deshalb in Deutschland nicht zugelassen. Die enzymatische Herstellung von Chitosan durch eine Chitindeycetylase scheiterte bisher an einem Mangel geeigneter katabolischer En zyme.The production of chitosan from chitin-containing Crab waste from the fishing industry took place so far due to an inefficient and environmentally harmful tendency thermochemical process. The won from it nene Chitosan is for medical applications only suitable to a limited extent and therefore in Germany not allowed. The enzymatic production of Chitosan failed due to a chitindeycetylase a lack of suitable catabolic ene zyme.

Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende A technische Problem besteht also darin, Mittel und Verfahren für den Abbau von Chitin zu Chitosan be reitzustellen, die es ermöglichen, in effizienter, umweltschonender und kostengünstiger Weise in in dustriellem Maßstab aus Chitin Chitosan herzustel len, wobei die erhaltenen Chitosanpräparationen für eine Vielzahl von pharmazeutischen Anwendungen ge eignet sein sollen.The A. On which the present invention is based So the technical problem is means and Process for the degradation of chitin to chitosan re-sit, which make it possible in efficient, environmentally friendly and cost effective way in industrial scale from chitin chitosan len, the chitosan preparations obtained for a variety of pharmaceutical applications ge should be suitable.

Das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende technische Problem wird durch die Bereitstellung von, vorzugsweise isolierten und gereinigten, Nuc leinsäuremolekülen bereitgestellt, die ein Protein mit der Aktivität einer Chitindeacetylase codieren. Die Erfindung löst dieses Problem auch durch die Bereitstellung eines Proteins mit der Aktivität ei ner Chitindeacetylase aus einem grampositiven Bak terium sowie Verfahren zur Herstellung von Chitosan aus Chitin, wobei das vorgenannte Protein einge setzt wird.The basis of the present invention technical problem is caused by the deployment of, preferably isolated and purified, nuc Linseed acid molecules provided that are a protein encode with the activity of a chitin deacetylase. The invention also solves this problem by Providing a protein with the activity egg A chitin deacetylase from a gram positive bak terium and process for the production of chitosan from chitin, the aforementioned protein being incorporated is set.

Die vorliegende Erfindung löst das ihr zu Grunde liegende technische Problem insbesondere durch die Bereitstellung eines, vorzugsweise vollständig ge reinigten und isolierten, Nucleinsäuremoleküls, das ein Protein mit der Aktivität einer Chitindeacety lase codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
The present invention solves the technical problem on which it is based in particular by providing a, preferably completely purified and isolated, nucleic acid molecule which encodes a protein with the activity of a chitin deacety lase, selected from the group consisting of

a) a nucleic acid molecule with one of the in SEQ ID Nos. 1 to 7 nucleotide shown sequence or a fragment thereof;
b) a nucleic acid molecule with a sequence, which is a protein with one of SEQ ID No. 8 encoded to 13 sequence shown a fragment of it;
c) a nucleic acid molecule that forms a nuc Complement the linseic acid molecule according to a) or b) is tary or a fragment thereof;
d) a nucleic acid molecule which by Substi tution, addition, inversion and / or dele tion of one or more bases of a nuc Linseed acid molecule according to a) to c) available is; and
e) a nucleic acid molecule which, for example due to the degeneration of the genetic Codes with a nucleic acid molecule according to a) to d) or a fragment thereof hybridi Siert.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein mit der Aktivität einer Chitin deacetylase ein Protein verstanden, das in der Lage ist, Chitin zu Chitosan zu deacetylieren, wobei in bevorzugter Ausführung die genannte Aktivität die einzige enzymatische Aktivität des Proteins ist.In connection with the present invention under a protein with the activity of a chitin deacetylase understood a protein that is capable of is to deacetylate chitin to chitosan, whereby in preferred execution said activity the only enzymatic activity of the protein is.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung kann das Nucleinsäuremolekül ein DNA- oder RNA-Molekül in linearer oder zirkulärer Form sein.In a preferred embodiment of the present According to the invention, the nucleic acid molecule can be a DNA or RNA molecule in linear or circular form his.

In besonders bevorzugter Ausführungsform der vor liegenden Erfindung stammt das Nucleinsäuremolekül aus einem grampositiven Bakterium, insbesondere ei nem Bakterium der Gattung Promicromonospora aus dem Stamm der Actinobacterien. Der Stamm weist auf Nuc leinsäureebene hinsichtlich der 16S-RNA eine Homo logie von 95,4% zu Promicromonospora citrea auf. Damit gehört er entweder als neue Art der gleichen Gattung oder einer neuen Gattung an.In a particularly preferred embodiment of the lying invention the nucleic acid molecule from a gram positive bacterium, especially egg a bacterium of the genus Promicromonospora from the Strain of Actinobacteria. The trunk points to nuc linseic acid level a homo with respect to the 16S-RNA log of 95.4% on Promicromonospora citrea. So it belongs either as a new kind of the same Genus or a new genus.

Die Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäu remoleküle, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen des erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküls, insbesondere innerhalb der codierenden Sequenz eines Nucleinsäuremoleküles, erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuremoleküle, die als Mutanten, Derivate oder funktionelle Äquivalen te, also strukturverschiedene, aber funktionsglei che Derivate eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküls bezeichnet werden können. Solche Manipula tionen der Sequenzen werden beispielsweise durchge führt, um die von einer Nucleinsäure codierte Ami nosäuresequenz gezielt zu verändern. Nucleinsäuren, die veränderte Chitindeacetylasen codieren, können zur Gewinnung rekombinanter Proteine mit veränder tem Eigenschaftsprofil verwendet werden. Beispiels weise kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle so zu modifizieren, dass die Genprodukte leichter gewonnen werden können, zum Beispiel durch Fusion zu Sekretionssignalpeptiden, die eine Sezernation des Genproduktes in den extra zellulären Raum gewährleisten. Gezielte Sequenzver änderungen können auch dem Ziel dienen, innerhalb der Nucleinsäuresequenz geeignete Restriktions schnittstellenbereiche bereitzustellen oder nicht erforderliche Nucleinsäuresequenzen oder Restrikti onsschnittstellen zu entfernen. Dabei werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in Plasmide insertiert und mittels Standardverfahren der Mikro biologie oder Gentechnologie einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unter zogen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie Transitionen und Transver sionen, sind beispielsweise Verfahren zur in vitro- Mutagenese, "Primer Repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren geeignet (Vergleich Sambrook et al., 1989, Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). Sequenz veränderungen lassen sich auch durch Anlagerung be ziehungsweise Fusion natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen zu der natürlichen Sequenz erreichen. Beispiele für synthetische Nucleinsäure sequenzen sind Adaptoren oder Linker, die unter an derem auch zur Verknüpfung von Nucleinsäure- Fragmenten an diese Fragmente angefügt werden kön nen.The invention also includes modified nucleic acid remolecules, for example by substitution, Addition, inversion and / or deletion of one or several bases of the nucleic acid according to the invention molecule, especially within the coding Sequence of a nucleic acid molecule available are, that is also nucleic acid molecules that as mutants, derivatives or functional equivalents te, structurally different, but functionally the same che derivatives of a nucleic acid according to the invention Molecule can be called. Such manipulation cations of the sequences are performed, for example leads to the Ami encoded by a nucleic acid To specifically change the acid sequence. nucleic acids, encoding modified chitin deacetylases for the production of recombinant proteins with alter property profile can be used. example way can be provided, the invention Modify nucleic acid molecules so that the Gene products can be obtained more easily by Example by fusion to secretion signal peptides, which secrete the gene product into the extra ensure cellular space. Targeted sequence ver Changes can also serve the goal within appropriate restriction of the nucleic acid sequence to provide interface areas or not required nucleic acid sequences or restrictions to remove interfaces. The Nucleic acid molecules according to the invention in plasmids inserted and using standard methods of micro biology or genetic engineering of a mutagenesis or a sequence change by recombination under pulled. To create insertions, deletions or substitutions such as transitions and transvers sions, are for example methods for in vitro Mutagenesis, "Primer Repair" process as well Restriction and / or ligation procedures are suitable (Compare Sambrook et al., 1989, Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). sequence Changes can also be caused by accumulation or fusion of natural or synthetic Nucleic acid sequences to the natural sequence to reach. Examples of synthetic nucleic acid sequences are adapters or linkers that are listed below also to link nucleic acid Fragments can be attached to these fragments NEN.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäu remoleküle, die mit einem der vorstehend beschrie benen Nucleinsäuremoleküle nach a) bis d) hybridi sieren. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Nucleinsäuremole kül, das mit einem Nucleinsäuremolekül hybridisiert" erfasst ein Nucleinsäuremolekül oder eine Nucleinsäure, die unter mäßig stringenten Bedingun gen mit einem Nucleinsäuremolekül oder einer Nuc leinsäure nach a) bis d) hybridisiert. Beispiels weise kann die Hybridisierung mit einer radioakti ven Gensonde in einer Hybridisierungslösung (25% Formamid; 5 × SSPE; 0,1% SDS; 5 × Denhardt-Lösung; 50 µg/ml Heringsperma-DNA; bezüglich Zusammenset zung der Einzelkomponenten vgl. Sambrook et al., a. a. O.) 20 Stunden bei 37°C erfolgen. Anschließend wird unspezifisch gebundene Sonde durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C entfernt. Vorzugsweise werden die Filter mit 0,5 × SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Diese Nucleinsäu remoleküle weisen in bevorzugter Ausführungsform mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 70%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% und besonders be vorzugt mindestens 99% Homologie (Identität) auf Nucleinsäureebene zueinander auf.The present invention also encompasses nucleic acid remolecules described with one of the above benen nucleic acid molecules according to a) to d) hybridi Sieren. The related to the present Invention used expression "nucleic acid moles cool that hybridizes with a nucleic acid molecule " detects a nucleic acid molecule or a Nucleic acid that is under moderately stringent conditions gene with a nucleic acid molecule or a nuc Linseed hybridized according to a) to d). example Hybridization with a radioacti ven gene probe in a hybridization solution (25% formamide; 5 x SSPE; 0.1% SDS; 5 × Denhardt's solution; 50 µg / ml herring sperm DNA; regarding composition for the individual components cf. Sambrook et al., a. a. O.) 20 hours at 37 ° C. Subsequently becomes unspecifically bound probe by multiple Wash the filters in 2 × SSC / 0.1% SDS at 42 ° C away. The filters are preferably 0.5 × SSC / 0.1% SDS, particularly preferably 0.1 × SSC / 0.1% SDS washed at 42 ° C. This nucleic acid In a preferred embodiment, remolecules have at least 60%, preferably at least 70%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% and especially be prefers at least 99% homology (identity) Nucleic acid level to each other.

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls Nuc leinsäuremoleküle, die ein Polypeptid oder Protein mit der Aktivität einer Chitindeacetylase codieren, dessen Aminosäuresequenz mindestens 40%, vorzugs weise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindes tens 70%, 80%, 90%, 95% insbesondere 99% Homo logie zu einem Polypeptid oder Protein aufweist, das von einer Nucleinsäure mit einer der in SEQ ID Nr. 1 bis 7 dargestellten Sequenzen codiert wird.The present invention also encompasses nuc linseic acid molecules that are a polypeptide or protein encode with the activity of a chitin deacetylase, whose amino acid sequence at least 40%, preferably wise at least 60%, particularly preferably at least at least 70%, 80%, 90%, 95% especially 99% homo logic to a polypeptide or protein, that of a nucleic acid with one of those in SEQ ID Nos. 1 to 7 sequences shown are encoded.

Im Zusammenhang mit der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 70%, 80%, 90%, 95% insbesondere 99% Homologie" auf eine Sequenzübereinstimmung auf der Aminosäuresequenz- Ebene, die mit Hilfe bekannter Verfahren, zum Bei spiel computergestützter Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Bio. 215 (1990), 403-410), bestimmt werden kann.In connection with the invention, the Expression "at least 40%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 70%, 80%, 90%, 95% especially 99% homology "on one Sequence match on the amino acid sequence Level, using known methods, to game of computer-aided sequence comparisons (Basic local alignment search tool, S.F. Altschul et al., J. Mol. Bio. 215 (1990), 403-410) can.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck "Homologie" be zeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehreren Polypeptid-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird, wobei Übereinstimmung sowohl eine identische Übereinstimmung als auch einen konservativen Amino säure-Austausch bedeuten kann. Der Prozentsatz der "Homologie" ergibt sich aus dem Prozentsatz über einstimmender Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Se quenzbesonderheiten.The term "homology" known to those skilled in the art draws the degree of kinship between two or more polypeptide molecules, which by the Match between the sequences determined being matched with both an identical Consistency as well as a conservative amino acid exchange can mean. The percentage of "Homology" results from the percentage above matching areas in two or more sequences considering gaps or other se quenzbesonderheiten.

Der Begriff "konservativer Aminosäure-Austausch" bedeutet den Austausch eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Aus tausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäu re führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Ami nosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Amino säurerest. Konservative Aminosäure-Austausche im Zusammenhang mit der Erfindung umfassen beispiels weise: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.The term "conservative amino acid exchange" means the exchange of an amino acid residue for another amino acid residue, this Aus do not swap for a change in polarity or Charge at the position of the exchanged amino acid re leads, e.g. B. the exchange of a non-polar Ami nosa residues against another non-polar amino acid residue. Conservative amino acid exchanges in Connection with the invention include, for example Wise: G = A = S, I = V = L = M, D = E, N = Q, K = R, Y = F, S = T G = A = I = V = L = M = Y = F = W = P = S = T.

Die Homologie zwischen miteinander verwandten Poly peptid-Molekülen kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Com puterprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevor zugte Verfahren zur Bestimmung der Homologie erzeu gen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Homologie zwischen zwei Sequenzen umfassen, z. B. das GCG-Programmpaket, einschließ lich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Re search, 12 (12) (1984), 387; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison (WI)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S., et al., J. Molec Bio 215 (1990), 403-410). Das BLASTX Programm kann vom National Centre for Biotechnology Informa tion (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (Altschul S., et al., BLAST Handbuch, NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. 215 (1990), 403-410). Auch der bekannte Smith Wa terman-Algorithmus kann zur Bestimmung der Homolo gle verwendet werden.The homology between related poly Peptide molecules can be made using known methods be determined. As a rule, special Com computer programs with special requirements Algorithms used. before generated methods for determining homology First the greatest agreement between the sequences examined. Computer programs for Determination of the homology between two sequences include, e.g. B. include the GCG program package Lich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Re search, 12 (12) (1984), 387; Genetics computer Group University of Wisconsin, Madison (WI)); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S., et al., J. Molec Bio 215 (1990), 403-410). The BLASTX program can be obtained from the National Center for Biotechnology Informa tion (NCBI) and from other sources (Altschul S., et al., BLAST Handbuch, NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. 215: 403-410 (1990)). The famous Smith Wa Terman's algorithm can be used to determine homolo be used.

Bevorzugte Standard-Parameter für den Aminosäurese quenz-Vergleich umfassen beispielsweise: Algorith mus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Vergleichsmatrix: BLOSUM 62 von He nikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 10915-10919; Lücken-Wert (Gap Penalty): 12 Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty): 4 Schwel lenwert der Ähnlichkeit: 0.Preferred standard parameters for amino acid synthesis Sequence comparison include, for example: algorithm mus: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Comparison matrix: BLOSUM 62 from He nikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 10915-10919; Gap Penalty: 12 Gap length penalty: 4 smoldering Similarity score: 0.

Auch das GAP-Programm eignet sich zur Verwendung der vorstehend beschriebenen Parameter. The GAP program is also suitable for use of the parameters described above.

Darüber hinaus lassen sich weitere Algorithmen, Lü cken-Öffnungs-Werte, Lückenausdehnungs-Werte und Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm- Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9 (September 1997) beschriebenen verwenden. Die Auswahl der Pro gramme hängt sowohl von dem durchzuführenden Ver gleich als auch davon ab, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren durchgeführt wird, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Se quenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind.In addition, other algorithms, Lü Corner opening values, gap expansion values and Comparison matrices including those in the program Manual, Wisconsin Package, version 9 (September 1997) use. The selection of the pro program depends both on the ver to be carried out the same as well depending on whether the comparison between Sequence pairs is performed, where GAP or Best Fit are preferred, or between a Se quenz and an extensive sequence database, FASTA or BLAST are preferred.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein, vorzugsweise isoliertes und partiell oder vollstän dig gereinigtes, Protein, das durch Expression ei nes erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls oder ei nes Fragments davon, zum Beispiel in einer Wirts zelle oder einem in vitro-Expressionssystem, er hältlich ist. Vorzugsweise besitzt das Protein die gleichen Chitin-deacetylierenden Eigenschaften wie das Protein, das von einem Nucleinsäuremolekül mit einer der in SEQ ID Nr. 1 bis 7 dargestellten Se quenz codiert wird. Zum Nachweis der Aktivität ei nes solchen Proteins können die in Chitin Enzymolo gy; Vol. 1 und 2, R. A. A. Muzzarelli, Editor, Atec Edizioni, Italien beschriebenen Chitindeacetylisie rungs-Experimente durchgeführt werden.The present invention also relates to a preferably isolated and partial or complete dig purified protein, which by expression ei nes nucleic acid molecule according to the invention or egg fragment of it, for example in a host cell or an in vitro expression system, he is stable. The protein preferably has the same chitin-deacetylating properties as the protein that is made up of a nucleic acid molecule one of the Se shown in SEQ ID No. 1 to 7 sequence is encoded. To prove the activity ei Such a protein can be found in Chitin Enzymolo gy; Vol. 1 and 2, R. A. A. Muzzarelli, Editor, Atec Edizioni, Italy described chitin deacetylisie experiments are carried out.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte und vollständig oder partiell gereinigte monoclona le oder polyclonale Antikörper oder deren Fragmen te, die mit einem erfindungsgemäßen Protein spezi fisch und mit einer solchen Affinität reagieren, insbesondere erkennen und binden, dass beispielsweise ein Nachweis und/oder Aufreinigung dieses Proteins möglich ist. Vorzugsweise reagieren die Antikörper oder deren Fragmente mit keinem anderen Antigen.The present invention also includes isolated ones and fully or partially purified monoclona le or polyclonal antibodies or their fragments te that speci with a protein of the invention fish and react with such an affinity, in particular recognize and bind that, for example proof and / or purification of this Protein is possible. Preferably the respond Antibodies or their fragments with no other Antigen.

Die Erfindung erfasst auch Vektoren, die die vor liegenden Nucleinsäuremoleküle oder deren Fragmente enthalten. Erfindungsgemäß kann der Vektor zum Bei spiel als Plasmid, Cosmid, Bakteriophage, Virus oder Liposom ausgeführt sein.The invention also encompasses vectors that precede the lying nucleic acid molecules or their fragments contain. According to the invention, the vector can be used for the play as plasmid, cosmid, bacteriophage, virus or liposome.

Die Erfindung betrifft ferner ein Konstrukt, das eine erfindungsgemäße Nucleinsäure und/oder ein Fragment davon enthält, vorzugsweise unter der Kon trolle von mindestens einem Expressions- Regulationselement. Im Zusammenhang mit der vorlie genden Erfindung bedeutet ein "Konstrukt", das hier auch als Vektor bezeichnet sein kann, die Kombina tion einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure oder ei nes Fragments davon mit mindestens einem Nuclein säure-Zusatzelement, beispielsweise einem Regulati onselement, Adaptoren, Linker, Spacer, Selektions markern, Replikationssequenzen o. ä. Beispiele für solche Regulationselemente sind konstitutive oder induzierbare Promotoren, wie der E.coli-Promotor araBAD (Carra und Schlief, EMBO J., 12 (1993), 35-44) zur Expression in Bakterien, der Hefepromotor PMA1 (Rentsch et al., FEBS Lett., 370 (1995), 264-268) zur Expression in Pilz-Systemen und der virale CaMV35S Promotor (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res., 14 (1986), 5857-5868) zur Expression in Pflanzen. The invention further relates to a construct that a nucleic acid according to the invention and / or a Contains fragment thereof, preferably under the Kon trolls from at least one expression Regulatory element. In connection with the present Invention means a "construct" that here The Kombina can also be called a vector tion of a nucleic acid according to the invention or egg nes fragment thereof with at least one nuclein acid additive element, for example a Regulati onselement, adapters, linkers, spacers, selection markers, replication sequences or similar examples for such regulatory elements are constitutive or inducible promoters, such as the E. coli promoter araBAD (Carra and Schlief, EMBO J., 12 (1993), 35-44) for expression in bacteria, the yeast promoter PMA1 (Rentsch et al., FEBS Lett., 370 (1995), 264-268) for expression in fungal systems and the viral CaMV35S promoter (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res., 14 (1986), 5857-5868) for expression in Plants.

Ferner kann die erfindungsgemäße Nucleinsäure oder das Fragment mit einem Transkriptions-Terminations signal versehen werden. Derartige Elemente sind be reits beschrieben worden (vgl. zum Beispiel Gielen et al., EMBO J., 8 (1984), 23-29).Furthermore, the nucleic acid according to the invention or the fragment with a transcription termination signal. Such elements are have already been described (see e.g. Gielen et al., EMBO J., 8: 8-29 (1984).

Die genannten Nucleinsäure-Zusatzelemente, zum Bei spiel Transkriptionsstart- und -terminationsberei che, können sowohl nativ (homolog) als auch fremd artig (heterolog) zum Wirtsorganismus sein. Die ge nannten Sequenzen der Nucleinsäure-Zusatzelemente, zum Beispiel der Transkriptionsstart- und -termina tionsregionen, können synthetischen oder natürli chen Ursprungs sein oder eine Mischung aus synthe tischen und natürlichen Bestandteilen enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Er findung ist das Konstrukt ein Plasmid.The above-mentioned nucleic acid additive elements play transcription start and termination area che, can be both native (homologous) and foreign be good (heterologous) to the host organism. The ge named sequences of the nucleic acid additional elements, for example the transcription start and term regions, can be synthetic or natural Chen origin or a mixture of synthesis tables and natural ingredients. In a particularly preferred embodiment of the Er the construct is a plasmid.

Die Nucleinsäure oder das Fragment kann in dem Kon strukt, insbesondere einem Plasmid, sowohl in Anti sinnorientierung als auch in Sinnorientierung zu dem/den regulatorischen Element(en) vorliegen.The nucleic acid or fragment can be in the con strukt, especially a plasmid, both in anti sense orientation as well as sense orientation too the regulatory element (s) are available.

Selbstverständlich erfasst die Erfindung auch die Anordnung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekü le in einem polycistronischen Gen-Cluster. Gemäß einer solchen Ausführungsform betrifft die Erfin dung eine unter der operativen Kontrolle einer Pro moterregion, die für eine Gruppe von Genen als Kon trollelement dieses Operons wirkt, stehende erfin dungsgemäße Nucleinsäure. Solche Gene werden demge mäß gemeinsam transkribiert. Die einzelnen Gene weisen in den intercistronischen Regionen Sequenzen auf, an denen nach der Transkription Ribosomen an die RNA binden. Aufgrund dieser Ribosomen-Bindungs- Stellen, auch Shine-Dalgarno-Sequenzen genannt, können die jeweiligen Proteine separat translatiert werden.Of course, the invention also covers the Arrangement of the nucleic acid molecule according to the invention le in a polycistronic gene cluster. According to such an embodiment relates to the invention one under the operational control of a pro moterregion, which for a group of genes as Kon troll element of this operon acts, standing invent nucleic acid according to the invention. Such genes are demerged as transcribed together. The individual genes have sequences in the intercistronic regions on which ribosomes appear after transcription bind the RNA. Because of this ribosome binding Passages, also called Shine-Dalgarno sequences, the respective proteins can be translated separately become.

Die Erfindung stellt auch Wirtszellen bereit, die eine erfindungsgemäße Nucleinsäure, insbesondere eine Nucleinsäure mit einer in SEQ ID Nr. 1 bis 7 dargestellten Sequenz oder eines Fragmentes davon oder ein eine erfindungsgemäße Nucleinsäure oder ein Fragment davon umfassendes Konstrukt enthält. Bei der erfindungsgemäßen Wirtszelle kann es sich zum Beispiel um ein Bakterium oder eine Hefe-, In sekten-, Säuger- oder Pflanzenzelle handeln.The invention also provides host cells that a nucleic acid according to the invention, in particular a nucleic acid with one in SEQ ID No. 1 to 7 sequence shown or a fragment thereof or a nucleic acid according to the invention or contains a construct comprising a fragment thereof. The host cell according to the invention can for example around a bacterium or a yeast, in act sect, mammalian or plant cell.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Her stellung eines Proteins mit der Aktivität einer Chitindeacetylase, wobei ein Protein mit der Akti vität einer Chitindeacetylase hergestellt wird, in dem in einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung oder deren Fragment unter geeigneten Bedingungen kultiviert, und exprimiert und das Protein gewonnen wird.The invention also relates to a method for manufacturing provision of a protein with the activity of a Chitin deacetylase, a protein with the Akti is produced in a chitin deacetylase, in that in a host cell of the present invention a nucleic acid molecule of the present invention or its fragment under suitable conditions cultivated, and expressed and the protein recovered becomes.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstel lung von Chitosan aus Chitin, wobei Chitin mit ei nem Protein der vorliegenden Erfindung oder einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter geeig neten Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium so in Kontakt gebracht wird, dass das Chitin zu Chitosan abgebaut und letzteres gewonnen werden kann. The invention also relates to manufacturing processes chitosan from chitin, whereby chitin with egg a protein of the present invention or one Host cell of the present invention is suitable conditions in a suitable culture medium is brought into contact so that the chitin too Chitosan is broken down and the latter can be obtained can.

Die Erfindung betrifft auch erfindungsgemäß herge stelltes Chitosan sowie dessen Verwendung in der Nahrungsmittelherstellung, der Landwirtschaft und der pharmazeutischen Industrie.The invention also relates to the invention Chitosan and its use in the Food production, agriculture and the pharmaceutical industry.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further advantageous embodiments of the invention result from the subclaims.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Bei spiele sowie des dazugehörigen Sequenzprotokolles näher erläutert.The invention is based on the following case games and the associated sequence listing explained in more detail.

Das Sequenzprotokoll umfasst:
SEQ ID Nr. 1 die vollständige DNA-Sequenz der er findungsgemäßen Chitindeacetylase aus Promicromonospora,
SEQ ID Nr. 2 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter erster Protein-codierender Bereich (1071 bp),
SEQ ID Nr. 3 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter zweiter Protein-codierender Bereich (918 bp),
SEQ ID Nr. 4 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter vierter Protein-codierender Bereich (792 bp),
SEQ ID Nr. 5 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter fünfter Protein-codierender Bereich (762 bp),
SEQ ID Nr. 6 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter sechster Protein-codierender Bereich (750 bp),
SEQ ID Nr. 7 ein aus der SEQ ID Nr. 1 abgeleiteter siebter Protein-codierender Bereich (636 bp),
SEQ ID Nr. 8 bis 13 die Aminosäuresequenzen, abgeleitet aus den Protein-codierenden DNA-Be reichen der SEQ ID Nr. 2 bis 7,
SEQ ID Nr. 14 bis 42 erfindungsgemäß eingesetzte Clonie rungsprimer.The sequence listing includes:
SEQ ID No. 1 the complete DNA sequence of the chitin deacetylase according to the invention from Promicromonospora,
SEQ ID No. 2, a first protein-coding region derived from SEQ ID No. 1 (1071 bp),
SEQ ID No. 3 a second protein-coding region derived from SEQ ID No. 1 (918 bp),
SEQ ID No. 4, a fourth protein-coding region derived from SEQ ID No. 1 (792 bp),
SEQ ID No. 5, a fifth protein-coding region derived from SEQ ID No. 1 (762 bp),
SEQ ID No. 6 is a sixth protein-coding region (750 bp) derived from SEQ ID No. 1,
SEQ ID No. 7 a seventh protein-coding region derived from SEQ ID No. 1 (636 bp),
SEQ ID No. 8 to 13 the amino acid sequences derived from the protein-coding DNA regions of SEQ ID No. 2 to 7,
SEQ ID No. 14 to 42 cloning primer used according to the invention.

Example 6

Aus marinen Sedimentproben wurden mittels selekti ver Kulturmedien beziehungsweise Agarplatten mit Chitin als alleiniger Kohlenstoffquelle Mikroorga nismen mit Chitin-abbauender Aktivität isoliert. Es wurde ein Bakterium der Gattung Promicromonospora isoliert. Dazu wurden Primer mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 14 bis 24 hergestellt, wobei diese in dege nerierter Form eingesetzt wurden. Die degenerierten Primer wurden von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin) bezogen. Mittels PCR wurden Teilsequenzen des zu isolierenden Genes amplifiziert, die Produkte se lektiv isoliert und sequenziert. Anschließend wurde mittels direkter genomischer Sequenzierung unter Verwendung der Primer-Sequenzen, dargestellt in SEQ ID Nr. 25 bis 42, die genomische DNA des Bakteriums direkt sequenziert. Die dabei verwendeten Primer wurden ebenfalls von der Firma TIB MOLBIOL (Berlin) bezogen.Marine sediment samples were used to select culture media or agar plates with Chitin as the sole carbon source microorgan isolated with chitin-degrading activity. It became a bacterium of the genus Promicromonospora isolated. For this, primers with the sequences SEQ ID No. 14 to 24, these in dege nerated form were used. The degenerate Primers were made by TIB MOLBIOL (Berlin) based. Partial sequences of the isolating genes amplified, the products se isolated and sequenced. Then was using direct genomic sequencing under Use of the primer sequences shown in SEQ ID No. 25 to 42, the genomic DNA of the bacterium sequenced directly. The primers used were also made by TIB MOLBIOL (Berlin) based.

Die erhaltene, komplette genomische DNA-Sequenz des Chitindeacetylase-Gens ist in SEQ ID Nr. 1 darge stellt. Dieses Gen enthält sechs bakterielle Start codons (Positionen: SEQ ID Nr. 2: 364-366, Nr. 3: 517-519, Nr. 4: 643-645, Nr. 5: 673-675, Nr. 6: 685- 687, Nr. 7: 799-801 in SEQ ID Nr. 1), die 6 offene Leseraster initiieren. Sie enden alle an ein und demselben Stopcodon TGA, und zwar Position 1432-1435 in SEQ ID Nr. 1.The complete genomic DNA sequence of the Chitin deacetylase gene is shown in SEQ ID No. 1 provides. This gene contains six bacterial start codons (positions: SEQ ID No. 2: 364-366, No. 3: 517-519, No. 4: 643-645, No. 5: 673-675, No. 6: 685- 687, No. 7: 799-801 in SEQ ID No. 1), the 6 open Initiate reading frame. They all end in and the same stop codon TGA, position 1432-1435 in SEQ ID No. 1.

In der folgenden Tabelle werden die von den sechs in den SEQ ID Nr. 2 bis 7 (entspricht offenem Le seraster 1 bis 6) dargestellten Nucleinsäuresequen zen-codierten Proteine (mit den Aminosäuresequenzen nach SEQ ID Nr. 7 bis 13) und ihre Eigenschaften dargestellt.The following table shows the six in SEQ ID No. 2 to 7 (corresponds to open Le seraster 1 to 6) shown nucleic acid sequences zen-encoded proteins (with the amino acid sequences according to SEQ ID No. 7 to 13) and their properties shown.

Eine Analyse der Sequenz in SEQ ID Nr. 1 zeigt, dass vor dem dritten Leseraster (SEQ ID Nr. 4) eine Shine-Dalgarno-Sequenz (GAAGGACG) (Position 629-636 in SEQ ID Nr. 1) vorhanden ist. Da das Startcodon dieses Leserasters GTG ist, welches bei grampositi ven Bakterien häufig den Translationsstart mar kiert, erscheint dieses Leseraster die Chitindeace tylase der Erfindung zu codieren. An analysis of the sequence in SEQ ID No. 1 shows that before the third reading frame (SEQ ID No. 4) one Shine-Dalgarno sequence (GAAGGACG) (position 629-636 in SEQ ID No. 1). Because the start codon of this reading frame is GTG, which is available at grampositi bacteria often start translating this reading frame appears the Chitindeace to encode the tylase of the invention.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. Nucleic acid molecule encoding a protein with the activity of a chitin deacetylase, selected from the group consisting of:

a) a nucleic acid molecule with at least one of the nucleotide sequence shown in SEQ ID Nos. 1 to 7 or a fragment thereof;
b) a nucleic acid molecule with a sequence encoding a protein with a sequence shown in SEQ ID Nos. 8 to 13 or a fragment thereof;
c) a nucleic acid molecule which is complementary to a nucleic acid molecule according to a) or b), or a fragment thereof;
d) a nucleic acid molecule which is obtainable by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more nucleotides of a nucleic acid molecule according to a) to c); and
e) a nucleic acid molecule which, for example due to the degeneration of the genetic code, hybridizes with a nucleic acid molecule according to a) to d) or a fragment thereof.

2. Nucleic acid molecule according to claim 1, characterized ge indicates that it is a DNA or RNA.

3. Vector containing a nucleic acid molecule after one of claims 1 or 2.

4. The vector of claim 3, wherein the nucleic acid molecule under operational control at least an expression regulatory element.

5. The vector of claim 4, wherein the expression Regulatory element is a promoter.

6. The vector of claim 5, wherein the promoter is a is a prokaryotic promoter.

7. Host cell containing a nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 or a vector according to one of claims 2 to 6.

8. The host cell of claim 7, wherein the host cell a bacterial, yeast, insect, mammalian or Plant cell is.

9. Protein encoded by a nucleic acid sequence according to claim 1 or 2 or obtainable from one Host cell according to claim 7 or 8.

10. Antibody with a protein according to claim 9 reacts.

11. Process for producing a chitin deacety Read according to claim 9, wherein in a first step a host cell according to claim 7 or 8 in a ge suitable culture medium cultivated under conditions is the expression and possibly secretion tion of chitin deacetylase enable and in in a second step the chitin deacetylase iso is won and won.

12. Process for the production of chitosan from chi tin, where chitin with a host cell after a of claims 7 or 8 or a protein according to An saying 9 brought into contact under conditions that allow deacetylation of chitin and then chitosan is obtained.