DE10052583A1 - Verfahren zur Optimierung der Molekularen Multiplex-Diagnostik von Microtissue Arrays mit Hilfe von Virtual Cell Nucleus Imageing - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Berechnung von Optimierungsstrategien für die Molekulare-Multiplex-Diagnostik von Microtissue-Arrays, dadurch gekennzeichnet, daß für die zu untersuchende Zellart/Zellarten ein Computermodell von Kernen der betreffenden Zellen in der Weise berechnet wird, dass den zu markierenden Orten geeignete lichtoptisch detektierbare Eigenschaften zugeschrieben werden, wie zum Beispiel bestimmte spektrale Signaturen oder Kombinationen von spektralen Signaturen.

Description

Verfahren zur Berechnung von Optimierungsstrategien für die Molekulare-Multiplex- Diagnostik von Microtissue-Arrays, dadurch gekennzeichnet, daß für die zu untersuchende Zellart/Zellarten ein Computermodell von Kernen der betreffenden Zellen in der Weise berechnet wird, dass den zu markierenden Orten geeignete lichtoptisch detektierbare Eigenschaften zugeschrieben werden, wie zum Beispiel bestimmte spektrale Signaturen oder Kombinationen von spektralen Signaturen.

Bei dem Verfahren der Molekularen Genomdiagnostik in Microtissue-Arrays können mehrere hundert mikroskopisch kleine Gewebeschnitte auf einem einzelnen Objektträger aufgebracht und die daran enthaltenen Zellen molekulardiagnostisch in einem Arbeitsschritt analysiert werden. Beispielsweise können so in Zellkernen unter Verwendung geeigneter Mikroskopieverfahren auf einer "Zelle-für Zelle-Basis" diagnostiziert werden: Tumorrelevante spezifische Genomaberrationen, wie z. B. Deletionen, Amplifikationen einzelner Gene oder Genbereiche, oder spezifische Translokationen; Integrationsorte von DNA-Vektoren im Bereich des Gewebe- Engineering; spezifische aktive Gene, z. B. über den Nachweis von Hybridisierungssonden gegen Boten-RNA (m-RNA), oder über geometrische Distanzmessungen zwischen DNA-Sequenzen und Transkriptionsfaktoren und/oder Splicing-Faktoren unter Verwendung von Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM). Bei diesem Verfahren ist eine molekulare Analyse unter gleichzeitiger Markierung mit einer Vielzahl von spektralen Signaturen (Molekulare Multiplex-Diagnostik) auf einer "Zelle-für-Zelle" Basis möglich, insbesondere auch von Zellen in Mikrogewebe-Rasteranordnungen ("Microtissue Arrays"). In Microtissue Arrays sind kleine Zellgruppen Z1, Z2, Z3 . . . ZN von z. B. jeweils einigen hundert Zellen auf einem geeigneten Täger, z. B. einem Mikroskopie-Objektträger, in einem Raster an Stellen z1, z2, z3, . . . zN getrennt voneinander angeordnet, wobei N einen Wert bis zu mehreren hundert bis mehreren tausend annehmen kann.

Die Molekulare Multiplex-Diagnostik stellt eine wichtige Ergänzung dar zu Techniken der Molekularen Genomdiagnostik mit Hilfe von DNA-Microarrays, bei denen eine Zuordnung der diagnostizierten Genominformation im allgemeinen nur für Zellgruppen erfolgt und daher die Einzelzellinformation verloren geht. Grundsätzlich ist diese bei Verwendung von Techniken der Molekularen Genomdiagnostik zwar möglich, jedoch für größere Zahlen von Einzelzellen, z. B. 1000 pro Analyse, wegen des außerordentlichen zusätzlichen Aufwandes impraktikabel.

Die Techniken der Molekularen Genomdiagnostik auf der Grundlage von DNA-Arrays haben vollkommen neue und wichtige Perspektiven der wirtschaftlichen Anwendung der Genomforschung eröffnet. Diese Technologie hat den Vorteil, daß bis zu viele Tausende von Gensequenzen simultan analysiert werden können. Ein fundamentales Problem dieser Methode besteht jedoch darin, daß aufgrund der notwendigen Extraktion der zu untersuchenden Nukleinsäuren aus den Trägerzellen die eindeutige Zuordnung von Sequenzinformation und Einzelzelle (von technisch aufwendigen Ausnahmen abgesehen) nicht mehr erhalten ist. Eine Zuordnung von Sequenzinformation zu den einzelnen, topologisch identifizierten Zellen in einem Gewebeschnitt oder in einem Embryo eines Versuchstieres ist jedoch für zahlreiche Anwendungen von großer Bedeutung. So ist es für die Tumordiagnostik und Tumortherapie von größter Bedeutung, die Anwesenheit von spezifischen Deletionen, Amplifikationen oder Translokationen in einzelnen Zellen im Rahmen des spezifischen Gewebeverbandes zu detektieren. Ein anderes Beispiel ist die Detektion von Integrationsorten von DNA-Vektoren im Gewebe-Engineering, oder die Analyse der Verteilung von spezifischen aktiven Genen in den verschiedenen Zellen eines Gewebes. Diese kann bei wenigen Genen und geeigneter Kopienzahl der RNA über Methoden der in situ Hybridisierung mit entsprechenden RNA-Sonden erfolgen. Für die simultane Untersuchung von einer großen Anzahl von Genen besser geeignet ist folgendes Verfahren:

• 1. Die zu analysierenden Gene werden mithilfe von Fluoreszenz-in situ Hybridisierungs-(FISH)-Sonden mit einer ersten spektralen Signatur, oder einer Kombination von ersten spektralen Signaturen, markiert, die eine zu den jeweiligen Transkriptionsregionen komplementäre Nukleinsäuresequenzen haben; die Markierung kann nach den Prinzipien der Kombinatorik erfolgen, wenn die markierten Genorte in dem zur Analyse verwendeten Mikroskopiesystem noch optisch aufgelöst werden können; d. h. der mittlere Abstand der markierten Genorte voneinander muß größer sein als die Halbwertsbreite ("Full Width at Half Maximum", FWHM) der Punktbildfunktion (PSF) des: verwendeten Mikroskopsystems. Unter "spektraler Signatur" wird jede Art der Markierung verstanden, die eine lichtoptische Identifizierung der markierten Molekülart gestattet, wie zum Beispiel: Art des Absorptions/Fluoreszenzemissionsspektrums; Fluoreszenzlebensdauer; Polarisationseigenschaften; Energietransfereigenschaften; Bleichverhalten; Eigenschäften der stimulierten Emission.
• 2. Transkriptionsfaktoren werden mit einer zweiten "spektralen Signatur" oder einer einer Kombination von zweiten spektralen Signaturen so markiert, daß mit den Verfahren der Spektralen Präzsionsdistanzmikroskopie" eine Distanzmessung bis 10 nm hinunter zu Abständen kleiner/gleich einem bestimmten, biologisch gegebenen Abstand d₀, z. B. 30 Nanometer, zwischen Genort und Transkriptionsfaktor/Splicing Faktor realisiert wird. Hierfür ist es erforderlich, daß bei zu messenden Abständen kleiner als die FWHM des zur Analyse verwendeten optischen Systems die ersten spektralen Signaturen von den zweiten spektralen Signaturen getrennt detektiert werden können.
• 3. Ist der Abstand d zwischen einem bestimmten Genort und einem Transkriptionsfaktor/Splicingfaktor größer als d₀, z. B. größer als 30 Nanometer, so wird das entsprechende Gen als inaktiv klassifiziert; ist der Abstand d kleiner/gleich d₀, so wird das entsprechende Gen als aktiv klassifiziert.

Beispielsweise erlaubt dieses Verfahren bei Verwendung von 10 spektralen Signaturen specs 1, specs 2, . . . specs 10 für die kombinatorische Markierung von Genorten und einer zusätzlichen spektralen Signatur specs 11 für die Markierung eines Transkriptionsfaktors/Splicingfaktor mit bekannter Affinität zu den zu analysierenden Genen die simultane Analyse von bis zu 1023 (2^N - 1) Genen pro Zellkern. Die hierfür erforderliche simultane Markierung mit 11 spektralen Signaturen führt bei einer geeigneten Markierungseffizienz von derzeit beispielsweise 95% in etwa der Hälfte der zu untersuchenden Zellen zu einer Markierung mit allen 11 spektralen Signaturen; die Auflösung (FWHM) zur lichtoptisch getrennten Detektion der Genorte kann durch Verfahren der hochauflösenden dreidimensionalen (3D)-Mikroskopie nach dem Stand der Technik realisiert werden. Für eine große Zahl von gendiagnostischen Untersuchungen ist dies ausreichend; in vielen Fällen wird bereits eine sehr viel geringere Zahl von Genorten für die Analyse genügen. Die Analyse geschieht hier auf einer "Zelle-für-Zelle-Basis", während mithilfe von DNA-Arrays eine "Zelle-für-Zelle"- Diagnostik für größere Zellzahlen ausserordentlich aufwendig wird.

Eine "Zelle-für-Zelle" ("cell-by-cell")-Diagnostik von DNA-Sequenzen wird heute mithilfe von Methoden der Molekularen in situ Markierung erreicht. So können bei Anwendung von Methoden der Multispektralen Fluoreszenz-in situ Hybridisierung (M-FISH) mit Kombination von 10 Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur (statt bisher 6) bereits ca. 1000 (2^N - 1 = 1023) verschiedene DNA-Sequenzen auf einer cell-by-cell Basis in der Metaphase diagnostiziert werden. Dies würde für die verfeinerte Genomdiagnostik vieler pathologischer Zustände einen wesentlichen Fortschritt bedeuten. Da die weitaus meisten Zellen in Geweben jedoch in der Interphase vorliegen, ist es von großer Wichtigkeit für die praktische Anwendung, Multiplex- Techniken der Molekulardiagnostik auf die Diagnose von Zellkernen in Microtissue- Arrays zu übertragen.

Inwieweit eine größere Zahl von Zieltargets, z. B. 10 (markierte DNA-Sequenzen, markierte Transkriptionsfaktoren/Splicingfaktoren) im Zellkern mit Hilfe von Multiplex- Verfahren sicher diagnostiziert werden kann, hängt in entscheidendem Maße ab z. B. von der Art und Effizienz der Markierung;

• - der dreidimensionalen (3D) Struktur des Zellkerns, bei Analysen an lebenden Zellen auch von seiner Dynamik in den zu untersuchenden Zellen;
• - der optischen Auflösung des zur Analyse verwendeten Mikroskopsystems;
• - der Trennschärfe der Detektion der verwendeten spektralen Signaturen;
• - dem Hintergrundsrauschen im Objekt;
• - dem Photonenrauschen der registrierten Photonen;
• - dem Detektorrauschen;
• - der zur Analyse eingesetzten Signalverarbeitungs-Software.

Je größer die Zahl der zu analysierenden Marker wird, desto schwieriger wird die rein empirische Optimierung von Molekularen Multiplex-Diagnostik-Verfahren für spezifische Anforderungen; desto größer werden somit die zur Optimierung erforderlichen Sach- und Arbeitskosten, sowie der benötigte Zeitaufwand für eine Lösung.

Das hier beschriebene Bioinformatik-Verfahren erlaubt die wirtschaftliche Optimierung der Molekularen Multiplex-Diagnostik durch "Virtual Cell Nucleus Imaging" (VIRNI) Simulationen des Prozesses, unter Zugrundelegung der neuesten Daten der dreidimensionalen Humangenomstruktur. Die beanspruchten Schutzrechte beziehen sich auf die kommerzielle Verwertung dieses Verfahrens für die Optimierung von Techniken der Micro-Tissue-Array-Diagnostik. Die wirtschaftliche Verwertung ergibt sich aus dem Verkauf von Information zu Optimierungsstrategien, sowie von Programmpaketen an interessierte Abnehmer, insbesondere im Bereich der Biotechnologie. Das hier beschriebene Verfahren des Virtual Cell Nucleus Imaging (VIRNI) erlaubt es, quantitative Voraussagen über das zu erwartende Potential der Molekularen Multiplex-Diagnostik von Microtissue-Arrays an "realistischen" Computermodellen des Zellkerns berechnen, unter Berücksichtigung der Auflösung des verwendeten Mikroskopsystems, der spektralen Charakteristik der zur Markierung eingesetzten Multiplex-Marker, der Quantenausbeute, der Länge der Zielsequenzen, der spektralen Trennschärfe des Detektorsystems, des Detektorrauschens, der zur automatischen digitalen Bildanalyse verwandten Software, der Kernstruktur der Zellen des zu untersuchenden Gewebes, etc. Damit können Entwicklungszeiten und Entwicklungskosten für die Etablierung von Molekularen Multiplex-Diagnostik- Strategien in Microtissue-Arrays wesentlich gesenkt und so die wirtschaftliche Anwendung erheblich gesteigert werden. Auf der Grundlage experimenteller Vorarbeiten inklusive der Entwicklung/Weiterentwicklung neuer Verfahren der Mikroskopie, der Molekularen Markierung und der digitalen Bildanalyse wurde unter Berücksichtigung der Ergebnisse auch anderer Arbeitsgruppen ein für Virtual Cell Nucleus Imaging geeignetes Computermodell der 3D-Struktur des menschlichen Genoms entwickelt, das den gegenwärtigen Forschungsstand integriert. Die Anwendbarkeit des Modells wurde mit gutem Erfolg an Problemen der Zellkernstruktur und der Strahlenbiologie getestet. Das Modell bietet daher eine gute Ausgangsbasis für die Anwendung des VIRNI-Verfahrens. Beispielsweise ist das Ziel die Abschätzung des mittleren minimalen linearen Abstandes (Basenpaare) zwischen markierten DNA- Sequenzen in menschlichen Zellkernen von 10 Mikrometer Durchmesser für die Realisierung einer kombinatorischen Molekularen Multiplex-Analyse von DNA- Sequenzen bei Verwendung eines konfokalen Laserscanningmikroskopie-Systems mit 250 nm lateraler und 600 nm axialer Auflösung (FWHM). Damit die kombinatorische Multiplexanalyse durchgeführt werden kann, muß der mittlere minimale 3D-Abstand zwischen zwei markierten DNA-Sequenzen im Zellkern größer sein als die Halbwertsbreite (FWHM) des zur Multiplex-Analyse verwendeten optischen Systems. Daher ist es in diesem Beispiel die Aufgabe von VIRNI zu berechnen, bei welchen linearen Abständen (Basenpaare) von Markierungsorten dies für ein bestimmtes zu analysierendes Chromosom oder einen bestimmten zu analysierenden Chromatinbereich der Fall ist. Die erhaltene Information wird nach den Grundsätzen des Verkaufs von biotechnologischer Information an den Interessenten/Auftraggeber weitergegeben.

Die Möglichkeiten der Virtuellen-Zellkern-Abbildungstechnik ("Virtual Cell Nucleus Imaging", VIRNI) werden am folgenden Ausführungsbeispiel des 1-Mbp Chromatin Domain Modells erläutert.

Das Modell

Das "Multi Loop Subkompartiment" (MLS) Modell [Münkel, Ch. & Langowski, J. (1998) Chromosome structure predicted by a polymer model, Phys. Rev. E, 57, 5888-5896] beschreibt die experimentell beobachtete "Foci"-/Domänen-Struktur in menschlichen Zellen [Cremer, T., Kreth, G., Koester, H., Fink, R. H. A., Heintzmann, R., Cremer, M., Solovei, I., Zink, D., Cremer, C. (2000) Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix: an integrated view of the functional nuclear architecture. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, in press; Koss, L. G. (1998) Characteristics of chromosomes in polarized normal human bronchial cells provide a blueprint for nuclear organization, Cytogenet. Cell Genet., 82, 230-237; Croft, J. A., Bridger, J. M., Boyle, S., Perry, P., Teague, P., Bickmore, W. A. (1999) Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus, J. of Cell Biology, 145, 1119-1131; Sun, H. B., Shen, J., Yokota, H. (2000) Size-dependent positioning ofhuman chromosomes in interphase nuclei, Bioph. J., 79, 184-190; v. Hase, J. (2000) Quantitative Bildanalyse der DNA-Verteilung spezifischer Chromosomenterritorien im Zellkern, Diploma Thesis, University of Heidelberg; Robinett, C. C., Straight, A., Li, G., Willhelm, C., Sudlow, G., Murray, A., Belmont, A. S. (1996) In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition, J. Cell Biol., 135, 1685-700; Zink, D., Cremer, T. (1998a) Chromosome dynamics in nuclei of living cells, Curr. Biol. 8, R321-324; Zink, D., Cremer, T., Saffrich, R., Fischer, R., Trendelenburg, M. F., Ansorge, W., Stelzer, E. H. (1998b) Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo, Hum. Genet. 102, 241-51; Sadoni, N., Langer, S., Fauth, C., Bernardi, G., Cremer, T., Turner, B. M., Zink, D. (1999) Nuclear organization of mammalian genomes. Polar chromosome territories build up functionally distinct higher order compartments, J. Cell Biol. 146, 1211-26; Bornfleth, H., Edelmann, P., Zink, D., Cremer, T., Cremer, C. (1999) Quantitative motion analysis of sub-chromosomal foci in living cells using four-dimensional microscopy, Biophys. J., 77, 2871-2886] durch zehn 100-Kilobasenpaare (kbp) langen "Schleifen" (100 ps), die Rosetten bilden. Benachbarte Rosetten werden durch ein Stück Chromatinfaser verbunden, dessen DNA Gehalt demjenigen einer "Schleife" entspricht. Zunm ersten Male erlaubte dieses Modell die Bestimmung quantitativer Kernstrukturparameter und den Vergleich dieser mit beobachteten Messungen. Beispielsweise waren dreidimensionale (3D) Messungen in guter Übereinstimmung mit experimentellen daten, die für "Territorien" von Chromosom 15 im Zellkern bestimmt worden waren [Münkel, Ch., Eils, R., Dietzel, S., Zink, D., Mehring, C., Wedemann, G., Cremer, T., Langowski, J. (1999) Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment, J. Mol. Biol. 285, 1053-1065], wobei jedoch nur Probleme der reinen Grundlagenforschung dargestellt wurden.

Um den gegenwärtigen Mangel an Wissen in Bezug auf die detaillierte Ultrastruktur der 1-Mbp Chromatin Domänen zu berücksichtigen, und um den beim MLS-Modell erforderlichen hohen Aufwand an Rechenzeit für die Simulation von Zellkernen mit dem vollständigen Satz der Chromosomen des menschlichen Genoms zu reduzieren, wurde im Forschungsbereich von Prof C. Cremer das "Spherical 1-Mbp Chromatin Domain" (SCD) Modell von Gregor Kreth entwickelt [Cremer, T., Kreth, G., Koester, H., Fink, R. H. A., Heintzmann, R., Cremer, M., Solovei, I., Zink, D., Cremer, C. (2000) Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix: an integrated view of the functional nuclear architecture. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, in press; Kreth, G., Edelmann, P., Münkel, Ch., Langowski, J., Cremer, C. (2000) Translocation frequencies for X and Y chromosomes predicted by computer simulations of nuclear structure, Chromosome Structure and Function, in press; Kreth, G., Edelmann, P., Cremer, C. (2000) Towards a dynamical approach for the simulation of large scale, cancer correlated chromatin structures, Marcello Malpighi Symposia Series, in press]. Dieses Modell ersetzt die Rosetten des MLS Modells durch einhüllende Kugeln ("spheres") von 500 nm Durchmesser, die jeweils einen angenommenen Gehalt von 1-Mbp DNA umfassen. Andere Ausführungsformen des Modells lassen zu: andere angenommene DNA-Gehalte und Durchmesser; andere Längen der Chromatinverbindungsstücke, vom normalen Chromosomensatz des Menschen abweichende Anzahlen von Chromosomen und anggenommenen DNA- Gehalte dieser Chromosomen; Chromosmensätze anderer Spezies, wie z. B. Ratte, Maus, Schwein. Im gegenwärtigen Zustand wurden für das SCD Modell drei verschiedene Simulationsmethoden implementiert, die entsprechend der beabsichtigten Applikation verschiedene "Realitätsebenen" zu simulieren erlauben (Alle bisher erfolgten Veröffentlichungen beziehen sich auf Fragen der Grundlagenforschung, nicht auf die hier vorgesehenen Anwendungen):

1) Statische Modellierung

In der "statischen" Methode wird ein Selbsvermeidungsweg ("Biased Selfavoiding Walk" Algorithmus angewandt, der es erlaubt, statistisch unabhängige Konfigurationen von ganzen Zellkernen entsprechend dem SCD-Modell zu generieren. Für diese Prozedur wird jedes Chromosom durch eine lineare Kette von 1-Mbp Domänen und vier 300 nm (Nanometer) lange Verbindungs-("linker")Elemente angenähert, mit einer Gesamt- Konturlänge von 4 × 300 nm. Die Anzahl der 1-Mbp Domänen wird dabei entsprechend dem DNA Gehalt des betreffenden spezifischen Chromosoms gewählt. Die Ketten aller Chromosomen werden zusammen wachsen gelassen unter Berücksichtigung der Ausschlußvolumen ("excluded volume") Interaktion der 1-Mbp Domänen und einer zusätzlichen TensegritätsKraft ("tensegrity force") Wechselwirkung; diese ist dadurch bestimmt, daß sie in dem Modell eine Kompaktierung der Chromosomen-Ketten in Chromosomenterritorien bewirkt; d. h. das einhüllende Volumen einer solchen Chromosomenkette [Eils R., S. Dietzel, E. Bertin, M. Granzow, E. Schröck, M. R.. Speicher, T. Ried, M. Robert-Nicoud, C. Cremer, T. Cremer (1996): Three-dimensional reconstruction of Painted human interphase chromosomes: Active and inactive X chromosome territories have similar volumes but differ in shape and surface structure. J. Cell Biology 135: 1427-1440] nimmt nur einen relativ kleinen Teil des Zellkerns ein. Die Rechenzeit eine Modellkern-Konfiguration auf einer Standard Intel Pentium Maschine erfordert nur etwa 1.5 Minuten. Durch Parallelisierung der Rechenaufgabe können somit pro Arbeitsstunde bis zu mehrere tausend Kernkonfgurationen dieses Typs berechnet werden. Eine einfache und anwendbare Form der Parallelisierung besteht beispielsweise darin, das gleiche Modellierungsprogramm statt auf einem Prozessor parallel auf vielen, z. B. 100 Prozessoren, laufen zu lassen. Auf die erhaltenen Kernkonfigurationen wurden Verfahren der Virtuellen Mikroskopie ("Virtual Microscopy" angewandt [Kreth, G., Edelmann, P., Münkel, Ch., Langowski, J., Cremer, C. (2000) Translocation frequencies for X and Y chromosomes predicted by computer simulations of nuclear structure, Chromosome Structure and Function, in press; Kreth, G., Edelmann, P., Cremer, C. (2000) Towards a dynamical approach for the simulation of large scale, cancer correlated chromatin structures, Marcello Malpighi Symposia Series, in press].

Die Virtuelle Mikroskopie beruht darauf, daß nach den bekannten Prinzipien der Entstehung von Fluoreszenzbildern der berechnete Modelldatensatz der Punktbildfunktion des zu simulierenden optischen Systems gefaltet wird, wobei ggf. noch geeignete Rauschparameter wie z. B. Photonenrauschen oder Kamerarauschen berücksichtigt werden werden, oder monochromatische oder chromatische Aberrationen des Optischen Systems sowie seine Vergößerungsfaktoren in die Rechnungen einbezogen werden können. Die so erhaltenen Mikroskopbilder können einer Analyse mithilfe von digitalen Bildauswertungsalgorithmen in der gleichen Weise unterworfen werden, als ob es sich um reelle mikroskopische Fluoreszenzbilder handeln würde, die als digitale Datensätze vorliegen Bei den im Ausführungsbeispiel verwandten Algorithmen konnte die pro Kernkonfiguration aufgewandte Bearbeitungszeit ebenfalls gering gehalten werden. Parallelisierung der Evaluierungsaufgabe ermöglicht die Berechnung hunderter bis tausender von Kernkonfigurationen und ihre Bildverarbeitung unter konkreten Annahmen der mikroskopischen Bildgebung in erfindungsrelevant kurzer Zeit. Durch Änderung der Modellierungsbedingungen können z. B. die räumliche Verteilung und die Morphologie der Chromosomen im Modellkern, die Art und Verteilung der Markierung auf den Chromosomenterritorien vorgegeben, sowie andere in Bezug auf die Analyse interessierende geometrische Parameter eingegeben und ihre Wirkung bei der Analyse der erhaltenen virtuell mikroskopischen Datensätze mit bestimmten Algorithmen geprüft werden.

2) Relaxations-Modellierung

Bei dem "Relaxationsverfahren" [Kreth, G., Edelmann, P., Cremer, C. (2000) Towards a dynamical approach for the simulation of large scale, cancer correlated chromatin structures, Marcello Malpighi Symposia Series, in press; Einzelheiten zum Zeitpunkt der Einreichung der Schutzrechteanmeldung noch nicht publiziert] werden zum Beispiel, beginnend von einer Startkonfiguration, die z. B. aus Ketten spärischer 1-Mbp Domänen von 500 nm Durchmesser bestehenden Modell-Chromosomen in einem Gleichgewichtszustand nahe des globalen Energieminimums nach Monte-Carlo- Methoden relaxiert. Zwischen benachbarten Domänen wird ein entropisches Federpotential so eingestellt, daß ein Gleichgewichtsabstand von 600 nm zwischen den Mittelpunkten der benachbarten sphärischen Domänen erreicht wird. Die Interaktion zwischen den 1-Mbp Domänen wird durch ein repulsives, abstandsabhängiges Potential erreicht, das z. B. eine Halbwertsbreite von 250 nm besitzt. Um die Kompaktierung der Modellchromosomenterritorien zu gewährleisten, wird wiederum ein "Tensegritätspotential" eingeführt. Dieses ist beispielsweise durch ein schwaches sphärisches Potential realisiert, das jedes der Modellchromosomenterritorien einhüllt, dergestalt, daß sein Volumen (bis zu einem bestimmten Schwellwert) dem relativen DNA-Gehalt des zu modellierenden Chromosomenterritoriums entspricht. Diese Methode erfüllt die Bedingung, daß die Domänen Selbstvermeidungseigenschaften zeigen.

Das Verfahren erlaubt es, in Modellkernen beliebige dreidimensionale Distanzen bzw. zweidimensionale Projektionen zwischen beliebigen Domänen beliebiger Modellchromosomenterritorien zu berechnen; in Verbindung mit den oben beschriebenen Verfahren der Virtuellen Mikroskopie ist es möglich, die aufgrund eines bestimmten Mikroskopie und eines bestimmten Markierungsverfahrens zu erwartenden Distanzen in Epifluoreszenzanordnungen, konfalen Laserrasteranordnungen, oder irgendwelchen anderen Mikroskopieverfahren zu bestimmen, sowie die dabei auftretenden Fehler der Objekterkennung, Positionsbestimmung und Distanzbestimmung abzuschätzen. Die konkrete Brauchbarkeit des Modells auch bei komplexen Vorhersagen wurde z. B. bei einem Problem der experimentellen Tumorforschung [Kienle, D., Solovei, I., Little, G., Eils, R., Savelyeva, L., Schwab, M., Cremer, C., Jäger, W., Cremer, T. (2000) Topology of tumor specific chromatin structures in neuroblastoma cell nuclei, Genes, Chromosomes and Cancer, in press] bestätigt.

3) Brownsch'sche Dynamik-Modellierung

Für weiter verfeinerte Vorhersagen ist es möglich, auch Techniken der Brown'schen Dynamik einzusetzen. Im Gegensatz zu den oben dargestellten statischen Modellen und den Monte Carlo Methoden erlauben diese es, geometrische Parameter der Modellchromosomen als Funktion der Zeit zu berechnen. Dies ist insbesondere dann wichtig, wenn z. B. Konsequenzen solcher Prozesse auf die lichtmikroskopisch detektierbare Kernstruktur modelliert werden sollen, die mit einer Veränderung dynamischer Parameter korreliert sind, wie z. B. der Einfluß von Pharmaka auf die Beweglichkeit von Chromosomenterritorien und Untereinheiten von diesen; auf die Aktivierung (Dekondensationsprozesse im Chromatin) oder Inaktivierung (Kondensationsprozesse im Chromatin); auf die Diffusion/Beweglichkeit von Proteinen/Proteinkomplexen; auf die Induktion von Vorgängen des programmierten Zelltods (Apoptose) usw. In dem Ausführungsbeispiel (Einzelheiten vor der Einreichung dieser Schutzrechteanmeldung nicht publiziert) wird der Algoritmus von Ermak et al. [Ermak, D., McCammon, J. (1978) Brownian dynamics with hydrodynamic interactions, J. Chem. Phys., 69, 1352-1360] unter Verzicht auf Berücksichtigung nicht-linearer hydrodynamischer Einflüsse der Hydrodynamik benutzt. Dieser Verzicht führt zu einer scheinbaren starken Beschleunigung der dynamischen Vorgänge im Zellkern, erlaubt jedoch eine fortgeschrittene relative zeitliche Skalierung. Die Durchführung des Verfahrens benötigt für die Berechnung einer Zeitserie von etwa 3 Millionen Zeitschritten auf einem Standard Intel Prozessor etwa einen Tag: Unter Zugrundlegung von Parallelisierung (z. B. 100-1000 Prozessoren) können pro Tag auch hier noch etwa 100-1000 dynamische Kernmodelle mit dieser Schrittzahl berechnet werden. Da derartige Hochleistungsrechensysteme noch für vielfältige andere Aufgaben im Bereich der Biotechnologie benötigt werden, sind solche Modellrechnungen auch öknomisch vertretbar.

Modellierung des Einflusses der makroskopischen Kernstruktur auf die Mikro/Nanostruktur des Chromatins

Einfache theoretische Überlegungen zeigen, daß Veränderung der "makroskopischen" (typischer Größenbereich: Mikrometer) Kernstruktur ("Large Scale Nuclear Structure") einen Einfluß auf die biotechnologisch relevante Mikro/Nanostruktur des Chromatins haben können. Wird eine durch Tensegrität (s. oben) bestimmte Struktur einem äußeren Druck ausgesetzt, so ändern sich die Mikrobeziehungen in dieser Struktur in einem Skalenbereich, der wesentlich kleiner ist als die Abmessungen des Gesamtsystems. Bezogen auf die Kernstruktur, könnte sich z. B. die Zugänglichkeit bestimmter, genetisch bedeutsamer Stellen des Chromatins wie von Transkriptionsfaktorbindungsstellen für Multiproteinkomplexe der Transkription wesentlich ändern; damit könnte die genetische Aktivität bestimmter Gene erheblich beeinflußt werden. Die dynamische Modellierung von Kernmodellen und ihre Anwendung in Virtuellen Mikroskopieevaluationen erlaubt eine bessere Abschätzung der zu erwartenden, lichtmikroskopisch diagnostizierbaren Wirkungen.

Die Virtuelle-Zellkern-Abbildungstechnik ("Virtual Cell Nucleus Imaging", VIRNI)

Um die erfindungsgemäße Modellierung der kombinierten Wirkungen eines gegebenen optischen Abbildungssystems und Bildverarbeitungssystems zu erreichen, werden die Computermodellierungen des Zellkerns mit Verfahren der Virtuellen Mikroskpie verbunden (Zum allgemeinen Verfahren der Virtuellen Mikroskopie siehe oben). Erfindungswesentlich ist die Verbindung von Verfahren der Computermodellierung von Zellkernstrukturen zum Zwecke der Berechnung von optimalen Markierungsstrategien in der Zellkerndiagnostik. Alle Modifikationen an der Zellkernmodellierung sind erfindungsgemäß, soweit sie diesem technischen Ziel dienen. Dieses erfindungsgemäße Verfahren wird abkürzend als Virtuelle-Zellkern-Abbildungstechnik ("Virtual Cell Nucleus Imaging" VIRNI) bezeichnet.

Beispiele für optische Systeme, bei denen das VIRNI-Verfahren von Interesse ist, beinhalten

• - Epifluoreszenzmikroskope unter Verwendung von Objektiven einer gegebenen Numerischen Apertur, gegebenen Zwischenvergrößerungen, sowie mit gegebenen Charakteristiken monochromatischer und chromatischer Aberrationen;
• - Konfokale Laser-Rastermikroskope (confocal laser scanning microscopes, CLSM) mit gegebenen Charakteristiken von monochromatischen und chromatischen Aberrationen;
• - Optischen Anordnungen nach den Prinzipien des "Point Spread Function Engineering", wie z. B. 4Pi-Mikroskope, STED ("Stimulated EmissionDepletion") Mikroskope, SMI ("Spatially Modulated Illumination") Mikroskope, mit einer gegebenen Charakteristik von monochromatischen und chromatischen Aberrationen.

Um Rauschbedingungen zu simulieren, kann zu den gefalteten Bildern ein geeignetes Rauschen addiert werden, wie z. B. Poisson Rauschen zur Simulation der Auswirkungen der Statistik der registrierten Fluoreszenzphotonen, oder das Ausleserauschen des Detektorsystems; zufällig oder nach anderen Statistiken verteilte Objekte einer gegebenen Größe, spektralen Signatur und Intensität können den Modellberechnungen vor der Faltung hinzugefügt werden, um das Objektbedingte Hintergrundsrauschen zu simulieren, das zum Beispiel durch suboptimale Markierungsbedingungen, wie unzureichende Spezifität der verwendeten Markierungstechniken, kleinere Bindungsstellen usw. entsteht. Die erfindungsgemäße Anwendung von VIRNI erlaubt es ferner, die bei der Kalibrierung monochromatischer und chromatischer Aberrationen auftretenden Fehler in den virtuellen Abbildungsprozess einzubeziehen. Ist beispielsweise durch Messungen die statistische Verteilung dieser Fehler bekannt [P. Edelmann, A. Esa, M. Hausmann, C. Cremer (1999): Confocal laser scanning micro-scopy: In situ determination of the confocal point-spread function and the chromatic shifts in intact cell nuclei. Optik 110: 194-198], so können nach bekannten Verfahren die durch diese Fehlerverteilung bewirkten zufälligen Verschiebungen der durch den Abbildungsprozess in der Bildebene des Optischen Detektorsystems erzeugten Intensitätsverteilungen simuliert werden. Eine weitere Erfindungswesentliche Eigenschaft von VIRNI ist es, daß die Wirkung einer bestimmten Bildverarbeitungs-Software, insbesondere einer automatischen, auf das Ergebnis der Auswertung von Zellkernbildern nach gegebenen Markierungs- und Abbildungsbedingungen simuliert werden kann. Das Ergebnis kann unmittelbar mit den für den VIRNI-Prozess verwandten Modellierungsdaten vor dem virtuellen Abbildungsprozess verglichen und so die Zuverlässigkeit des Algorithmus in objektiver Weise getestet werden. Voraussagen von erwarteten geometrischen Parametern ("Expected Geometrical Features, EGF) Verschiedene Entwicklungen in den letzten Jahren, sowohl auf der experimentellen wie auf der theoretischen Seite, unterstützen eine hochorganisierte Organisation des menschlichen Genoms im Zellkern (Zusammenfassung des Standes der Technik: Cremer, T., Kreth, G., Koester, H., Fink, R. H. A., Heintzmann, R., Cremer, M., Solovei, I., Zink, D., Cremer, C. (2000) Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix: an integrated view of the functional nuclear architecture. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, in press). Unter Verwendung der o. g. Kerngenom- Modellierungsverfahren in erfindungswesentlicher Einbindung in VIRNI können Voraussagen über lichtoptisch, mit Hilfe von Multiplex-Abbildungsverfahren ("Multiplex- Imaging") beobachtbare erwartete geometrische Parameter (EGF) der "Large Scale" Kerngenomstruktur gewonnen werden. Die EGFs beinhalten beispielsweise:

• - 3D-DNA-Verteilung spezifischer Chromosomenterritorien in fxierten menschlichen Zellkernen oder Zellkernen anderer Spezies; 3D-Morphologie spezifischer Chromosomenterritoreien (z. B. Rundheit, Glattheit, "smoothness", einhüllende Oberfläche und Volumen) von spezifischen Chromosomenterritorien in fixierten Zellkernen;
• - 3D-Distanzen zwischen den Schwerpunkten gegebener Chromosomenteritorien;
• - 3D-Abstände oder ihre 2D-Projektionen zwischen gegebenen einzelnen DNA- Sequenzen, wie z. B. einzelnen kurzen Abschnitten von individuellen Genen, die sich an gegebenen Stellen in gegebenen Chromosomenterritorien befinden, oder zwischen solchen Sequenzen und bestimmten einzelnen Proteinen, Proteinkomplexen, sowie Nukleinsäure-Proteinkomplexen;
• - 3D-Distanzen oder ihre 2D-Projektionen zwischen repetitven Sequenzen, wie z. B. Zentromeren, Telomeren in fixierten Zellkernen;
• - 4D-Bewegungen (3D-Positionen in Abhängigkeit von der Zeit) von individuellen Chromosomenterritorien, Chromosomarmterritorien, Chromosom-Banden-Domänen, wie z. B. R- und G-banden Domänen, einzelnen 1-Mbp-Domänen, oder irgendwelchen anderen Domänen; 4D-Bewegungen von irgendwelchen DNA-Sequenzen, Proteinen, Proteinkomplexen, sowie Nukleinsäure-Proteinkomplexen [Marshall, W. F., Straight, A., Marko, J. F., Swedlow, J., Dernburg, A., Belmont, A., Murray, A. W., Agard, D. A., Sedat, J. W. (1997) Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells, Curr. Biol., 7, 930-939];
• - Abhängigkeiten von bestimmten Pharmaka; deren Wirkung auf die EGF kann beispielsweise simuliert werden durch bekannte oder vermutete Wirkungen auf die Apparente Viskosität des Zellkerns, der Tensegritätskräfte, der Domänengröße, der Rigidität der die Domänen verbindenden Chromatinfaserstücke ("Linker"), usw.

Alle oder einzelne dieser Parameter können den 3D-Abstand bzw. den projizierten 2D- Abstand zwischen gegebenen Sätzen von DNA-Sequenzen in den Chromosomenterritorien der zu analysierenden Zellkerne wesentlich beeinflussen; Wegen der beschränkten Auflösung lichtoptischer Beobachtungssysteme kann eine diagnostisch relevante Trennung der Signale von benachbarten, mit derselben spektralen Signatur markierten DNA Sequenzen oder anderen markierten Einheiten nur dan erfolgen, wenn die Auflösung des verwendeten optischen Systems bestimmte Kriterien erfüllt (H. Bornfleth, K. Sätzler, R. Eils, C. Cremer (1998): High precision distance measurements and volume-conserving segmentation of objects near and below the resolution limit in three-dimensional confocal fluorescence microscopy. J. Microscopy 189: 118-136; R. Heintzmann, G. Kreth, C. Cremer (2000) Reconstruction of axial tomographic high resolution data from confocal fluorescence microscopy. A method for improving 3D FISH images. Analytical Cellular Pathology 20: 7-15]. Durch geeignete Variation der virtuellen Markierungsbedingungen können bei der erfindungsgemäßen Anwendung des beschriebenen Verfahrens die bei einer gestellten Aufgabe optimalen Lösungsstrategien (z. B. Markierung, Mikroskopieverfahren, Bildanalyseverfahren) rechnerisch vorhergesagt werden.

Eine erfindungsgemäße wesentliche Anwendung von VIRNI ist die Voraussage optimaler Markierungsstrategien für die Multiplex-Diagnostik der Aktivität/Inaktivität von spezifischen Genen auf dem Niveau einzelner Zellen. Dies ist möglich, da aktive bzw. inaktive Gene eine verschiedene Faltung des Chromatins (DNA-Sequenz plus zugehörige, faltungsrelevante Proteine, insbesondere Histone) zeigen; ausserdem zeichnen sich aktive bzw. inaktive Gene durch verschiedene Distanzverteilungen zu Transkriptionsrelevanten Biostrukturen aus, wie z. B. Transkriptionsfaktorkomplexen, oder Komplexen des RNA-Processing ("Splicing")

[T. Cremer, G. Kreth, H. Koester, R. H. A. Fink, R. Heintzmann, M. Cremer, I. Solovei, D. Zink, C. Cremer (2000) Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix: An integrated view of the functional nuclear architecture. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, in press]. In den folgenden Beispielen wird eine solche Anwendung wie folgt durchgeführt:

Beispiel 1

Die Aktivität/Inaktivität von Genen G1, G2, G3 . . . an bestimmten Positionen (Genorten S1, S2, S3, . . . in den zu analysierenden Zellkernen soll aufgrund ihrer Chromatinfaltung untersucht werden.

Dabei wird mit VIRNI folgender Prozess simuliert:

Verfahrensschritt 1

Markierung einer Genregion G1, G2, G3, . . . mit einem Satz von DNA- sequenzspezifischen DNA Proben (markierte Nukleinsäuresequenzen mit Bindungsspezifität für bestimmte DNA-Abschnitte) p1.1, p1.2, p1.3 . . . für bestimmte DNA-Abschnitte in G1; p2.1, p2.2, p2.3, . . . für bestimmte DNA-Abschnitte in G2, usw., mit jeweils bestimmten spektralen Signaturen. Die spektralen Signaturen werden so gewählt, daß sie mit einem gegebenen lichtoptischen Detektionsverfahren getrennt voneinander registriert werden können und die geometrische Position der lichtemittierenden Moleküle eindeutig im Rahmen bestimmter Fehlergrenzen den Positionen der Bindung von p1.1, p1.2, . . . p2.1, p2.2, . . . p1.k in den Genregionen G1, G2, . . . zugeordnet werden kann.

Verfahrensschritt 2

Unter Anwendung der bekannten Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) oder anderer Verfahren, die auf der Ausnutzung der spektralen Diskriminierung beruhen [Burns DH, Callis JB, Christian GD, Davidson ER (1985) Appl. Optics 24: 154-161; C. Cremer, M. Hausmann, J. Bradl, B. Rinke (1996) Verfahren zur multispektralen Präzisionsdistanzmessung in biologischen Mikroobjekten; Deutsches Patentamt, DE 196 54 824.1; Bornfleth, H., Sätzler, K., Eils, R., Cremer, C. (1998) High precision distance measurements and volume-conserving segmentation of objects near and below the resolution limit in three-dimensional confocal fluorescence microscopy, J. Microscopy, 189: 118-136; C. Cremer, J. Rauch, P. Edelmann, H. Bornfleth, B. Schneider, I. Upmann, J. Bradl, S. Dietzel, I. Solovei, T. A. Knoch, J. Langowski, T: Cremer & M. Hausmann (1998): Spectral Precision Distance Measurements by Confocal Laser Scanning and SME-Microscopy for 3D Ge­ nome Analysis, in: Progress Report 1996-1998, German Human Genome Project, 91- 95; A. M. von Oijen, J. Köhler, J. Schmidt, M. Müller, G. J. Brakenhoff (1998) Chem. Phys. Lett 292: 183-187; C. Cremer, P. Edelmann, A. Esa, H. Bornfleth, B. Schneider, J. Bradl, B. Rinke, L. Trakhtenbrot, S. Dietzel, M. Hausmann, T. Cremer (1999): Spektrale Präzisionsdistanzmikroskopie in der Genomforschung. Z. Med. Physik 9: 14- 20; C. Cremer, P. Edelmann, H. Bornfleth, G. Kreth, H. Muench, H. Luz, M. Hausmann (1999): Principles of Spectral Precision Distance confocal microscopy for the analysis of molecular nuclear structure. In: Handbook of Computer Vision and Applications (ed. B. Jähne, H. Haußecker, P. Geißler), Ch. 41., Vol. 3, Academic Press San Diego, New York: 839-857; Hausmann, M, Cremer C, Bradl J, Schneider B (1999) Wellenfeldmikroskop, Wellenfeldmikroskopieverfahren, auch zur DNA-Sequenzierung, und Kalibrierverfahren für die Wellenfeldmikroskopie, Offenlegungsschrift Deutsches Patentamt DE 198 30 596 A1; B. Schneider, I. Upmann, I. Kirsten, J. Bradl, M. Hausmann, C. Cremer (1999): A dual-laser, spatially modufated illumination fluorescence microscope. Microsc. & Anal. 57(1/99): 5-7. M. Hausmann, A. Esa, P. Edelmann, L. Trakhtenbrot, H. Bornfleth, B. Schneider, J. Bradl, I. Ben-Bassat, G. Rechavi, C. Cremer (1999): Advanced precision light microscopy for the analysis of 3D- nanostructures of chromatin breakpoint regions: Towards a structure-function relationship of the BCR-ABL region. NATO ASI Series (Editor: G. Horneck), Vol. 55, Kluwer Academic Publ., Dordrecht: 219-230. P. Edelmann, A. Esa, H. Bornfleth, R. Heintzmann, M. Hausmann, C. Cremer (1999): Correlation of chromatic shifts and focal depth in Spectral Precision Distance microscopy measured by micro axial tomography. Proc. SPIE 3568: 89-95; P. Edelmann, A. Esa, M. Hausmann, C. Cremer (1999): Confocal laser scanning micro-scopy: In situ determination of the confocal point-spread function and the chromatic shifts in intact cell nuclei. Optik 110: 194-198; S. Dietzel, K. Schiebel, G. Little, P. Edelmann, G. A. Rappold, R. Eils, C. Cremer & T. Cremer (1999): The 3D Positioning of ANT2 and ANT3 genes within female X-chromosome territories correlates with gene activity. Exp. Cell Res. 252: 363-375; A. Esa, P. Edelmann, L. Trakthenbrot, N. Amariglio, G. Rechavi, M. Hausmann, C. Cremer (2000) 3D-spectral precision distance microscopy (SPDM) of chromatin nanostructures after triple-colour labeling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J. Microscopy 199: 96-105; P. Edelmann, C. Cremer (2000) Improvement of confocal spectral precision distance microscopy (SPDM). Optical Diagnostics of Living Cells III. SPIE 3921: 313-320; Lacoste TD, Michalet X, Pinaud F, Chemla DS, Alivisatos AP, Weiss S (2000) Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 9461-9466; ] wird die Faltungstopologie bestimmt. Unter Topologie werden hier die relative Position und Abstandsverteilung der markierten DNA-Sequenzen der Genregionen G1, G2, G3 . . . verstanden.

Der gesamte Vorgang wird mit VIRNI nach den oben beschriebenen Verfahren simuliert. Dabei wird ggfs. das Zellkernmodell so erweitert, daß bestimmte Annahmen über die Mikro/Nanostruktur des Chromatins in den 1-Mbp Domänen (oder anderen modellierten Untereinheiten des Zellkerngenoms) [T. Cremer, G: Kreth, H. Koester, R. H. A. Fink, R. Heintzmann, M. Cremer, I. Solovei, D. Zink, C. Cremer (2000) Chromosome territories, interchromatin domain compartment and nuclear matrix: An integrated view of the functional nuclear architecture. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, in press] in die Modellierung einbezogen werden. Im einzelnen handelt es sich um folgende wesentlichen Schritte:

• - Modellierung der "Large Scale" Struktur (typische Dimension im Mikrometerbereich) der zu analysierenden Modellzellkerne, z. B. unter Verwendung von spärischen 1-Mbp Domänen mit 500 nm Durchmesser;
• - Modellierung der Mikro/Nanostruktur der 1-Mbp Domänen, in denen angenommen wird, daß die DNA-Sequenz der Genbereiche G1, G2, G3, . . . an Stellen markiert ist, die der Bindungsspezifität von Proben p1.1, p1.2, . . . pi.k. entspricht;
• - Modellierung der spektralen Markierungen an den vorstehend genannten Markierungsstellen, beispielsweise durch Annahme einers bestimmten von p1.1, p1.2, pi.k . . . emittierten Spektrums mit bestimmten Eigenschaften, wie Emissionswellenlänge, Fluoreszenzlebensdauer etc.
• - Modellierung der mikroskopischen Abbildung des zur Analyse angewandten optishen Detektorsystems;
• - Modellierung der spektral selektiven Bildregistrierung, unter Berücksichtigung der spektralen Signatur, z. B. Absorptions/Emissionswellenlängen; Fluoreszenzlebensdauern, Energietransfereigenschaften; Polsarisationseigenschaften, usw., sowie der Fehler, die bei der Zuordnung bestimmter Signale zu bestimmten spektralen Signaturen entstehen;
• - Modellierung des Rauschverhaltens, z. B. aufgrund von Photonenrauschen, Kamerarauschen etc.;
• - Modellierung der Kalibrierung von monochromatischen und optischen Aberrationen nach den Prinzipien der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) bzw. verwandter Verfahren unter Berücksichtigung von Meßfehlern in der selektiven Zurodnung von bestimmten lichtoptischen Signalen zu bestimmten spektralen Signaturen, usw. Solche Unsicherheiten können beispielsweise dadurch modelliert werden, daß die bildseitigen Modellintensitätsverteilungen nach der Faltung nach einer statistischen Regel um einen an der Verteilung der Meßfehler orientierten Betrag verschoben werden;
• - Anwendung von Bildauswertungsprogrammen für die erhaltenen Datensätze;
• - Vergleich der auf diese Weise erhaltenen Positionen und Abstandsverteilungen für die von p1.1, p1.2, . . . pi.k markierten Positionen mit den im Modell vor dem Virtuellen Mikroskopieprozess erhaltenen Werten;
• - Variation der Annahmen über Art und Verteilung der zur Markierung verwandten Fluorochrome, über Eigenschaften des lichtoptisches Detektorsystems, der Kalibrierungsstrategie, der Eigenschaften der Auswertungssoftware, wie z. B. Segmentierungsstrategien, Schwellwertsetzung etc.;
• - Ermittlung optimaler Analyseparameter, auch unter Berücksichtigung ökonomisch wirksamer Größen, wie z. B. Ersatz eines konfokalen Laserastermikroskopieverfahrens durch ein Epifluoreszenzverfahren; kostengünstigere Fluorochrome, schnellere Auswertungsalgorithmen, etc.

Beispiel 2

Die Aktivität/Inaktivität von Genen G1, G2, G3 . . . an bestimmten Positionen (Genorten S1, S2, S3, . . .) in den zu analysierenden Zellkernen soll aufgrund ihrer Lagebeziehungen zu bestimmten für Transkription/Splicing wichtigen Komplexen analysiert werden.

Analytischer Verfahrensschritt 1

Markierung von G1, G2, G3, . . . mit spektralen Signaturen g1 für G1, g2 für G2, . . .; g1, g2, g3, . . . wird jeweils mit einem einzelnen Fluorochrom oder einer Kombination realisiert; der Abstand von S1, S2, . . . wird so gewählt, daß mit dem verwendeten lichtoptischen Detektorsystem eine eindeutige Zuordnung der spektralen Signaturen bzw. ihrer für G1, G2, G3 spezifischen Kombinationen zu den Positionen S1, S2, S3, . . . möglich ist;

Analytischer Verfahrensschritt 2

Markierung eines oder mehrerer Transkriptionsfaktoren, Transkriptionsfaktorkomplexe, oder Splicingkomplexe T1, T2, T3, . . ., deren Relevanz zur Genaktivität von G1, G2, G3; bekannt ist, mit spektralen Signaturen t1, t2, t3. Die Markierung erfolgt so, mit dem verwendeten lichtoptischen Detektorsystem eine eindeutige Zuordnung der spektralen Signaturen t1, t2, t3 zu den Positionen der Splicingkomplexe T1, T2, T3 in Anwesenheit der markierten Genbereiche G1, G2, G3 . . . möglich ist.

Analytischer Verfahrensschritt 3

Bestimmung der Positionen und Distanzen von T1, T2, T3, . . . zu S1, S2, S3 . . . mithilfe von Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) oder anderer Verfahren der spektralen Diskriminierung.

Beispielsweise befindet sich ein mit einer spektralen Signatur g1 markierter transkriptionsrelevanter Abschnitt eines aktiven Gens G1 an einer räumlichen Stelle S1 in der unmittelbaren Nachbarschaft eines mit einer spektralen Signaur t1 markierten Transkriptionsfaktorkomplexes T1 mit einem Durchmesser von 30 nm, wobei der geometrische Abstand zwischen den Fluoreszenzintensitätsschwerpunkten (Baryzentren) von S1 und T1 30 nm beträgt; ein mit einer spektralen Signatur g2 markierter transkriptionsrelevanter Abschnitt eines inaktiven Gens G2 an einer Stelle S2 befindet sich in ebenfalls in der Nachbarschaft des Transkriptionsfaktorkomplexes T1 oder eines anderen, mit einer spektralen Signatur t2 markierten Transkriptionsfaktorkomplexes T2, wobei der Abstand zwischen den Fluoreszenzintensitätsschwerpunkten (Baryzentren) von S2 und T2 sowie zwischen S2 und T1 z. B. 100 nm beträgt. Mithilfe der SPDM-Technik können solche Distanzen mit einem Fehler im Nanometerbereich bestimmt werden. Aufgrund des geringen Abstandes von S1 zu T1 wird das Gen G1 als aktiv diagnostiziert; aufgrund des erheblich größeren Abstandes von S2 sowohl zu T1 wie zu T2 wird das Gen G2 als inaktiv diagnostiziert. Andere Abstandskriterien sind ebenfalls erfindungsgemäß, sofern sie den biologischen Verhältnissen Rechnung tragen, d. h. mit Aussagen über die Aktivität/Inaktivität von Genen korreliert sind.

Beispielsweise können Genbereiche G1, G2, G3 mit Positionen an den Stellen S1, S2, S3 im Zellkern, mit Kombinationen k1, k2, k3 von Fluorochromen mit geeigneten spektralen Signaturen markiert werden; bei N spektralen Signaturen gibt es 2N - 1 verschiedene Kombinationen; wird die Auflösung des zur Detektion verwendeten lichtoptischen Systems so gewählt, daß Beugungsbilder von Markierungsstellen Si, Sk, die Fluorochrome derselben spektralen Signatur enthalten, von einander getrennt registriert werden können, so können bis zu 2N - 1 Genbereiche in einem Zellkern gleichzeitig analysiert werden; dabei sind die Transkriptionsfaktoren/Splicingkomplexe so markiert, daß von ihnen erzeugte Beugungsbilder bei einer gegebenen spektralen Signatur von einander sowie von den Beugungsbildern der Genpositionen S1, S2, S3 . . . getrennt registriert werden können. Beispielsweise können bei N = 10 für die Markierung von Genpositionen zur Verfügung stehenden spektralen Signaturen bis zu etwa 1000 verschiedene Gene gleichzeitig in individuellen Zellkernen auf ihre Aktivität/Inaktivität untersucht werden. Die hierzu erforderliche räumliche Auflösung kann mit verschiedenen lichtoptischen Verfahren nach dem Stand der Technik erreicht werden [C. Cremer, T. Cremer (1978) Considerations on a laser scanning microscope with high resolution and depth of field. Microsc. Acta 81: 31-44; S. Hell, E. H. K. Stelzer (1992) J. Opt. Soc. Am. A 9: 2159-2166; T. A. Klar, S. Jakobs, M. Dyba, A. Enger, S. Hell (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 8206-8210]

VIRNI

Eine erfindungsgemäße VIRNI-Ausführung des genannten Prozesses besteht darin, optimale Bedingungen der Markierung, der Kombination von Markierungen, der lichtoptischen Auflösung, des Bildanalyseverfahrens etc. zu bestimmen. Dies kann z. B. in folgenden Einzelschritten geschehen:

• - Modellierung der "Large Scale" Struktur der zu analysierenden Modellzellkerne, z. B. unter Verwendung von spärischen 1-Mbp Domänen mit 500 nm Durchmesser;
• - Modellierung der Mikro/Nanostruktur der 1-Mbp Domänen, in denen der Ort der Genbereiche mit den Positionen S1, S2, . . . angenommen wird;
• - Modellierung der Position der Komplexe T1, T2, . . . von Transkription/Splicing, deren Distanzen zu S1, S2 . . . festgestellt werden soll;
• - Modellierung der spektralen Markierungen, beispielsweise durch Annahme eines bestimmten von S1, S2, . . . T1, T2, . . . emittierten Spektrums mit bestimmten Eigenschaften, wie Emissionswellenlänge bei bestimmten Absorptionswellenlängen, Fluoreszenzlebensdauer, Energietransfer, Polarisation, Bleichung, Stimulierter Emission etc.
• - Modellierung der mikroskopischen Abbildung des zur Analyse angewandten optishen Detektorsystems oder der zur Analyse angewandten Detektorsysteme;
• - Modellierung der spektral selektiven Bildregistrierung, unter Berücksichtigung der spektralen Signatur (z. B. Absorptions/Emissionswellenlängen; Fluoreszenzlebensdauern, Energietransfereigenschaften; Polsarisationseigenschaften, usw., sowie der Fehler, die bei der Zuordnung bestimmter Signale zu bestimmten spektralen Signaturen entstehen;
• - Modellierung des Rauschverhaltens, z. B. aufgrund von Photonenrauschen, Kamerarauschen etc.;
• - Modellierung der Kalibrierung von monochromatischen und optischen Aberrationen nach den Prinzipien der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie bzw. verwandter Verfahren (s, Beispiel 1) unter Berücksichtigung von Fehlern in der selektiven Zuordnung von bestimmten lichtoptischen Signalen zu bestimmten spektralen Signaturen, usw. Solche Unsicherheiten können beispielsweise dadurch modelliert werden, daß die bildseitigen Modellintensitätsverteilungen nach der Faltung nach einer statistischen Regel um einen an der Verteilung der Meßfehler orientierten Betrag verschoben werden;
• - Anwendung von Bildauswertungsprogrammen für die erhaltenen Datensätze;
• - Vergleich der auf diese Weise erhaltenen Positionen und Abstandsverteilungen für S1, S2, S3, . . . T1, T2, T3 . . . mit den im Modell vor dem Virtuellen Mikroskopieprozess erhaltenen Wert;
• - Variation der Annahmen über Art und Verteilung der zur Markierung verwandten Fluorochrome, über Eigenschaften des lichtoptisches Detektorsystems, der Kalibrierungsstrategie, der Eigenschaften der Auswertungssoftware, wie z. B. Segmentierungsstrategien, Schwellwertsetzung etc.;
• - Ermittlung optimaler Analyseparameter, auch unter Berücksichtigung ökonomisch wirksamer Größen, wie z. B. Ersatz eines konfokalen Laserastermikroskopieverfahrens durch ein Epifluoreszenzverfahren; kostengünstigere Fluorochrome, schnellere Auswertungsalgorithmen, etc.

Beispiel 3

Es sollen optimale Markierungsstrategien für die Detektion von Chromosomenaberrationen, wie z. B. Translokationen (Austausch von Chromatinbereichen zwischen verschiedenen Chromosomen); von intrachromosomalen Austauschen von Chromatinbereichen; von Amplifikationen (Erhöhung der Anzahl bestimmter DNA-Sequenzen), sowie Deletionen (Verminderung/Eliminierung bestimmter DNA-Sequenzen) berechnet werden. Die Diagnostik dieser Größen in Zellkernen ist wegen ihrer großen biologischen und medizinischen Bedeutung, z. B. für die Strahlenbiologie, oder für die Tumorforschung und die Tumordiagnostik, von erheblicher, auch wirtschaftlicher Bedeutung. Alle diese Änderungen lassen sich als Änderungen der Abstände bestimmter spezifischer DNA-Sequenzen im Zellkern darstellen. Beispielsweise bedeutet eine Translokation, daß zwei oder mehr vor der Translokation weit voneinander getrennte DNA-Sequenzen ihren mittleren Abstand ausserordentlich stark vermindern, oder daß zwei oder mehr nahe benachbarte DNA- Sequenzen ihren Abstand ausserordentlich stark vergrößern; ein intrachromosomaler Austausch läßt sich ebenfalls dadurch beschreiben, daß zwei oder mehr vorher weit voneinander getrennte DNA Bereiche nunmehr ihren mittleren Abstand ausserordentlich stark vermindern, oder aber aber stark vergrößern; eine Amplifikation, beispielsweise einer DNA-Sequenz sequ 1, zu einer Amplifikationsregion Amp 1 bedeutet, daß der Abstand zwischen dem Fluoreszenzintensitätsschwerpunkt (Baryzentrum) eines mit einer spektralen Signatur s1 markierten Bereiches Amp1 zu einer benachbarten Sequenz sequ 2 auf demselben Chromosomenterritorium vergrößert wird. Im Falle einer Elimination von sequ 1 verschwindet eine mit sequ 1 spezifisch verbundene spektrale Signatur oder Kombination von Signaturen; im Falle einer Verminderung des Repetitionsgrades einer Sequenz sequ 1 vermindert sich der Abstand des Baryzentrums zu den Baryzentren von geeignet markierten Nachbarbereichen auf demselben Chromosomenterritorium.

Analytischer Verfahrensschritt 1

Markierung von sequ1, sequ2, . . . an den Stellen S1, S2, S3 . . . mit spektralen Signaturen s1, s2, s3 . ., jeweils mit einem einzelnen Fluorochrom oder einer Kombination; der Abstand von S1, S2, . . . wird so gewählt, daß mit dem verwendeten lichtoptischen Detektorsystem eine eindeutige Zuordnung der spektralen Signaturen bzw. ihrer für sequ 1, sequ 2, . . . spezifischen Kombinationen zu den Positionen S1, S2, S3, . . . möglich ist;

Analytischer Verfahrensschritt 2

Bestimmung der Positionen und Distanzen von S1, S2, S3. Dabei ist insbesondere der Einsatz von Verfahren der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie (SPDM) oder anderer Verfahren der spektralen Diskriminierung erfindungsgemäß.

Beispielsweise befindet sich ein mit einer spektralen Signatur s1 markierter Abschnitt einer DNA-Sequenz sequ 1 im normalen (nicht veränderten) Zellkern an einer räumlichen Stelle S1 in der unmittelbaren Nachbarschaft einer mit einer spektralen Signaur s2 markierten Sequenz sequ2, wobei der geometrische Abstand zwischen den Fluoreszenzintensitätsschwerpunkten (Baryzentren) von S1 und S2 30 nm beträgt; liegt in den veränderten Zellkernen beispielsweise eine Translokation oder ein intrachromosomaler Austausch vor, bei dem der Bruchpunkt zwischen S1 und S2 liegt, so wird in den Kernen mit Austausch eine sehr viel höherer mittlerer Abstand gemessen [A. Esa, P. Edelmann, L. Trakthenbrot, N. Amariglio, G. Rechavi, M. Hausmann, C. Cremer (2000) 3D-spectral precision distance microscopy (SPDM) of chromatin nanostructures after triple-colour labeling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J. Microscopy 199: 96-105]. Ebenso verändert sich der Abstand bei Amplifikation von sequ1 und/oder sequ2; bei Verminderung des Repetitionsgrades sinkt er; bei Elimination von sequ1 oder sequ 2 verschwindet das Markierungsignal von sequ1 bzw. sequ 2.

Beispielsweise können DNA-Sequenzen sequ 1, sequ 2, sequ3, . . . mit Positionen an den Stellen S1, S2, S3, im Zellkern mit Kombinationen k1, k2, k3 von Fluorochromen mit geeigneten spektralen Signaturen markiert werden; bei N spektralen Signaturen gibt es 2N - 1 verschiedene Kombinationen; wird die Auflösung des zur Detektion verwendeten lichtoptischen Systems so gewählt, daß Beugungsbilder von Markierungsstellen Si, Sk, die Fluorochrome derselben spektralen Signatur enthalten, von einander getrennt registriert werden können, so können bis zu 2N - 1 Sequenzen in einem Zellkern gleichzeitig analysiert werden. Beispielsweise können bei N = 10 für die Markierung von Genpositionen zur Verfügung stehenden spektralen Signaturen bis zu etwa 1000 verschiedene Sequenzen gleichzeitig in individuellen Zellkernen auf ihre Bruchpunkte für Chromosomenaustausche, ihre Amplifikation und Deletion untersucht werden. Die hierzu erforderliche räumliche Auflösung kann mit verschiedenen lichtoptischen Verfahren nach dem Stand der Technik erreicht werden.

VIRNI

Eine erfindungsgemäße VIRNI-Ausführung des genannten Prozesses besteht darin, optimale Bedingungen der Markierung, der Kombination von Markierungen, der lichtoptischen Auflösung, des Bildanalyseverfahrens etc. zu bestimmen. Dies kann z. B. in folgenden Einzelschritten geschehen:

• - Modellierung der "Large Scale" Struktur der zu analysierenden Modellzellkerne, z. B.
• - unter Verwendung von spärischen 1-Mbp Domänen mit 500 nm Durchmesser; a) für eine als "Normal" angesehene Konfiguration 1; b) für als "aberrant" angesehene Konfigurationen 2, 3, 4 . . . (z. B. mit Translokationen, Deletionen, Amplifikationen); dabei können z. B. die Daten von bekannten, z. B. tumorrelevanten, Translokationschromosomen eingesetzt werden, wie z. B. DNA-Gehalt;; Zentromerpositionen; R- und -G-banden-Positionen, etc. [Kreth, G., Münkel, Ch., Langowski, J., Cremer, T., Cremer, C. (1998) Chromatin structure and chromatin aberrations: Modeling of damage induced by isotropic and localized irradiation, Mutat. Research, 404, 77-88];
• - Modellierung der Mikro/Nanostruktur der 1-Mbp Domänen, in denen der Ort der DNA- Sequenzen mit den Positionen S1, S2, . . . angenommen wird;
• - Modellierung der spektralen Markierungen, beispielsweise durch Annahme einers bestimmten von S1, S2, . . . emittierten Spektrums mit bestimmten Eigenschaften, wie Emissionswellenlänge, Fluoreszenzlebensdauer etc.
• - Modellierung der mikroskopischen Abbildung des zur Analyse angewandten optishen Detektorsystems;
• - Modellierung der spektral selektiven Bildregistrierung, unter Berücksichtigung der spektralen Signatur (z. B. Absorptions/Emissionswellenlängen; Fluoreszenzlebensdauern, Energietransfereigenschaften; Polsarisationseigenschaften, usw., sowie der Fehler, die bei der Zuordnung bestimmter Signale zu bestimmten spektralen Signaturen entstehen;
• - Modellierung des Rauschverhaltens, z. B. aufgrund von Photonenrauschen, Kamerarauschen etc.;
• - Modellierung der Kalibrierung von monochromatischen und optischen Aberrationen nach den Prinzipien der Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie bzw. verwandter Verfahren, unter Berücksichtigung von Fehlern in der selektiven Zurodnung von bestimmten lichtoptischen Signalen zu bestimmten spektralen Signaturen, usw. Solche Unsicherheiten können beispielsweise dadurch modelliert werden, daß die bildseitigen Modellintensitätsverteilungen nach der Faltung nach einer statistischen Regel um einen an der Verteilung der Meßfehler orientierten Betrag verschoben werden;
• - Anwendung von Bildauswertungsprogrammen für die erhaltenen Datensätze;
• - Vergleich der auf diese Weise erhaltenen Positionen und Abstandsverteilungen für S1, S2, S3, . . _. mit den Modellkonfigurationen vor dem Virtuellen Mikroskopieprozess;
• - Variation der Annahmen über Art und Verteilung der zur Markierung verwandten Fluorochrome, über Eigenschaften des lichtoptisches Detektorsystems, der Kalibrierungsstrategie, der Eigenschaften der Auswertungssoftware, wie z. B. Segmentierungsstrategien, Schwellwertsetzung etc.;
• - Ermittlung optimaler Analyseparameter, auch unter Berücksichtigung ökonomisch wirksamer Größen, wie z. B. Ersatz eines konfokalen Laserastermikroskopieverfahrens durch ein Epifluoreszenzverfahren; kostengünstigere Fluorochrome, schnellere Auswertungsalgorithmen, etc.

Zur Bedeutung realistischer Computersimulationen

Um die angestrebte Optimierung der Zellkern Multiplex-Diagnostik zu erreichen, müssen die experimentell bekannten Kernstrukturen nach dem jeweiligen Stand der Forschung auch in die Virtuelle-Zellkern-Abbildungs-Technik (VIRNI) Eingang finden. Bei den der Virtuellen Mikroskopie vorausgehenden Zellkernmodellierungen wird beispielsweise berücksichtigt:

• - verschiedene Formen des Zellkerns;
• - Größe und Lage von Nukleoli;
• - Die besondere räumliche Verteilung von Chromosomenterritorien mit Nukleolus- Organisatorregionen;
• - Die nicht-zufällige Verteilung von Zentromeren und Telomeren;
• - Der Einfluß entropischer Effekte auf die Verteilung und Morphologie von Chromosomen;
• - Der Einfluß verschiedener viskoser Eigenschaften des Kernes, die die Bewegung von Chromosomenterritorien und ihren Teilen, sowie von Proteinen, Proteinkomplexen, Nukleinsäuren und Nukleinsäure-Proteinkomplexen beeinflussen;
• - Der Einfluß von verschiedenen Kondensationszuständen spezifischer Chromatinregionen, z. B. in normalen und apoptotischen (dem programmierten Zelltod unterworfenen) Zellen, unter Verwendung geeigneter Tensegritätspotentiale;
• - Verschiedene Zustände der Aktivität/Inaktivität von spezifischen Genen, z. B. über Faltungs-/Kondensationseigenschaften, und/oder Nachbarschaft zu Komplexen für Transkription/Splicing;
• - Der Einfluß verschiedener Häufigkeiten für gegebene Chromosomenaberrationen, z. B. Chromosomenaustausche, Deletionen, Amplifikationen von DNA-Sequenzen auf die Grenze der Detektion seltender Ereignisse.

Das erfindungswesentliche Ziel von VIRNI ist es, möglichst realistische Schätzungen für eine optimale Strategie für Markierung, Abbildung und Bildanalyse unter gegebenen Randbedingungen zu erhalten, wie z. B.:

• - Der Anzahl und linearen Sequenzposition der zu markierenden DNA-Sequenzen;
• - Größe, Form, Aktivitätszustand, Aberrationszustand der zu analysierenden Kerne;
• - Der Anzahl und Art der für die Markierung verwendeten spektralen Signaturen;
• - Des für die Analyse verwendeten Mikroskopsystems;
• - Der Bildauswerteverfahren für die Analyse;
• - Der Rauschbedingungen der zu analysierenden Bilder, wie z. B. Photonenstatistik, Ausleserauschen, Markierungsprobbleme etc.

Es ist offensichtlich, daß eine rein empirische Optimierung der verschiedenen Parameter aufgrund von Arbeits- und Materialkosten sowie aufgrund des Zeitaufwandes impraktikabel wird, sobald die Anzahl der zu variierenden Parameter eine bestimmte, relativ niedrige Größe überschreitet. Die erfindungsgemäße Anwendung von VIRNI erlaubt es jedoch, mit wesentlich geringerem Aufwand in verhältnismäßig kurzer Zeit eine großen Zahl von Modellsituationen von der Markierung bis zum erwarteten diagnostischen Resultat zu simulieren. Damit lassen sich insbesondere auch die Zuverlässigkeit von bestimmten Analyseverfahren in Mikrogewebe-Anordnungen ("Microtissue arrays") mit sehr vielen Zellen testen.

Ein auf der Grundlage von Bioinformatik-Verfahren der Zellkernstruktur entwickeltes erfindungsgemäßes Virtual-Cell-Nucleus-Imaging (VIRNI) Verfahren liefert Angaben über die speziellen Parameter der zellulären Molekulardiagnostik von Microtissue- Arrays. Aufgrund dieser Angaben wird ein individueller Vorschlag für eine diagnostisch und wirtschaftlich optimale Multiplex-Microtissue-Genomdiagnostik-Strategie berechnet, unter Berücksichtigung von Zelltyp/Gewebe, Präparationszustand, Markierungsverfahren, Anzahl und Länge der zu identifizierenden Sequenzen, Mikroskopietechniken, Bildanalysealgorithmen etc.

Literatur

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[20] Edelmann, P., Bornfleth, H., Zink, D., Cremer, T., Cremer, C. (2000) Morphology and dynamics of chromosome territories in living cells, in preparation

Claims (5)

1. Verfahren zur Berechnung von Optimierungsstrategien für die Molekulare- Multiplex-Diagnostik von Microtissue-Arrays, dadurch gekennzeichnet, daß für die zu untersuchende Zellart/Zellarten ein Computermodell von Kernen der betreffenden Zellen in der Weise berechnet wird, dass den zu markierenden Orten geeignete lichtoptisch detektierbare Eigenschaften zugeschrieben werden, wie zum Beispiel bestimmte spektrale Signaturen oder Kombinationen von spektralen Signaturen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das berechnete Computermodell mit diagnostisch relevanten experimentellen Punktbildfunktionen des zur vorgesehenen Analyse verwendeten lichtoptischen Systems rechnerisch gefaltet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass das gefaltete Bild mit diagnostisch relevanten Werten für Hintergrundsrauschen, Photonenrauschen, Detektorrauschen versehen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass das gefaltete und mit Rauschsignalen versehene Bild mit den für die experimentelle Analyse vorgesehenen Signalverarbeitungsalgorithmen untersucht wird, insbesondere von Algorithmen für die Trennung der Signale verschiedener spektraler Signaturen; für die Identifizierung kombinatorisch markierter Orte; sowie für die Feststellung von Distanzen nach den Prinzipien der spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass durch systematische Variation der eingesetzten Parameter unter Verwendung einer geeigneten Zahl modellierter Kerne eine optimale Markierungsstrategie für die Molekulare Multiplex-Diagnostik von Microtissue-Arrays unter gewünschten Randbedingungen des Zelltyps, der Markierungsart, der Rauschbedingungen, der optischen Eigenschaften des zur Analyse vorgesehenen Systems, der Eigenschaften des Detektors, der zur Analyse vorgesehenen Auswertungssoftware, sowie der gewünschten diagnostischen Zuverlässigkeit berechnet wird.