DE10052823B4

DE10052823B4 - Method for light microscopic analysis of the topology of molecular structures in grid arrangements

Info

Publication number: DE10052823B4
Application number: DE2000152823
Authority: DE
Inventors: Prof. Cremer Christoph; Prof. Grunze Michael
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2000-10-24
Publication date: 2014-11-20
Anticipated expiration: 2020-10-25
Also published as: DE10052823A1

Abstract

Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen (MS), dadurch gekennzeichnet, dass die molekularen Strukturen (MS) einen Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer aufweisen und in Form von Rastern zusammen mit Kalibrierungssubstanzen (K1, K2, ...) auf einem nanolithographisch reaktiven Träger (RT) angeordnet werden.Method for the light microscopic analysis of the topology of molecular structures (MS), characterized in that the molecular structures (MS) have a total diameter between 0.1 nanometers and 200 nanometers and are in the form of grids together with calibration substances (K1, K2, ...) be arranged on a nanolithographically reactive carrier (RT).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur lichtmikroskopischen Analyse der Topologie molekularer Strukturen mit einem Gesamtdurchmesser zwischen 0,1 Nanometer und 200 Nanometer in Rasteranordnungen.The present invention relates to methods for light microscopic analysis of the topology of molecular structures having a total diameter between 0.1 nanometer and 200 nanometers in raster arrangements.

Vielfältige Forschungsergebnisse haben in den letzten Jahren deutlich gemacht, dass der Zwischenbereich zellulärer ”Nano”-Strukturen mit typischen Abmessungen von etwa 10 Nanometer bis einige hundert Nanometer von größter Bedeutung für Molekulare Medizin und Pharmaforschung/Entwicklung ist. Dies ist der Bereich von komplexen Systemen von biologischen Makromolekülen, bei denen viele einzelne, miteinander in vielfältiger Weise interagierende Untereinheiten zu einem funktionellen Ganzen verbunden sind. Als Beispiele seien genannt die dynamische Nanostruktur von Zell-Zell-Kontakte vermittelnden Komplexen, von membranlokalisierten Proteinkomplexen wie Ionenkanälen oder Kernporen, von Zytoskelett- und Vesikel-assoziierten Komplexen, sowie der Komplexe für Replikation, Transkription, Reparatur und Remodellierung des Genoms.Numerous research results have shown in recent years that the intermediate range of cellular "nano" structures with typical dimensions of about 10 nanometers to several hundred nanometers is of paramount importance for molecular medicine and drug development / development. This is the domain of complex systems of biological macromolecules, in which many individual, mutually interacting subunits are linked to a functional whole. Examples include the dynamic nanostructure of cell-cell contact mediating complexes, membrane-localized protein complexes such as ion channels or nuclear pores, cytoskeletal and vesicle-associated complexes, and the complexes for replication, transcription, repair, and remodeling of the genome.

a) Experimentelle Verfahrena) Experimental procedures

Der in den letzten Jahren erzielte große Fortschritt in der Entwicklung von Verfahren der atomaren Kraftmikroskopie, der optischen Nahfeldmikroskopie, der Fluoreszenzenergietransfermikroskopie, der multispektralen linearen und nicht linearen Laser-Raster-Mikroskopie sowie der spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie, in Verbindung mit neuen, hochspezifischen und effizienten molekularen Markierungstechniken macht es möglich, Fragen der dreidimensionalen (3D) Architektur und Dynamik großer Molekularer Strukturen, wie z. B. von Multiproteinkomplexen, unter Einschluss physiologischen Bedingungen mit Aussicht auf Erfolg anzugehen. Im Vordergrund der beschriebenen Erfindung steht dabei ein Verfahren zur Aufklärung der Topologie von molekularen Strukturen, z. B. großen Multiproteinkomplexen, oder Protein-Nukleinsäurekomplexen von einer unteren Grenze von ca. 10 Nanometern Gesamtdurchmesser bis hin zu einer oberen Grenze von einigen 100 Nanometern (1 Nanometer = 1 × 10^–9 m). Auf der Ebene der 3D-„Nano” Struktur kommt der „Anatomie” von supramolekularen Biostrukturen und ihrer Dynamik gegenwärtig eine fundamentale Rolle bei der zielgerichteten Entwicklung neuer Pharmaka zu. Beispielsweise ist zu erwarten, dass eine verbesserte Kenntnis der 3D-Organisation funktionell wichtiger Multiproteinkomplexe, oder von Protein-Nukleinsäurekomplexen, neue Verfahren zu ihrer Kontrolle ergeben wird. Nach dem erfolgreichen Abschluss der ersten vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms sowie anderer Modellgenome (Genomik) ist eines der gegenwärtig als vordringlichst angesehenen und mit erheblichen Mitteln unterstützen Folgevorhaben die Proteomik, d. h. die Erforschung der Strukturen der aufgrund der DNA-Sequenzinformation gebildeten Proteine und ihrer pharmakologisch relevanten Wechselwirkungen mit einander und mit anderen zellulären Strukturen. Als ein Beispiel sei hier die Erforschung von Transkriptionsrelevanten Multiproteinkomplexen angegeben, die bei der spezifischen Transkription der genetischen Information in Ribonukleinsäuren (RNA) von entscheidender Bedeutung sind. Andere Beispiele aus dem Bereich der Zellkernbiologie betreffen die Multiprotein-Ribonukleinkomplexe, die für das Processing (”Splicing”) der transkribierten RNA in Boten-RNA (m-RNA) verantwortlich sind (Für weitere Beispiele s. oben).The recent advances in the development of atomic force microscopy, near-field optical microscopy, fluorescence energy transfer microscopy, multispectral linear and non-linear laser scanning microscopy, and precision spectral microscopy, combined with new, highly specific, and efficient molecular labeling techniques makes it possible to answer questions of the three-dimensional (3D) architecture and dynamics of large molecular structures, such as Of multiprotein complexes, including physiological conditions with a view to success. In the foreground of the invention described is a method for elucidating the topology of molecular structures, eg. B. large multiprotein complexes, or protein-nucleic acid complexes from a lower limit of about 10 nanometers total diameter up to an upper limit of some 100 nanometers (1 nanometer = 1 × 10 ^-9 m). At the level of the 3D "nano" structure, the "anatomy" of supramolecular biostructures and their dynamics is currently playing a fundamental role in the targeted development of new drugs. For example, it is expected that improved knowledge of the 3D organization of functionally important multiprotein complexes, or of protein-nucleic acid complexes, will provide new methods for their control. Following the successful completion of the first complete sequencing of the human genome and other model genomes, one of the most urgent follow-up projects to date is proteomics, ie, the study of structures of DNA sequence information proteins and their pharmacologically relevant ones Interactions with each other and with other cellular structures. An example of this is the research on transcription-relevant multiprotein complexes, which are of crucial importance in the specific transcription of the genetic information into ribonucleic acids (RNA). Other examples in the field of nuclear biology concern the multi-protein ribonucleic complexes which are responsible for the processing ("splicing") of the transcribed RNA into messenger RNA (m-RNA) (for further examples see above).

b) Theoretische Modellrechnungen (Biocomputing)b) Theoretical model calculations (biocomputing)

Im Bereich des Biocomputing gibt es gegenwärtig dramatische Entwicklungen, deren Einbeziehung in die Analyse der experimentell gewonnenen Topologiedaten und damit für die Proteomik und die Pharmaforschung von erheblichem Vorteil sein kann. Mathematische Modellierungsmethoden, unterstützt durch computergrafische Visualisierung, haben inzwischen einen hohen Grad an berechenbarer Komplexität erreicht. Diesen Simulationen liegen biochemische oder physikalische Gesetzmäßigkeiten zu Grunde. Bis zu 50.000 Einzelmoleküle lassen sich bis zu einer Zeitdauer von 10 Nanosekunden simulieren. Die Modellierung von Dynamik, Funktion und Biomechanik in molekularbiologischen Anwendungen umfasst bisher u. a.: Protein-Membran-Komplexe, die Regulation und Packung von Proteinen, DNA-Bindungsdomänen, sowie verschiedene Strukturproteine. Durch die mathematische Komplexität ist jedoch eine Beschränkung auf das Verhalten innerhalb enger Grenzen der strukturellen Hierarchie notwendig. Ein wesentliches bei solchen Simulationsrechnungen verfolgtes Ziel der modernen Molekularbiologie und Proteomik ist es, die 3D-Struktur von Komplexen biologischer Makromoleküle bis ins atomare Detail zu bestimmen: Dies ist erforderlich, um die funktionelle Wirkung genau zu verstehen und damit effektiver kontrollieren zu können. Theoretische Modellrechnungen zur Bildung, Umbildung und Auflösung von Multiproteinkomplexen werden zu einem derartigen vertieften Verständnis ihrer 3D-Struktur und Dynamik und damit zu einer Optimierung der Wirkstoffentwicklung wesentlich beitragen. Verfahren des Biocomputing haben es in den letzten Jahren möglich gemacht, auf der Grundlage von atomaren Strukturdaten von einzelnen isolierten Untereinheiten auch sterisch mögliche Strukturen von Komplexen aus solchen Untereinheiten mit hoher ”Auflösung” zu berechnen. Es ergeben sich jedoch oftmals mehrere alternative Struktur-Möglichkeiten, eine experimentelle atomare Auflösung der Topologie von komplexen Molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexen, ist mit den hier beschriebenen Analyseverfahren in absehbarer Zeit zwar kaum erreichbar. Experimentelle Topologie-Messungen mit einer Distanzauflösung von einigen Nanometern kann die Anzahl der mit atomarer Auflösung berechneten ”möglichen” 3D-Strukturen eines Komplexes ganz erheblich einschränken. In günstigen Fällen kann es sogar möglich werden, ein bestimmtes atomar aufgelöstes Modell eines Proteinkomplexes als das einzige mit allen experimentellen Strukturdaten kompatible zu identifizieren. Liegen (hypothetisches Beispiel) zwei mit atomarer Auflösung berechnete Alternativen vor, von denen die eine einen Abstand bestimmter Marker in zwei Untereinheiten A, B von 10 Nanometer, die andere einen Abstand dieser Marker von 20 Nanometer voraussagt, so kann mithilfe höchstauflösender SPDM (Auflösungsäquivalent z. B. 2 Nanometer) eine der zwei Alternativen verworfen werden, so dass nur noch die andere in Frage kommt.In the field of biocomputing, there are currently dramatic developments that may be of considerable benefit in the analysis of the experimental topology data and thus in proteomics and drug discovery. Mathematical modeling methods, supported by computergraphic visualization, have now reached a high degree of computable complexity. These simulations are based on biochemical or physical laws. Up to 50,000 individual molecules can be simulated up to a period of 10 nanoseconds. The modeling of dynamics, function and biomechanics in molecular biology applications includes: protein-membrane complexes, the regulation and packaging of proteins, DNA-binding domains, as well as various structural proteins. The mathematical complexity, however, requires a limitation to the behavior within narrow limits of the structural hierarchy. An important goal of modern molecular biology and proteomics in such simulation calculations is to determine the 3D structure of complexes of biological macromolecules down to atomic detail: this is necessary in order to be able to understand the functional effect precisely and thus to control it more effectively. Theoretical model calculations for the formation, remodeling, and resolution of multi-protein complexes will contribute significantly to such a deeper understanding of their 3D structure and dynamics, thereby optimizing drug discovery. Methods of biocomputing have made it possible in recent years to calculate also sterically possible structures of complexes from such subunits with high "resolution" on the basis of atomic structural data of individual isolated subunits. However, there are often several alternative structural possibilities, an experimental atomic resolution of the topology of complex molecular structures, eg. As multiprotein complexes, is with those described here Although analysis methods are hardly achievable in the foreseeable future. Experimental topology measurements with a distance resolution of a few nanometers can considerably limit the number of "possible" 3D structures of a complex calculated with atomic resolution. In favorable cases, it may even be possible to identify a particular atomically resolved model of a protein complex as the only one compatible with all experimental structural data. If (hypothetical example) there are two alternatives calculated with atomic resolution, one of which predicts a distance of certain markers in two subunits A, B of 10 nanometers, the other a distance of these markers of 20 nanometers, then with the aid of super-resolution SPDM (resolution equivalent z B. 2 nanometers) one of the two alternatives be discarded, so that only the other comes into question.

Zur Untersuchung der räumlichen Topologie von molekularen Strukturen, z. B. von Multiproteinkomplexen, werden außerordentlich hohe Strukturauflösungsmethoden benötigt. Da die typischen Abmessungen der individuellen Bereiche (z. B. einzelne Proteinuntereinheiten) im Bereich von 5–10 Nanometer liegen, sind je nach analysiertem Komplex und Zielsetzung Strukturparametermessungen (z. B. 3D-Distanzen zwischen den Schwerpunkten einzelner Untereinheiten von Multiproteinkomplexen oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexen) bis hinunter zu wenigen Nanometern erforderlich. Im Vordergrund der Erfindung stehen insbesondere solche molekularen Strukturen, deren Topologie mit anderen Verfahren (z. B. Elektronenmikroskopie, Röntgenkristallographie, Magnetische Resonanz) nicht oder nur mit unverhältnismäßig großem Einsatz an Sach- und Personalmitteln sowie an Zeit bestimmt werden kann. Beispielsweise setzten kristallographische Untersuchungen die Bildung wenigstens von Mikrokristallen voraus, ein oftmals langwieriges Verfahren; die Elektronenmikroskopie erlaubt ebenso wie die Kristallographie nur in begrenztem Maße die Berücksichtigung physiologischer Bedingungen; Magnetische Resonanzverfahren erlauben zwar Strukturuntersuchungen unter physiologischen Lösungsbedingungen, sind jedoch auf absehbare Zeit auf die Analyse großer Multiproteinkomplexe und anderer vergleichbar großer molekularer Strukturen kaum anwendbar.To study the spatial topology of molecular structures, eg. As of multi-protein complexes, extremely high structure resolution methods are needed. Since the typical dimensions of the individual regions (eg individual protein subunits) are in the range of 5-10 nanometers, depending on the complex and objective analyzed, structural parameter measurements (eg 3D distances between the centers of gravity of individual subunits of multiprotein complexes or multiprotein complexes) Nucleic acid complexes) down to a few nanometers required. In the foreground of the invention are in particular those molecular structures whose topology can not be determined with other methods (eg electron microscopy, X-ray crystallography, magnetic resonance) or only with disproportionate use of material and personnel resources and time. For example, crystallographic studies have required the formation of at least microcrystals, often a lengthy process; Electron microscopy, like crystallography, allows physiological conditions to be taken into account only to a limited extent; Although magnetic resonance methods permit structural investigations under physiological solution conditions, they are hardly applicable for the foreseeable future to the analysis of large multiprotein complexes and other comparably large molecular structures.

Dort, wo die zu untersuchenden molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe, in einer essentiell „zwei-dimensionalen Anordnung” vorliegen, wie bei Kernporenkomplexen in isolierten Membranen, stehen nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Verfügung. Neben klassischen elektronenmikroskopischen Techniken werden hier insbesondere die Atomare Kraftmikroskopie und „Optische Pinzetten”-Verfahren angewandt, die vor allem hochaufgelöste Höhenprofile und deren dynamische Änderungen zu messen gestattet, ggf. in Verbindung mit elektrophysiologischen Funktionsanalysen; in einer Variante dieser Mikroskopiemethode, der Atomaren Kraft-Spektroskopie, sind auch Messungen der Kraftwechselwirkungen zwischen Untereinheiten molekularer Strukturen möglich. Ein weiteres Verfahren mit einem weiter gesteigerten Auflösungspotential ist die Optische Nahfeldmikroskopie. Die genannten Methoden können auch bei begleitenden Untersuchungen an isolierten, d. h. aus ihrem zellulären oder membranösen Kontext herausgelösten molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexen, vorteilhaft angewandt werden. Z. B. kann durch eine solche Analyse ein genaueres Verständnis des Einflusses physikochemischer Parameter (z. B. pH, Ionenkonzentration, Temperaturänderungen, Druck), auf die Topologie des Multiproteinkomplexes gewonnen werden. Bis vor wenigen Jahren war es allgemeine Meinung, dass lichtoptische Ultrastrukturanalysen individueller molekularer Strukturen wegen der auf etwa eine halbe Lichtwellenlänge begrenzten optischen Auflösung von einigen hundert Nanometern aus grundsätzlichen physikalischen Gründen nicht möglich seien. Diese Grenzen der optischen Auflösung können jedoch in vielen Fällen überwunden werden, wenn es gelingt, spezifische Wechselwirkungen des Lichtes mit den zu analysierenden Molekülen zu nutzen. Beispielsweise erlauben Verfahren des „Point Spread Function (PSF) Engineering” gegenwärtig eine fernfeldlichtmikroskopische Auflösung (angegeben als „Full Width at Half Maximum, FWHM, der Punktbildfunktion/”Point Spread Function”, PSF) von 100 nm in alle drei Raumrichtungen. Theoretische Überlegungen zeigen, dass mit derartigen Methoden unter Verwendung von Licht im sichtbaren Spektralbereich noch Auflösungen (FWHM) von 20–30 nm erreicht werden könnten. Ein anderes neues Verfahren von erheblicher Bedeutung für die Analyse molekularer Strukturen betrifft die Optische Nahfeldmikroskopie, mit der in einer fürfluoreszenzoptische Anwendungen geeigneten Anordnung laterale Auflösungen im Bereich von einigen zehn Nanometern erreicht wurden.There, where the molecular structures to be investigated, for. As multiprotein complexes, in an essentially "two-dimensional arrangement" exist, as in nuclear pore complexes in isolated membranes, various methods are available in the prior art. In addition to classical electron microscopic techniques, atomic force microscopy and optical forceps methods are used here, which above all allow high-resolution height profiles and their dynamic changes to be measured, possibly in conjunction with electrophysiological functional analyzes; In a variant of this microscopy method, atomic force spectroscopy, it is also possible to measure the force interactions between subunits of molecular structures. Another method with a further increased dissolution potential is near field optical microscopy. The above methods can also be used in accompanying studies on isolated, d. H. from their cellular or membranous context detached molecular structures, eg. As multiprotein complexes, be applied advantageously. For example, such an analysis may provide a more in-depth understanding of the influence of physicochemical parameters (eg, pH, ion concentration, temperature changes, pressure) on the topology of the multiprotein complex. Until just a few years ago, it was generally believed that optical-optical ultrastructural analysis of individual molecular structures was not possible because of the physical resolution of a few hundred nanometers, limited to about half the wavelength of the light, for fundamental physical reasons. However, these limits of optical resolution can in many cases be overcome if it is possible to use specific interactions of the light with the molecules to be analyzed. For example, methods of "Point Spread Function (PSF) Engineering" currently allow far field microscopic resolution (reported as "Full Width at Half Maximum," FWHM, Point Spread Function, PSF) of 100 nm in all three spatial directions. Theoretical considerations show that such methods could still achieve resolutions (FWHM) of 20-30 nm using light in the visible spectral range. Another new method of considerable importance for the analysis of molecular structures concerns near-field optical microscopy, which achieved lateral resolutions in the range of a few tens of nanometers in an arrangement suitable for fluorescence optical applications.

Optische Auflösungen (FWHM) von 20–30 nm wären ausreichend, sehr große molekulare Strukturen zumindest teilweise zu analysieren; in vielen Fällen von erheblicher biomedizinischer/pharmazeutischer Relevanz wird jedoch selbst eine optische Auflösung von 20–30 nm für sich alleine genommen nicht ausreichend sein. Mithilfe von spektralen Fluoreszenzresonanzenergietransfermessungen ist es möglich, Distanzen von wenigen Nanometern zwischen zwei Fluorochrom-Positionen in einer Struktur abzuschätzen. Beispielsweise kann auf diese Weise die räumliche Struktur von Chromatin weiter aufgeklärt werden. Diese Technik ist zwar in der Lage, höchstaufgelöste Distanzbestimmungen im gesamten infrage kommenden Bereich von molekularen Strukturen zu machen. Nach dem Stand der Technik erlaubt das Verfahren jedoch nicht, die Topologie vielfach markierter individueller molekularer Strukturen zu analysieren; ferner versagt sie bei Abständen größer als ca. 10 nm. Für eine effektive Topologieanalyse ist es jedoch von großem Vorteil, neben kleineren Abständen (z. B. 3 nm) auch größere Abstände weiter entfernter Bereiche (z. B. 20 nm) detektieren können. Theoretische Verfahren des Biocomputing sind von größter Bedeutung für die Berechnung einer eingeschränkten Zahl „möglicher” Strukturalternativen; sie können die Interpretation experimenteller Messungen an „tatsächlichen” Strukturen wesentlich verbessern, jedoch nicht ersetzen. Zusammenfassend kann festgestellt werden: Der Bedeutung des Problems entsprechend gibt es eine Vielzahl von experimentellen Verfahren zur Struktur- und Topologieanalyse von molekularen Strukturen. Zum Teil sind diese Verfahren jedoch nur zur Analyse relativ großer Abstände bzw. sehr kleiner Abstände geeignet, oder sie einen erheblichen Personal- und Zeitaufwand und sind daher für Analysen von zahlreichen molekularen Strukturen in relativ kurzer Zeit nicht optimal.Optical resolutions (FWHM) of 20-30 nm would be sufficient to at least partially analyze very large molecular structures; however, in many cases of significant biomedical / pharmaceutical relevance, even an optical resolution of 20-30 nm alone will not be sufficient. Using spectral fluorescence resonance energy transfer measurements, it is possible to estimate distances of a few nanometers between two fluorochrome positions in a structure. For example, in this way the spatial structure of chromatin can be further elucidated. Although this technique is able to make highly resolved distance determinations in the entire candidate range of molecular structures. According to the state of However, technology does not allow the method to analyze the topology of multi-labeled individual molecular structures; Furthermore, it is of great advantage for an effective topology analysis to be able to detect not only smaller distances (eg 3 nm) but also larger distances of more distant regions (eg 20 nm) , Theoretical methods of biocomputing are of paramount importance for the calculation of a limited number of "possible" structural alternatives; they can significantly improve, but not replace, the interpretation of experimental measurements on "actual" structures. In summary, it can be stated that, in accordance with the importance of the problem, there are a multitude of experimental methods for the structural and topological analysis of molecular structures. However, some of these methods are only suitable for the analysis of relatively large distances or very small distances, or they require considerable manpower and time and are therefore not optimal for analyzes of numerous molecular structures in a relatively short time.

WO 98/28592 A1 beschreibt ein Verfahren und Vorrichtungen für die Fernfeldmikroskopie und Flussfluorometrie zur geometrischen Distanzmessung zwischen fluorochrommarkierten Objektstrukturen, wobei die Distanzen geringer sein können als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion. DE 198 30 596 A1 beschreibt ein Wellenfeldmikroskop mit einem Beleuchtungs- bzw. Anregungssystem, das wenigstens eine reelle und eine virtuelle Beleuchtungsquelle und wenigstens ein Objektiv umfasst, wobei Beleuchtungsquellen und Objektiv(e) derart zueinander angeordnet sind, dass sie zur Erzeugung eines eindimensionalen stehenden Wellenfeldes geeignet sind, mit einem Objektraum, der Halte und Manövriervorrichtung(en) für ein Objekt umfasst, und mit einem Detektionssystem, das ein Objektiv, ein Okular und einen Detektor umfasst. WO 00/36398 A2 beschreibt Verfahren und Vorrichtungen zur Erfassung optischer Eigenschaften, insbesondere von Lumineszenz-Reaktionen und Brechungsverhalten, von auf einem Träger direkt oder indirekt gebundenen Molekülen. WO 98/28592 A1 describes a method and apparatus for far-field microscopy and flux fluorometry for geometrical distance measurement between fluorochrome-labeled object structures, wherein the distances may be less than the half-width of the main maximum effective dot image function. DE 198 30 596 A1 describes a wave field microscope with an illumination or excitation system comprising at least one real and one virtual illumination source and at least one lens, wherein illumination sources and objective (s) are arranged to each other, that they are suitable for generating a one-dimensional standing wave field, with a Object space comprising holding and maneuvering device (s) for an object, and a detection system comprising a lens, an eyepiece and a detector. WO 00/36398 A2 describes methods and devices for detecting optical properties, in particular luminescence reactions and refractive behavior, of molecules bound directly or indirectly to a support.

Die hier beschriebene Erfindung hat die Analyse der Topologie der supramolekularen Biostruktur und Dynamik solcher biochemisch, molekularbiologisch und zellbiologisch bereits charakterisierter „Cluster” von funktionellen biologischen Makromolekülen mit schwacher Wechselwirkung der Untereinheiten (z. B. Multiproteinkomplexen) zum Ziel. Überschreiten die Abmessungen eines einzelnen biologischen Makromoleküls in wenigstens einer Richtung eine Größe von 10 nm, so ist auch die Analyse eines einzelnen Moleküls erfindungsgemäß. Erfindungsgemäß sind ferner Analysen synthetisch hergestellter oder mit biotechnologischen oder chemischen Verfahren modifizierter anderer Makromoleküle und Makromolekülkomplexe, die in natürlichen biologischen Systemen nicht vorkommen, sofern die hier beschriebenen Analyseverfahren angewandt werden. Im Folgenden sollen alle genannten Makromoleküle/Makromolekülkomplexe abkürzend als „molekulare Strukturen” bezeichnet werden. Unter „Topologie” wird im Folgenden die relative Lage von geeignet gekennzeichneten („markierten”) Bereichen der molekularen Struktur bezeichnet, zum Beispiel die durch geometrische Distanzbeziehungen gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Untereinheiten in einem Multiproteinkomplex, oder die durch geometrische Distanzbeziehungen gekennzeichneten Lagebeziehungen von markierten Bereichen in einem aus Proteinen und Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten bestehenden Komplex. Die im Folgenden beschriebene Erfindung erlaubt es, die oben genannten Nachteile des Standes der Technik wesentlich zu verringern. Dabei werden in einer neuen, erfindungsgemäßen Weise verbunden:

• Nanolithographische Präparationsverfahren und, die eine Anordnung der zu analysierenden molekularen Strukturen in Rastern („Arrays”) erlauben, die eine auch fernfeldlichtmikroskopische SPDM-Analyse routinemäßig ermöglichen.
• Verfahren des PSF-Engineering, soweit dies für höchstauflösende Topologieuntersuchungen (z. B. bei zu messenden Distanzen im Bereich von 20 nm und darunter) erforderlich ist.
• Methoden der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM), unter Verwendung von spektralen Kalibrierungsverfahren auf nanolithographischer Basis.

The invention described herein aims to analyze the topology of the supramolecular biostructure and dynamics of such biochemically, molecular biologically and cell biologically already characterized "clusters" of functional biological macromolecules with weak subunit interactions (eg, multiprotein complexes). If the dimensions of a single biological macromolecule exceed 10 nm in at least one direction, the analysis of a single molecule is also according to the invention. Furthermore, according to the invention, analyzes of other macromolecules or macromolecule complexes modified synthetically or modified by biotechnological or chemical processes which do not occur in natural biological systems, provided that the analysis methods described here are used. In the following, all the macromolecules / macromolecule complexes mentioned are to be abbreviated to "molecular structures". The term "topology" below denotes the relative position of suitably labeled ("marked") regions of the molecular structure, for example the positional relationships of labeled subunits in a multiprotein complex characterized by geometric distance relationships, or the positional relationships of labeled regions in FIG a complex consisting of proteins and nucleic acids or nucleic acid segments. The invention described below makes it possible to substantially reduce the above-mentioned disadvantages of the prior art. It is connected in a new, inventive way:

• Nanolithographic preparation methods and, which allow the arrangement of the molecular structures to be analyzed in grids ("arrays"), which routinely enable a far-field light microscopic SPDM analysis.
• Method of PSF engineering, as required for high-resolution topology studies (eg at distances to be measured in the range of 20 nm and below).
• Spectral Precision Distance Microscopy (SPDM) methods using nanolithographic spectral calibration techniques.

Im Zusammenhang mit geeigneten, erfindungsgemäßen nanolithographisch unterstützten Kalibrierungstechniken werden lichtoptische topologische Vielfach-Messungen an molekularen Strukturen vom Bereich von einem bis wenigen Nanometer bis in den Bereich der konventionellen optischen Auflösung von 100 bis mehrere hundert Nanometer ermöglicht. Bei der bevorzugten fernfeldlichtmikroskopischen Anwendung ist es möglich, mit dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bis zu mehreren hundert bis mehrere tausend individuelle molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe oder Multiprotein-Nukleinsäurekomplexe, simultan im Rahmen desselben fernfeldlichtmikroskopischen Gesichtsfeldes zu analysieren und damit eine rasche, topologische Hoch präzisionsanalyse zu ermöglichen, insbesondere auch unter physiologischen Bedingungen (Temperatur, Ionenmilieu, Wirkstoffkonzentration, elektrische und magnetische Felder).In connection with suitable nanolithographic assisted calibration techniques according to the invention, optical topological multiple measurements on molecular structures of the range of one to a few nanometers up to the range of the conventional optical resolution of 100 to several hundred nanometers are made possible. In the preferred far-field light microscopic application, it is possible with the inventive method described herein up to several hundred to several thousand individual molecular structures, eg. As multiprotein complexes or multi-protein nucleic acid complexes, to analyze simultaneously in the same far field light microscopic field of view, and thus to enable rapid, topological high-precision analysis, especially under physiological conditions (temperature, ion environment, drug concentration, electric and magnetic fields).

Die Bildung, Umbildung und Disintegration von molekularen Strukturen, wie z. B. Multiproteinkomplexen ist ein entscheidender Prozess ihrer funktionellen Wirkung. Beispielsweise ist bekannt, dass die enzymatische Wirksamkeit eines Proteinkomplexes in entscheidender Weise von seiner Topologie unter physiologischen Bedingungen abhängt. Diese Topologie kann insbesondere auch durch Pharmaka verändert werden. Die erfindungsgemäße Analyse der 3D- bzw. 4D(3D plus Zeit)-Topologie in Abhängigkeit von Wirkstoffeinflüssen gestattet daher einen wesentlichen Beitrag für eine weitere Optimierung der Wirkstoffentwicklung; sie erlaubt es, simultan molekulare Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe unter verschiedenen Bedingungen (z. B. Wirkstoffe) auf hierdurch induzierte topologische Veränderungen getestet werden. Soweit die molekularen Strukturen, z. B. Multiproteinkomplexe, in fixierter Form vorliegen, so kann die Analyse der Dynamik der Topologie durch Vergleich der Präparate in verschiedenen funktionellen Phasen erfolgen. Für die langfristige Perspektive eines „High Through Put Screening” besonders vorteilhaft sind dabei fernfeldmikroskopische Verfahren, da diese vollkommen „berührungsfrei” arbeiten und in kurzer Zeit (z. B. einige Minuten oder sogar Sekunden) lichtmikroskopische Informationen von hunderten oder tausenden von molekularen Strukturen registriert und der Datenanalyse zugeführt werden können. In Verbindung mit der erfindungsgemäßen nanolithographischen Kalibrierung, die auch simultan mit der Vermessung der zu analysierenden molekularen Strukturen erfolgen kann, und geeigneter Rechnerkapazität, kann auch eine vergleichbar rasche Analyse der gewonnenen Daten realisiert werden.The formation, remodeling and disintegration of molecular structures such. B. Multiprotein complexes is a crucial process of their functional effect. For example, it is known that the enzymatic activity of a protein complex is critically dependent on its topology under physiological conditions. This topology can also be changed by pharmaceuticals. The analysis according to the invention of the 3D or 4D (3D plus time) topology as a function of active substance influences therefore makes a substantial contribution to a further optimization of the drug development; it allows simultaneous molecular structures, eg. For example, multiprotein complexes under various conditions (eg, drugs) can be tested for topological changes induced thereby. As far as the molecular structures, eg. B. Multiproteinkomplexe, in a fixed form, so the analysis of the dynamics of the topology can be done by comparing the preparations in different functional phases. Far-field microscopy methods are particularly advantageous for the long-term perspective of "high through put screening" because they work completely "without contact" and register light microscopic information of hundreds or thousands of molecular structures in a short time (eg a few minutes or even seconds) and the data analysis can be supplied. In conjunction with the nanolithographic calibration according to the invention, which can also take place simultaneously with the measurement of the molecular structures to be analyzed, and suitable computer capacity, a comparatively rapid analysis of the data obtained can also be realized.

Methodische VorgehensweiseMethodical approach

Die erfindungsgemäße Anwendung des SPDM-Verfahrens auf die Topologieanalyse von molekularen Strukturen in Rasteranordnungen auf einen nanolithographisch reaktiven Träger erfolgt in folgender Weise:The application according to the invention of the SPDM method to the topology analysis of molecular structures in raster arrangements on a nanolithographically reactive support takes place in the following manner:

I. Ausgangspunkt: Identifizierung von molekularen StrukturenI. Starting point: Identification of molecular structures

Das erfindungsgemäße Verfahren soll zunächst am Beispiel der Analyse von biologisch/pharmazeutisch wichtigen molekularen Strukturen dargestellt werden. Methodischer Ausgangspunkt der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist die Identifizierung von funktionell wichtigen molekularen Strukturen, beispielsweise von Multiproteinkomplexen, deren makromolekulare Untereinheiten und gegenseitige Wechselwirkung aufgrund biochemischer/molekularbiologischer Untersuchungen bereits hinreichend gut charakterisiert sind. Als Beispiele seien hier genannt die vielfältigen, hochspezialisierten und funktionell essentiellen, an Membranen (z. B. Zellmembran, Kernhülle, Vesikel) oder fibrilläre Strukturen (z. B. Elemente des Zytoskeletts) gebundenen Multiproteinkomplexe; die Komplexe der Proteindegradationsmaschinerie, die in ihrer Komplexität diejenige der Proteinsynthese erreichen; sowie die aus zahlreichen Untereinheiten bestehenden Komplexe der Replikations-, Transkriptions- und Reparatur-„Maschinerie” des Genoms im Zellkern. Weitere Beispiele sind Verbindungen der oben genannten Multiproteinkomplexe mit Nukleinsäuren oder Nukleinsäureabschnitten. Beispielsweise erfolgen die Replikation, Transkription und Reparatur der DNA, die Bildung von Boten-RNA (m-RNA) aus der transkribierten RNA und deren Transport vom Zellkern zum Zytoplasma, sowie die Proteinsynthese in solchen Multiprotein-Nukleinsäure-Komplexen.The process according to the invention will first be illustrated by the example of the analysis of biologically / pharmaceutically important molecular structures. The methodological starting point of the procedure according to the invention is the identification of functionally important molecular structures, for example of multiprotein complexes whose macromolecular subunits and mutual interaction are already sufficiently well characterized on the basis of biochemical / molecular biological investigations. Examples which may be mentioned here are the diverse, highly specialized and functionally essential multiprotein complexes bound to membranes (eg cell membrane, nuclear envelope, vesicles) or fibrillar structures (eg elements of the cytoskeleton); the complexes of the protein degradation machinery, which in complexity reach that of protein synthesis; as well as the numerous subunits existing complexes of the replication, transcription and repair "machinery" of the genome in the nucleus. Further examples are compounds of the abovementioned multiprotein complexes with nucleic acids or nucleic acid sections. For example, the replication, transcription and repair of DNA, the formation of messenger RNA (m-RNA) from the transcribed RNA and their transport from the nucleus to the cytoplasm, as well as the protein synthesis in such multiprotein-nucleic acid complexes.

II. Bindung der molekularen Strukturen in einer nanolithographisch hergestellten Rasteranordnung auf einem Reaktiven TrägerII. Binding of the molecular structures in a nanolithographic grid arrangement on a reactive support

Es wird ein nanolithographisch Reaktiver Träger RT mit einer Reaktiven Oberfläche RO verwendet, wie zum Beispiel bei Geyer et al. und Eck et al. beschrieben (Applied Physics Letters, Volume 75, Number 16, 2401, 1999; Advance Materials, Volume 12, 805, 2000).A nanolithographic reactive support RT with a reactive surface RO is used, as described, for example, in Geyer et al. and Eck et al. (Applied Physics Letters, Volume 75, Number 16, 2401, 1999; Advance Materials, Volume 12, 805, 2000).

In einem Bereich des Reaktiven Trägers wird durch ein nanolithographisches Verfahren ein Muster K1 mit Reaktiven Features KF1.1, KF1.2, KF1.3 ... KF1.N., KF2.1, ... KFM.N erzeugt. Im oben genannten Beispiel werden funktionelle Gruppen von selbstaggregierenden Monolagen (SAMs) durch einen Elektronenstrahl kontrolliert modifizieren (Umwandlung von Nitrogruppen in Aminogruppen), so dass definierte reaktive Features für eine molekülspezifische Ankopplung entstehen. Mittels dieses nanolithographischen Verfahrens kann man gezielte und räumlich genau definierte molekulare Modifikation nanostrukturierter Oberflächen herstellen, die die Eigenschaften für einen Träger für das erfindungsgemäße Verfahren gewährleisten. Die Ausdehnung in einer oder mehreren Raumrichtungen muss erheblich kleiner als die durch die optische Auflösung des für die lichtmikroskopische Analyse verwendeten Optischen Systems OS sein. Gekennzeichnet durch die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) der Punktbildfunktion (Point Spread Function, PSF) verwendeten Optischen Systems in der betreffenden Raumrichtung, und deren Abstand voneinander größer ist als die FWHM des verwendeten Optischen Systems. Es werden nun eine oder mehrere Kalibrierungssubstanz(en) K1, K2 ... mit einer oder mehreren spektralen Signaturen Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3 an die Reaktiven Features KF1, KF2, KF3 ... gebunden, wobei der geometrische Abstand zwischen Kspecs 1, Kspecs 2, Kpecs 3 usw. auf den Kalibrierungssubstanzen aus anderen Messungen oder aus den zur Herstellung verwendeten Reaktionsbedingungen bekannt ist. Durch Wiederholung des nanolithographischen Verfahrens in einem Bereich MEAS des Reaktiven Trägers RT ein Muster M1 mit Reaktiven Features MF1.1, MF1.2, ... MF1.L, MF2.1, MF2.2, ... MF.L,K erzeugt wird, wobei der mittlere Durchmesser der Reaktiven Features MF kleiner/gleich dem mittleren geschätzten oder anderweitig bestimmten Durchmesser der zu analysierenden molekularen Strukturen MS ist, und der Abstand der Reaktiven Features MF voneinander sowie von den zur Kalibrierung verwendeten Reaktiven Features KF größer ist als die FWHM des OS in der betreffenden Richtung. Es werden eine oder mehrere zu messende molekulare Struktur(en) MS1, MS2, MS3, ... (Messobjekte) an die Reaktiven Features MF ... gebunden. Die zu messende/n molekularen Struktur/en MS an bestimmten chemisch/biochemisch/molekularbiologisch identifizierten Stellen mit mindestens zwei spektralen Signaturen specs 1, specs 2, specs 3 markiert werden, die bevorzugt mit denen zur Markierung der Kalibrierungssubstanz verwendeten identisch sind. Die Abstände und relativen Lagebeziehungen der durch die spektralen Signaturen identifizierten Positionen auf der/den Kalibrierungssubstanz/en bzw. in den Messobjekten nach Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bestimmt wird, wobei die Kalibrierung der Distanzbestimmung mithilfe der spektral markierten Kalibrierungssubstanzen K1, K2, ... erfolgt.In a region of the reactive carrier, a pattern K1 with reactive features KF1.1, KF1.2, KF1.3... KF1.N., KF2.1,... KFM.N is generated by a nanolithographic method. In the above example, functional groups of self-assembled monolayers (SAMs) are controlled by an electron beam to modify (conversion of nitro groups into amino groups), so that defined reactive features for a molecule-specific coupling arise. By means of this nanolithographic method, it is possible to produce specific and spatially precisely defined molecular modification of nanostructured surfaces which ensure the properties for a carrier for the method according to the invention. The extent in one or more spatial directions must be considerably smaller than that due to the optical resolution of the optical system OS used for the light microscopic analysis. Characterized by the Full Width at Half Maximum (FWHM) of the Point Spread Function (PSF) optical system used in the respective spatial direction, and whose distance from each other is greater than the FWHM of the optical system used. One or more calibration substance (s) K1, K2... Are then bound to the reactive features KF1, KF2, KF3... With one or more spectral signatures Kspecs 1, Kspecs 2, KFcs 3, the geometric distance between Kspecs 1, Kspecs 2, Kpecs 3, etc. on the calibration substances from other measurements or from the reaction conditions used for the preparation. Repeating the nanolithographic process in a region MEAS of the reactive carrier RT, a sample M1 with reactive features MF1.1, MF1.2, ... MF1.L, MF2.1, MF2.2, ... MF.L, K, wherein the mean diameter of the reactive features MF is less than or equal to the mean estimated or otherwise determined diameter of the molecular structures MS to be analyzed, and the distance of the reactive ones Features MF as well as the reactive features KF used for calibration is greater than the FWHM of the OS in that direction. One or more molecular structures (s) MS1, MS2, MS3, ... (measurement objects) to be measured are bound to the reactive features MF .... The molecular structure (s) to be measured are marked at certain chemically / biochemically / molecular-biologically identified sites with at least two spectral signatures specs 1, specs 2, specs 3, which are preferably identical to those used for labeling the calibrating substance. The distances and relative positional relationships of the positions identified by the spectral signatures on the calibration substance (s) or in the measurement objects are determined by precision spectral distance microscopy (SPDM) methods, wherein the calibration of the distance determination using the spectrally marked calibration substances K1, K2,. .. he follows.

III. Markierung spezifischer Bereiche von molekularen Strukturen:III. Labeling specific regions of molecular structures:

Zur lichtmikroskopischen Identifizierung der molekularen Strukturen, wie z. B. von Multi proteinkomplexen und ihrer Untereinheiten, sowie ggf. weiterer Teilregionen, werden spezifische molekulare Markierungsmethoden eingesetzt. Diese Markierungsverfahren müssen abgestimmt sein auf das angewandte Mikroskopieverfahren. Beispielsweise steht für Untersuchungen an fixierten molekularen Strukturen bereits jetzt eine Fülle von Möglichkeiten zur Verfügung, wie die spezifische Bindung von fluoreszierenden Proteinen; insoweit Nukleinsäuren an der betreffenden Multiproteinkomplexe oder ihrer biologischen Funktion beteiligt sind, kann deren Position durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechniken mit Fluorochromen von verschiedener spektraler Signatur (gekennzeichnet beispielsweise durch Unterschiede im Anregungs/Emissionsspektrum bzw. in der Fluoreszenzlebensdauer) markiert werden.For light microscopic identification of the molecular structures, such. B. of multi-protein complexes and their subunits, and possibly other subregions, specific molecular labeling methods are used. These labeling methods must be adapted to the applied microscopy method. For example, studies on fixed molecular structures already provide a wealth of opportunities, such as the specific binding of fluorescent proteins; Insofar as nucleic acids are involved in the relevant multiprotein complexes or their biological function, their position can be marked by fluorescence in situ hybridization techniques with fluorochromes of different spectral signature (characterized, for example, by differences in the excitation / emission spectrum or in the fluorescence lifetime).

Seit einigen Jahren ergeben sich jedoch darüber hinaus ständig sich erweiternde Möglichkeiten einer In-vivo-Markierung spezifischer Untereinheiten von Multiproteinkomplexen sowie ihrer funktionellen Wechselwirkungspartner. Unter In-vivo-Markierung werden hier Markierungsverfahren verstanden, die eine Analyse der molekularen Strukturen unter physiologischen Bedingungen erlauben, zum Beispiel in einem flüssigen Medium, bei einer auch in lebenden Zellen vorkommenden Konzentration von Wasserstoffionen (pH) und anderen Ionen und Molekülen. Zur Zeit sind hier insbesondere Methoden der Verbindung der zu analysierenden Bereiche mit Konstrukten von Green Fluorescent Proteins” verschiedener spektraler Signatur zu nennen. Andere, gegenwärtig in Entwicklung begriffene Verfahren betreffen die In-vivo-Markierung von spezifischen Proteinen, z. B. mithilfe von einzelsträngigen fluorochromierten oder anders modifizierten Oligonukleotiden. Zusätzlich zu Unterschieden im Anregungs- und Emissionsspektrum sind hier insbesondere spektrale Signaturunterschiede aufgrund der Fluoreszenzlebensdauer von größtem Interesse. Unter spektraler Signatur werden im Folgenden alle physikalischen Eigenschaften verstanden, die eine lichtoptische Identifizierung der Markierung gestatten. Unter Licht wird hier der Bereich elektromagnetischer Strahlung vom Ultravioletten (Vakuumwellenlänge 200 nm) bis zum infraroten (Vakuumwellenlänge 2000 nm) verstanden. Insbesondere werden unter spektraler Signatur Fluoreszenzeigenschaften mit der oben genannten Charakterisierung verstanden. Gegenwärtig kommen für Fluoreszenzmarkierungen 6–10 gleichzeitig einsetzbare, durch die spektrale Signatur diskriminierbare Verfahren in Betracht. Durch konsequente Weiterentwicklung der kürzlich in die Biowissenschaften eingeführten Fluoreszenzmarkierung mithilfe von „Nanokristallen” (Halbleitersystemen von 1–100 nm Durchmesser), sowie der Synthese neuer, photostabiler Fluorochrome mit einem erweiterten Spektrum von Fluoreszenzlebensdauern ist die Möglichkeit einer erheblichen Vermehrung der molekularen Markierungsmöglichkeiten gegeben. Nach dem Stand der Technik ist derzeit eine Erweiterung auf ca. 16 Markierungsmöglichkeiten grundsätzlich durchführbar. Es ist erfindungsgemäß, die Markierung auch vor der Bindung der molekularen Strukturen an den Reaktiven Träger (s. 2.) oder gleichzeitig mit dieser Bindung durchzuführen, oder eine Mischung dieser Verfahren, d. h. einige Markierungen vor der Bindung an den Reaktiven Träger (RT), einige Markierungen während der Bindung an den RT, sowie einige Markierungen nach der erfolgten Bindung der molekularen Strukturen an den RT durchzuführen.However, in recent years there has been a growing potential for in vivo labeling of specific subunits of multiprotein complexes as well as their functional interaction partners. In vivo labeling is understood here as meaning labeling methods which allow an analysis of the molecular structures under physiological conditions, for example in a liquid medium, with a concentration of hydrogen ions (pH) and other ions and molecules which also occurs in living cells. At present, in particular, methods of combining the regions to be analyzed with constructs of Green Fluorescent Protein of different spectral signature can be mentioned. Other methods currently under development involve the in vivo labeling of specific proteins, e.g. Using single-stranded fluorochromated or otherwise modified oligonucleotides. In addition to differences in the excitation and emission spectrum, in particular spectral signature differences due to the fluorescence lifetime are of greatest interest here. In the following, spectral signature is understood as meaning all physical properties which permit a light-optical identification of the marking. Light is understood here to be the range of electromagnetic radiation from the ultraviolet (vacuum wavelength 200 nm) to the infrared (vacuum wavelength 2000 nm). In particular, spectral signature means fluorescence properties with the above-mentioned characterization. For fluorescence labels, at least 6 to 10 simultaneously employable methods which can be discriminated by the spectral signature can be considered. Consistent advances in fluorescence labeling recently introduced in the life sciences by using "nanocrystals" (semiconductor systems of 1-100 nm in diameter), as well as the synthesis of new photostable fluorochromes with an extended spectrum of fluorescence lifetimes, offer the potential for a significant increase in molecular tagging capabilities. According to the state of the art, an extension to approximately 16 marking options is currently feasible. It is also according to the invention to carry out the labeling before the binding of the molecular structures to the reactive support (see 2.) or simultaneously with this bond, or a mixture of these methods, ie. H. to do some labeling before binding to the reactive support (RT), some labeling during binding to the RT, and some labeling after the binding of the molecular structures to the RT.

IV. Lichtmikroskopische Analyse der markierten und an den Reaktiven Träger in einer Rasteranordnung gebundenen molekularen Strukturen.IV. Light microscopic analysis of the labeled and attached to the reactive carrier in a grid assembly molecular structures.

Die lichtoptische Analyse der markierten und an den Reaktiven Träger in einer Rasteranordnung gebundenen molekularen Strukturen erfolgt mit lichtmikroskopischen, bevorzugt fernfeldlichtmikroskopischen Techniken. Neue Fernfeld-lichtmikroskopische Verfahren des „Point-Spread-Function-Engineering” gestatten derzeit experimentell, die optische Auflösung (FWHM) in einer oder mehreren Raumrichtungen auf etwa 100 Nanometer (d. h. um ein Mehrfaches des konventionellen Wertes) zu verbessern. Theoretische Analysen ergaben, dass langfristig im Fernfeld eine optische Auflösung von wenigen zehn Nanometern (entsprechend einem Zwanzigstel oder weniger der eingesetzten Lichtwellenlänge) physikalisch möglich ist, sofern spezifische Wechselwirkungsbedingungen realisiert werden können. Erfindungsgemäß ist der Einsatz aller lichtmikroskopischen, insbesondere fernfeldlichtmikroskopischen Verfahren unter Einschluss von Methoden des PSF-Engineering, die sich in geeigneter Weise mit Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) kombinieren lassen.The light-optical analysis of the labeled molecular structures bound to the reactive support in a grid arrangement is carried out by light microscopy, preferably far-field light microscopy techniques. New far-field light microscopic techniques of "point-spread-function engineering" currently allow experimentally to improve the optical resolution (FWHM) in one or more spatial directions to about 100 nanometers (i.e., several times the conventional value). Theoretical analyzes showed that in the long-range far field, an optical resolution of a few tens of nanometers (corresponding to one twentieth or less of the wavelength of light used) is physically possible, provided that specific interaction conditions can be realized. According to the invention, the use of all methods of light microscopy, in particular far-field light microscopy, including methods of PSF engineering, which can be combined in a suitable manner with spectral precision distance microscopy (SPDM) methods.

Bei dem Verfahren der SPDM handelt es sich um eine Methode der digitalen Fluoreszenzmikroskopie, die in Verbindung mit den oben beschriebenen Verfahren der spektral unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung individueller biologischer Makromoleküle die Analyse der Topologie von molekularen Strukturen weit jenseits der jeweiligen optischen Auflösung (FWHM) des verwendeten Mikroskopiesystems erlauben. Physikalisch beruht dieses Verfahren auf der Positionsanalyse spektral diskriminierter „punktförmiger” Einzelobjekte.The method of SPDM is a method of digital fluorescence microscopy which, in conjunction with the above-described methods of spectrally different fluorescent labeling of individual biological macromolecules, allows analysis of the topology of molecular structures far beyond the respective optical resolution (FWHM) of the microscopy system used , Physically, this method is based on the position analysis of spectrally discriminated "punctiform" individual objects.

Erfindungsgemäß sind auch solche Strukturen, die nur in einer oder zwei Raumrichtungen eine „punktförmige” Ausdehnung besitzen, d. h. eine Ausdehnung, die wesentlich kleiner ist als die optische Auflösung (FWHM) des zur Analyse verwendeten lichtoptischen Systems in dieser Richtung. Bei der Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Genom-Nanostrukturen (hauptsächlich auch Proteinen und Nukleinsäuren bestehende molekulare Strukturen) in Zellkernen wurde unter Verwendung der konfokalen Laser-Rasterrnikroskopie ein 3D „Auflösungsäquivalent” von ca. 50 Nanometer erreicht; d. h. in einzelnen Zellkernen konnten noch individuelle 3D-Distanzen von 50 Nanometern detektiert werden. Ein Auflösungsäquivalent von 50 nm ist z. B. ausreichend, zur Analyse der Topologie von Genom-Nanostrukturen wesentlich beitragen zu können.According to the invention, those structures which have a "punctiform" extent only in one or two spatial directions, ie. H. an extent much smaller than the optical resolution (FWHM) of the light-optical system used for analysis in this direction. In the investigation of fluorescence-labeled genome nanostructures (mainly also protein and nucleic acid-based molecular structures) in cell nuclei, a 3D "resolution equivalent" of about 50 nanometers was achieved using confocal laser scanning microscopy; d. H. In individual cell nuclei, individual 3D distances of 50 nanometers could still be detected. A resolution equivalent of 50 nm is z. B. sufficient to contribute to the analysis of the topology of genome nanostructures significantly.

Mithilfe der Verbindung der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie mit weiteren Entwicklungen im Bereich des „Point Spread Function Engineering” und der „Molekularen Kalibrierung” ist es grundsätzlich möglich, bei geeigneter Markierung von Unterbereichen der zu analysierenden Multiproteinkomplexe, z. B. eines Multiproteinkomplexes, ein 3D-Auflösungsäquivalent von wenigen Nanometer zu erreichen:

a) Theoretische Analysen der das Auflösungsäquivalent bestimmenden Faktoren haben ergeben, dass unter Verwendung eines geeigneten Fernfeldmikroskopischen Mikroskopiesystems („Point Spread Function Engineering (PSF)” Mikroskopie, z. B. 4Pi, STED, SMI-Mikroskopie), geeigneter Markierung sowie multiplen Messungen in Verbindung mit „Molekularer Kalibrierung”, Auflösungsäquivalente von theoretisch sogar unter einem Nanometer zu erreichen sind („Picometer range”);
b) Experimentell wurden kürzlich (1999/2000) an markierten „physikalischen” Testobjekten mit ausreichender Photostabilität der eingesetzten Fluorochrome und in Verbindung mit den genannten neuen Methoden der Mikroskopie Distanzen von 10 bis 60 Nanometer mit einem Fehler (Standardabweichung) von 1–2 Nanometer gemessen. Insgesamt ist damit die grundsätzliche Durchführbarkeit topologischer Analysen von geeignet markierten molekularen Strukturen theoretisch und experimentell gesichert.

Using the combination of spectral precision distance microscopy with further developments in the field of "point spread function engineering" and "molecular calibration", it is basically possible, with appropriate labeling of subregions of the multiprotein complexes to be analyzed, eg. B. a multiprotein complex to achieve a 3D resolution equivalent of a few nanometers:

a) Theoretical analyzes of the dissolution equitivity determining factors have revealed that using a suitable far field microscopy system ("Point Spread Function Engineering" (PSF) microscopy, eg 4Pi, STED, SMI microscopy), appropriate labeling and multiple measurements in Connection with "molecular calibration", resolution equivalents of theoretically even less than one nanometer can be achieved ("picometer range");
b) Experiments have recently (1999/2000) on labeled "physical" test objects with sufficient photostability of the fluorochromes used and in conjunction with the above-mentioned new methods of microscopy distances of 10 to 60 nanometers measured with a error (standard deviation) of 1-2 nanometers , Overall, the fundamental feasibility of topological analyzes of suitably labeled molecular structures is theoretically and experimentally confirmed.

Claims

Method for light microscopic analysis of the topology of molecular structures (MS), characterized in that the molecular structures (MS) have a total diameter between 0.1 nanometer and 200 nanometers and in the form of grids together with calibration substances (K1, K2, ...) be arranged on a nanolithographically reactive support (RT).

A method according to claim 1, characterized in that the molecular structures (MS) are biological macromolecules such as proteins, biological or synthetic membranes, oligonucleotides, DNA, RNA, mRNA, genome structures and / or other macromolecular constituents of cells and / or technical microstructures.

A method according to claim 1 or 2, characterized in that a nanolithographically reactive support (RT) having a reactive surface (RO) is used.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the reactive support (RT) is modified with a reactive surface (RO) controlled by means of lithographic techniques and materials.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that in a region (KAL) of the reactive carrier by nanolithographic method a pattern (K1) with reactive features (KF1.1, KF1.2, KF1.3, ..., KF1.N, KF2.1, ..., KFM.N) whose extent in one or more spatial directions is considerably smaller than that due to the optical resolution of the optical system (OS) used for light microscopic analysis, determined by Full Width at Half Maximum (FWHM) of the point spread function (PSF) from the optical system (OS) in the respective spatial direction, and whose distance from each other is greater than the half-width (FWHM) of the optical system (OS) used ,

Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that by nanolithographic method one or more Kalibrierungsubststanz / s (K1, K2, ...) with one or more spectral signature / s (Kspecs 1, Kspecs 2, Kspecs 3,. ..) to the reactive features (KF1, KF2, KF3, ...), the geometric distance and distribution between the one or more spectral signatures and the calibration substances being known.

Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that by nanolithographic methods in a region (MEAS) of the reactive carrier (RT) a pattern (M1) with reactive features (MF1.1, MF1.2, ..., MF1 .L, MF2.1, MF2.2, ..., MF *), where the mean diameter of the reactive features (MF) is less than or equal to the mean diameter of the molecular structures (MS) to be analyzed, and the distance of the reactive features (MF) of each other and of the reactive features (KF) used for the calibration is greater than the half-width (FWHM) of the optical system (OS) used in the relevant direction.

A method according to claim 7, characterized in that one or more to be measured molecular structure (s) (MS1, MS2, MS3, ..., measuring objects) are bound to the reactive features (MF).

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that the / m to be measured molecular / s structure (MS) at certain chemically, biochemically, or molecular biologically identified sites with at least two spectral signatures (specs 1, specs 2, specs 3, ...), which are preferably identical to those used for labeling the calibrating substance.

Method according to one of Claims 1 to 9, wherein the distances and relative positional relationships of the positions identified by the spectral signatures on the calibration substance (s) or in the test objects are determined by precision spectral distance microscopy (SPDM) methods, the calibration of the distance determination with the help of the spectrally marked calibration substances (K1, K2, ...).