DE10108099A1 - Method for detection of specific proteins and use - Google Patents

Method for detection of specific proteins and use

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Abstract

The method is a method for the determination of specific proteins (PK), associated with diseases such as transmittable spongiform encephalopathies (TSE), bovine spongiform encephalopathy (BSE), kuru, scrapie, Creutzfeldt-Jakob disease and similar, comprising the following steps: a) removal of parts of the eye, b) production of a sample containing the eye substance and c) carrying out a determination method for the presence of specific proteins (PK) in the sample.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis spezifi­ scher Proteine, welche mit Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enze­ phalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krank­ heit, und dgl.. assoziiert sind. Sie betrifft ferner eine Verwendung.The invention relates to a method for specific detection proteins associated with diseases such as transmissible spongiform encephalopathies (TSE), bovine spongiform ence phalopathy (BSE), Kuru, scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krank heit, and the like .. are associated. It also concerns one Use.

Bei den sogenannten spongiformen Enzephalopathien handelt es sich um Krankheiten, die mit dem Auftreten und der Ablagerung spezifischer pathogener Proteine (PK) assoziiert sind. Es handelt es sich bei den krankheitsspezifischen Proteinen um Isoformen physiologisch vorkommender Proteine (P). Dabei kön­ nen P und PK sogenannte Prionproteine sein. PK unterscheidet sich insbesondere in seiner räumlichen Struktur von P. PK be­ sitzt eine β-Faltblattstruktur. Es hat eine erhöhte Aggrega­ tionsneigung und weist eine erhöhte Proteaseresistenz als das physiologische Protein (CP) auf. PK reichert sich im Nerven­ gewebe an. Es bildet dort sogenannte amyloide Ablagerungen, welche für die Krankheitssymptome mitverantwortlich gemacht werden.The so-called spongiform encephalopathies are diseases related to the occurrence and deposition specific pathogenic proteins (PK) are associated. It are the disease-specific proteins Isoforms of physiologically occurring proteins (P). You can P and PK are so-called prion proteins. PK differs especially in its spatial structure of P. PK be sits a β-sheet structure. It has an increased aggregate tendency and has an increased protease resistance than that physiological protein (CP). PK is getting nervous fabric. It forms so-called amyloid deposits there, which is partly responsible for the symptoms of the disease become.

Wodurch das Auftreten von PK hervorgerufen wird, ist bisher nicht bekannt. Sicher scheint allerdings zu sein, daß PK mit­ verantwortlich für die bei der Krankheit auftretenden Sympto­ me ist. Das im Zusammenhang mit spongiformen Enzephalopathien beim Tier auftretende pathogene Prionprotein "Scrapie" wird im folgenden mit PrPsc, das physiologische Protein mit PrPc abgekürzt. It is not yet known what causes PK to occur. What seems certain, however, is that PK is also responsible for the symptoms that occur with the disease. The pathogenic prion protein "scrapie" occurring in connection with spongiform encephalopathies in the animal is abbreviated in the following with PrP sc , the physiological protein with PrP c .

Insbesondere im Hinblick auf die in Europa auftretende Rin­ derseuche BSE und der damit einhergehenden Gefahr einer Über­ tragung dieser Krankheit auf den Menschen, besteht ein hoher Bedarf an der Diagnose transmissibler spongiformer Enzephalo­ pathien.Especially with regard to the Rin occurring in Europe the disease BSE and the associated danger of an over the spread of this disease to humans is high Need for the diagnosis of transmissible spongiform encephalo pathies.

Zur Herstellung einer Probe zum Nachweis z. B. des pathologi­ schen Prionproteins PrPsc wird nach dem Stand der Technik ei­ ne Gehirnprobe entnommen. Die Gehirnprobe wird dann enzyma­ tisch verdaut, um PrPc zu zerstören und von PrPsc zu trennen. Das verbleibende nicht verdaute PrPsc wird dann mittels enzy­ mimmunologischer Verfahren oder der Immunoblot-Technik nach­ gewiesen.To prepare a sample for detection e.g. B. the pathological prion protein PrP sc ei ne brain sample is taken according to the prior art. The brain sample is then digested enzymatically to destroy PrP c and separate it from PrP sc . The remaining undigested PrP sc is then detected using enzyme immunological methods or the immunoblot technique.

Die Herstellung der Probe ist zeit- und kostenaufwendig. Au­ ßerdem ist es erforderlich, die Gehirnprobe schnell zur Un­ tersuchungseinrichtung zu transportieren, weil deren Zerset­ zung zu einer Verfälschung des Nachweises von PrPsc führen kann. Die enzymatische Aufbereitung der Gehirnprobe ist eben­ falls zeitaufwendig. Zu deren Durchführung sind kostenaufwen­ dige Vorrichtungen erforderlich.The preparation of the sample is time-consuming and costly. In addition, it is necessary to quickly transport the brain sample to the examination facility, because its decomposition can lead to a falsification of the detection of PrP sc . The enzymatic preparation of the brain sample is also time-consuming. To carry them out, expensive devices are required.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere ein Verfah­ ren und eine Verwendung angegeben werden, welche einen einfa­ chen und schnellen Nachweis von mit spezifischen Proteinen assoziierten Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enze­ phalopathien, ermöglichen.The object of the invention is to overcome the disadvantages of the prior art of technology to eliminate. In particular, there should be a procedure Ren and a use are specified, which a simple and fast detection of with specific proteins associated diseases, such as transmissible spongiform ence phalopathies, allow.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 8 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltung ergeben sich aus den Merk­ malen der Ansprüche 2 bis 7 und 9 bis 14. This object is achieved by the features of claims 1 and 8 solved. Appropriate design result from the memo paint claims 2 to 7 and 9 to 14.  

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht einen einfachen und schnellen Nachweis von mit spezifischen Proteinen assoziier­ ten Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enzephalopa­ thien. Ein Anteil des Auges, wie Kammerwasser kann mittels eines kleinen Eingriffs auch vom lebenden Tier entnommen wer­ den. Es ist nicht zwangsläufig erforderlich, zur Durchführung des Nachweisverfahrens auf das Vorliegen spezifischer Prion­ proteine das Tier zu töten. Auch die Entnahme von Anteilen des Auges vom geschlachteten Tier ist deutlich einfacher mög­ lich als die Entnahme einer Gehirnprobe. Ein entnommenes Auge ist durch Kornea und Sklera vor mikrobieller Kontamination einige Zeit geschützt. Eine Zersetzung und autolytische Pro­ zesse treten im Gegensatz zu einer Gehirnprobe wesentlich später auf. - Bei dem Nachweisverfahren gemäß Schritt lit. c kann es sich um ein herkömmliches Nachweisverfahren für pa­ thologische Prionproteine handeln.The inventive method enables a simple and rapid detection of associated with specific proteins diseases such as transmissible spongiform encephalopa thien. A portion of the eye, such as aqueous humor, can be by means of a small intervention also taken from the living animal the. It is not essential to carry out the detection procedure for the presence of specific prions proteins to kill the animal. The withdrawal of shares of the eye from the slaughtered animal is much easier Lich as taking a brain sample. A removed eye is protected against microbial contamination by cornea and sclera protected for some time. A decomposition and autolytic pro Processes occur significantly in contrast to a brain test later on. - In the detection procedure according to step lit. c can it be a conventional detection procedure for pa act thological prion proteins.

Die unter Verwendung von Augenanteilen hergestellte Probenlö­ sung kann ohne langwierige Vorbehandlungen, wie es das Aus­ gangsmaterial Gehirn erfordern würde, mittels eines herkömm­ lichen Nachweisverfahrens auf das Vorhandensein von spezifi­ schen Proteinen untersucht werden.The sample solution prepared using eye portions solution can be done without lengthy pretreatments, as is the case gangs material brain would require, using a conventional verification procedure for the presence of speci proteins are examined.

Nach einer Ausgestaltung wird/werden für den Nachweis von PrPsc als Augenanteil/e, vorzugsweise Kammerwasser und/oder Glaskörper und/oder die Retina verwendet. Insbesondere das Kammerwasser kann auch am lebenden Tier entnommen werden. Da­ zu ist lediglich ein geringfügiger tierärztlicher Eingriff notwendig. Insbesondere schwer ersetzbare lebende Zuchttiere, Zoo- oder Wildtiere können auf diese Weise geschont werden; sie müssen für den Nachweis des Vorliegens von PrPsc nicht getötet werden. Ferner sind der Glaskörper, das Kammerwasser sowie die Retina nahezu frei von störendem Protein und Plasminogen. Im Vergleich zur Verwendung einer Gehirnprobe ent­ fallen langwierige Reinigungs- und Inaktivierungsschritte.According to one embodiment, for the detection of PrP sc the eye portion (s) are preferably used, preferably aqueous humor and / or vitreous and / or the retina. The aqueous humor in particular can also be taken from living animals. Only a minor veterinary intervention is necessary. Living breeding animals, zoo or wild animals, which are particularly difficult to replace, can be spared in this way; they do not have to be killed to demonstrate the presence of PrP sc . Furthermore, the vitreous, the aqueous humor and the retina are almost free of interfering protein and plasminogen. Compared to using a brain sample, there are no lengthy cleaning and inactivation steps.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal werden die Augenan­ teile dem Auge eines Tiers, insbesondere eines Rinds, entnom­ men. Insbesondere beim Rind eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut, weil im Rinderauge auch physiologi­ scherweise eine Proteinsynthese möglich ist. Schließlich ist es möglich, das spezifische Protein PK, insbesondere PrPsc, aus der Probe mittels Gradientenzentrifugation oder Kapillar- Immuno-Elektrophorese zu konzentrieren. Ferner ist es möglich zur Konzentration Affinitätsverfahren ohne Aufreinigung oder Dialyseverfahren mit einem Entsalzungsschritt zu verwenden.According to a further design feature, the parts of the eyes are removed from the eyes of an animal, in particular a cattle. In the case of cattle in particular, the method according to the invention is particularly suitable because protein synthesis is also physiologically possible in the cattle eye. Finally, it is possible to concentrate the specific protein PK, in particular PrP sc , from the sample by means of gradient centrifugation or capillary immuno-electrophoresis. It is also possible to use affinity processes for concentration without purification or dialysis processes with a desalination step.

Der Probe kann eine proteolytisch wirksame Substanz zugesetzt werden, welche unter definierten Reaktionsbedingungen das spezifische Protein PK im wesentlichen unbeeinflußt läßt und ein eine Isoform von PK bildendes Protein P spaltet. Bei den definierten Reaktionsbedingungen handelt es sich um Reakti­ onsbedingungen, welche physiologischen Bedingungen ähnlich sind. Bei dem spezifischen Protein Pk kann es sich um PrPsc und bei dem Protein P um PrPc handeln. Als proteolytisch wirksame Substanz wird zweckmäßigerweise ein Enzym, z. B. Pro­ teinase-K, verwendet. Zum Nachweis des spezifischen Proteins PK kann in herkömmlicher Weise ein an das spezifische Protein PK bindender, vorzugsweise markierter, Antikörper zugesetzt werden.A proteolytically active substance can be added to the sample which, under defined reaction conditions, leaves the specific protein PK essentially unaffected and cleaves a protein P which forms an isoform of PK. The defined reaction conditions are reaction conditions which are similar to physiological conditions. The specific protein Pk can be PrP sc and the protein P can be PrP c . As a proteolytically active substance, an enzyme, for. B. Pro teinase-K used. To detect the specific protein PK, an antibody which binds to the specific protein PK, preferably labeled, can be added in a conventional manner.

Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Verwendung von Anteilen des Augens zur Herstellung einer Probe für die Durchführung eines Nachweisverfahrens auf spezifische Protei­ ne PK beansprucht, welche mit Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krank­ heit, und dgl. assoziiert sind.According to another aspect of the invention, the use of Shares the eye to make a sample for the Carrying out a verification procedure on specific protei ne PK claims, which with diseases such as transmissible spongiform encephalopathy (TSE), bovine spongiform encephalopathy  (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krank unit, and the like are associated.

Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen der Verwendung wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.Because of the advantageous embodiments of the use referred to the previous statements. following the invention is illustrated by an embodiment explained.

Zur Herstellung einer Probe vom toten Toer werden z. B. einem geschlachteten Rind nach Absetzen des Schädels ein oder beide Augen nach der üblichen Technik entnommen. Das Auge/die Augen werden in sterile Transportgefäße gegeben und diese so ge­ kennzeichnet, daß sie eindeutig dem zugehörigen Schlachtkör­ per zuordenbar sind. Anschließend wird das Probenmaterial ge­ kühlt.For the preparation of a sample from the dead Toer z. B. one slaughtered cattle after weaning the skull or both Eyes removed using the usual technique. The eye / the eyes are placed in sterile transport containers and so ge indicates that they clearly belong to the carcass can be assigned by. Then the sample material is ge cools.

Mittels sterilem Injektionsbesteck wird nach Oberflächendes­ infektion des Auges am äußersten Rand der Kornea am Übergang zur Sklera eingestochen. Die Injektionsnadel wird parallel zur Iris in die vordere Augenkammer eingebracht und das sich in der vorderen Augenkammer befindliche Kammerwasser aspi­ riert, bis die vordere Augenkammer gänzlich kollabiert ist. Anschließend wird der Augapfel mit einem sterilen Skalpell in zwei Hälften gespalten und mit einem sterilen Besteck (Pin­ zette, scharfen Löffel etc.) der gelatinöse Glaskörper her­ ausgelöst. Zuletzt wird die Retina, sofern sie nicht durch die hervorgehende Maßnahme mit abgelöst ist, vorsichtig von den restlichen Augenanteilen getrennt und mit einer Pinzette abgelöst.Using a sterile injection set, the surface is finished infection of the eye at the extreme edge of the cornea at the transition stabbed to the sclera. The injection needle becomes parallel introduced to the iris in the anterior chamber and that aqueous humor aspi in the anterior chamber until the anterior chamber has completely collapsed. Then the eyeball is placed in with a sterile scalpel split in half and use sterile cutlery (pin zette, sharp spoons, etc.) of the gelatinous vitreous triggered. Finally, the retina, unless it is through the resulting measure has been replaced with caution by the remaining parts of the eyes separately and with tweezers replaced.

Alle so gewonnenen Augenanteile werden zur weiteren Bearbei­ tung in separate sterile Probengefäße verbracht. All parts of the eyes obtained in this way are used for further processing into separate sterile sample vessels.  

Zur Gewinnung einer Probe vom lebenden Tier wird z. B. ein Rind zunächst sediert. Alternativ kann das Tier auch in Voll­ narkose gelegt werden, wenn es sich um ein nicht zur Lebens­ mittelgewinnung genutztes Tier bzw. um ein sehr scheues (Zoo-)Tier handelt. Unter Anwendung allgemein üblicher Zwangsmaßnahmen (Fußfesseln, Kopfstrick) wird ein Lokal­ anästhetikum auf die Kornea des zu untersuchenden Auges auf­ getropft und der restliche Kopf abgedeckt. Anschließend wird mit einem sterilen Injektionsbesteck am temporalen Rand der Kornea am Übergang zur Sklera eingestochen und die Injekti­ onsnadel parallel zum Verlauf der Iris in die vordere Augen­ kammer eingebracht und Kammerwasser aspiriert.To obtain a sample from the live animal z. B. a Beef first sedated. Alternatively, the animal can also be in full to be put under anesthesia if it is not a life animal used for fundraising or a very shy animal (Zoo) animal acts. Using more common Coercive measures (ankle cuffs, head rope) become a place anesthetic on the cornea of the eye to be examined dripped and the rest of the head covered. Then will with a sterile injection set on the temporal edge of the Pierced the cornea at the transition to the sclera and the injections onsnadel parallel to the course of the iris in the front eyes chamber introduced and aspirated aqueous humor.

Die vom lebenden oder toten Tier entnommenen Augenanteile werden zur Herstellung der Probe nachfolgend mechanisch oder physikalisch zerkleinert und damit homogenisiert. Die Zer­ kleinerung kann z. B. mittels Ultraschall oder eines schnel­ laufenden Rührwerks, z. B. einem Ultrathurrax, erfolgen. Die hergestellte homogenisierte Flüssigkeit kann nachfolgend fil­ tiert oder zentrifugiert werden. Die Probe kann dann aus dem Überstand gewonnen werden.The parts of the eye taken from the living or dead animal are subsequently mechanically or to produce the sample physically crushed and thus homogenized. The Zer reduction can z. B. using ultrasound or a quick running agitator, e.g. B. an Ultrathurrax. The The homogenized liquid produced can subsequently be fil be centrifuged or centrifuged. The sample can then be taken from the Supernatant can be obtained.

Die Probe kann mittels herkömmlicher Verfahren unmittelbar auf das Vorliegen von PrPsc untersucht werden. Das nach dem Stand der Technik derzeit verwendete langwierige Aufberei­ tungsverfahren einer aus dem Gehirn entnommenen Probe ent­ fällt.The sample can be examined directly for the presence of PrP sc using conventional methods. The lengthy preparation method currently used according to the prior art of a sample taken from the brain is eliminated.

Claims (14)

1. Verfahren zum Nachweis spezifischer Proteine (PK), wel­ che mit Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enzephalo­ pathien (TSE), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Ku­ ru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und dgl. assoziiert sind, mit folgenden Schritten:
  • a) Entnahme von Anteilen des Auges,
  • b) Herstellung einer die Augenanteile enthaltenden Probe und
  • c) Durchführung eines Nachweisverfahrens auf das Vorhanden­ sein von spezifischen Proteinen (PK) in der Probe.
1. A method for detecting specific proteins (PK) associated with diseases such as transmissible spongiform encephalopathies (TSE), bovine spongiform encephalopathy (BSE), Ku ru, scrapie, Creutzfeldt-Jakob disease and the like, with the following steps:
  • a) removal of parts of the eye,
  • b) preparation of a sample containing the eye parts and
  • c) Carrying out a detection procedure for the presence of specific proteins (PK) in the sample.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Augenanteil der Glaskörper und/oder das Kammerwasser und/oder die Retina ver­ wendet wird/werden.2. The method according to claim 1, wherein the eye portion of the Vitreous and / or aqueous humor and / or the retina ver is / will be applied. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Augenanteile dem Auge eines Tiers, insbesondere eines Rinds, entnommen wird.3. The method according to any one of the preceding claims, wherein the eye parts of an animal's eye, especially one Beef. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das spezifische Protein aus der Probe mittels einer Gradien­ tenzentrifugation; Kapillar-Immuno-Elektrophorese oder Dialy­ se angereichert wird.4. The method according to any one of the preceding claims, wherein the specific protein from the sample using a gradient tenzentrifugation; Capillary immuno-electrophoresis or dialy se is enriched. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. c der Probe eine proteolytisch wirksame Substanz zugesetzt wird, welche unter definierten Reaktions­ bedingungen das spezifische Protein (PK) im wesentlichen un­ beeinflußt läßt und ein eine Isoform von (PK) bildendes Pro­ tein (P) spaltet. 5. The method according to any one of the preceding claims, wherein at step lit. c the sample is a proteolytically effective Substance is added, which under defined reaction conditions the specific protein (PK) essentially un and a pro forming an isoform of (PK) tein (P) splits.   6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das spezifische Protein (PK) PrPsc und das Protein (P) PrPc ist.6. The method according to any one of the preceding claims, wherein the specific protein (PK) PrP sc and the protein (P) PrP c . 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zum Nachweis des spezifischen Proteins (PK) der Probe ein an das spezifische Protein (PK) bindender, vorzugsweise markier­ ter, Antikörper zugesetzt wird.7. The method according to any one of the preceding claims, wherein to detect the specific protein (PK) of the sample the specific protein (PK) binding, preferably labeled ter, antibody is added. 8. Verwendung von Augenanteilen zur Herstellung einer Probe für die Durchführung eines Nachweisverfahrens auf spezifische Proteine (PK), welche mit Krankheiten, wie transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enze­ phalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und dgl. assoziiert sind.8. Use of eye parts to prepare a sample for carrying out a verification procedure on specific Proteins (PK), which are associated with diseases such as transmissible spongiform encephalopathies (TSE), bovine spongiform ence phalopathy (BSE), Kuru, scrapie, Creutzfeldt-Jakob disease and the like. 9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei als Augenanteile der Glaskörper und/oder das Kammerwasser und/oder die Retina ver­ wendet wird/werden.9. Use according to claim 8, wherein the eye parts of the Vitreous and / or aqueous humor and / or the retina ver is / will be applied. 10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Augenantei­ le dem Auge eines Tiers, insbesondere eines Rinds, entnommen ist.10. Use according to claim 8 or 9, wherein the eye part le taken from the eye of an animal, especially a cattle is. 11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das spezifische Protein (PK) mittels einer Gradientenzentrifuga­ tion, Kapillar-Immuno-Elektrophorese oder Dialyse angerei­ chert wird.11. Use according to one of claims 8 to 10, wherein the specific protein (PK) using a gradient centrifuga tion, capillary immuno-electrophoresis or dialysis is saved. 12. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei beim Nachweisverfahren der Probe eine proteolytisch wirksamen Sub­ stanz zugesetzt wird, welche unter definierten Reaktionsbe­ dingungen das spezifische Protein (PK) im wesentlichen unbeeinflußt läßt und ein eine Isoform des spezifischen Proteins bildendes Protein (P) spaltet.12. Use according to one of claims 8 to 11, wherein the Detection method of the sample a proteolytically active sub punch is added, which under defined reaction conditions the specific protein (PK) essentially unaffected  lets and an isoform of the specific protein forming protein (P) cleaves. 13. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei das spezifische Protein (PK) PrPsc und das Protein (P) PrPc ist.13. Use according to one of claims 8 to 12, wherein the specific protein (PK) PrP sc and the protein (P) PrP c . 14. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei zum Nachweis des spezifischen Proteins (PK) der Probe ein an das spezifische Protein (PK) bindender, vorzugsweise markierter, Antikörper zugesetzt wird.14. Use according to one of claims 8 to 13, wherein Detection of the specific protein (PK) of the sample sent to the specific protein (PK) binding, preferably labeled, Antibody is added.
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