DE10102839C2 - Method for the determination of hydrolytic enzymes - Google Patents

Method for the determination of hydrolytic enzymes

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Enzymen unter Einsatz der Fluoreszenz von Lanthanoidchelaten.The invention relates to a method for determining enzymes using the fluorescence of lanthanoid chelates.

Der Bestimmung von Enzymen kommt in der Bioanalytik eine große Bedeutung zu, da Enzyme als Biokatalysatoren innerhalb des pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Organismus wirksam sind. Ihre Bestimmung ist zur Überwachung der Funktionen des Organismus in vielen Fällen dringend erforderlich. Weiterhin werden Enzyme in Immunoassays oder Verfahren zur Bestimmung von Nucleinsäuren als Markersubstanzen eingesetzt. Durch die große Aktivität der Markerenzyme können erhebliche Signalverstärkungen erreicht werden, da ein Molekül des Biokatalysators eine Vielzahl von detektierbaren Produktmolekülen erzeugt.The determination of enzymes is a big one in bioanalytics Importance because enzymes as biocatalysts within the plant, animal or human organism are effective. Their purpose is to monitor the functions of the organism urgently needed in many cases. Furthermore enzymes are in Immunoassays or methods for determining nucleic acids as Marker substances used. Due to the great activity of the Marker enzymes can achieve significant signal enhancements because one molecule of the biocatalyst has a variety of detectable Product molecules generated.

Häufig werden zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen Bioassays auf der Basis von Fluoreszenzmessungen eingesetzt, die das Erreichen besonders niedriger Nachweisgrenzen ermöglichen. Das Hauptproblem derartiger, fluorimetrischer Bestimmungen liegt in der Limitierung der Nachweisgrenzen durch natürliche Hintergrundfluoreszenz und Streustrahlung. Es existieren jedoch Anwendungen, bei denen die langlebige Fluoreszenz von Seltenerdmetallchelaten (Tb(III), Eu(III), Sm(III), Dy(III)) dazu genutzt wird, eben diese Hintergrundstrahlung durch zeitverzögerte Aufnahme des Messsignals deutlich zu reduzieren. Zusätzlich erfolgt eine Vergrößerung der Stokes'schen Verschiebung (Abstand zwischen Anregungs- und Emissionsmaximum) auf weit über 100 nm. Dies bedeutet eine weitere Verbesserung des Verhältnisses zwischen spezifischer und unspezifischer Fluoreszenz. Diese Eigenschaft der Seltenerdmetallchelate ist durch eine Anregung der Chelatliganden und anschließenden Energietransfer auf das Zentralion, welches dann bei seiner charakteristischen Emissionswellenlänge Licht aussendet, begründet. Häufige Anwendung finden beispielsweise Europium(III)- Chelate als Markersubstanzen in Immunoassays. Nach der Immunreaktion und verschiedenen, weiteren Aufarbeitungsschritten wird die Fluoreszenz des Europiums zeitverzögert detektiert (neben vielen weiteren Literaturstellen unter anderem beschrieben bei Soini, E.; Kojola, H. Clin. Chem. 29 (1983) 65, Diamandis, E. P. Clin. Biochem. 21 (1983) 139).Bioassays are often used to determine the activity of enzymes used on the basis of fluorescence measurements that the Allow reaching particularly low detection limits. The The main problem with such fluorimetric determinations lies in Limitation of detection limits by natural Background fluorescence and scattered radiation. However, there do exist Applications in which the long-lasting fluorescence of Rare earth metal chelates (Tb (III), Eu (III), Sm (III), Dy (III)) this background radiation is used by time-delayed Significantly reduce the recording of the measurement signal. In addition an increase in Stokes' displacement (distance between Excitation and emission maximum) to well over 100 nm means a further improvement in the relationship between specific and non-specific fluorescence. This property of Rare earth metal chelate is due to excitation of the chelating ligands and subsequent energy transfer to the central ion, which then emits light at its characteristic emission wavelength, founded. Europium (III), for example, is frequently used - Chelates as marker substances in immunoassays. After Immune response and various other processing steps  the fluorescence of the europium is detected with a time delay (next to described in many other references, among others Soini, E .; Kojola, H. Clin. Chem. 29 (1983) 65, Diamandis, E.P. Clin. Biochem. 21 (1983) 139).

Verfahren, die eine enzymatische Reaktion mit der Bildung eines Lanthanoidchelates aus einem der Reaktionsprodukte koppeln, sind in der Literatur unter der Bezeichnung EALL (enzyme-amplified lanthanide luminescence) beschrieben worden (Evangelista, R. A.; Pollak, A.; Gudgin Templeton, E. F. Anal. Biochem. 197 (1991) 213; Gudgin Templeton, E. F.; Wong, H. E.; Evangelista, R. A.; Granger, T.; Pollak, A. Clin. Chem. 37 (9) (1991) 1506; Papanastasiou-Diamandi, A.; Christopoulos, T. K.; Diamandis, E. P. Clin. Chem. 38 (4) (1992) 545; Christopoulos, T. K.; Diamandis, E. P. Anal. Chem. 64 (1992) 342; Lianidou, E. S.; Ioannou, P. C.; Sacharidou, E. Anal. Chim. Acta 290 (1994) 159; Veiopoulou, C. J.; Lianidou, E. S.; Ioannou, P. C.; Efstathiou, C. E. Anal. Chim. Acta 335 (1996) 177). In diesen Arbeiten wurden weitestgehend Salicylatester durch hydrolytische Enzyme, in der Regel Phosphatasen, gespalten und mit Terbium(III) in alkalischen Medien zu fluoreszierenden Derivaten gekoppelt. Aufgrund der Zweizähnigkeit der Liganden ist hierbei zur koordinativen Absättigung des Zentralions die Zugabe eines weiteren Chelators (EDTA) erforderlich, der das Ausfallen von Terbium(III)hydroxid im alkalischen Medium verhindert. Nachteilig hierbei ist, dass auch das EDTA von kurzwelligem UV-Licht angeregt wird und in geringem Umfang ein Energietransfer auf das Zentralion stattfindet. Damit sind die Nachweisgrenzen aufgrund der stark gestiegenen Reagenz-Blindwerte deutlich schlechter als in Abwesenheit des EDTAs.Process involving an enzymatic reaction with the formation of a Coupling lanthanoid chelates from one of the reaction products are in the literature under the name EALL (enzyme-amplified lanthanide luminescence) (Evangelista, R. A .; Pollak, A .; Gudgin Templeton, E.F. Anal. Biochem. 197 (1991) 213; Gudgin Templeton, E. F .; Wong, H.E .; Evangelista, R. A .; Granger, T .; Pollak, A. Clin. Chem. 37 (9) (1991) 1506; Papanastasiou-Diamandi, A .; Christopoulos, T. K .; Diamandis, E.P. Clin. Chem. 38 (4) (1992) 545; Christopoulos, T. K .; Diamandis, E.P. Anal. Chem. 64 (1992) 342; Lianidou, E. S .; Ioannou, P. C .; Sacharidou, E. Anal. Chim. Acta 290 (1994) 159; Veiopoulou, C. J .; Lianidou, E. S .; Ioannou, P. C .; Efstathiou, C.E. Anal. Chim. Acta 335 (1996) 177). In these Work has largely been carried out on hydrolytic salicylate esters Enzymes, usually phosphatases, cleaved and treated with terbium (III) coupled to fluorescent derivatives in alkaline media. Due to the bidentate nature of the ligands coordinative saturation of the central ion the addition of another Chelators (EDTA) required to prevent the failure of Prevents terbium (III) hydroxide in an alkaline medium. adversely here is that the EDTA is also stimulated by short-wave UV light and to a small extent an energy transfer to the central ion takes place. Thus the detection limits are strong due to the increased reagent blank values significantly worse than in Absence of the EDTA.

In Zheng, X.-Y.; Lu J.-Z.; Zhu, Q.-Z.; Xu, J.-G.; Li, Q.-G. Analyst 122 (1997) 455 ist die Bildung fluoreszierender Terbium(III)- Chelate aus dem unter Häminkatalyse und Wasserstoffperoxideinwirkung gebildeten Oxidationsprodukt von p- Hydroxybenzoesäure beschrieben. Daraus wurde von den Autoren eine Methode zur Bestimmung mit Hämin markierten Albumins entwickelt. In Zheng, X.-Y .; Lu J.-Z .; Zhu, Q.-Z .; Xu, J.-G .; Li, Q.-G. analyst 122 (1997) 455 is the formation of fluorescent terbium (III) - Chelates from under hemin catalysis and Oxidation product of p- Hydroxybenzoic acid described. The authors turned this into a Method for determining albumins marked with hemin developed.  

Eigene, frühere Arbeiten zielten auf die Entwicklung eines Systems, bei dem das Enzym Peroxidase durch ein solches EALL-System bestimmt wird (Meyer, J.; Karst, U. DE 198 13 247.6; Meyer, J.; Karst, U. Analyst 125 (2000) 1537). Hiermit wurde eine Erweiterung des EALL- Prinzips auf eine bisher nicht zugängliche Enzymgruppe möglich. Die Kopplung der Hydroxyphenylcarbonsäuren zu zweizähnigen Liganden für Tb(III), die im Mittelpunkt dieser Arbeiten steht, erfordert jedoch wie die Salicylate den Zusatz von EDTA, um das Zentralion in den alkalischen Medien in Lösung zu halten. Daraus ergeben sich für die hämin- und peroxidasekatalysierten Enzymsysteme analoge Limitationen, wie für die o. g. Systeme auf Basis hydrolytischer Enzyme.Own, earlier work aimed at the development of a system, in which the enzyme peroxidase is determined by such an EALL system will (Meyer, J .; Karst, U. DE 198 13 247.6; Meyer, J .; Karst, U. Analyst 125 (2000) 1537). An extension of the EALL In principle, an enzyme group that was previously inaccessible is possible. The Coupling of the hydroxyphenylcarboxylic acids to bidentate ligands for However, Tb (III), which is the focus of this work, requires like the salicylates the addition of EDTA to the central ion in the keep alkaline media in solution. This results in the heme- and peroxidase-catalyzed enzyme systems analog Limitations as for the above Systems based on hydrolytic Enzymes.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Enzyme in Medien mit pH-Werten um den Neutralpunkt bestimmt werden können, so dass der Zusatz von EDTA oder analogen Hilfsliganden vermieden werden kann. Hierzu sollen die zeitverzögerte Fluoreszenz und/oder die große Stokes'sche Verschiebung der Lanthanoidchelate zur Bestimmung von Enzymen eingesetzt werden.The present invention is based on the object To provide methods of using enzymes in media pH values around the neutral point can be determined so that the Addition of EDTA or analogue auxiliary ligands can be avoided. For this purpose, the time-delayed fluorescence and / or the large one Stokes' shift of the lanthanoid chelates for the determination of Enzymes can be used.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass eine große Zahl von Derivaten des Liganden Bis(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin (Darstellung beschrieben in: Ito S.; Nishino S.; Itoh H.; Ohba S.; Nishida Y.; Polyhedron 17 (1998) 1637) nur in wesentlich geringerem Umfang als der Ligand selbst oder sogar überhaupt nicht zum Energietransfer auf das Zentralion Tb(III) geeignet ist. Hierbei handelt es sich um dessen Alkancarbonsäureester (Alkylkettenlängen von 2 bis 6 C-Atomen), Phosphorsäureester und Substrate der β- Galactosidase. Die starken Unterschiede zwischen verwandten Substanzen bezüglich der Eigenschaft, Energie auf die Lanthanoidionen zu transferieren, können auf die Komplexierungseigenschaften und/oder den Abstand zwischen den Energieniveaus zwischen Donorligand und Akzeptorion zurückzuführen sein. Surprisingly, it was found that a large number of Derivatives of the ligand bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine (Representation described in: Ito S .; Nishino S .; Itoh H .; Ohba S .; Nishida Y .; Polyhedron 17 (1998) 1637) only to a much lesser extent Extent than the ligand itself or even not at all Energy transfer to the central ion Tb (III) is suitable. in this connection is its alkane carboxylic acid ester (alkyl chain lengths of 2 to 6 carbon atoms), phosphoric acid esters and substrates of the β- Galactosidase. The strong differences between relatives Substances related to the property, energy on the Lanthanoid ions can be transferred to the Complexation properties and / or the distance between the Energy levels between donor ligand and acceptor ion his.  

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Enzymen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine enzymhaltige Probe mit einem durch das Enzym umwandelbaren Derivat des Liganden Bis(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin in Kontakt bringt, eine Lösung eines Terbium(III)salzes zugibt und die Reaktion fluoreszenzspektroskopisch auswertet.The invention relates to a method for determining Enzymes, which is characterized in that one contains an enzyme Sample with an enzyme convertible derivative of the ligand Bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine in contact, one Solution of a terbium (III) salt is added and the reaction evaluated by fluorescence spectroscopy.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bestimmung aller Enzyme eingesetzt werden, die bei der von ihnen katalysierten Umsetzung den Liganden Bis(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin freizusetzen vermögen, welcher seine Anregungsenergie auf Terbium(III) übertragen kann.The method according to the invention can be used to determine all enzymes are used in the catalyzed implementation to release the ligand bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine which have their excitation energy on terbium (III) can transmit.

Das Verfahren kann auch für die Auswertung von Immunoassays verwendet werden, bei denen eine der Immunkomponenten mit einem Enzym markiert ist, das bei der von ihm katalysierten Umsetzung den Liganden Bis(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin freizusetzen vermag, welcher seine Anregungsenergie auf Terbium(III) übertragen kann.The method can also be used for the evaluation of immunoassays are used in which one of the immune components with a Enzyme is marked, the in the catalyzed implementation of the Ligands to release bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine capable of transferring its excitation energy to terbium (III) can.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll im Folgenden anhand eines Beispiels verdeutlicht werden:The method according to the invention is to be described below using a Examples are made clear:

Beispielexample Bestimmung der Konzentration von Esterase in einer EnzymlösungDetermination of the concentration of esterase in a enzyme solution

Zunächst wird der Essigsäureester von Bis(2-pyridylmethyl)(2- hydroxybenzyl)amin nach folgender Vorschrift synthetisiert: 305 mg (1 mmol) Bis(2-pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin werden in 12 ml Acetonitril gelöst und mit 1,021 g (10 mmol) Essigsäureanhydrid versetzt. Nach Zusatz von 279 µL Triethylamin und 5 µL 4-(N,N- Dimethylamino)pyridin wird das Gemisch für 72 Stunden zum Sieden erhitzt. Nach dem Erkalten wird das Gemisch auf 50 ml Wasser gegeben und dreimal mit wenig Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase, die das Reaktionsprodukt Bis(2-pyridylmethyl)(2- acetoxybenzyl)amin enthält, wird mit Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration bis zur Trockene eingeengt.First, the acetic acid ester of bis (2-pyridylmethyl) (2- hydroxybenzyl) amine synthesized according to the following instructions: 305 mg (1 mmol) bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine in 12 ml Acetonitrile dissolved and with 1.021 g (10 mmol) of acetic anhydride added. After adding 279 µL triethylamine and 5 µL 4- (N, N- Dimethylamino) pyridine, the mixture is boiled for 72 hours heated. After cooling, the mixture is poured onto 50 ml of water given and extracted three times with a little dichloromethane. The organic phase containing the reaction product bis (2-pyridylmethyl) (2-  contains acetoxybenzyl) amine, is dried with sodium sulfate and after filtration evaporated to dryness.

Anschließend werden zwei Lösungen angesetzt:Then two solutions are prepared:

Lösung 1Solution 1

37,34 mg TbCl3.6H2O werden in 10 ml Wasser zu einer 0,01 molaren Lösung aufgenommen.37.34 mg TbCl 3 .6H 2 O are taken up in 10 ml water to a 0.01 molar solution.

Lösung 2Solution 2

3,47 mg Bis(2-pyridylmethyl)(2-acetoxybenzyl)amin werden in 8 ml Bis-Tris-Propanpuffer (0,01 molar, pH 6,8) gelöst, und es werden 2 ml Dimethylsulfoxid zugegeben, so dass sich eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mmol/l ergibt.3.47 mg of bis (2-pyridylmethyl) (2-acetoxybenzyl) amine dissolved in 8 ml bis-tris-propane buffer (0.01 molar, pH 6.8), and it 2 ml of dimethyl sulfoxide are added so that there is a solution with a concentration of 1 mmol / l.

100 µL einer Esteraselösung unbekannter Konzentration (Probenlösung) werden auf einer Mikrotiterplatte mit 50 µL von Lösung 2 zusammengegeben. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten werden 50 µL von Lösung 1 hinzugegeben. Die Reaktion wird fluoreszenzspektroskopisch bei einer Anregungswellenlänge von 297 nm und einer Emissionswellenlänge von 545 nm ausgewertet. Bei der zeitverzögerten Messung beträgt die Zeitverzögerung 50 µs und die Integrationszeit 1 ms. Die Kalibration erfolgt durch Einsatz einer Konzentrationsreihe der Esterase von bekannter Konzentration, die analog zur Probenlösung behandelt wird. Die Konzentration der Esterase in der Probenlösung wird auf diese Weise zu 0,085 units/ml bestimmt.100 µL of an esterase solution of unknown concentration (Sample solution) are on a microtiter plate with 50 µL of Solution 2 combined. After a reaction time of 30 minutes 50 µL of solution 1 are added. The reaction is fluorescence spectroscopic at an excitation wavelength of 297 nm and an emission wavelength of 545 nm were evaluated. In the time-delayed measurement, the time delay is 50 µs and the Integration time 1 ms. The calibration is carried out using a Concentration series of the esterase of known concentration, the is treated analogously to the sample solution. The concentration of In this way, esterase in the sample solution becomes 0.085 units / ml certainly.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung hydrolytischer Enzyme, gekennzeichnet dadurch, dass man eine enzymhaltige Probe mit einem durch das Enzym umwandelbaren Derivat des Liganden Bis(2-pyridylmethyl)(2- hydroxybenzyl)amin in Kontakt bringt, eine Lösung eines Terbium(III)salzes zugibt, wobei die Zugabe eines weiteren Komplexbildners nicht notwendig ist, und die Reaktion fluoreszenzspektroskopisch auswertet.1. A method for determining hydrolytic enzymes, characterized in that an enzyme-containing sample is brought into contact with a derivative of the ligand bis (2-pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine which can be converted by the enzyme, a solution of a terbium (III) salt is added , wherein the addition of a further complexing agent is not necessary and the reaction is evaluated by fluorescence spectroscopy. 2. Verfahren zur Bestimmung von Enzymen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass es sich bei dem Derivat von Bis(2- pyridylmethyl)(2-hydroxybenzyl)amin um einen Alkancarbonsäureester, einen Phosphorsäureester oder ein Substrat der β-Galactosidase handelt.2. A method for determining enzymes according to claim 1, characterized in that the derivative of bis (2- pyridylmethyl) (2-hydroxybenzyl) amine around an alkane carboxylic acid ester, a phosphoric acid ester or a substrate of β-galactosidase is. 3. Verfahren zur Bestimmung von Enzymen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, gekennzeichnet dadurch, dass die Auswertung der Reaktion unter Einsatz einer zeitverzögerten Fluoreszenzmessung erfolgt.3. Method for the determination of enzymes according to at least one of the Claims 1 to 2, characterized in that the evaluation of the Reaction using a time-delayed fluorescence measurement he follows. 4. Verfahren zur Bestimmung von Enzymen nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren zur Detektion eines Immunoassays herangezogen wird, bei dem eine enzymmarkierte Immunkomponente eingesetzt wird.4. Method for the determination of enzymes according to at least one of the Claims 1 to 3, characterized in that the method for Detection of an immunoassay is used, in which a enzyme-labeled immune component is used.
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