DE10065626A1 - Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren - Google Patents

Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren

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DE10065626A1
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Zeno Foeldes-Papp
Johan Holm
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.
Die Sequenzierung des aus ca. 3 × 109 Basen bestehenden humanen Genoms oder des Genoms anderer Organismen sowie die Bestimmung und der Vergleich individueller Sequenzvarianten erfordert die Bereitstellung von Sequenziermethoden, die einerseits schnell sind und andererseits routinemäßig und mit geringen Kosten eingesetzt werden können. Obwohl große Anstrengungen unternommen worden sind, um gängige Sequenziermethoden, z. B. die enzymatische Kettenabbruchmethode nach Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463), zu beschleunigen, insbesondere durch Automatisierung (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1994), New York, Academic Press) können derzeit maximal nur 2.000 Basen pro Tag mit einem Sequenziergerät bestimmt werden.
Während der letzten Jahre sind neue Ansätze zur Überwindung der Beschränkungen konventioneller Sequenzierverfahren entwickelt worden, u. a. die Sequenzierung durch Rastertunnelmikroskopie (Lindsay und Phillip, Gen. Anal. Tech. Appl. 8 (1991), 8-13), durch hochparallelisierte Kapillarelektrophorese (Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 2149-2154; Kambara und Takahashi, Nature 361 (1993), 565-566), durch Oligonukleotidhybridisierung (Drmanac et al., Genomics 4 (1989), 114-128; Khrapko et al., FEBS Let. 256 (1989), 118-122; Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20 (1992), 1675-1678 und 1679-1684) sowie durch Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs- Massenspektroskopie (Hillenkamp et al., Anal. Chem. 63 (1991), 1193A-1203A).
Ein weiterer Ansatz ist die Einzelmolekülsequenzierung (Dörre et al., Bioimaging 5 (1997), 139-152), bei der die Sequenz von Nukleinsäuren durch fortschreitenden enzymatischen Abbau von fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und Nachweis der sequenziell freigesetzten Monomermoleküle in einem Mikrostrukturkanal erfolgt, in dem die Monomermoleküle durch Pumpen elektroosmotisch geleitet werden. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass jeweils nur ein einziges Molekül der Zielnukleinsäure für die Durchführung einer Sequenzbestimmung ausreicht.
Ein Nachteil der bei Dörre et al. beschriebenen Methode besteht jedoch darin, dass die sequenziell freigesetzten Monomermoleküle mit den Wänden der Mikrostrukturen wechselwirken können, was zu erheblichen Problemen bei der Auswertung führen kann. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellt und das insbesondere eine Verbesserung der Detektion durch Vermeidung von Wandeffekten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
  • b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
  • c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
  • d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
  • e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mittels eines hydrodynamischen Flusses und
  • f) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Sequenziermethode, bei der ein einzelnes auf einem Träger immobilisiertes Nukleinsäuremolekül untersucht wird. Das für das Verfahren verwendete Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten Position innerhalb einer Sequenziervorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 µm und besonders bevorzugt von 1 bis 3 µm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind Kunststoffe wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre 5'-Enden auf dem Trägerpartikel immobilisiert. Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti- Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt werden. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z. B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche vermittelt werden kann.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Trägerpartikel verwendet, an die nur ein einziges Nukleinsäuremolekül gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zur Sequenzierung vorgesehenen Nukleinsäuremoleküle in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1 : 5 bis 1 : 20, z. B. 1 : 10, mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen eine Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger stattfindet. Die resultierenden Trägerpartikel werden dann, z. B. anhand der auf den Nukleinsäuremolekülen enthaltenen Fluoreszenzmarkierungsgruppen sortiert und von Partikeln, an die kein Nukleinsäuremolekül gebunden ist, abgetrennt. Diese Sortierung und Abtrennung kann beispielsweise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special IssuepTAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5740-5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschriebenen Methode erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten.
Die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z. B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form vorliegen. Bei doppelsträngigen Molekülen muss sichergestellt sein, dass markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können. Bei den zu sequenzierenden Nukleinsäuresträngen tragen im Wesentlichen alle, z. B. mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95% aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe. Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen, beispielsweise zwei, drei oder vier Basentypen, eine Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe trägt. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nu­ kleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z. B. einer DNA-Polymerase wie etwa einer DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1999), 3600-3605) oder einer mutierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-510) unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine erzeugt werden. Die markierten Nukleinsäurestränge können auch durch Amplifikationsreaktionen, z. B. PCR, hergestellt werden. So entstehen bei einer asymmetrischen PCR Amplifikationsprodukte, bei denen nur ein einziger Strang Fluoreszenzmarkierungen enthält. Derartige asymmetrische Amplifikationsprodukte können in doppelsträngiger Form sequenziert werden. Durch symmetrische PCR werden Nukleinsäurefragmente herge­ stellt, bei denen beide Stränge fluoreszenzmarkiert sind. Diese beiden fluoreszenzmarkierten Stränge können separiert und getrennt in einzelsträn­ giger Form auf Trägerpartikeln immobilisiert werden, sodass die Sequenz eines oder beider Komplementärstränge separat bestimmt werden kann. Alternativ kann einer der beiden Stränge am 3'-Ende derart modifiziert werden, z. B. durch Einbau einer PNA-Klammer, sodass eine Abspaltung von Monomerbausteinen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall ist eine Doppelstrangsequenzierung möglich.
Gegebenenfalls kann an den zu untersuchenden Nukleinsäurestrang noch ein "Sequenzidentifikator", d. h. eine markierte Nukleinsäure bekannter Sequenz, angefügt werden, z. B. durch enzymatische Reaktion mit Ligase oder/und Terminaler Transferase, sodass zu Beginn der Sequenzierung zunächst ein bekanntes Fluoreszenzmuster und anschließend erst das der unbekannten, zu untersuchenden Sequenz entsprechende Fluoreszenzmu­ ster erhalten wird.
Die Nukleinsäurematrize, deren Sequenz bestimmt werden soll, kann beispielsweise aus DNA-Matrizen wie genomischen DNA-Fragmenten, cDNA-Molekülen, Plasmiden etc., aber auch aus RNA-Matrizen wie mRNA- Molekülen ausgewählt werden.
Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus bekannten zur Markierung von Biopolymeren, z. B. Nukleinsäuren, verwendeten Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausgewählt werden.
Schritt (b) umfasst das Einbringen eines beladenen Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung mit einem Mikrokanal. Mit Hilfe eines Einfanglasers, z. B. eines IR-Lasers, kann das Trägerpartikel in einer Kapillare oder einem Mikrokanal gemäß Verfahrensschritt (c) festgehalten werden. Derartige Methoden sind beispielsweise bei Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) und Chu (Science 253 (1991), 861-866) beschrieben.
Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen automatisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel im hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren. Der Detektor im Detektionsfenster wird so eingestellt, dass er eine markierte Kugel aufgrund der darauf befindlichen fluoreszenzmarkierten DNA und/oder einer zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Sonde erkennt, und daraufhin automatisch das Aktivieren des Einfanglasers im Messraum bewirkt. Trägerpartikel, die der Detektor nicht als positiv einstuft, werden durchlaufen gelassen. Nach dem Einfangen eines Trägerpartikels wird der Sortierungsprozess gestoppt und die restlichen Trägerpartikel weggewaschen. Dann wird die Sequenzierungsreaktion am immobilisierten Trägerpartikel durchgeführt.
Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder in 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Die Erfindung beruht darauf, dass die durch die Abspaltungsreaktion freigesetzten Nukleotidbausteine mittels eines hydrodynamischen Flusses durch einen Mikrokanal geleitet und während des Flusses durch den Mikrokanal bestimmt werden. Durch den hydrodynamischen Fluss wird eine Erhöhung der Flussgeschwindigkeit ermöglicht, die wiederum zu einer Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit eines Nukleotidbausteins führt. Weiterhin kann man durch den hydrodynamischen Fluss, der z. B. durch Saugwirkung oder Anlegen von Druck erzeugt wird, das Auftreten von Wandeffekten gegenüber dem aus dem Stand der Technik bekannten elektroosmotischen Pumpen verringern. Der hydrodynamische Fluss durch den Mikrokanal weist vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d. h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im Zentrum des Mikrokanals und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeit ab. Die Flussgeschwindigkeit durch den Mikrokanal liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 mm/s, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/s. Der Durchmesser des Mikrokanals liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 µm, besonders bevorzugt von 10 bis 50 µm. Vorzugsweise wird die Messung in einem linearen Mikrokanal mit im Wesentlichen einen konstanten Durchmesser durchgeführt.
Die Identifizierung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine gemäß Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels einer beliebigen Messmethode, z. B. mit einer orts- oder/und zeitaufgelösten Fluoreszenz- Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion, wie etwa durch Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 × 10-15 bis 20 × 10-12 l der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994) 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomenes", D. H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von ≧ 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion unter Verwendung einer Laser-Vorrichtung, die ein Beugungselement oder ein phasenmodulierendes Element im Strahlengang des Lasers aufweist, welches gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren optischen Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich konfokal für die Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung abzubilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Detektionsvorrichtung in zwei aneinander gegenüberliegende Seiten begrenzende Wände des Mikrokanals integriert, wobei eine Wand einen Array von in den Mikrokanal emittierenden Laserelementen als Fluoreszenz-Anregungslichtquelle aufweist und die andere einen Array von den Laserelementen jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweist. Diese beiden Ausführungsformen sind ausführlich in der Patentanmeldung DE 10 02 3423.2 offenbart.
Eine erfindungswesentliche Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit von Nukleotidbausteinen und somit eine Verbesserung der Sensitivität wird durch das hydrodynamische Flussprofil im Mikrokanal der Sequenziervorrichtung erreicht. Der hydrodynamische Fluss im Mikrokanal kann durch geeignete elektronische Steuereinrichtungen eingestellt und geregelt werden. Zusätzlich zum hydrodynamischen Fluss im Mikrokanal können in der Sequenziervorrichtung auch elektrophoretische und elektroosmotische Methoden zum Transport von Reagenzien eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die parallele Sequenzierung von mehreren Trägerpartikel-gebundenen Nukleinsäuremolekülen in jeweils verschiedenen, vorzugsweise parallel angeordneten Mikrokanälen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die an ein Trägerpartikel gekoppelte Nukleinsäure im Wesentlichen in der Mitte des Mikrokanals festgehalten, die abgespaltenen fluoreszenzmarkierten Nukleotide werden in einem laminaren Fluss stromabwärts zu einem Detektionsvolumenelement geleitet, welches im Wesentlichen in der Kanalmitte, wo die höchste Flussgeschwindigkeit herrscht, positioniert ist. Die Flussgeschwindigkeit ist dabei vorzugsweise so groß, dass ungeachtet der thermischen Verbreiterung der Flusstrajektorien durch Brown'sche Diffusion das Nukleotid im Detektorfeld ankommt und registriert wird. Das Detektorfeld wird dabei so klein wie möglich gehalten, dass die Nukleotidbasen vollständig detektiert werden, während nur ein geringstmöglicher Bruchteil der Hintergrundkontamination (Verhältnis des Detektorquerschnitts zum Kanalquerschnitt) im Detektor auftritt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zu Sequenzierung eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend:
  • a) einen optisch transparenten Mikrokanal,
  • b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
  • c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position des Mikrokanals,
  • d) Mittel zum Erzeugen eines hydrodynamischen Flusses im Mikrokanal,
  • e) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül und
  • f) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Die Vorrichtung enthält vorzugsweise weiterhin automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz- oder Kühleinrichtungen wie Peltier- Elemente, Mittel zur Sortierung von Trägerpartikeln, Reservoirs und gegebenfalls Zufuhrleitungen für Probeflüssigkeit und Reagenzien sowie elektronische Auswertungsgeräte.
Die Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Sortieren von Partikeln in einem Mikrokanal, umfassend die Schritte:
  • a) Leiten von Partikeln durch ein Detektionselement im Mikrokanal, wobei das Detektionselement so eingestellt ist, dass bei Vorhandensein eines vorbestimmten Parameters, z. B. einer Fluoreszenzmarkierung, auf dem Partikel ein Einfanglaser, z. B. ein IR-Laser, aktiviert wird und bei Fehlen des vorbestimmten Parameters auf dem Partikel der Einfanglaser nicht aktiviert wird,
  • b) Festhalten eines Partikels, auf dem der vorbestimmte Parameter vorhanden ist, durch den Einfanglaser in einem Messelement,
  • c) Unterbrechen des Sortiervorgangs und
  • d) Messen des festgehaltenen Partikels.
Das Detektions- oder/und das Messelement sind vorzugsweise konfokale Volumenelemente, wobei das Detektionselement stromaufwärts bezüglich des Messelements im Mikrokanal angeordnet ist. Das Messen des festgehaltenen Partikels kann beispielsweise eine Sequenzierung wie zuvor beschrieben umfassen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 einen Ausschnitt einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem Mikrokanal (2) wird ein Trägerpartikel (4) mittels eines Einfang-Lasers (6) festgehalten. Auf dem Trägerpartikel (4) ist ein Nukleinsäuremolekül (8) immobilisiert, von dem durch enzymatischen Verdau einzelne Nukleotidbausteine (10) sequenziell abgespalten werden und von einem hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal zu einem Detektionselement (12) vorzugsweise einem konfokalen Detektionselement transportiert und dort nachgewiesen werden. Die durch den Mikrokanal strömende Flüssigkeit enthält das zum Verdau des immobilisierten Nukleinsäuremoleküls verwendete Enzym, vorzugsweise eine Exonuklease.
Die Fließgeschwindigkeit durch den Mikrokanal wird so eingestellt, dass die durch die Braun'sche Molekularbewegung verursachte Verbreiterung des Wanderungswegs der abgespaltenen Nukleotidbausteine derart gering ist, sodass sie mit ausreichender statistischer Wahrscheinlichkeit im Detektionsvolumen (12) nachgewiesen werden können.
Fig. 2 einen größeren Ausschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung, umfassend den in Fig. 1 gezeigten Ausschnitt (20a) des Mikrokanals (20) mit dem Einfang-Laser und dem konfokalen Detektionselement (hier nicht gezeigt). Die Vorrichtung enthält weiterhin eine Zufuhröffnung (22) und eine Abflussöffnung (28) für Flüssigkeit, z. B. Lösungsmittel, zwischen denen durch Anlegen von Druck oder Saugwirkung der hydrodynamische Fluss im Mikrokanal (20) erzeugt wird. Weiterhin enthält die Vorrichtung eine Öffnung zur Zufuhr von Trägerpartikeln (24) und eine Öffnung zur Zufuhr von Enzym (26). Die Einleitung von Enzym und Trägerpartikel kann gegebenenfalls durch elektroosmotischen Fluss erfolgen, wobei eine negative Elektrode bei (24) und (26) und eine positive Elektrode bei (28) angelegt wird. Der hydrodynamische Fluss durch den Mikrokanal (20) kann durch elektronisch geregelte Pumpen erfolgen, die sich außerhalb der Mikrostruktur befinden können, jedoch auch darin integriert sein können.
Zur Durchführung des Verfahrens werden Trägerpartikel durch die Öffnung (24) in den Kanal (20) geleitet. Ein einzelnes Trägerpartikel, welches mit einem Nukleinsäuremolekül beladen ist, wird durch den Einfang-Laser festgehalten. Andere Partikel und Verunreinigungen werden fortgespült. Anschließend wird durch die Öffnung (26) Enzym zugegeben und die Sequenzierungsreaktion durchgeführt. Nach Abschluss der Sequenzierung wird das Trägerpartikel aus dem Mikrokanal herausgespült. Dann kann ein weiterer Sequenzierzyklus mit einem neuen Mikropartikel durchgeführt werden. Diese Prozedur kann durch Verwendung entsprechender elektronischer Steuerungsgeräte automatisiert werden. Weiterhin kann die Vorrichtung mehrere Mikrokanäle zur parallelen Sequenzierung mehrerer Trägerpartikel enthalten.

Claims (23)

1. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
  • a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
  • b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
  • c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
  • d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül,
  • e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mittels eines hydrodynamischen Flusses und
  • f) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 0,5 bis 10 µm aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül auf dem Trägerpartikel über seinen 5'-Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein 5'-biotinyliertes Nukleinsäuremolekül an ein Avidin- oder Streptavidin-beschichtetes Trägerpartikel immobilisiert wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül in einzelsträngiger Form auf dem Trägerpartikel immobilisiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäuremolekül in doppelsträngiger Form auf dem Trägerpartikel immobilisiert ist, wobei markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Festhalten des Trägerpartikels mit einem Einfanglaser erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel in einem Mikrokanal festgehalten werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch eine Exonuklease erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass T7-DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mit einem Durchmesser von 1 bis 100 µm geleitet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 50 mm/s geleitet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch eine konfokale Fluoreszenzmessung in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion wie etwa Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung bzw. Time Gating in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine parallele Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in mehreren Mikrokanälen durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass an das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül eine Sequenz mit bekannter Basenfolge angefügt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel im Wesentlichen in der Mitte des Mikrokanals festgehalten und die abgespaltenen Nukleotidbausteine in einem laminaren Fluss zu einem Detektionsvolumenelement geleitet werden, das in der Kanalmitte positioniert ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsvolumenelement so klein wie möglich gehalten wird, um alle abgespaltenen Nukleotidbausteine gerade noch nachzuweisen.
22. Vorrichtung zur Sequenzierung eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend:
  • a) einen optisch transparenten Mikrokanal,
  • b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekül in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
  • c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position des Mikrokanals,
  • d) Mittel zum Erzeugen eines hydrodynamischen Flusses im Mikrokanal,
  • e) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül und
  • f) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
23. Verfahren zum Sortieren von Partikeln in einem Mikrokanal, umfassend die Schritte:
  • a) Leiten von Partikeln durch ein Detektionselement im Mikrokanal, wobei das Detektionselement so eingestellt ist, dass bei Vorhandensein eines vorbestimmten Parameters auf dem Partikel ein Einfanglaser aktiviert wird und bei Fehlen des vorbestimmten Parameters auf dem Partikel der Einfanglaser nicht aktiviert wird,
  • b) Festhalten eines Partikels, auf dem der vorbestimmte Parameter vorhanden ist, durch den Einfanglaser in einem Messelement,
  • c) Unterbrechen des Sortiervorgangs und
  • d) Messen des festgehaltenen Partikels.
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DE10212960A1 (de) * 2002-03-22 2003-10-23 Gnothis Holding Sa Ecublens Verwendung von Oxazin-Farbstoffen als Markierungsgruppen für die Einzelmolekülanalyse

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