DE10060133A1 - Expression system containing Debaromyces, useful for production of homologous or heterologous proteins, includes a plasmid that integrates into the host genome - Google Patents
Expression system containing Debaromyces, useful for production of homologous or heterologous proteins, includes a plasmid that integrates into the host genomeInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Wirts-Vektor-System für die heterologe Genexpression in der Hefe Debaryomyces, bevorzugt in den Hefearten D. hansenii und D. polymorphus, sowie seine Verwendung.The present invention relates to a novel host vector system for the heterologous gene expression in the yeast Debaryomyces, preferably in the yeast types D. hansenii and D. polymorphus, and its use.
Solch ein Wirts-Vektor-System lässt sich in Kombination mit homologen und heterologen Genen zur Produktion von Bioreaktoren mit Hilfe der Hefe Debaryomyces nutzen. Das System wird in der Biotechnologie, der Lebensmittelanalytik und medizinische Diagnostik angewendet.Such a host-vector system can be used in combination with homologues and heterologous genes for the production of bioreactors using yeast Use Debaryomyces. The system is used in biotechnology Food analysis and medical diagnostics applied.
Hefen als Produzenten heterologer Proteine bieten einige Vorteile. So werden sie bereits für die Synthese von Proteinen verwendet, darunter auch solchen mit katalytischen Aktivitäten (Tab. 1).Yeasts as producers of heterologous proteins offer several advantages. So they will already used for the synthesis of proteins, including those with catalytic activities (Tab. 1).
Zusätzlich können die seit langem eingeführten und optimierten Prozessregimes zur großtechnischen Produktion von Hefe-Biomasse mit Vorteil genutzt werden, wenn Hefen als "Reaktoren" in großen Mengen benötigt werden. Hefezellen sind größer und bieten daher auch Vorteile bei der Aufarbeitung, sie sind metabolisch und ernährungsphysiologisch flexibel und als Wildtypen ökologisch unbedenklich. Prokaryotische Expressionssysteme dagegen, wie beispielsweise die von E. coli, erlauben zwar hohe Transkriptions- und Translationsraten für Fremdgene, jedoch fehlen dem Produkt einige charakteristische Eigenschaften; so können beispielsweise Disulfidbrücken an falschen Positionen eingeführt werden oder N- terminale Abschnitte sich verändern. Bakterien sind außerdem nicht in der Lage, posttranslationale Modifikationen durchzuführen. Zusätzlich haben bestimmte Hefearten das Potential, hohe Konzentrationen an rekombinanten Proteinen in Kulturen zu akkumulieren. Mittlerweile existieren bei S. cerevisiae sowohl für intra- als auch für extrazelluläre Proteine zahlreiche Expressionssysteme. Es werden jedoch auch andere Hefe als Expressionswirte verwendet, wie z. B. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha oder Arxula adeninivorans (Tab. 1 - vgl. Übersichten: Romanos et al. 1992, Gellissen et al. 1995).In addition, the long-established and optimized process regimes can Large-scale production of yeast biomass can be used to advantage Yeasts are needed as "reactors" in large quantities. Yeast cells are bigger and therefore also offer advantages in processing, they are metabolic and nutritionally flexible and ecologically harmless as wild types. Prokaryotic expression systems, on the other hand, such as those of E. coli, allow high transcription and translation rates for foreign genes, however the product lacks some characteristic properties; so can for example, disulfide bridges are introduced at wrong positions or N- terminal sections are changing. Bacteria are also unable to to carry out post-translational modifications. In addition, certain Yeast types have the potential to contain high concentrations of recombinant proteins To accumulate cultures. In the meantime, S. cerevisiae exists for both intra- as well as numerous expression systems for extracellular proteins. It will however, other yeast are used as expression hosts, e.g. B. Pichia pastoris, Hansenula polymorpha or Arxula adeninivorans (Tab. 1 - see overviews: Romanos et al. 1992, Gellissen et al. 1995).
Trotz Existenz einiger etablierter Hefe Wirts-Vektor-Systeme stößt deren Nutzung immer wieder an Grenzen. So ist bisher kein System in der Lage, jedes gewünschte heterologe Gen maximal zu exprimieren. In Abhängigkeit vom Gen werden diese Werte in den verschiedensten Wirten erreicht. Zusätzlich sind die Fermentationsbedingungen unter denen optimale Parameter erreichbar werden zwischen den Wirten sehr unterschiedlich. So variieren u. a. die Substratspektren, die Thermo- und Osmoresistenz bzw. die Wachstumseigenschaften bei all den genutzten Hefen (Sudbery 1996, Hollenberg 1997, Gellissen & Hollenberg 1997).Despite the existence of some established yeast host-vector systems, their use has been met always at the limits. So far, no system has been able to do any maximum expression of heterologous gene. Depending on the gene, these become Values achieved in a wide variety of hosts. In addition, they are Fermentation conditions under which optimal parameters can be achieved very different between the hosts. So vary. a. the substrate spectra, the Thermal and osmoresistance or the growth properties in all of them yeasts used (Sudbery 1996, Hollenberg 1997, Gellissen & Hollenberg 1997).
Besonders kritisch ist die Halotoleranz, da Hefen in der Regel nicht in Medien mit höheren Salzkonzentrationen wachsen können. Eine Ausnahme ist die Hefe Debaryomyces hansenii, die sich z. B. in Medien mit mehr als 20% NaCl (Endkonzentration) kultivieren lässt (Adler 1986). Von dieser Hefe liegen detaillierte Untersuchungen zur Salzresistenz vor (Gustafsson & Norkrans 1976, Hobot et al. 1998, Larsson & Gustafsson 1993, Lacas et al. 1990, Nevers et al. 1997, Thome & Trench 1999). Ein Wirts-Vektor-System hingegen existiert bisher nicht. Es gelang lediglich Ricaurte & Govind (1999), ein autonom replizierendes Plasmid (enthielt ARSD - Govind & Banaszak 1992) in D. hansenii zu transformieren. Mit Hilfe der PCR und der Rücktransformation in E. coli konnte die autonome Replikation dieses Plasmides in der Hefe bewiesen werden. Die erreichten Transformationsfrequenzen waren jedoch sehr gering. Außerdem war das Plasmid auf Grund fehlender unikaler Restriktionsorte nicht für die heterologe Genexpression geeignet.Halotolerance is particularly critical since yeasts are usually not in the media higher salt concentrations can grow. The yeast is an exception Debaryomyces hansenii, e.g. B. in media with more than 20% NaCl (Final concentration) can be cultivated (Adler 1986). Of this yeast are detailed Studies on salt resistance (Gustafsson & Norkrans 1976, Hobot et al. 1998, Larsson & Gustafsson 1993, Lacas et al. 1990, Nevers et al. 1997, Thome & Trench 1999). However, a host-vector system does not yet exist. It worked only Ricaurte & Govind (1999), an autonomously replicating plasmid (contained ARSD - Govind & Banaszak 1992) in D. hansenii. With the help of PCR and the inverse transformation in E. coli enabled the autonomous replication of this Plasmids can be proven in yeast. The transformation frequencies achieved however, were very small. In addition, the plasmid was more unique due to the lack of unique Restriction sites are not suitable for heterologous gene expression.
Aufgabe der Erfindung war deshalb die Etablierung eines Wirts-Vektor-Systems, mit dem rekombinante Proteine erzeugt werden können.The object of the invention was therefore to establish a host-vector system with which can produce recombinant proteins.
Diese Aufgabe wurde mit einer integrativen Transformation und entsprechenden Plasmiden gemäß den Ansprüchen 1-15 gelöst. Mit den rekombinanten Debaryomyces Stämmen lassen sich homologe und heterologe Proteine kontinuierlich oder diskontinuierlich produzieren.This task was done with an integrative transformation and corresponding Plasmids solved according to claims 1-15. With the recombinant Debaryomyces strains can be homologous and heterologous proteins produce continuously or discontinuously.
Das erfindungsgemäße Wirts-Vektor-System für die heterologe Genexpression in der Hefe Debaryomyces umfasst einen Wirts-Mikroorganismus-Stamm der Gattung Debaryomyces und einen Plasmidvektor mit einem Selektionsmarker, wobei als Selektionsmarker ein homologes Gen von Debaryomyces oder ein pro- bzw. eukaryotisches heterologes Gen verwendet wurde.The host-vector system according to the invention for heterologous gene expression in the Yeast Debaryomyces comprises a host microorganism strain of the genus Debaryomyces and a plasmid vector with a selection marker, being as Selection marker a homologous gene from Debaryomyces or a pro- or eukaryotic heterologous gene was used.
Bevorzugte Wirts-Mikroorganismus-Stämme sind Stämme der Art Debaryomyces hansenii und der Art Debaryomyces polymorphus.Preferred host microorganism strains are strains of the Debaryomyces species hansenii and the species Debaryomyces polymorphus.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird ein Plasmidvektor zur heterologen Genexpression verwendet, der neben Debaryomyces auch in den Hefegattungen Arxula und Saccharomyces funktionstüchtig ist. Für die Expression von heterologen Genen werden die TEF1-Promotoren von Arxula adeninivorans, Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii oder Debaryomyces polymorphus genutzt.In a preferred embodiment of the invention, a plasmid vector is used heterologous gene expression used, which in addition to Debaryomyces also in the Yeast genera Arxula and Saccharomyces is functional. For expression the heterologous genes are the Arxula adeninivorans TEF1 promoters, Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii or Debaryomyces polymorphus used.
Besonders bevorzugt ist ein Plasmidvektor, der eine Kassette mit TEF1-Promotor von Arxula adeninivorans - ein Resistenzgen - PHO5-Terminator von Saccharomyces cerevisiae enthält und die Transformanten über ihre Resistenz selektierbar sind. Als Resistenzgen wird vorzugsweise das aus E. coli stammende hph-Gen genutzt.A plasmid vector which contains a cassette with a TEF1 promoter is particularly preferred of Arxula adeninivorans - a resistance gene - PHO5 terminator from Saccharomyces cerevisiae contains and the transformants on their resistance are selectable. The resistance gene is preferably that derived from E. coli hph gene used.
Dabei wird der Plasmidvektor vorzugsweise in mehreren Kopien in die chromosomale DNA von Debaryomyces integriert, insbesondere in repetitive DNA Bereiche, bevorzugt die 25S rDNA. Darüber hinaus können die Plasmidvektoren unikale Restriktionsorte enthalten, um weitere Gene und Genkassetten zur homologen und heterologen Genexpression in diese Vektoren einzubauen. The plasmid vector is preferably in several copies in the Chromosomal DNA from Debaryomyces integrated, especially in repetitive DNA Areas, preferably the 25S rDNA. In addition, the plasmid vectors contain unique restriction sites for additional genes and gene cassettes to incorporate homologous and heterologous gene expression into these vectors.
Nach Transformation in Debaryomyces ist das erfindungsgemäße Wirts-Vektor- System zur Produktion von homologen und heterologen Proteinen geeignet, wobei die Proteine während der gesamten Kultivierung kontinuierlich produziert werden. Sie werden mit den entsprechenden Promotoren nur unter definierten Bedingungen produziert.After transformation into Debaryomyces, the host vector according to the invention is System suitable for the production of homologous and heterologous proteins, whereby the proteins are continuously produced throughout the cultivation. she with the corresponding promoters only under defined conditions produced.
Mit einer entsprechenden Promotorenauswahl kann das System sowohl zur Produktion von intra- als auch von extrazellulär lokalisierten Proteinen genutzt werden.With an appropriate selection of promoters, the system can be used for both Production of intra- as well as extracellularly localized proteins used become.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante werden als heterologe Gene das aus Aequorea victoria stammende GFP-Gen bzw. das aus Ralstonia eutrophus stammende Gen phbB verwendet.In a preferred embodiment, the heterologous genes are used Aequorea victoria-derived GFP gene or that from Ralstonia eutrophus originating gene phbB used.
Aufgrund unikaler Restriktionsorte ist das Plasmid für die heterologe Genexpression hervorragend geeignet. Im Prinzip ist es mit dem erfindungsgemäßen System möglich, jedes gewünschte heterologe Gen optimal zu exprimieren. Die erreichten Transformationsfrequenzen sind gut bis sehr gut.Due to the unique restriction sites, the plasmid is for heterologous gene expression excellently suited. In principle, it is with the system according to the invention possible to optimally express any desired heterologous gene. They reached Transformation frequencies are good to very good.
In den folgenden Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher erläutert. The invention is explained in more detail in the following exemplary embodiments.
Um mitotisch stabile Transformanten zu erhalten, wurde eine integrative Transformationsmethode etabliert. Diese basiert auf dem bereits zur Transformation in A. adeninivorans genutzten Plasmid pAL-HPH1 (Rösel & Kunze 1998), welches neben dem Hygromycin-Resistenzgen als Selektionsmarker Teile der 25S rDNA von Arxula enthält. Nach Linearisierung von pAL-HPH1 mit BgIII integriert dieses Plasmid während der Transformation in die 25S rDNA von D. hansenii. Die erhaltenen Transformanten lassen sich anschließend über ihre Hygromycin B-Resistenz auf YEPD-Medium (Rose et al. 1990) plus 250 µg/ml Hygromycin B selektieren (Abb. 1).In order to obtain mitotically stable transformants, an integrative transformation method was established. This is based on the plasmid pAL-HPH1 (Rösel & Kunze 1998), which is already used for the transformation in A. adeninivorans and which, in addition to the hygromycin resistance gene, contains parts of the 25S rDNA from Arxula as a selection marker. After linearization of pAL-HPH1 with BglII, this plasmid integrated into the 25S rDNA of D. hansenii during the transformation. The transformants obtained can then be selected for their hygromycin B resistance on YEPD medium (Rose et al. 1990) plus 250 µg / ml hygromycin B ( Fig. 1).
Mit der von Dohmen et al. (1991) beschriebenen Methode ließ sich pAL-HPH1 mit hohen Frequenzen in D. hansenii H158 transformieren. Voraussetzung hierfür war allerdings die vorherige Linearisierung des Plasmides. In Gegensatz dazu konnten zirkuläre Plasmide nicht in D, hansenii H158 transformiert werden (Tab. 1).With the by Dohmen et al. (1991) described method pAL-HPH1 transform high frequencies into D. hansenii H158. The prerequisite for this was however, the previous linearization of the plasmid. In contrast, could circular plasmids cannot be transformed into D, hansenii H158 (Tab. 1).
Von den erhaltenen Transformanten, D. hansenii H158/pAL-HPH1, wurde die Hygromycin B-Resistenz ermittelt und mit der des Ausgangsstammes verglichen. Während sich D. hansenii H158 nur bis 50 µg/ml Hygromycin B-Zusatz kultivieren lässt, wiesen die Transformanten 158/pAL-HPH1 erheblich höhere Resistenzen auf. So wuchsen diese Kulturen bis zu einer Hygromycin B-Konzentration von 2000 µg/ml. Wurde diese Konzentration auf 5000 µg/ml gesteigert, waren nur noch einzelne Zellen in der Lage zu wachsen (Tab. 2). From the transformants obtained, D. hansenii H158 / pAL-HPH1, the Resistance to hygromycin B was determined and compared with that of the parent strain. While D. hansenii H158 only cultivate up to 50 µg / ml hygromycin B additive transformants 158 / pAL-HPH1 showed significantly higher resistances. These cultures grew up to a hygromycin B concentration of 2000 µg / ml. If this concentration was increased to 5000 µg / ml, there were only individual cells able to grow (Tab. 2).
a. je 100 µl der Verdünnungsstufe mit logarithmisch wachsenden Zellen wurden auf YEPD-Agar mit den entsprechenden Hygromycin B-Konzentrationen ausplattiert und die Platten für 2 Tage bei 30°C inkubiert. a. 100 .mu.l each of the dilution step with logarithmically growing cells were plated out on YEPD agar with the corresponding hygromycin B concentrations and the plates were incubated for 2 days at 30.degree.
Der Integrationsort des Plasmid pAH-HPH1 in der chromosomalen DNA der D. hansenii Transformanten wurde mit Hilfe von Southern Hybridisierungen bestimmt. Dazu wurden mit einer "Pulsed Field Gelelektrophorese" (PFGE) die Chromosomen von D. hansenii H158 und H158/pAL-HPH1 gelelektrophoretisch getrennt und über Southern Hybridisierung das hph-Gen enthaltenen Chromosomen ermittelt. Sowohl der Ausgangsstamm als auch die Transformanten enthalten mindestens 4 Chromosomen, wobei das kleinste Chromosom mehr als 1,5 Mbp und das größte Chromosom mehr als 6 Mbp ist. In Gegensatz zum Ausgangsstamm D. hansenii H158 hybridisierte bei den Transformanten das Chromosom mit dem größten Molekulargewicht mit dem radioaktiv markiertem hph-Fragment. Damit enthalten die Transformanten das Plasmid pAL-HPH1 im Chromosom 1, auf welchem auch die 25S rDNA lokalisiert ist (Fig. 2). The integration site of the plasmid pAH-HPH1 in the chromosomal DNA of the D. hansenii transformants was determined using Southern hybridizations. For this purpose, the chromosomes of D. hansenii H158 and H158 / pAL-HPH1 were separated by gel electrophoresis using "pulsed field gel electrophoresis" (PFGE) and the chromosomes containing the hph gene were determined by Southern hybridization. Both the parent strain and the transformants contain at least 4 chromosomes, with the smallest chromosome more than 1.5 Mbp and the largest chromosome more than 6 Mbp. In contrast to the parent strain D. hansenii H158, the chromosome with the largest molecular weight hybridized with the radioactively labeled hph fragment in the transformants. The transformants thus contain the plasmid pAL-HPH1 in chromosome 1, on which the 25S rDNA is also located ( FIG. 2).
Um detailliertere Angaben zum Integrationsort von pAL-HPH1 zu erhalten, wurde die chromosomale DNA des Ausgangsstammes und der Transformanten isoliert, mit BgIII restringiert und wieder mit dem hph-Gen enthaltenen DNA-Fragment hybridisiert. Auch bei diesem Experiment ließen sich Hybridisierungssignale mit der chromosomalen DNA der Transformanten bestimmen. Die Molekulargewichte dieser Hybridisierungsbanden variierten jedoch zwischen den getesteten Transformanten. Damit wurde pAL-HPH1 zwar stets im gleichen Chromosom, nicht aber im gleichen Ort der chromosomalen DNA integriert. Ursache für diesen Effekt könnte die Nutzung der 25S rDNA von der Hefe A. adeninivorans sein, die zwar sehr homolog, jedoch nicht identisch zur 25S rDNA von D. hansenii ist (Fig. 3).In order to obtain more detailed information on the integration site of pAL-HPH1, the chromosomal DNA of the parent strain and the transformants was isolated, restricted with BglII and hybridized again with the DNA fragment containing the hph gene. Hybridization signals with the chromosomal DNA of the transformants could also be determined in this experiment. However, the molecular weights of these hybridization bands varied between the transformants tested. Thus pAL-HPH1 was always integrated in the same chromosome, but not in the same location of the chromosomal DNA. The cause of this effect could be the use of the 25S rDNA from the yeast A. adeninivorans, which is very homologous but not identical to the 25S rDNA from D. hansenii ( FIG. 3).
Auch die Daten zur mitodischen Stabilität belegen eine Integration des Plasmides pAL-HPH1 in die chromosomale DNA von D. hansenii. So beträgt diese unter selektiven oder nichtselektiven Bedingungen 97% (Tab. 3).Mitodic stability data also demonstrate integration of the plasmid pAL-HPH1 in the chromosomal DNA of D. hansenii. So this is below selective or non-selective conditions 97% (Tab. 3).
a. Die mitotische Stabilität von pAL-HPH1 in D. hansenii H158 wurde durch Kultivierung einer einzelnen Kolonie im nicht-selektiven (YEPD-Medium ohne Hygromycin B) und im selektiven Medium (YEPD mit 250 µg/ml Hygromycin B) für 15 Generationen bei 30°C ermittelt. Dazu wurden Aliquote dieser Kulturen auf YEPD- Agar ohne und mit 250 µg/ml Hygromycin B ausplattiert und die Platten für 2 Tage bei 30°C inkubiert. a. The mitotic stability of pAL-HPH1 in D. hansenii H158 was determined by cultivating a single colony in the non-selective (YEPD medium without hygromycin B) and in the selective medium (YEPD with 250 µg / ml hygromycin B) for 15 generations at 30 ° C. For this purpose, aliquots of these cultures were plated on YEPD agar without and with 250 μg / ml hygromycin B and the plates were incubated at 30 ° C. for 2 days.
Auch für die Transformanten in D. polymorphus H120 wurde die integrative Transformationsmethode genutzt. Dazu wurde das Plasmid pAL-HPH1 mit BgIII linearisiert und in die rDNA von D. polymorphus integriert. Die Transformanten konnten über die Hygromycin B-Resistenz, auf YEPD mit 250 µg/ml Hygromycin B selektiert werden (Abb. 1).The integrative transformation method was also used for the transformants in D. polymorphus H120. For this purpose the plasmid pAL-HPH1 was linearized with BglII and integrated into the rDNA of D. polymorphus. The transformants could be selected via the hygromycin B resistance, on YEPD with 250 µg / ml hygromycin B ( Fig. 1).
Mit der von Dohmen et al. (1991) beschriebenen Methode ließ sich das Plasmid pAL- HPH1 in D. polymorphus H120 transformieren. Allerdings war auch hier die Transformation nur dann erfolgreich, wenn das Plasmid pAL-HPH1 vorher mit BgIII linearisiert wurde (Tab.4).With the by Dohmen et al. (1991) described the plasmid pAL- Transform HPH1 into D. polymorphus H120. However, this was also the case here Transformation only successful if the plasmid pAL-HPH1 has previously been treated with BglII was linearized (Tab. 4).
Von D. polymorphus H120/pAL-HPH1 wurde die Hygromycin B-Resistenz ermittelt und mit der des Ausgangsstammes H120 verglichen. Während sich D. polymorphus H120 nur bis 50 µg/ml Hygromycin B-Zusatz kultivieren lässt, weisen die Transformanten H120/pAL-HPH1 Wachstum bis zu einer Hygromycin B- Konzentration von 5000 µg/ml auf (Tab. 5).The resistance to hygromycin B was determined from D. polymorphus H120 / pAL-HPH1 and compared with that of the parent strain H120. While D. polymorphus H120 can only cultivate up to 50 µg / ml hygromycin B additive Transformants H120 / pAL-HPH1 growth up to a hygromycin B- Concentration of 5000 µg / ml (Tab. 5).
a. je 100 µl der Verdünnungsstufe mit logarithmisch wachsenden Zellen wurden auf YEPD-Agar mit den entsprechenden Hygromycin B-Konzentrationen ausplattiert und die Platten für 2 Tage bei 30°C inkubiert. a. 100 .mu.l each of the dilution step with logarithmically growing cells were plated out on YEPD agar with the corresponding hygromycin B concentrations and the plates were incubated for 2 days at 30.degree.
Mit Hilfe der Southern-Hybridisierung wurde der Integrationsort des Plasmides pAL- HPH1 in der chromosomalen DNA der D. polymorphus Transformanten ermittelt. Dazu wurden mit der "Pulsed Field Gelelektrophorese" (PFGE) die Chromosomen von D. polymorphus H120 und den H120/pAL-HPH1 Transformanten gelelektrophoretisch getrennt und über Southern Hybridisierung das hph-Gen enthaltenen Chromosomen bestimmt. Analog zu D. hansenii enthalten auch D. polymorphus H120 und alle daraus resultierenden Transformanten mindestens 4 Chromosomen, wobei das kleinste Chromosom < 1,5 Mbp und das größte Chromosom < 6 Mbp ist. In Gegensatz zum Ausgangsstamm D. polymorphus H120 hybridisierte bei den Transformanten das Chromosom mit dem größtem bzw. mit dem kleinsten Molekulargewicht. Dies zeigt, dass das hph-Gen in zwei verschiedene Chromosomen integrieren kann (Fig. 4).The integration site of the plasmid pAL-HPH1 in the chromosomal DNA of the D. polymorphus transformants was determined with the aid of Southern hybridization. For this purpose, the chromosomes of D. polymorphus H120 and the H120 / pAL-HPH1 transformants were separated by gel electrophoresis using "pulsed field gel electrophoresis" (PFGE) and the chromosomes containing the hph gene were determined by Southern hybridization. Analogous to D. hansenii, D. polymorphus H120 and all resulting transformants contain at least 4 chromosomes, the smallest chromosome <1.5 Mbp and the largest chromosome <6 Mbp. In contrast to the parent strain D. polymorphus H120, the chromosome with the largest or the smallest molecular weight hybridized in the transformants. This shows that the hph gene can integrate into two different chromosomes ( Fig. 4).
Um weitere Angaben zum Integrationsort von pAL-HPH1 zu erhalten, wurde die chromosomale DNA von D. polymorphus H120 und H120/pAL-HPH1 isoliert, mit BgIII restringiert und mit dem hph-Gen-Fragment hybridisiert. Hybridisierungssignale konnten nur mit der chromosomalen DNA der D. polymorphus-Transformanten erhalten werden, wobei diese jedoch zwischen den Transformanten variieren. So wird das Plasmid pAL-HPH1 auch in D. polymorphus H120 in die chromosomale DNA integriert. Die Integration kann jedoch in Abhängigkeit von der entsprechenden Transformante an verschiedenen Orten innerhalb von zwei verschiedener Chromosomen erfolgen. Die Ursachen dieses Effektes basieren u. a. auf der Nutzung der 25S rDNA von der Hefe A. adeninivorans, die homolog und nicht identisch zur 25S rDNA von D. polymorphus ist (Fig. 5). In order to obtain further information on the integration site of pAL-HPH1, the chromosomal DNA of D. polymorphus H120 and H120 / pAL-HPH1 was isolated, restricted with BglII and hybridized with the hph gene fragment. Hybridization signals could only be obtained with the chromosomal DNA of the D. polymorphus transformants, although these vary between the transformants. The plasmid pAL-HPH1 is also integrated into the chromosomal DNA in D. polymorphus H120. However, depending on the corresponding transformant, the integration can take place at different locations within two different chromosomes. The causes of this effect are based, among other things, on the use of the 25S rDNA from the yeast A. adeninivorans, which is homologous and not identical to the 25S rDNA from D. polymorphus ( FIG. 5).
Die Integration des Plasmides pAL-HPH1 in die chromosomale DNA von D. polymorphus belegen auch die Daten zur mitodischen Stabilität. So beträgt diese unter selektiven und nichtselektiven Bedingungen ≧ 96% (Tab. 6).The integration of the plasmid pAL-HPH1 into the chromosomal DNA of D. polymorphus also support the data on mitodic stability. So this is under selective and non-selective conditions ≧ 96% (Tab. 6).
a. Die mitotische Stabilität von pAL-HPH1 wurde durch Kultivierung einer einzelnen Kolonie im nicht-selektiven (YEPD-Medium ohne Hygromycin B) und im selektiven Medium (YEPD mit 250 µg/ml Hygromycin B) für 15 Generationen bei 30°C ermittelt. Dazu wurden Aliquote dieser Kulturen auf YEPD-Agar ohne und mit 250 µg/ml Hygromycin B ausplattiert und die Platten für 2 Tage bei 30°C inkubiert. a. The mitotic stability of pAL-HPH1 was determined by culturing a single colony in the non-selective (YEPD medium without hygromycin B) and in the selective medium (YEPD with 250 μg / ml hygromycin B) for 15 generations at 30 ° C. For this purpose, aliquots of these cultures were plated on YEPD agar without and with 250 μg / ml hygromycin B and the plates were incubated at 30 ° C. for 2 days.
Die Eignung von D. hansenii und D. polymorphus als Wirt für die heterologe Genexpression wurde am Beispiel des GFP-Gens von Aequorea victoria getestet. Dieses Gen codiert das "Green Fluorescent Protein" (GFP) welches sich im Fluoreszenzmikroskop analysieren lässt.The suitability of D. hansenii and D. polymorphus as hosts for the heterologous Gene expression was tested using the example of the GFP gene from Aequorea victoria. This gene encodes the "Green Fluorescent Protein" (GFP) which is found in the Fluorescence microscope can be analyzed.
Um eine konstitutive Expression dieses Gens zu erhalten, wurde der aus A. adeninivorans stammende TEF1-Promotor genutzt. Nach Konstruktion einer Kassette mit TEF1-Promotor - GFP-Gen - PHO5-Terminator und Integration in das Plasmid pAL-HPH1, wurde das Plasmid pAL-HPH-GFP erhalten (Abb. 6). Dieses Plasmid lässt sich nach Linearisierung mit BgIII (siehe Punkt 1.1 bzw. 2.1) in D. hansenii H158 und D, polymorphus H120 transformieren. Die erhaltenen Transformanten wurden über ihre Hygromycin B-Resistenz selektiert. Dazu wurden YEPD-Agarplatten mit 250 µg/ml Hygromycin B genutzt. Die erhaltenen Transformanten wurden anschließend charakterisiert, indem nach Isolation ihrer chromosomalen DNA diese als Template für eine PCR eingesetzt wurde. Durch die Nutzung von Oligonukleotiden mit GFP-Gen spezifischen Sequenzen, ließ sich der GFP enthaltene DNA-Bereich amplifizieren und damit die Existenz dieses Gens in der chromosomalen DNA der Debaryomyces Transformanten beweisen.In order to obtain a constitutive expression of this gene, the TEF1 promoter derived from A. adeninivorans was used. After construction of a cassette with TEF1 promoter - GFP gene - PHO5 terminator and integration into the plasmid pAL-HPH1, the plasmid pAL-HPH-GFP was obtained ( Fig. 6). After linearization with BgIII (see points 1.1 and 2.1), this plasmid can be transformed into D. hansenii H158 and D, polymorphus H120. The transformants obtained were selected for their hygromycin B resistance. For this, YEPD agar plates with 250 µg / ml hygromycin B were used. The transformants obtained were then characterized by using their chromosomal DNA as a template for a PCR after isolation. The use of oligonucleotides with sequences specific to GFP genes made it possible to amplify the DNA region contained in GFP and thus to prove the existence of this gene in the chromosomal DNA of the Debaryomyces transformants.
Von diesen selektierten Transformanten (Wachstum auf YEPD-Agarplatten mit Hygromycin B, Amplifikation des GFP-Gen-Bereiches) musste die GFP- Transkriptkonzentration ermittelt werden. Dazu wurden die D. hansenii H158- und D. polymorphus H120-Transformation in SD-Medium mit 2% Glukose als C-Quelle für 24 h kultiviert, die Gesamt-RNA isoliert und diese für Northern Hybridisierungen genutzt. Als radioaktiv markierte Probe wurde das TEF1-Gen (Kontrolle) bzw. GFP- Gen enthaltene DNA-Fragment eingesetzt. Im Gegensatz zu den beiden nicht transformierten Stämmen lassen sich in allen getesteten Transformanten GFP- Transkripte nachweisen (Abb. 7).The GFP transcript concentration had to be determined from these selected transformants (growth on YEPD agar plates with hygromycin B, amplification of the GFP gene region). For this purpose, the D. hansenii H158 and D. polymorphus H120 transformation were cultivated in SD medium with 2% glucose as the C source for 24 h, the total RNA was isolated and this was used for Northern hybridizations. The DNA fragment containing TEF1 (control) or GFP gene was used as the radioactively labeled sample. In contrast to the two non-transformed strains, GFP transcripts can be detected in all tested transformants ( Fig. 7).
Aussagen zur GFP-Akkumulation lassen sich mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie machen. Dazu wurden die Transformanten D. polymorphus H120/pAL-HPH-GFP-1 und D. hansenii H158/pAL-HPH-GFP-1 für 24 h in SD-Medium mit 2% Glukose kultiviert, geerntet und die Zellen direkt am Laser Scanning Mikroskop analysiert. Da das GFP-Gen ohne Singalsequenzen ausgestattet wurde, sollte das Genprodukt (GFP) im Zytoplasma lokalisiert sein, was die durchgeführten Fluoreszenzuntersuchungen bestätigten. Die als Kontrollen mitgeführten Ausgangsstämme wiesen keine Fluoreszenz auf (Abb. 8 und 9).Statements on GFP accumulation can be made using fluorescence microscopy. For this purpose, the transformants D. polymorphus H120 / pAL-HPH-GFP-1 and D. hansenii H158 / pAL-HPH-GFP-1 were cultivated for 24 h in SD medium with 2% glucose, harvested and the cells were directly scanned using laser scanning Microscope analyzed. Since the GFP gene was equipped without singal sequences, the gene product (GFP) should be located in the cytoplasm, which was confirmed by the fluorescence studies carried out. The parent strains carried as controls showed no fluorescence ( Figs. 8 and 9).
Das phbB-Gen von R. euthropha codiert eine Acetoacetyl CoA-Reduktase, die Acetoacetyl CoA zu 3-Hydroxybutyryl-CoA synthetisiert. Auch dieses Gen wurde zwischen dem TEF1-Promotor von A. adeninivorans und den PHO5-Terminator von S. cerevisiae eingebaut und die Kassette mit TEF1-Promotor - phbB-Gen - PHO5- Terminator in das Plasmid pAL-HPH1 rekloniert. Das erhaltene Plasmid pAL-HPH- phbB (Abb. 10) ließ sich nach Linearisierung mit BgIII direkt in D. polymorphus H120 und D. hansenii H158 transformieren. Die erhaltenen Transformanten wurden über ihre Hygromycin B-Resistenz selektiert, indem YEPD-Agarplatten mit 250 µg/ml Hygromycin B genutzt wurden. Die sich anschließende Charakterisierung erfolgte wie im Punkt 3.2 beschrieben mit Hilfe der PCR.The R. euthropha phbB gene encodes an acetoacetyl CoA reductase that synthesizes acetoacetyl CoA to 3-hydroxybutyryl-CoA. This gene was also inserted between the TEF1 promoter from A. adeninivorans and the PHO5 terminator from S. cerevisiae and the cassette with TEF1 promoter - phbB gene - PHO5 terminator was cloned into the plasmid pAL-HPH1. The resulting plasmid pAL-HPH-phbB ( Fig. 10) could be transformed directly into D. polymorphus H120 and D. hansenii H158 after linearization with BgIII. The transformants obtained were selected for their hygromycin B resistance using YEPD agar plates with 250 μg / ml hygromycin B. The subsequent characterization was carried out using the PCR as described in point 3.2.
Von den selektierten Transformanten (Wachstum auf YEPD-Agarplatten mit Hygromycin B, Amplifikation des pbhB-Gen-Bereiches) wurde die phbB- Transkriptkonzentration ermittelt. Dazu wurden D. hansenii H158/pAL-HPH-phbB und D. polymorphus H120/pAL-HPH-phbB in YEPD-Medium kultiviert, die Gesamt-RNA isoliert und diese für Northern Hybridisierungen genutzt. Als radioaktiv markierte Probe diente das phbB-Gen enthaltene DNA-Fragment. Im Gegensatz zu den beiden nichttransformierten Stämmen H120 und H158 ließen sich in allen Transformanten phbB-Transkripte identifizieren (Abb. 11).The phbB transcript concentration was determined from the selected transformants (growth on YEPD agar plates with hygromycin B, amplification of the pbhB gene region). For this purpose, D. hansenii H158 / pAL-HPH-phbB and D. polymorphus H120 / pAL-HPH-phbB were cultivated in YEPD medium, the total RNA was isolated and used for Northern hybridizations. The DNA fragment containing the phbB gene served as the radioactively labeled sample. In contrast to the two non-transformed strains H120 and H158, phbB transcripts could be identified in all transformants ( Fig. 11).
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Abb. 1: Integrative Transformation in Debaryomyces mit Hilfe des Plasmides pAL- HPH1. Fig. 1: Integrative transformation in Debaryomyces using the plasmid pAL-HPH1.
Abb. 2: PFGE (A) und Southern Hybridisierung (B) von D. hansenii H158 (1) und H158/pAL-HPH1-A und -B (2-3) mit dem BamHI hph-Genfragment von Plasmid pLG89 (Gritz & Davies 1983). Molekulargewichtsmaker (Mbp) ist an der rechten Seite angezeigt. Fig. 2: PFGE (A) and Southern hybridization (B) of D. hansenii H158 (1) and H158 / pAL-HPH1-A and -B (2-3) with the BamHI hph gene fragment from plasmid pLG89 (Gritz & Davies 1983). Molecular Weight Maker (Mbp) is shown on the right.
Abb. 3: Southern-Blot Analyse der chromosomalen DNA verschiedener D. hansenii H158 Transformanten. Die chromosomale DNA von D. hansenii H158 (1) und H158/pAL-HPH1-A-F (2-7) wurde mit BgIII restringiert, gelelektrophoretisch an einem 0,8%igem Agarosegel aufgetrennt und mit den radioaktiv markiertem BamHI- hph-Fragment hybridisiert. Molekulargewichtsmarker (Kbp) ist an der linken Seite angegeben. Fig. 3: Southern blot analysis of the chromosomal DNA of various D. hansenii H158 transformants. The chromosomal DNA of D. hansenii H158 (1) and H158 / pAL-HPH1-AF (2-7) was restricted with BglII, separated by gel electrophoresis on a 0.8% agarose gel and hybridized with the radiolabelled BamHI-hph fragment , Molecular weight marker (Kbp) is shown on the left.
Abb. 4: PFGE (A) und Southern Hybridisierung (B) von Arxula adeninivorans LS3 (1), D. polymorphus H120 (2) und H120/pAL-HPH1-A und -B (3-4) mit dem BamHI hph-Genfragment von Plasmid pLG89 (Gritz & Davies 1983). Molekulargewichtsmakter (Mbp) ist an der rechten Seite angezeigt. Fig. 4: PFGE (A) and Southern hybridization (B) of Arxula adeninivorans LS3 (1), D. polymorphus H120 (2) and H120 / pAL-HPH1-A and -B (3-4) with the BamHI hph- Gene fragment from plasmid pLG89 (Gritz & Davies 1983). Molecular weight character (Mbp) is shown on the right.
Abb. 5: Southern-Blot Analyse der chromosomalen DNA verschiedener D. polymorphus H120 Transformanten. Die chromosomale DNA von D. polymorphus H120 (1) und H120/pAL-HPH1-A-D (2-5) wurde mit BgIII restringiert, gelelektrophoretisch an einem 0,8%igem Agarosegel aufgetrennt und mit den radioaktiv markiertem BamHI-hph-Fragment hybridisiert. Molekulargewichtsmarker (Kbp) ist an der linken Seite angegeben. Fig. 5: Southern blot analysis of the chromosomal DNA of various D. polymorphus H120 transformants. The chromosomal DNA of D. polymorphus H120 (1) and H120 / pAL-HPH1-AD (2-5) was restricted with BglII, separated by gel electrophoresis on a 0.8% agarose gel and hybridized with the radiolabelled BamHI-hph fragment , Molecular weight marker (Kbp) is shown on the left.
Abb. 6: Gen- und Restriktionskarte des Plasmides pAL-HPH-GFP. Fig. 6: Gene and restriction map of the plasmid pAL-HPH-GFP.
Abb. 7: TEF1- und GFP-Transkriptkonzentration in D. hansenii H158 (1), H158/pAL- HPH-GFP-1 (2) und H158/pAL-HPH-GFP-2 (3) bzw. D. polymorphus H120 (4), H120/pAL-HPH-GFP-1 (5) und H120/pAL-HPH-GFP-2 (6). Dazu wurden die Kulturen für 24 h in SD-Medium mit 2% Glukose kultiviert, die Gesamt-RNA isoliert und diese für Northern Hybridisierungen genutzt. Als radioaktiv markierte Probe wurde das TEF1-Gen bzw. GFP-Gen enthaltene DNA-Fragment eingesetzt. Fig. 7: TEF1 and GFP transcript concentration in D. hansenii H158 (1), H158 / pAL-HPH-GFP-1 (2) and H158 / pAL-HPH-GFP-2 (3) and D. polymorphus H120 (4), H120 / pAL-HPH-GFP-1 (5) and H120 / pAL-HPH-GFP-2 (6). For this purpose, the cultures were cultivated for 24 h in SD medium with 2% glucose, the total RNA was isolated and this was used for Northern hybridizations. The DNA fragment containing the TEF1 gene or GFP gene was used as the radioactively labeled sample.
Abb 8: Nachweis des "Green Fluorescent Proteins" in D. polymorphus H120/pAL- HPH-GFP-1. Dazu wurden die Kulturen für 24 h in SD-Medium mit 2% Glukose kultiviert und anschließend die Transmission und die GFP-Fluoreszenz der Zellen mit Hilfe des Laser Scanning Mikroskops analysiert.Fig. 8: Detection of the "green fluorescent protein" in D. polymorphus H120 / pAL- HPH-GFP. 1 For this, the cultures were kept in SD medium with 2% glucose for 24 h cultivated and then the transmission and the GFP fluorescence of the cells with Analyzed with the help of the laser scanning microscope.
Abb 9: Nachweis des "Green Fluorescent Proteins" in D. hansenii H158/pAL-HPH- GFP-1. Dazu wurden die Kulturen für 24 h in SD-Medium mit 2% Glukose kultiviert und anschließend die Transmission und die GFP-Fluoreszenz der Zellen mit Hilfe des Laser Scanning Mikroskops analysiert.Fig. 9: Detection of the "green fluorescent protein" in D. hansenii H158 / pAL-HPH- GFP-first For this purpose, the cultures were cultivated for 24 h in SD medium with 2% glucose and then the transmission and GFP fluorescence of the cells with the help of the laser scanning microscope.
Abb. 10: Gen- und Restriktionskarte des Plasmides pAL-HPH-phbB. Fig. 10: Gene and restriction map of the plasmid pAL-HPH-phbB.
Abb. 11: phbB-Transkriptkonzentration in D. polymorphus H120 (1), H120/pAL-HPH- phbB-1 (2) bzw. D, hansenii H168 (3), H158/pAL-HPH-phbB-1 (4) und H158/pAL- HPH-phbB-2 (5). Dazu wurden die Kulturen für 24 h in YEPD kultiviert, die Gesamt- RNA isoliert und diese für Northern Hybridisierungen genutzt. Als radioaktiv markierte Probe wurde das phbB-Gen enthaltene DNA-Fragment eingesetzt. Fig. 11: phbB transcript concentration in D. polymorphus H120 (1), H120 / pAL-HPH-phbB-1 (2) or D, hansenii H168 (3), H158 / pAL-HPH-phbB-1 (4) and H158 / pAL-HPH-phbB-2 (5). For this purpose, the cultures were cultured in YEPD for 24 h, the total RNA was isolated and this was used for Northern hybridizations. The DNA fragment containing phbB gene was used as the radioactively labeled sample.
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