DE10110344A1 - Fermentative production of L-amino acids, especially lysine or valine, by fermenting Coryneform bacteria in which the nadA and/or nadC gene is weakened - Google Patents

Fermentative production of L-amino acids, especially lysine or valine, by fermenting Coryneform bacteria in which the nadA and/or nadC gene is weakened

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Abstract

Fermentative production of L-aminoacids (I) involves: (a) fermenting (I)-producing Coryneform bacteria, in which at least one nadA and/or nadC gene is weakened; (b) enriching (I) in the medium or cells of the bacteria; and (c) isolating (I).

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin und L-Lysin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das nadA- und/oder nadC-Gen abgeschwächt ist.The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, in particular L-valine and L-lysine, using coryneformer Bacteria in which the nadA and / or nadC gene is weakened.

Stand der TechnikState of the art

L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin und L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.L-amino acids, in particular L-valine and L-lysine, are found in of human medicine and in the pharmaceutical industry, in the food industry and especially in the Animal nutrition application.

Es ist bekannt, daß Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.It is known that amino acids by fermentation of Strains coryneformer bacteria, in particular Corynebacterium glutamicum. Because of the Great importance is constantly attached to the improvement of Manufacturing process worked. process improvements can fermentation measures such as Stirring and supply of oxygen, or the Composition of nutrient media such as the Sugar concentration during fermentation, or the Work-up to the product form by, for example Ion exchange chromatography or the intrinsic Performance characteristics of the microorganism itself affect.

Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysin-Analogon S-(2-Aminoethyl)-Cystein oder das Valin- Analogon 2-Thiazolyl-Alanin oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren produzieren. To improve the performance characteristics of this Microorganisms become methods of mutagenesis, selection and mutant selection applied. In this way you get Strains that are resistant to antimetabolites such as the lysine analogue S- (2-aminoethyl) -cysteine or the valine Analog 2-thiazolyl-alanine or auxotrophic for are regulatory metabolites and L-amino acids to produce.  

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Aminosäure produzierender Stämme von Corynebacterium glutamicum eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure- Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die L-Aminosäure-Produktion untersucht.For some years now also methods of Recombinant DNA technology for strain improvement L-amino acid producing strains of Corynebacterium glutamicum by adding single amino acid Biosynthesis genes amplified and the effect on the L-amino acid production studied.

Aufgabe der ErfindungObject of the invention

Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren mit coryneformen Bakterien bereitzustellen.The inventors have set themselves the task, new Foundations for improved processes for fermentative Production of L-amino acids with coryneform bacteria provide.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Werden im folgenden L-Aminosäuren oder Aminosäuren erwähnt, sind damit eine oder mehrere Aminosäuren einschließlich ihrer Salze, ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan und L-Arginin gemeint. Besonders bevorzugt sind L-Lysin und L-Valin.Are mentioned in the following L-amino acids or amino acids, are thus including one or more amino acids their salts selected from the group L-asparagine, L-threonine, L-serine, L-glutamate, L-glycine, L-alanine, L-cysteine, L-valine, L-methionine, L-isoleucine, L-leucine, L-tyrosine, L-phenylalanine, L-histidine, L-lysine, L-tryptophan and L-arginine. Particularly preferred are L-lysine and L-valine.

Wenn im Folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern sind auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.When L-lysine or lysine are mentioned below so not only the bases, but also the salts are like z. For example, lysine monohydrochloride or lysine sulfate.

Wenn im Folgenden L-Valin oder Valin erwähnt werden, sind damit auch die Salze wie z. B. Valin-Monohydrochlorid oder Valin-Sulfat gemeint.When L-valine or valine are mentioned below so that the salts such. B. valine monohydrochloride or Meant valine sulfate.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, unter Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen man zumindest die für die Chinolinsäure-Synthetase A (Quinolinate-Synthetase A) kodierende Nucleotidsequenz (nadA-Gen) und/oder die für die Nicotinat-Nucleotid Pyrophosphorylase kodierende Nucleotidsequenz (nadC-Gen) abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert.The invention relates to a method for fermentative production of L-amino acids, under Use of coryneform bacteria in which one at least those for quinolinic acid synthetase A (Quinolinate synthetase A) coding nucleotide sequence (nadA gene) and / or those for the nicotinate nucleotide  Pyrophosphorylase-encoding nucleotide sequence (nadC gene) weakens, in particular turns off or on low Expressed level.

Gegenstand dieser Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren in dem folgende Schritte durchführt werden:
The subject of this invention is furthermore a process for the fermentative production of L-amino acids in which the following steps are carried out:

  • a) Fermentation der L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen zumindest die für die Chinolinsäure-Synthetase kodierende Nucleotidsequenz (nadA) und/oder die für die kodierende Nucleotidsequenz (nadC), abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet oder auf niedrigem Niveau exprimiert wird;a) fermentation of L-amino acid producing coryneform bacteria in which at least the for the Quinolinic acid synthetase coding Nucleotide sequence (nadA) and / or for the coding nucleotide sequence (nadC), attenuated, especially off or at a low level is expressed;
  • b) Anreicherung der L-Aminosäuren im Medium oder in den Zellen der Bakterien; undb) accumulation of L-amino acids in the medium or in the Cells of the bacteria; and
  • c) Isolierung der produzierten L-Aminosäuren.c) isolation of the produced L-amino acids.

Die eingesetzten Stämme produzieren bevorzugt bereits vor der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens L-Aminosäuren, insbesondere L-Valin oder L-Lysin.The strains used preferably already produce before the attenuation of the nadA and / or nadC gene L-amino acids, in particular L-valine or L-lysine.

Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.Preferred embodiments can be found in the claims.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. The term "weakening" describes in this Related to the reduction or elimination of the intracellular activity of one or more enzymes (Proteins) in a microorganism produced by the corresponding DNA are encoded by, for example used a weak promoter or a gene or allele used for a corresponding enzyme with a low activity encodes or the corresponding gene or Inactivated enzyme (protein) and optionally this Measures combined.  

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter coryneformer Bakterien insbesondere der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.The microorganisms that are the subject of the present Invention, amino acids from glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol. It can be around Representative coryneformer bacteria especially the genus Corynebacterium act. In the genus Corynebacterium is in particular the species Corynebacterium glutamicum too which is known in the art for their ability To produce L-amino acids.

Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Aminosäuren produzierende Mutanten bzw. Stämme
wie beispielsweise die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM 5714
oder wie beispielsweise die Valin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium flavum FERM-P 512
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324 und
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.Suitable strains of the genus Corynebacterium, in particular of the species Corynebacterium glutamicum, are especially the known wild-type strains
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium molassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
and L-amino acid producing mutants or strains thereof
such as the L-lysine producing strains
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 and
Corynebacterium glutamicum DSM 5714
or such as the valine producing strains
Corynebacterium glutamicum DSM 12455
Corynebacterium glutamicum FERM-P 9325
Brevibacterium flavum FERM-P 512
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1845
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 9324 and
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 1763.

Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens in verbesserter Weise L-Aminosäuren produzieren.It was found that coryneform bacteria after Attenuation of the nadA and / or nadC gene in improved Way to produce L-amino acids.

Die Sequenzen der Gene nadA und nadC sind in der SEQ ID No. 1 und 3 dargestellt und können erfindungsgemäß verwendet werden. Die Aminosäuresequenzen der dazugehörigen Genprodukte sind in der SEQ ID No. 2 und 4 dargestellt. Weiterhin können Allele des nadA- und/ oder nadC-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen ("sense mutations") ergeben.The sequences of genes nadA and nadC are shown in SEQ ID no. 1 and 3 and can be used according to the invention become. The amino acid sequences of the associated Gene products are shown in SEQ ID no. 2 and 4 shown. Furthermore, alleles of the nadA and / or nadC gene be used, resulting from the degeneration of the genetic code or by functionally neutral Meaning mutations.

Zur Erzielung einer Abschwächung können entweder die Expression des nadA- und/oder nadC-Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Genprodukte herabgesetzt oder ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls werden beide Maßnahmen kombiniert.To achieve a weakening either the Expression of the nadA and / or nadC gene or the reduced catalytic properties of the gene products or turned off. If necessary, both Measures combined.

Die Genexpression kann durch geeignete Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression verringert werden. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), bei Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).Gene expression can be achieved by appropriate culture or by genetic modification (mutation) of the Signaling structures of gene expression can be reduced. Signaling structures of gene expression are, for example Repressor genes, activator genes, operators, promoters, Attenuators, ribosome binding sites, the start codon and Terminators. Information on this is the expert z. In of patent application WO 96/15246 to Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)) Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) and in known textbooks of genetics and Molecular biology such. B. the textbook by Knippers  ("Molecular Genetics", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or that of Winnacker ("Gene and clones ", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations that lead to a change or reduction of the catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art; as examples are the Works by Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) and Möckel ("Threonine dehydratase Corynebacterium glutamicum: abolition of allosteric Regulation and structure of the enzyme ", reports of the Forschungszentrum Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich, Germany, 1994). Summary presentations can be known textbooks of genetics and Molecular biology such. B. von Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) become.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), in deren Folge falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Mutations are transitions, transversions, Insertions and deletions into consideration. In dependence of the effect of amino acid exchange on the Enzyme activity is mediated by missense mutations ("missense mutations ") or non-nonsense mutations spoken. Insertions or deletions of at least lead to a base pair in a gene Frame shift mutations, in the consequence of which incorrect amino acids are incorporated or the Translation aborts prematurely. Deletions of several Codons typically result in a complete one Failure of enzyme activity. Instructions for generation Such mutations are prior art and can be known textbooks of genetics and Molecular biology such. B. the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th Edition, Georg Thieme Verlag,  Stuttgart, Germany, 1995), that of Winnacker ("Gene and Klone ", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) or that of Hagemann ("General Genetics", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Eine gebräuchliche Methode, Gene von C. glutamicum zu mutieren, ist die von Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) beschriebene Methode der Gen-Unterbrechung ("gene disruption") und des Gen-Austauschs ("gene replacement").A common method, genes of C. glutamicum too mutate is that of Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991)) method of gene disruption ("gene disruption") and gene exchange ("gene replacement ").

Bei der Methode der Gen-Unterbrechung wird ein zentraler Teil der Kodierregion des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-Patent 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zentrale Teil der Kodierregion des Gens enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross-over"- Ereignisses wird die Kodierregion des betreffenden Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen und man erhält zwei unvollständige Allele, denen jeweils das 3'- bzw. das 5'- Ende fehlt. Diese Methode wurde beispielsweise von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) zur Ausschaltung des recA-Gens von C. glutamicum verwendet.In the method of gene disruption becomes a central Part of the coding region of the gene of interest in a Plasmid vector cloned in a host (typically E. coli) but not in C. glutamicum. When For example, vectors come from pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB or pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; U.S. Patent 5,487,993), pCR® Blunt (Invitrogen, Groningen, The Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) or pEM1 (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516). The plasmid vector containing the central part of the coding region of the gene contains subsequently by conjugation or transformation into the desired strain of C. glutamicum transferred. The method the conjugation is described by Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) described. Methods for transformation are for example, in Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio / Technology 7, 1067-1070 (1989)) and Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). After homologous recombination by means of a cross-over  Event becomes the coding region of the gene in question interrupted by the vector sequence and you get two incomplete alleles to which the 3 'and 5' End is missing. For example, this method was used by Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)) to eliminate the recA gene of C. glutamicum used.

Beispielhaft ist in Fig. 1 das Plasmid pCR2.1nadAint dargestellt mit Hilfe dessen das Verfahren der Unterbrechung des nadA-Gens durchgeführt werden kann. Plasmid pCR2.1nadAint enthält einen, als nadAint-Fragment bezeichneten, zentralen Teil des nadA-Gens, der in SEQ ID No. 5 dargestellt ist.By way of example, FIG. 1 shows the plasmid pCR2.1nadAint with the aid of which the method of interrupting the nadA gene can be carried out. Plasmid pCR2.1nadAint contains a central part of the nadA gene, designated as nadAint fragment, which is shown in SEQ ID no. 5 is shown.

Beispielhaft ist weiterhin in Fig. 2 das Plasmid pCR2.1nadCint dargestellt mit Hilfe dessen das Verfahren der Unterbrechung des nadC-Gens durchgeführt werden kann. Plasmid pCR2.1nadCint enthält einen, als nadCint-Fragment bezeichneten, zentralen Teil des nadC-Gens, der in SEQ ID No. 6 dargestellt ist.By way of example, FIG. 2 also shows the plasmid pCR2.1nadCint with the aid of which the method of interrupting the nadC gene can be carried out. Plasmid pCR2.1nadCint contains a central part of the nadC gene, designated as nadCint fragment, which is shown in SEQ ID no. 6 is shown.

Bei der Methode des Genaustausches ("gene replacement") wird eine Mutation wie z. B. eine Deletion, Insertion oder Basenaustausch in dem interessierenden Ben in-vitro hergestellt. Das hergestellte Allel wird wiederum in einen für C. glutamicum nicht replikativen Vektor kloniert und dieser anschließend durch Transformation oder Konjugation in den gewünschten Wirt von C. glutamicum überführt. Nach homologer Rekombination mittels eines ersten, Integration bewirkenden "cross-over"-Ereignisses und eines geeigneten zweiten, eine Exzision bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau der Mutation bzw. des Allels. Diese Methode wurde beispielsweise von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion auszuschalten. In the method of gene replacement (gene replacement) is a mutation such. B. a deletion, insertion or Base exchange in the Ben of interest in vitro manufactured. The produced allele turns into a cloned for C. glutamicum non-replicative vector and this subsequently by transformation or conjugation into the desired host of C. glutamicum. To homologous recombination by means of a first, integration effecting a cross-over event and an appropriate second excision-causing cross-over event in the target gene or in the target sequence to reach the installation the mutation or the allele. This method was for example, by Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) to the pyc gene of C. to eliminate glutamicum by a deletion.  

In das nadA- und/oder nadC-Gen kann auf diese Weise eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch eingebaut werden.In the nadA and / or nadC gene can in this way a Deletion, insertion or base exchange incorporated become.

Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Aminosäuren vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens, eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Zitronensäure-Zyklus, des Pentosephosphat- Zyklus, des Aminosäure-Exports und gegebenenfalls regulatorische Proteine zu verstärken, insbesondere überzuexprimieren.Additionally, it may be responsible for the production of L-amino acids be advantageous, in addition to weakening the nadA- and / or nadC gene, one or more enzymes of the biosynthesis pathway, glycolysis, Anaplerotic, the citric acid cycle, the pentose phosphate Cycle, amino acid export and optionally in particular, to amplify regulatory proteins overexpress.

Der Begriff "Verstärkung" bzw. "Verstärken" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw., der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.The term "reinforcement" or "reinforcing" describes in In this connection, the increase of intracellular Activity of one or more enzymes or proteins in one Microorganism encoding the corresponding DNA be, for example, by the copy number of the gene or, the gene increases, a strong promoter or a gene used for a corresponding enzyme or protein encoded with a high activity and optionally this Measures combined.

So kann für die Herstellung von L-Lysin neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
Thus, for the production of L-lysine, in addition to the attenuation of the nadA and / or nadC gene, one or more of the genes selected from the group

  • - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512),- that for a feedback-resistant aspartate kinase coding gene lysC (Accession No. P26512),
  • - das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA (EP-B 0 197 335),The gene coding for the dihydrodipicolinate synthase dapA (EP-B 0 197 335),
  • - das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- that for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase encoding gene gap (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),
  • - gleichzeitig das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc (DE-A-198 31 609), At the same time coding for the pyruvate carboxylase Gen pyc (DE-A-198 31 609),  
  • - das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),- the gene coding for the malate: quinone oxidoreductase mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)),
  • - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),- The coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase Gen zwf (JP-A-09224661),
  • - gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE (DE-A-195 48 222),At the same time as the lysine export-encoding gene lysE (DE-A-195 48 222),
  • - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)The zwa1 gene coding for the Zwa1 protein (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)
  • - das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), und- The gene coding for the triose isomerase gene tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), and
  • - das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),- The gene coding for the 3-phosphoglycerate kinase gene pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086),

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, in particular overexpressed.

So kann für die Herstellung von L-Valin neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe
Thus, for the production of L-valine, in addition to the attenuation of the nadA and / or nadC gene, one or more of the genes selected from the group

  • - das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC (Accession No. P26512),- that for a feedback-resistant aspartate kinase coding gene lysC (Accession No. P26512),
  • - das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom (EP-A 0131171),Homoserine dehydrogenase-encoding gene hom (EP-A 0131171),
  • - das für eine feed-back resistente Homoserin-Dehydrogenase kodierende Allel hom(Fbr) (Reinscheid et al. (1991) Journal of Bacteriology 173: 3228-3230),- that for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase coding allele hom (Fbr) (Reinscheid et al. (1991) Journal of Bacteriology 173: 3228-3230),
  • - das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)), oder das für eine feed-back resistente Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),- The gene encoding ilvA for the threonine dehydratase (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072)), or the feedback-resistant threonine  Dehydratase-encoding allele ilvA (Fbr) (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842),
  • - das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN (EP-B 0356739),- The gene coding for the acetohydroxy acid synthase gene ilvBN (EP-B 0356739),
  • - das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD (Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),- The gene encoding the Dihydroxysäuredehydratase ilvD (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979),
  • - das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf (JP-A-09224661),- The coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase Gen zwf (JP-A-09224661),
  • - gleichzeitig die für den Valin-Export kodierenden Gene brnF- und/oder brnE (DE: 199 51 708.8), und- At the same time coding for the valine export genes BRNF and / or BRNE (DE: 199 51 708.8), and
  • - das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)The gene coding for the Zwa1 protein zwa1 (DE: 199 59 328.0, DSM 13115)

verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.amplified, in particular overexpressed.

Weiterhin kann es für die Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
Furthermore, it may be advantageous for the production of amino acids, in particular L-lysine and L-valine, in addition to the attenuation of nadA and / or nadC gene simultaneously one or more of the genes selected from the group

  • - das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),- The coding for the phosphoenolpyruvate carboxykinase Gene pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),
  • - das für die Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodierende Gen pgi (US 09/396,478, DSM 12969),- The gene coding for the glucose-6-phosphate isomerase gene pgi (US 09 / 396,478, DSM 12969),
  • - das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),- The gene encoding the pyruvate oxidase poxB (DE: 199 51 975.7, DSM 13114),
  • - das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)- the zwa2 protein encoding gene zwa2 (DE: 199 59 327.2, DSM 13113)

abzuschwächen, insbesondere die Expression zu verringern.attenuate, in particular to reduce expression.

Schließlich kann es für die Produktion von Aminosäuren, vorteilhaft sein, neben der Abschwächung des nadA- und/oder nadC-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro­ organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).Finally, it may be responsible for the production of amino acids, be beneficial, in addition to the mitigation of nadA and / or nadC gene to turn off unwanted side reactions (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung und können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The microorganisms produced according to the invention are also the subject of the invention and can continuous or discontinuous in the batch process (Batch cultivation) or in the fed batch (feed method) or repeated fed batch process (repetitive feed process) cultured for the purpose of producing L-amino acids become. A summary of known Cultivation methods is in the textbook of Chmiel (Bioprocessing Technology 1. Introduction to the Bioprocess Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook of Storhas (Bioreactors and peripheral facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.The culture medium to be used must suitably Claims of the respective strains suffice. descriptions of culture media of various microorganisms are in Manual of Methods for General Bacteriology American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).

Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As a carbon source, sugars and carbohydrates can z. Glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, Molasses, starch and cellulose, oils and fats such. B. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such as Palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, Alcohols such. As glycerol and ethanol and organic  Acids such. As acetic acid can be used. These substances can be used singly or as a mixture.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.As nitrogen source, organic nitrogen-containing Compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, Ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used singly or as a mixture.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.As phosphorus source can phosphoric acid, Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used. The culture medium must further contain salts of metals such as As magnesium sulfate or iron sulfate, for the Growth are necessary. Finally, essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the above mentioned substances. The culture medium In addition, suitable precursors may be added. The mentioned feedstocks can be used to culture in the form of a added one-off approach or appropriately be fed during cultivation.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff­ haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.For pH control of the culture basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or Ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. to Foam processing control can use anti-foaming agents z. B. fatty acid polyglycol esters are used. to Maintaining the stability of plasmids can the Medium suitable selective substances such. B. Antibiotics are added. To aerobic conditions maintain, become oxygen or oxygen containing gas mixtures such. B. air into the culture entered. The temperature of the culture is usually at 20 ° C to 45 ° C, and preferably at 25 ° C to 40 ° C. The Culture is continued until a maximum of  desired product has formed. This goal will be usually within 10 hours to 160 hours reached.

Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.Methods for the determination of L-amino acids are known from the Known in the art. The analysis can be as with Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) described by anion exchange chromatography with followed by ninhydrin derivatization, or they can be done by reversed phase HPLC, as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) described.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.The present invention will be described below with reference to Embodiments explained in more detail.

Beispiel 1example 1 Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032Preparation of a Genomic Cosmid Gene Bank Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wird wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code no. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) wird mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code no. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit shrimp alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is used as in Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179) described isolated and with the restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product description Sau3AI, Code no. 27-0913-02) partial split. The DNA fragments are alkaline with shrimp Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product description SAP, code no. 1758250) dephosphorylated. The DNA of the cosmid vector SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164), obtained from the company Stratagene (La Jolla, USA, Product description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301) comes with the Restriction enzyme XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02) cleaved and also with shrimp alkaline phosphatase dephosphorylated.  

Anschließend wird die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wird mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4- DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wird anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) in Phagen verpackt.Subsequently, the cosmid DNA with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04). The cosmid DNA treated in this way is mixed with the treated ATCC13032 DNA and the mixture with T4 DNA ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA Ligase, Code no. 27-0870-04) treated. The ligation mixture is then with help Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Product description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) packed in phages.

Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575) werden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank werden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert werden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C werden rekombinante Einzelklone selektioniert.To infect the E. coli strain NM554 (Raleigh et al 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563-1575), the cells are taken up in 10 mM MgSO 4 and mixed with an aliquot of the phage suspension. Infection and titering of the cosmidbank are as described in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), where the cells are plated on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) with 100 mg / l ampicillin. After overnight incubation at 37 ° C, recombinant single clones are selected.

Beispiel 2Example 2 Isolierung und Sequenzierung des nadA-GensIsolation and sequencing of the nadA gene

Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wird mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Product No. 27- 0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente werden mit shrimp alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgt die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).The cosmid DNA of a single colony is treated with the Qiaprep Spin Miniprep Kit (Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) isolated according to the manufacturer and with the Restriction enzyme Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, product no. 27- 0913-02) partially split. The DNA fragments are with shrimp alkaline phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product no. 1758250) dephosphorylated. After gel electrophoresis Separation takes place the isolation of cosmid fragments in Size range from 1500 to 2000 bp with the QiaExII gel  Extraction Kit (Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany).

Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), wird mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wird wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wird. Dieses Ligationsgemisch wird anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 mg/l Zeocin ausplattiert.The DNA of the sequencing vector pZero-1, obtained from the Invitrogen company (Groningen, the Netherlands, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01), with the restriction enzyme BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04) split. The Ligation of Cosmidfragmente in the Sequencing vector pZero-1 is as described by Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) described, wherein the DNA mixture with T4 ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) Incubated overnight. This ligation mixture becomes into the E. coli strain DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) (Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) and on LB agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) with 50 mg / l Zeocin plated.

Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgt mit dem Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgt nach der Dideoxy- Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A., 74: 5463-5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wird der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgt in einem "Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid" Gel (29 : 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) mit dem "ABI Prism 377" Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland). The plasmid preparation of the recombinant clones is carried out with the Biorobot 9600 (Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany). The sequencing takes place after the dideoxy Chain termination method of Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467) with modifications according to Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). It becomes the "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit "by PE Applied Biosystems (Product No. 403044, Weiterstadt, Germany). Gel electrophoretic separation and analysis of the Sequencing reaction takes place in a "Rotiphorese NF Acrylamide / Bisacrylamide "Gel (29: 1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) with the "ABI Prism 377" Sequencer from PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany).  

Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten werden anschließend unter Anwendung des Staden-Programpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate werden zu einem zusammenhängenden Contig assembliert. Die computergestützte Kodierbereichsanalyse wird mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231) angefertigt.The obtained raw sequence data are then under Application of the Staden Program Package (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231), version 97-0. The Single sequences of pZerol derivatives become one coherent contig assembled. The computer-aided Coding area analysis is performed with the program XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231).

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 1 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergibt ein offenes Leseraster von 1287 Basenpaaren, welches als nadA- Gen bezeichnet wird. Das nadA-Gen kodiert für ein Protein von 428 Aminosäuren.The nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID no. 1 shown. Analysis of the nucleotide sequence yields open reading frame of 1287 base pairs, which is called nadA Gen is called. The nadA gene encodes a protein of 428 amino acids.

Beispiel 3Example 3 Isolierung und Sequenzierung des nadC-GensIsolation and sequencing of the nadC gene

Die Isolierung und Sequenzierung des nadC-Gens wird wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.The isolation and sequencing of the nadC gene is performed as in Example 2 described performed.

Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID No. 3 dargestellt. Die Analyse ergibt ein offenes Leseraster von 840 Basenpaaren, welches als nadC-Gen bezeichnet wird. Das nadC-Gen kodiert für ein Polypeptid von 279 Aminosäuren.The nucleotide sequence obtained is shown in SEQ ID no. 3 shown. The analysis gives an open reading frame of 840 base pairs, which is referred to as nadC gene. The nadC gene encodes a polypeptide of 279 amino acids.

Beispiel 4Example 4 Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des nadA-GensPreparation of an integration vector for the Integration mutagenesis of the nadA gene

Aus dem Stamm ATCC 13032 wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 2 für C. glutamicum bekannten Sequenz des nadA-Gens werden die folgenden Oligonukleotide als Primer für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
nadAint1 (dargestellt in SEQ ID No. 7)
5' AAG CGA TTG TGT TCT GCG GT 3'
nadAint2 (dargestellt in SEQ ID No. 8)
5' TCG AGG CAG AAG ATG GTG TG 3'From strain ATCC 13032, the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Because of the sequence of the nadA gene known from Example 2 for C. glutamicum, the following oligonucleotides are selected as primers for the polymerase chain reaction:
nadAint1 (shown in SEQ ID No. 7)
5 'AAG CGA TTG TGT TCT GCG GT 3'
nadAint2 (shown in SEQ ID No. 8)
5 'TCG AGG CAG AAG ATG GTG TG 3'

Die dargestellten Primer werden von der Firma ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein 780 bp großes DNA- Fragment isoliert, welches ein internes Fragment des nadA- Gens ist. Es ist in der SEQ ID No. 5 dargestellt.The primers shown are from the company ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Germany) synthesized and according to the standard PCR method of Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) with Pwo polymerase from the company Boehringer performed the PCR reaction. With the help of Polymerase chain reaction becomes a 780 bp DNA Isolated fragment containing an internal fragment of the nadA Gene is. It is in SEQ ID no. 5 is shown.

Das amplifizierte DNA Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. Anschließend wird der E. coli Stamm DH5αmcr mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wird. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel- Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2.1nadAint genannt. Es ist in Fig. 1 dargestellt. The amplified DNA fragment is cloned into the vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio / Technology 9: 657 using the TOPO TA cloning kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, catalog number K4500-01) -663). Subsequently, E. coli strain DH5αmcr is electroporated with the ligation mixture (Hanahan, In: DNA cloning, A practical approach, Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). The selection of plasmid-carrying cells is made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989..), The 25 mg / l kanamycin is supplemented. Plasmid DNA is isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmid is called pCR2.1nadAint. It is shown in Fig. 1.

Beispiel 5Example 5 Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des nadC-GensPreparation of an integration vector for the Integration mutagenesis of the nadC gene

Wie in Beispiel 3 beschrieben wird aus dem Stamm ATCC 13032 nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) chromosomale DNA isoliert. Aufgrund der aus Beispiel 3 für C. glutamicum bekannten Sequenz des nadC-Gens werden die folgenden Oligonukleotide als Primer für die Polymerase Kettenreaktion ausgewählt:
nadCintl (dargestellt in SEQ ID No. 9)
5' AGC TGA GCG CCA AGG TTG TT 3'
nadCint2 (dargestellt in SEQ ID No. 10)
5' CGA TGA GCT GAT CAA TGG TG 3'As described in Example 3, the strain ATCC 13032 is purified by the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isolated chromosomal DNA. Because of the sequence of the nadC gene known from example 3 for C. glutamicum, the following oligonucleotides are selected as primers for the polymerase chain reaction:
nadCintl (shown in SEQ ID No. 9)
5 'AGC TGA GCG CCA AGG TTG TT 3'
nadCint2 (shown in SEQ ID No. 10)
5 'CGA TGA GCT GAT CAA TGG TG 3'

Die dargestellten Primer werden von der Firma ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und nach der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase der Firma Boehringer die PCR Reaktion durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein 582 bp großes DNA- Fragment isoliert, welches ein internes Fragment des nadC- Gens ist. Es ist in der SEQ ID No. 6 dargestellt.The primers shown are from the company ARK, Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Germany) synthesized and according to the standard PCR method of Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) with Pwo polymerase from the company Boehringer performed the PCR reaction. With the help of Polymerase chain reaction will produce a 582 bp DNA Isolated fragment containing an internal fragment of nadC Gene is. It is in SEQ ID no. 6 shown.

Das amplifizierte DNA Fragment wird mit dem TOPO TA Cloning Kit der Firma Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalog Nummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663) ligiert. Anschließend wird der E. coli Stamm DH5αmcr mit dem Ligationsansatz (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) elektroporiert. Die Selektion von Plasmid-tragenden Zellen erfolgt durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert wird. Plasmid-DNA wird aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegel- Elektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wird pCR2.1nadCint genannt. Es ist in Fig. 2 dargestellt.The amplified DNA fragment is cloned into the vector pCR2.1-TOPO (Mead et al. (1991) Bio / Technology 9: 657 using the TOPO TA cloning kit from Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, catalog number K4500-01) -663). Subsequently, E. coli strain DH5αmcr is electroporated with the ligation mixture (Hanahan, In: DNA cloning, A practical approach, Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). The selection of plasmid-carrying cells is made by plating out the transformation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular cloning. A laboratory manual 2 nd Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989..), The 25 mg / l kanamycin is supplemented. Plasmid DNA is isolated from a transformant using the QIAprep Spin Miniprep Kit from Qiagen and checked by restriction with the restriction enzyme EcoRI and subsequent agarose gel electrophoresis (0.8%). The plasmid is called pCR2.1nadCint. It is shown in FIG. 2.

Beispiel 6Example 6 Integrationsmutagenese des nadA-Gens in dem C. glutamicum Stamm DM678Integration mutagenesis of the nadA gene in the C. glutamicum Strain DM678

Der in Beispiel 4 genannte Vektor pCR2.1nadAint wird nach der Elektroporationsmethode von Tauch et. al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DM678 elektroporiert.The vector pCR2.1nadAint named in example 4 is after the electroporation method of Tauch et. al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DM678 electroporated.

Der Corynebacterium glutamicum Stamm DM678 wurde durch mehrfache Mutagenese und Selektion aus Stamm ATCC13032 hergestellt. Dieser Stamm ist Methionin-sensitiv. Eine Reinkultur des Stammes DM678 wurde am 15. Juni 1999 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig, Deutschland) als DSM12866 hinterlegt.The Corynebacterium glutamicum strain DM678 was analyzed by multiple mutagenesis and selection from strain ATCC13032 manufactured. This strain is methionine-sensitive. A Pure culture of the DM678 strain was detected on June 15, 1999 at the German Collection for Microorganisms and Cell Cultures (DSM, Braunschweig, Germany) as DSM12866 deposited.

Der Vektor pCR2.1nadAint kann in DM678 nicht selbständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle erhalten, wenn er ins Chromosom von DM678 integriert hat. Die Selektion von Klonen mit ins Chromosom integriertem pCR2.1nadAint erfolgt durch Ausplattieren des Elektroporationsansatzes auf LB Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der mit 15 mg/l Kanamycin supplementiert ist.The vector pCR2.1nadAint can not self-replicate in DM678 and only remains in the cell if it has integrated into the chromosome of DM678. The selection of clones with integrated into the chromosome pCR2.1nadAint is carried out by plating out the electroporation batch on LB agar (Sambrook et al, Molecular Cloning:.. A Laboratory Manual, 2 nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), supplemented with 15 mg / l kanamycin.

Für den Nachweis der Integration wird das nadAint-Fragment nach der Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) mit dem Dig- Hybridisierungskit der Firma Boehringer markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wird nach der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII geschnitten. Die entstehenden Fragmente werden mit Agarosegel- Elektrophorese aufgetrennt und mit dem Dig-Hybrisierungskit der Firma Boehringer bei 68°C hybridisiert. Das in Beispiel 4 genannte Plasmid pCR2.1nadAint hat innerhalb des chromosomalen nadA-Gens ins Chromosom von DM678 inseriert. Der Stamm wird als DM678::pCR2.1nadAint bezeichnet.Proof of integration is the nadAint fragment according to the method "The DIG System Users Guide for Filters Hybridization "the company Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) with the dig-  Hybridization kit of the company Boehringer marked. Chromosomal DNA of a potential integrants decreases the method of Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) and each with the Restriction enzymes SalI, SacI and HindIII cut. The resulting fragments are washed with agarose gel Separated electrophoresis and with the Dig Hybrisierungskit Boehringer hybridized at 68 ° C. That in example 4 mentioned plasmid pCR2.1nadAint has within the Inserted chromosomal nadA gene into the chromosome of DM678. The root is called DM678 :: pCR2.1nadAint.

Beispiel 7Example 7 Herstellung von L-Valin mit Hilfe des Corynebacterium glutamicum Stammes DM678::pCR2.1nadAintProduction of L-valine with the help of Corynebacterium glutamicum strain DM678 :: pCR2.1nadAint

Der in Beispiel 6 erhaltene C.glutamicum Stamm DM678::pCR2.1nadAint wurde zunächst auf Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz Agar mit 25 mg/l Kanamycin) für 24 Stunden bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplatte wurde eine Vorkultur angeimpft (40 ml Medium im 500 ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Medium SK65 verwendet. The C.glutamicum strain obtained in Example 6 DM678 :: pCR2.1nadAint was initially on agar plate with the corresponding antibiotic (brain-heart agar with 25 mg / l Kanamycin) for 24 hours at 33 ° C. Starting from This agar plate was inoculated into a preculture (40 ml Medium in 500 ml Erlenmeyer flask). As a medium for the Preculture, the medium was used SK65.  

Medium SK65Medium SK65

CSL (Corn Steep Liquor)CSL (Corn Steep Liquor) 25 g/l25 g / l Glucoseglucose 23 g/l23 g / l Pepton aus CaseinPeptone from casein 20 g/l20 g / l Pepton aus FleischPeptone made from meat 20 g/l20 g / l Ammoniumsulfatammonium sulfate 8 g/l8 g / l Harnstoffurea 3 g/l3 g / l AL=L<Salze:AL = L <salts: KH2PO4KH 2 PO4 2,0 g/l2.0 g / l MgSO4.7 H2OMgSO 4 .7H 2 O 0,5 g/l0.5 g / l FeSO4.7 H2OFeSO 4 .7H 2 O 10 mg/l10 mg / l CuSO4 CuSO 4 1,0 mg/ml1.0 mg / ml ZnSO4 ZnSO 4 10 mg/l10 mg / l Thiamin.HCl (sterilfiltriert)Thiamine.HCl (sterile filtered) 0,5 mg/l0.5 mg / l Biotin (sterilfiltriert)Biotin (sterile filtered) 0,2 mg/l0.2 mg / l CaCO3 CaCO 3 1,6 g/l1.6 g / l

Die Vorkultur wurde 20 Stunden bei 33°C bei 170 rpm auf dem Schüttler inkubiert.The preculture was 20 hours at 33 ° C at 170 rpm on the Shaker incubated.

2,5 g dieser Vorkultur wurde in 831 g des Fermentationsmediums M1-457 angeimpft. Die Anzuchtfermentation wurde in 2 l Rührreaktor-Fermentern der Firma B. Braun (BBI, Deutschland, Melsungen, Modell Biostat MD) durchgeführt. Das Medium M1-457 enthielt die in Tabelle 1 aufgeführten Bestandteile. Der Fermenter wurde nach Befüllen mit dem Medium für 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Lediglich Stärkehydrolysat, Ca-Pantothenat und Thiamin wurden sterilfiltriert nach dem autoklavieren zugegeben. Die Kultur wurde bei einer Temperatur von 32°C, einer Belüftung von 1 l/min., einer minimalen Rührergeschwindigkeit von 800 rpm und einem pH von 7,0 und einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung bis zum Verbrauch des vorgelegten Zuckers kultiviert. Die Kultur wurde anschließend für weitere 38 Stunden bei einer Temperatur von 34°C, einem Sauerstoffpartialdruck von 20% der Luftsättigung und einem pH-Wert von pH 7,0 bis zum Erreichen einer OD660 von 30,5 kultiviert. Während dieser Zeit wurden 273,6 g des Mediums M2-242 mit einer Glucose- Konzentration von 506,3 g/l, einer Ammoniumsulfatkonzentration von 35,7 g/l und einer KH2PO4 Konzentration von 1,342 g/l zugefüttert.2.5 g of this preculture was inoculated into 831 g of the fermentation medium M1-457. The seed fermentation was carried out in 2 l stirred reactor fermenters from B. Braun (BBI, Germany, Melsungen, model Biostat MD). Medium M1-457 contained the ingredients listed in Table 1. The fermenter was sterilized after filling with the medium for 30 minutes at 121 ° C. Only starch hydrolyzate, Ca-pantothenate and thiamine were added sterile filtered after autoclaving. The culture was cultured at a temperature of 32 ° C, aeration of 1 l / min., A minimum stirrer speed of 800 rpm and a pH of 7.0, and an oxygen partial pressure of 20% of the air saturation until consumption of the initially charged sugar. The culture was then cultured for a further 38 hours at a temperature of 34 ° C, an oxygen partial pressure of 20% of the air saturation and a pH of pH 7.0 until reaching an OD660 of 30.5. During this time, 273.6 g of medium M2-242 with a glucose concentration of 506.3 g / l, an ammonium sulfate concentration of 35.7 g / l and a KH 2 PO 4 concentration of 1.342 g / l were fed.

Anschließend wurden die optische Dichte (OD) mit einem Digitalphotometer vom Typ LP1W der Firma Dr. Bruno Lange GmbH (Berlin, Deutschland) bei einer Meßwellenlänge von 660 nm und die Konzentration an gebildetem L-Valin mittels ASA bestimmt.Subsequently, the optical density (OD) with a Digital photometer of type LP1W from Dr. Ing. Bruno Lange GmbH (Berlin, Germany) at a measuring wavelength of 660 nm and the concentration of L-valine formed by ASA certainly.

In der Fermentationsendprobe wurde nach Ende der Fermentation eine L-Valin Konzentration von 160 mg/l festgestellt. In einer Parallelfermentation mit dem Kontrollstamm C. glutamicum DM678 konnte kein L-Valin nachgewiesen werden. In the final fermentation sample was after the end of the Fermentation an L-valine concentration of 160 mg / l detected. In a parallel fermentation with the Control strain C. glutamicum DM678 failed to produce L-valine be detected.  

Zusammensetzung des Mediums M1-457Composition of the medium M1-457

Beschreibung der FigurenDescription of the figures

Fig. 1 Karte des Plasmides pCR2.1nadAint Fig. 1 Map of the plasmid pCR2.1nadAint

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kam: Resistenzgen für Kanamycin
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
ColEI ori: Replikationsursprung ColEI aus Escherichia coli
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
nadAint: internes Fragment des nadA-GensThe abbreviations and designations used have the following meaning. The base pair numbers are approximations obtained as part of the reproducibility of measurements.
Kam: resistance gene for kanamycin
Amp: resistance gene for ampicillin
ColEI ori: origin of replication ColEI from Escherichia coli
EcoRI: restriction enzyme EcoRI site
nadAint: internal fragment of nadA gene

Fig. 2 Karte des Plasmides pCR2.1nadCint Fig. 2 Map of the plasmid pCR2.1nadCint

Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende Bedeutung. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.
Kam: Resistenzgen für Kanamycin
Amp: Resistenzgen für Ampicillin
ColEI ori: Replikationsursprung ColEI aus Escherichia coli
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
nadCint internes Fragment des nadC-Gens The abbreviations and designations used have the following meaning. The base pair numbers are approximations obtained as part of the reproducibility of measurements.
Kam: resistance gene for kanamycin
Amp: resistance gene for ampicillin
ColEI ori: origin of replication ColEI from Escherichia coli
EcoRI: restriction enzyme EcoRI site
nadCint internal fragment of the nadC gene

SEQUENZPROTOKOLLSEQUENCE LISTING

Claims (9)

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin und L-Valin, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt,
  • a) Fermentation der die gewünschte L-Aminosäure produzierenden coryneformen Bakterien, in denen man zumindest das nadA- und/oder nadC-Gen abschwächt,
  • b) Anreicherung des gewünschten Produkts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und
  • c) Isolierung der L-Aminosäure.
1. A process for the fermentative production of L-amino acids, in particular L-lysine and L-valine, characterized in that one carries out the following steps,
  • a) fermentation of the desired L-amino acid-producing coryneform bacteria in which at least the nadA and / or nadC gene is attenuated,
  • b) enrichment of the desired product in the medium or in the cells of the bacteria, and
  • c) Isolation of the L-amino acid.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich weitere Gene des Biosyntheseweges der gewünschten L-Aminosäure verstärkt.2. The method according to claim 1, characterized characterized in that you have bacteria used, in which additional genes of the Biosyntheseweges the desired L-amino acid strengthened. 3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der gewünschten L-Aminosäure verringern.3. The method according to claim 1, characterized characterized in that you have bacteria in which the metabolic pathways at least are partially switched off, which is the formation of the reduce the desired L-amino acid. 4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression des (der)Polynukleotides (e), das (die) für das nadA- und/oder nadC-Gen kodiert, verringert.4. The method according to claim 1, characterized characterized in that the expression the polynucleotide (s) used for the nadA- and / or nadC gene. 5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die regulatorischen/katalytischen Eigenschaften des Polypeptids (Enzymproteins) verringert, für das das Polynukleotid nadA und/oder nadC kodiert. 5. The method according to claim 1, characterized characterized in that the regulatory / catalytic properties of the Polypeptide (enzyme protein), for which the Polynucleotide nadA and / or nadC encoded.   6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  • 1. 6.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
  • 2. 6.2 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase kodierende Gen dapA,
  • 3. 6.3 das für die Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen gap,
  • 4. 6.4 das für die Pyruvat Carboxylase kodierende Gen pyc,
  • 5. 6.5 das für die Malat : Chinon Oxidoreduktase kodierende Gen mqo,
  • 6. 6.6 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
  • 7. 6.7 gleichzeitig das für den Lysin-Export kodierende Gen lysE,
  • 8. 6.8 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1
  • 9. 6.9 das für die Triosephosphat Isomerase kodierende Gen tpi, und
  • 10. 6.10 das für die 3-Phosphoglycerat Kinase kodierende Gen pgk,
verstärkt insbesondere überexprimiert.6. The method according to claim 1, characterized in that fermented for the production of L-lysine coryneform microorganisms in which simultaneously one or more of the genes selected from the group
  • 1. 6.1 the gene lysC coding for a feedback-resistant aspartate kinase,
  • 2. 6.2 the gene dapA coding for the dihydrodipicolinate synthase,
  • 3. 6.3 the gene gap coding for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
  • 4. 6.4 the gene coding for pyruvate carboxylase pyc,
  • 5. 6.5 the gene mqo coding for the malate: quinone oxidoreductase,
  • 6. 6.6 the gene coding for the glucose-6-phosphate dehydrogenase zwf,
  • 7. 6.7 Simultaneously the gene lysE coding for lysine export,
  • 8. 6.8 the gene coding for the Zwa1 protein zwa1
  • 9. 6.9 the gene tpi coding for the triose phosphate isomerase, and
  • 10. 6.10 the gene pgk coding for the 3-phosphoglycerate kinase,
especially overexpressed. 7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Herstellung von L-Valin coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  • 1. 7.1 das für eine feed-back resistente Aspartatkinase kodierende Gen lysC,
  • 2. 7.2 das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende Gen hom,
  • 3. 7.3 das für eine feed-back resistente Homoserin- Dehydrogenase kodierende Allel hom(Fbr),
  • 4. 7.4 das für die Threonin-Dehydratase kodierende Gen ilvA, oder das für eine feed-back resistente Threonin- Dehydratase kodierende Allel ilvA(Fbr),
  • 5. 7.5 das für die Acetohydroxysäure-Synthase kodierenden Gen ilvBN,
  • 6. 7.6 das für die Dihydroxysäuredehydratase kodierende Gen ilvD,
  • 7. 7.7 das für die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase kodierende Gen zwf,
  • 8. 7.8 gleichzeitig die für den Valin-Export kodierenden Gene brnF- und/oder brnE, und
  • 9. 7.9 das für das Zwa1-Protein kodierende Gen zwa1 verstärkt, insbesondere überexprimiert.
7. The method according to claim 1, characterized in that fermented for the production of L-valine coryneforme microorganisms, in which simultaneously one or more of the genes selected from the group
  • 1. 7.1 the lysC gene coding for a feedback-resistant aspartate kinase,
  • 2. 7.2 the homoserine dehydrogenase-encoding gene hom,
  • 3. 7.3 the allele hom (Fbr) coding for a feedback-resistant homoserine dehydrogenase,
  • 4. 7.4 the gene encoding ilvA for the threonine dehydratase, or the allele ilvA (Fbr) coding for a feedback-resistant threonine dehydratase,
  • 5. 7.5 the gene ilvBN coding for the acetohydroxy acid synthase,
  • 6.7.6 the gene ilvD coding for the dihydroxy acid dehydratase,
  • 7.7.7 gene encoding glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • 8. 7.8 simultaneously the genes coding for valine export, brnF and / or brnE, and
  • 9. 7.9 enhances the Zwa1 gene coding for the Zwa1 protein, in particular overexpressing it.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von L-Aminosäuren coryneforme Mikroorganismen fermentiert, in denen man gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  • 1. 8.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende pck-Gen,
  • 2. 8.2 das für die Glucose-6-Phosphat Isomerase kodierende pgi-Gen
  • 3. 8.3 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende Gen poxB, oder
  • 4. 8.4 das für das Zwa2-Protein kodierende Gen zwa2 abschwächt.
8. The method according to claim 1, characterized in that fermented to produce L-amino acids coryneform microorganisms, in which one or more of the genes selected from the group
  • 1. 8.1 the phosphoenolpyruvate carboxykinase-encoding pck gene,
  • 2. 8.2 the pgi gene encoding glucose-6-phosphate isomerase
  • 3. 8.3 the gene coding for the pyruvate oxidase poxB, or
  • 4. 8.4 attenuates the Zwa2 gene coding for the Zwa2 protein.
9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Art Corynebacterium glutamicum einsetzt.9. Method according to one or more of the preceding Claims, characterized that one microorganisms of the species Corynebacterium glutamicum.
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