DE10050540A1

DE10050540A1 - Stimulation of radiation emissions in plane involves focusing pulsed laser beams into object under investigation with foci adjacent to other in plane to stimulate emissions by non-linear effects

Info

Publication number: DE10050540A1
Application number: DE2000150540
Authority: DE
Inventors: Tim Nielsen; Peter Andresen
Original assignee: Lavision Biotec GmbH
Current assignee: Lavision Biotec GmbH
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2002-05-02

Abstract

The method involves focusing several pulsed laser beams (1) into the object under investigation with the foci adjacent to other in a plane to stimulate emissions by non-linear effects. Each point of the surface under investigation lies in the stimulation volume (2) of at least one laser beam and the laser beams pass through the object with a time delay that prevents interference in the object. An Independent claim is also included for an arrangement for stimulation of radiation emissions in plane of 3D object.

Description

Verfahren zur flächigen Anregung von Strahlungsemission in einer Ebene eines dreidimensionalen Objekts, umfassend eine Quelle für mehrere gepulste Laserstrahlen und einer Fokussicherungseinrichtung.Process for the flat excitation of radiation emission in one plane of a three-dimensional object comprising one source for several pulsed laser beams and a focus lock.

State of the art

Lichtmikroskopie ist auch heute noch, obwohl es mit der Elektronenmikroskopie oder Nahfeldtechniken Verfahren mit besserer Ortsauflösung gibt, eine wichtige Untersuchungsmethode in Biologie und Medizin. Dies liegt an einigen wesentlichen Vorteilen, die diese Technik gegenüber anderen hat:
Light microscopy is still an important method of investigation in biology and medicine, even though there are methods with better spatial resolution using electron microscopy or near-field techniques. This is due to some key advantages that this technique has over others:

- you can examine living objects,
- Investigations in volume and not only on the surface three-dimensional objects are performed
- through the targeted use of dye markings (e.g. Fusion proteins [1]) and spectroscopic techniques for detection (e.g. FRET detection [2], lifetime measurement [3]) will be high Selectivity achieved
- The sensitivity is very high due to highly sensitive detectors (down to for the detection of individual molecules)

Insbesondere die Techniken, bei denen das Objekt zur Emission von Strahlung angeregt wird, haben die beiden zuletzt genannten Eigenschaften. Die emittierte Strahlung kann u. a. Fluoreszenz, Raman- oder Rayleigh-Streuung, CARS oder frequenzvervielfachtes Beleuchtungslicht sein.In particular, the techniques in which the object is used to emit Radiation is excited, the latter two have Characteristics. The emitted radiation can u. a. Fluorescence, Raman or Rayleigh scattering, CARS or frequency-multiplied illuminating light his.

Die verschiedenen bekannten Lichtmikroskopietechniken bei denen das Objekt zur Emission von Strahung angeregt wird, werden im folgenden kurz beschrieben, um das der Erfindung zugrunde liegende Problem zu schildern.The various known light microscopy techniques in which the Object to be emitted by radiation will be briefly below described to illustrate the problem underlying the invention.

fluorescence microscopy

Hier wird das Objekt in seinem ganzen Volumen von Licht, das Substanzen, die natürlicherweise im Objekt vorkommen oder mit denen das Objekt angefärbt wurde, zur Fluoreszenz anregt, durchstrahlt. Die emittierte Fluoreszenz wird von einem Objektiv aufgenommen und abgebildet. Das Problem bei dieser Art der Mikroskopie ist, dass im ganzen Volumen des Objekts Fluoreszenzlicht angeregt und emittiert wird, dass aber nur eine dünne Ebene des Objekts scharf abgebildet wird. Die Fluoreszenz, die aus den anderen Teilen des Objekts emittiert wird, verteilt sich diffus über das Bild. Dies hat zur Folge, dass die Bilder nur geringen Kontrast haben bzw. feine Strukturen durch die diffuse Überstrahlung nicht zu erkennen sind. Here the object in its entire volume of light, the substances, that occur naturally in the object or with which the object was stained, stimulated to fluoresce, shines through. The emitted Fluorescence is recorded and imaged by a lens. The The problem with this type of microscopy is that in the entire volume of the Object fluorescent light is excited and emitted, but only one thin plane of the object is in focus. The fluorescence that comes from is emitted to the other parts of the object, diffuses across the Image. As a result, the images have little contrast or fine structures cannot be seen due to the diffuse overexposure.

Nur sehr dünne Objekte (in der Regel in Scheiben geschnitten) können hoch auflösend untersucht werden. Ein weiterer Nachteil ist, dass das gesamte Objekt mit Licht bestrahlt und auch durch das Licht geschädigt bzw. ausgebleicht wird. (siehe auch [])Only very thin objects (usually sliced) can be tall be resolved. Another disadvantage is that the whole Object irradiated with light and also damaged or damaged by the light is bleached. (see also [])

Confocal Laser Scanning Microscopy []

Hier wird die Fluoreszenz von einem Laserstrahl, der in das Objekt fokussiert wird, angeregt. Die Fluoreszenz wird von einem Objektiv aufgenommen und auf eine Lochblende abgebildet, hinter der sich der Lichtdetektor befindet. Die Lochblende ist dabei so angeordnet, dass nur der Teil des Fluoreszenzlichtes, der im Fokus des Lasertrahls erzeugt wird, die Lochblende passieren kann. Die übrige Fluoreszenz wird von der Lochblende aufgefangen. Durch diese Anordnung wird erreicht, dass nur Fluoreszenz aus einem dreidimensional eng begrenzten Volumen (nämlich dem Fokus) aufgenommen wird. Wird der Fokus in einer Ebene rasterartig durch das Objekt bewegt und dabei das jeweilige Signal gemessen, kann die abgerasterte Ebene mit hoher Auflösung untersucht werden. Neben dem Nachteil, dass auch hier ein großer Teil des Objekts zur Fluoreszenz angeregt und ausgebleicht wird, bzw. durch das Laserlicht geschädigt wird, liegt ein weiterer Nachteil dieser Technik darin, dass zur Aufnahme eines Bildes der Laserstrahl nacheinander auf alle Punkte der abzubildenen Ebene gelenkt werden muß. Dies führt dazu, dass zur Aufnahme eines Bildes eine erhebliche Zeit benötigt wird, die die Geschwindigkeit der Prozesse, die mit einem solchen Mikroskop noch untersucht werden können, limitiert.Here the fluorescence is from a laser beam that is directed into the object is focused, stimulated. The fluorescence is from a lens recorded and shown on a pinhole, behind which the Light detector is located. The pinhole is arranged so that only the part of the fluorescent light that is generated in the focus of the laser beam, the pinhole can happen. The remaining fluorescence is from the Pinhole caught. This arrangement ensures that only Fluorescence from a three-dimensionally limited volume (namely the focus). The focus becomes grid-like in one plane can move through the object and measure the respective signal the scanned plane can be examined with high resolution. In addition to the disadvantage that a large part of the object is also here Fluorescence is excited and bleached, or by the laser light is damaged, another disadvantage of this technique is that Taking a picture of the laser beam in sequence on all points of the to be mapped plane must be directed. This leads to the Taking a picture takes a significant amount of time Speed of processes with such a microscope can be examined, limited.

Nonlinear laser scanning microscopy

Hier wird, ähnlich wie bei einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, ein Laserstrahl in das Objekt fokussiert. Die Anregung der Emission erfolgt hier allerdings durch einen nichtlinearen optischen Prozess. Durch die Nichtlinearität der Anregung wird die Strahlungsemission auf das Fokalvolumen des Laserstrahles begrenzt. Eine weitere Einschränkung der Emission durch eine Lochblende o. ä. ist nicht nötig. Auch dieser Mikroskoptyp muß allerdings zur Erzeugung eines Bildes alle Punkte nacheinander aufnehmen, was mit den oben genannten Nachteilen verbunden ist.Similar to a confocal laser scanning microscope, a Laser beam focused on the object. The emission is stimulated here however, through a nonlinear optical process. Through the Nonlinearity of the excitation is the radiation emission on the Focal volume of the laser beam limited. Another limitation of Emission through a pinhole or the like is not necessary. This one too Microscope type must, however, all points to create an image consecutively record what with the above disadvantages connected is.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, hochaufgelöste flächige Bilder aus dem Volumen dreidimensionaler Objekte mit hoher Bildaufnahmegeschwindigkeit zu erzeugen.The invention is therefore based on the object of high-resolution planar Images from the volume of three-dimensional objects with high To generate image recording speed.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass mehrere, gepulste Laserstrahlen mittels der Fokussierungseinrichtung in das zu untersuchende Objekt fokussiert werden, und dass die Foki der Laserstrahlen nebeneinander in einer Ebene angeordnet sind, und dass die Laserstrahlen in den Volumina der Foki das Objekt durch nichtlineare Effekte zur Emission von Strahlung anregen, und dass jeder Punkt der zu untersuchenden Fläche im Anregungsvolumen mindestens einer der Laserstrahlen liegt, und dass die Laserstrahlen das Objekt mit einer Zeitverzögerung, die verhindert, dass die Strahlen im Objekt interferieren, durchlaufen.The object is achieved in that several, pulsed Laser beams by means of the focusing device into the one to be examined Object to be focused and that the focus of the laser beams are arranged side by side in one plane and that the laser beams in the volumes of the foci the object due to nonlinear effects for emission of radiation excite and that every point of the area to be examined there is at least one of the laser beams in the excitation volume, and that the laser beams the object with a time delay that prevents the rays interfere in the object, go through.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine Anordnung zur insbesondere flächigen Anregung von Strahlungsemission in der Ebene eines dreidimensionalen Objekts mit Mitteln zur Erzeugung anderer gepulster Laserstrahlen und einer Fokussiereinrichtung, wobei vor der Fokussiereinrichtung eine Strahlteilereinrichtung zur Vervielfachung des Laserstrahls vorgesehen ist.The invention also relates to an arrangement for in particular areal excitation of radiation emission in the plane of a three-dimensional object with means for generating other pulsed Laser beams and a focusing device, in front of the Focusing device a beam splitter device for multiplying the Laser beam is provided.

Weitere vorteilhafte Merkmale sind den Unteransprüchen zu entnehmen. Hieraus wird deutlich, dass viele Laserstrahlen in das Objekt fokussiert werden, wobei jeweils jeder der Strahlen in seinem Fokusvolumen das Objekt durch einen nichtlinearen optischen Prozess zur Emission von Strahlung anregen kann und die Abstände der Foki so klein sind, dass sich die Anregungsvolumina überlappen. Damit es nicht zur Vergrößerung der Anregungsvolumina der einzelnen Strahlen gegenüber dem Anregungs volumen nur eines Strahles kommt, durchlaufen die Strahlen das Objekt mit einer Zeitverzögerung, die verhindert, dass die einzelnen Strahlen im Objekt miteinander interferieren.Further advantageous features can be found in the subclaims. This makes it clear that many laser beams are focused on the object each of the rays in its focus volume Object through a nonlinear optical process for emission of Can excite radiation and the distances between the foci are so small that the excitation volumes overlap. So that it does not enlarge the Excitation volumes of the individual beams compared to the excitation volume of only one ray comes, the rays pass through the object a time delay that prevents the individual rays in the object interfere with each other.

Die Zeitverzögerung zwischen den Strahlen bewirkt also, dass jeder Strahl das Objekt unabhängig von allen anderen Strahlen durchläuft und auch unabhängig von allen anderen Strahlen in seinem Fokusvolumen die Strahlungsemission anregt. Sind die Zeitverzögerungen sehr klein (z. B. 1 ps) können alle Strahlen das Objekt innerhalb der Zeit, die für die Emission der angeregten Strahlung charakteristisch ist (z. B. 1 ns für Fluoreszenz) durchlaufen. Man erhält also eine quasisimultane Anregung der Emission.So the time delay between the beams causes each beam the object passes through independently of all other rays and also independent of all other rays in its focus volume Stimulates radiation emission. Are the time delays very small (e.g. 1 ps) All rays can reach the object within the time required for emission is characteristic of the excited radiation (e.g. 1 ns for fluorescence) run through. So you get a quasi-simultaneous excitation of the emission.

Jeder der Strahlen regt die Emission in einem dreidimensional begrenzten Volumen an. Durch die eng benachbarte, überlappende Anordnung der Anregungsvolumina in einer Ebene, kann die Emission in der kompletten Ebene angeregt werden.Each of the rays stimulates the emission in a three-dimensionally limited Volume. Due to the closely adjacent, overlapping arrangement of the Excitation volumes in one level, the emission in the complete Level.

Durch diese Art der Beleuchtung werden zweidimensionale Schnittbilder dreidimensional ausgedehnter Objekte gewonnen, ohne dass dazu die Laserstrahlen gerastert werden müssen. Durch schrittweises Verfahren der Ebene in Richtung ihrer Normalen, kann die dreidimensionale Struktur eines Objekts aufgenommen werden.This type of lighting creates two-dimensional sectional images three-dimensionally extended objects without the Laser beams must be scanned. Through the gradual process of Plane in the direction of its normal, the three-dimensional structure of a Object.

Es wird die gleiche Ortsauflösung erreicht wie bei gerasterter Beleuchtung mit einem Strahl.The same spatial resolution is achieved as with screened lighting with a beam.

Die Bildrate, die erreicht werden kann, ist durch die Wiederholrate der Laserpulse gegeben und kann bedeutend höher sein als bei Rastersystemen (MHz gegenüber einigen Hz). Dies stellt einen wesentlichen technischen Fortschritt dar, weil die Bildrate die maximale Geschwindigkeit der Prozesse, die noch beobachtet werden können, angibt.The frame rate that can be achieved is the repetition rate of the Given laser pulses and can be significantly higher than with raster systems (MHz versus some Hz). This represents an essential technical Progress because the frame rate is the maximum speed of the Processes that can still be observed indicates.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung beispielhaft näher erläutert.The invention is explained in more detail by way of example with reference to the drawings.

Fig. 1 zeigt mehrere fokussierte Laserstrahlen und deren Anregungsvolumina; Fig. 1 shows a plurality of focused laser beams and their excitation volumes;

Fig. 2 zeigt die Fokussierung mehrerer Laserstrahlen in das Objekt; Fig. 2 shows the focusing of several laser beams in the object;

Fig. 3 zeigt schematisch das zeitliche Aufeinanderfolgen der Laserstrahlen; Fig. 3 shows schematically the temporal succession of the laser beams;

Fig. 4 zeigt eine erste Variante zur Teilung des Laserstrahls; Fig. 4 shows a first variant for dividing the laser beam;

Fig. 5 zeigt eine weitere Variante Izsur Teilung des Laserstrahls. Fig. 5 shows a further variant Izsur dividing the laser beam.

Fig. 1 zeigt mehrere fokussierte Laserstrahlen (1) und deren Anregungsvolumina (2). Die Anregung ist durch nichtlineare Prozesse auf die Fokalregion der Laserstrahlen begrenzt. Die Foki der Laserstrahlen liegen so nah aneinander, dass sich die Anregungsvolumina überlappen. Dadurch wird erreicht, dass ein zusammenhängender Teil der Fokalebene, in der sich die Anregungsvolumina befinden angeregt wird. Fig. 1 shows several focused laser beams ( 1 ) and their excitation volumes ( 2 ). The excitation is limited to the focal region of the laser beams by non-linear processes. The foci of the laser beams are so close together that the excitation volumes overlap. This ensures that a coherent part of the focal plane in which the excitation volumes are located is excited.

Fig. 2 zeigt die Fokussierung mehrerer Laserstrahlen (1) in das Objekt (4), wobei die Fokuspunkte und somit die Anregungsvolumina (2) eng benachbart sind. Dies wird erreicht indem die Winkel der Laserstrahlen vor der Fokussierungseinrichtung (3) klein gewählt werden. Fig. 2 shows the focusing of several laser beams ( 1 ) in the object ( 4 ), the focus points and thus the excitation volumes ( 2 ) being closely adjacent. This is achieved by making the angles of the laser beams in front of the focusing device ( 3 ) small.

Fig. 3 zeigt schematisch das zeitliche Aufeinanderfolgen der Laserstrahlen, die das Objekt alte zu unterschiedlichen Zeiten durchlaufen. Der zeitliche Verlauf der Laserpulse (6) ist an die Strahlachsen (5) der Laser gezeichnet, um zu verdeutlichen, dass sich die Laserpulse zu einem festen Zeitpunkt an verschiedenen Positionen auf den Strahlachsen befinden und somit auch in der Probe zeitlich nicht überlappen können. Fig. 3 shows schematically the temporal succession of the laser beams passing through the object old at different times. The temporal course of the laser pulses ( 6 ) is drawn on the beam axes ( 5 ) of the lasers in order to clarify that the laser pulses are at different positions on the beam axes at a fixed point in time and therefore cannot overlap in time in the sample.

Fig. 4 zeigt als Beispiel eine Möglichkeit für eine Realisierung des Verfahrens durch Teilung eines intensiven Laserstrahls. Der Laserstrahl (1) wird durch eine Serie teilreflektierender Strahlteilerspiegel (7a-7d) gelenkt. Die Reflexionsgrade der Strahlteiler sind so eingestellt, dass die reflektierten Teilstrahlen (8a-8d) identische Intensität besitzen. Dies erfordert unterschiedliche Reflexionsgrade der Strahlteiler, wobei der letzte der Strahlteiler (7d) ein hochreflektierender Spiegel ist. Die Teilstrahlen (8a-8d) werden auf eine Serie weiterer teilreflektierender Strahlteilerspiegel (9a-9d) gelenkt, die ihrerseits die Teilstrahlen in die endgültigen Teilstrahlen (10) zerlegen. Die Strahlteiler (7a-7d, 9a-9d) sind so angeordnet, dass die Winkel zwischen den Teilstrahlen so klein sind, dass sich die Foki der Teilstrahlen im Objekt (4) hinter der Fokussierungseinrichtung (3) überlappen und eine rechteckige Fläche in der Fokalebene vollständig ausgeleuchtet wird. Durch die Anordnung, bei der jeder der Teilstrahlen einen unterschiedlichen geometrischen Weg zurücklegt kann gewährleistet werden, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren alle Teilstrahlen die Fokalebene zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchtreten. Die Anzahl der Strahlteiler bestimmt die Größe der Fläche im Objekt, die quasi simultan angeregt wird. Fig. 4 shows an example of one way for realization of the method by dividing an intense laser beam. The laser beam ( 1 ) is guided by a series of partially reflecting beam splitter mirrors ( 7 a - 7 d). The reflectance levels of the beam splitters are set so that the reflected partial beams ( 8 a - 8 d) have an identical intensity. This requires different degrees of reflection of the beam splitters, the last of the beam splitters ( 7 d) being a highly reflecting mirror. The partial beams ( 8 a - 8 d) are directed onto a series of further partially reflecting beam splitter mirrors ( 9 a - 9 d), which in turn split the partial beams into the final partial beams ( 10 ). The beam splitters ( 7 a - 7 d, 9 a - 9 d) are arranged so that the angles between the partial beams are so small that the foci of the partial beams in the object ( 4 ) overlap behind the focusing device ( 3 ) and a rectangular one Area in the focal plane is fully illuminated. The arrangement in which each of the partial beams travels a different geometric path can ensure that, according to the method according to the invention, all partial beams pass through the focal plane at different times. The number of beam splitters determines the size of the area in the object that is excited almost simultaneously.

Fig. 5 zeigt als Beispiel eine weitere Möglichkeit für eine Realisierung des Verfahrens durch Teilung eines intensiven Laserstrahls. Die Teilung des Laserstrahl erfolgt in der Strahlteileranordnung gemäß Patent 199 04 592.5-42. Aus dieser Literaturstelle ist bekannt, den Strahl zunächst an einer Strahlteilerplatte (10) in zwei Teilstrahlen gleicher Intensität zu zerlegen, die dann wiederum mittels der Spiegel (11, 12) auf die gleiche Strahlteilerplatte gelenkt werden, wobei jeder der Strahlen wiederum zerlegt wird, so dass vier Strahlen gleicher Intensität entstehen. Dieser Prozess wird wiederholt, bis genügend Teilstrahlen erzeugt sind. Die Einstellung der Spiegel ist so gewählt, dass sich die Strahlen in der Eintrittsebene des Objektives (17) überlappen. Die Foki der Teilstrahlen in der Probe liegen dann in einer Reihe. Eine weitere, um 90° gedrehte identische Anordnung von Strahlteilerplatte und Spiegeln erlaubt die weitere Teilung der Teilstrahlen, so dass eine flächige, insbesondere quadratische Anordnung von Foki in der Probe ensteht. Das heißt, dass durch eine vielfache Teilung des Laserstrahles eine entsprechend der Anzahl des geteilten Laserstrahles vergrößerte Fläche in der Probe ausgeleuchtet wird. Durch die Drehung der zweiten Strahlteilereinrichtung relativ zur ersten Strahlteilereinrichtung wird die zweite Dimension der Anregung, und damit eine flächige Anordnung von Foki ermöglicht. Die Strahlen müssen im Strahlteiler nebeneinander verlaufen, um eine Trennung zu ermöglichen. Die Anforderung des Überlappens benachbarter Foki erfordert bei einer Fokusgröße im Bereich von 0,5 µm und einem Objektiv mit einer Vergrößerung von 63 einen Winkel der Strahlen von etwa 0.01°. Bei einem typischen Strahldurchmesser von 3 mm muß dann der Strahl etwa 20 Meter von dem Strahlteiler zum Objektiv zurücklegen. Dies macht die Anordnung anfällig für Störungen, insbesondere in Form von Erschütterungen. Reduziert man allerdings den Strahldurchmesser vor dem Strahlteiler mittels eines telezentrischen Teleskopes 15 und weitet ihn vor dem Objektiv durch das Teleskop 16 wieder auf und verkleinert hierbei den Winkel zwischen den Strahlen, so kann der Strahlweg zum Objektiv 17 so stark reduziert werden, dass der Aufbau kompakt und robust wird. Die Reduzierung und Aufweitung des Strahldurchmessers um einen Faktor N vermindert den nötigen Strahlweg vom Mikroskop zum Objektiv um den Faktor 1/N². Dieser Faktor kommt wie folgt zustande: Die Reduzierung des Strahldurchmessers ermöglicht die Reduzierung des Abstandes der Strahlen im Strahlteiler, also einen kleineren Strahlteiler. Dieser kann dann näher an das Objekt gebracht werden. Fig. 5 shows an example of a further possibility for an implementation of the method by dividing an intense laser beam. The laser beam is split in the beam splitter arrangement according to patent 199 04 592.5-42. From this literature it is known to first split the beam on a beam splitter plate ( 10 ) into two partial beams of the same intensity, which are then directed again to the same beam splitter plate by means of the mirrors ( 11 , 12 ), each of the beams being split again, so that four rays of the same intensity arise. This process is repeated until enough partial beams are generated. The setting of the mirrors is selected such that the rays overlap in the entrance plane of the objective ( 17 ). The foci of the partial beams in the sample are then in a row. A further, identical arrangement of beam splitter plate and mirrors rotated by 90 ° permits the further division of the partial beams, so that a flat, in particular square arrangement of foci is created in the sample. This means that a multiple division of the laser beam illuminates an area in the sample that is enlarged in accordance with the number of divided laser beams. The second dimension of the excitation, and thus a flat arrangement of foci, is made possible by the rotation of the second beam splitter device relative to the first beam splitter device. The beams must run side by side in the beam splitter to enable separation. The requirement of overlapping neighboring foci requires a beam angle of approximately 0.01 ° with a focus size in the range of 0.5 µm and a lens with a magnification of 63. With a typical beam diameter of 3 mm, the beam must then travel about 20 meters from the beam splitter to the objective. This makes the arrangement susceptible to interference, particularly in the form of vibrations. However, if you reduce the beam diameter in front of the beam splitter by means of a telecentric telescope 15 and expand it again in front of the lens through the telescope 16 and thereby reduce the angle between the beams, the beam path to the lens 17 can be reduced so much that the structure is compact and becomes robust. The reduction and expansion of the beam diameter by a factor of N reduces the necessary beam path from the microscope to the objective by a factor of 1 / N ² . This factor comes about as follows: The reduction in the beam diameter enables the distance between the beams in the beam splitter, ie a smaller beam splitter, to be reduced. This can then be brought closer to the object.

Die Winkel der Strahlen zueinander sind von dem zweiten Teleskop um den Faktor N größer als der Sollwinkel im Objektiv. Dadurch kann der Strahlteiler zusätzlich an einem weiteren Faktor 1/N näher an das Objektiv angebracht werden. Am oben angeführten Beispiel bewirkt eine Reduzierung des Strahldurchmessers um den Faktor 4, also eine Reduzierung des Abstandes zum Objektiv von 20 Meter auf 1,25 Meter. Da die Apertur des Objektives für einen idealen Fokus voll ausgeleuchtet werden muß ist eine stärkere Aufweitung der Strahlen vor dem Objektiv in der Regel nötig, die zu einer weiteren Reduzierung des Strahlweges führt. The angles of the beams are from the second telescope around the Factor N greater than the target angle in the lens. This allows the Beam splitter additionally at a further factor 1 / N closer to the lens be attached. In the example above, a Reduction of the beam diameter by a factor of 4, i.e. one Reduction of the distance to the lens from 20 meters to 1.25 meters. There the lens aperture fully illuminated for an ideal focus must be a stronger expansion of the rays in front of the lens generally necessary, which leads to a further reduction in the beam path.

LIST OF REFERENCE NUMBERS

11

Laserstrahl
laser beam

22

Anregungsvolumen
excitation volume

33

Fokussierungseinrichtung
focusing device

44

Objekt
object

55

Mittenlinie eines Laserstrahls
Center line of a laser beam

66

Zeitlicher Verlauf der Pulsintensität eines Laserstrahls
Time course of the pulse intensity of a laser beam

Claims

1. A method for the flat excitation of radiation emission in a plane of a three-dimensional object consisting of a source for several, pulsed laser beams, a focusing device, characterized in that
several, pulsed laser beams are focused by means of the focusing device into the object to be examined, and that the foci of the laser beams are arranged next to one another in one plane, and that the laser beams in the volumes of the foci excite the object to emit radiation by nonlinear effects, and
that each point of the area to be examined lies in the excitation volume of at least one of the laser beams,
and that the laser beams pass through the object with a time delay that prevents the beams from interfering in the object.

2. The method according to claim 1 characterized in that imaging the emitted radiation, e.g. B. by a camera, is registered.

3. The method according to claim 1 characterized in that the time course of the emitted radiation is registered.

4. The method according to claim 1 characterized in that the laser beams are generated by several lasers.

5. The method according to claim 1 characterized in that the laser beams are generated by splitting a laser beam become.

6. The method according to claim 1 or 5 characterized, that the laser beam or beams in front of the beam splitter Telescope can be reduced in diameter.

7. The method according to claim 1 characterized in that the angles between the laser beams in front of the Focusing device can be reduced by a telescope.

8. The method according to claim 1 characterized in that the radiation emitted is fluorescent light.

9. The method according to claim 1 characterized in that the radiation emitted by frequency multiplication or mixture is generated from the laser beams in the object.

10. The method according to claim 1 characterized in that the radiation emitted by CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) is generated in the object.

11. The method according to claim 1 characterized in that the radiation emitted by stimulated Raman scattering in the object is produced.

12. The method according to claim 1 characterized in that the area that is illuminated by the laser beams different areas of the object is directed.

13. The method according to claim 1 characterized in that the area that is illuminated by the laser beams, perpendicular to the Plane is moved through the object to make the object three-dimensional to investigate.

14. Arrangement for excitation of, in particular, flat Radiation emission in the plane of a three-dimensional object with Means for generating several pulsed laser beams and one focusing marked by a beam splitter device arranged in front of the focusing device to multiply the laser beam.

15. Arrangement according to claim 14, characterized in that in front of the beam splitter device means for reducing the Diameter of the laser beam are provided.

16. Arrangement according to claim 14, characterized in that in front of the focusing device means for enlarging the Diameter of the laser beam are provided.

17. Arrangement according to claim 15 or 16, characterized in that the means to reduce and enlarge the diameter of the Laser beam is a telescope.