DE10047295A1 - Medicinal use of galiella lactone as specific interleukin-6 signal induction inhibitor e.g. in treatment of fibrotic, cerebrovascular or neurodegenerative disease, pain, inflammation or tumors - Google Patents
Medicinal use of galiella lactone as specific interleukin-6 signal induction inhibitor e.g. in treatment of fibrotic, cerebrovascular or neurodegenerative disease, pain, inflammation or tumorsInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft die Verwendung der unter dem Namen Galiella-Lacton bekannten Substanz als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von entzünd lichen Prozessen.The invention relates to the use of the name Galiella lactone known substance as a medicine, especially for the treatment of inflammation processes.
Entzündungen zeichnen sich durch eine Vielzahl von Veränderungen auch in Organsystemen aus, die sich nicht in unmittelbarer Nähe zum Ort der Entzündung befinden. Alle mit einer Entzündung einhergehenden systemischen Veränderungen werden unter dem Begriff 'Acute Phase Response' zusammengefasst. Dies gilt auch für chronische Entzündungserscheinungen (Perspect. Biol. Med., 1993, 36: 611-22). Die wichtigste Rolle bei der Entstehung der 'Acute Phase Response' spielt die veränderte Syntheserate der sogenannten 'Acute Phase' Proteine (AP Proteine) in der Leber (N. Engl. J. Med., 1999, 340: 448-54). Die 'Acute Phase Response' tritt auf bei Infektionen, Traumata, Operationen, Verbrennungen, Organschäden und fortge schrittenen Stadien von malignen Erkrankungen. Der Hauptmediator der 'Acute Phase Response' ist Interleukin-6 (IL-6) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84: 7251-5).Inflammation is also characterized by a variety of changes Organ systems that are not in close proximity to the site of the inflammation are located. All systemic changes associated with inflammation are summarized under the term 'acute phase response'. this is also valid for chronic inflammation symptoms (Perspect. Biol. Med., 1993, 36: 611-22). The most important role in the emergence of the 'acute phase response' plays the altered synthesis rate of the so-called 'acute phase' proteins (AP proteins) in the Leber (N. Engl. J. Med., 1999, 340: 448-54). The 'acute phase response' occurs Infections, trauma, surgery, burns, organ damage and advanced advanced stages of malignancy. The main mediator of the 'Acute Phase Response 'is Interleukin-6 (IL-6) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84: 7251-5).
IL-6 nutzt Tyrosin-Kinasen aus der Janus-Kinase (Jak) Familie und Trans kriptionsfaktoren aus der 'Signal Transducer and Activator of Transcription' (Stat) Familie als Hauptmediatoren der intrazellulären Signaltransduktion. IL-6 induziert die Phosphorylierung und damit die Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Stat3 und Stat1 (in geringerem Maße) (Science, 1994, 264: 1415-21; Science, 1997, 277: 1630-5). Nach der Aktivierung translozieren Stat3 und Stat1 in den Zellkern und verursachen dort nach Bindung an ihre Bindungsstellen auf der DNA die Expression der Gene von AP Proteinen (Biochem. J., 1998, 334: 297-314).IL-6 uses tyrosine kinases from the Janus kinase (Jak) family and Trans description factors from the 'Signal Transducer and Activator of Transcription' (Stat) Family as the main mediators of intracellular signal transduction. IL-6 induced the phosphorylation and thus the activation of the transcription factors Stat3 and Stat1 (to a lesser extent) (Science, 1994, 264: 1415-21; Science, 1997, 277: 1630-5). After activation, Stat3 and Stat1 translocate into the cell nucleus and cause expression there after binding to their binding sites on the DNA the genes of AP proteins (Biochem. J., 1998, 334: 297-314).
Die dem heutigen Stand der Technik entsprechenden Behandlungen entzündlicher Prozesse, beispielsweise mit Corticosteroiden, sind nicht ohne unerwünschte Nebenwirkungen. Es gibt einen Bedarf an Therapeutika, die bei den oben und weiter unten genannten Erkrankungen die unerwünschte oder unerwünscht starke Express ion der IL-6 induzierten AP Proteine reduziert bzw. supprimiert, ohne dabei an anderen Stellen des Zellstoffwechsels einzugreifen. Daher wird Stat3 als ein geeignetes Target gesehen für die Entwicklung von neuen Wirkstoffen gegen eine nicht nützliche, übermäßige (nicht selbstbegrenzende) 'Acute Phase Response' wie sie beispielsweise im Falle der Leberzirrhose vorliegt.The inflammatory treatments corresponding to the current state of the art Processes, for example with corticosteroids, are not without undesirable ones Side effects. There is a need for therapeutics in the above and beyond diseases mentioned below the undesirable or undesirably strong express ion of the IL-6-induced AP proteins is reduced or suppressed without affecting to intervene in other areas of cell metabolism. Therefore, Stat3 is considered a suitable target seen for the development of new active substances against a non-useful, excessive (non-self-limiting) acute phase response such as for example, in the case of cirrhosis of the liver.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Galiella-Lacton genannte Verbindung
der Formel (I)
It has now surprisingly been found that the compound of the formula (I) called Galiella lactone
hervorragend geeignet ist zur Behandlung von entzündlichen Prozessen, die durch zu starke Expression der IL-6 induzierten 'Acute Phase' Proteine ausgelöst werden. Die Substanz wirkt dabei spezifisch auf die IL-6 Signalinduktion, wie es bisher für keine Substanz bekannt geworden ist.is excellent for treating inflammatory processes caused by strong expression of the IL-6 induced 'acute phase' proteins are triggered. The Substance has a specific effect on IL-6 signal induction, as has never been the case before Substance has become known.
Das Galliela-Lacton der Formel (I) ist bekannt aus Z. Naturforsch. 1990, 45c: 1093-8 (sowie der Dissertation von R. Hautzel, Universität Kaiserslautern 1989) und kann aus dem Pilz Galiella rufa (Unterabteilung Ascomycotina, Klasse Discomycotina, Ordnung Pezizales, Familie Sarcosomaraceae, Gattung Galiella) wie dort oder in der Dissertation von H.-J. Knerr, Universität Kaiserslautern 1995 beschrieben, gewonnen werden. Über seine Anwendung als Arzneimittel ist bisher nicht berichtet worden. Galiella rufa ist beispielsweise beschrieben in: Gary H. Lincoff, Carol Nehring, The Audubon Society Field Guide to North American Mushrooms, Alfred A. Knopf, New York 1981. The Galliela lactone of formula (I) is known from Z. Naturforsch. 1990, 45c: 1093-8 (and the dissertation by R. Hautzel, University of Kaiserslautern 1989) and can from the mushroom Galiella rufa (subdivision Ascomycotina, class Discomycotina, Order Pezizales, family Sarcosomaraceae, genus Galiella) as there or in the Dissertation by H.-J. Knerr, University of Kaiserslautern described in 1995 become. No use has been reported of its use as a medicinal product. Galiella rufa is described, for example, in: Gary H. Lincoff, Carol Nehring, The Audubon Society Field Guide to North American Mushrooms, Alfred A. Knopf, New York 1981.
Galiella-Lacton hat die nachfolgend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften. Galiella-Lacton bildet weiße Kristalle, die sich in polaren Lösungs mitteln (Methanol, Pyridin, Ethylacetat, Acetonitril, tert-Butylmethylether (tBME) Tetrahydrofuran (THF) und Wasser) gut und in unpolaren Lösungsmitteln (Cyclohexan, n-Pentan, n-Hexan) kaum lösen. Mit Hilfe der Massenspektren (Tabelle 1) konnte zunächst das Molekulargewicht, 194 Da, und dann die Summenformel, C11H14O3, ermittelt werden.Galiella lactone has the physical and chemical properties described below. Galiella lactone forms white crystals that form well in polar solvents (methanol, pyridine, ethyl acetate, acetonitrile, tert-butyl methyl ether (tBME) tetrahydrofuran (THF) and water) and in non-polar solvents (cyclohexane, n-pentane, n-hexane ) hardly solve. With the help of the mass spectra (Table 1) it was first possible to determine the molecular weight, 194 Da, and then the molecular formula, C 11 H 14 O 3 .
Die Strukturaufklärung erfolgte mittels zweidimensionaler homo- und hetero nuklearer NMR-Spektroskopie (1H und 13C). Tabelle 2 kann die Zuordnung der NMR-Signale zu den jeweiligen Kernen entnommen werden. Das UV-Spektrum von Galiella-Lacton zeigt ein Maximum bei 219 nm. Der Tabelle 3 können die charakteristischen Peaks des IR-Spektrums samt ihrer Zuordnung entnommen werden. The structure was elucidated using two-dimensional homo- and hetero-nuclear NMR spectroscopy ( 1 H and 13 C). Table 2 shows the assignment of the NMR signals to the respective nuclei. The UV spectrum of Galiella lactone shows a maximum at 219 nm. Table 3 shows the characteristic peaks of the IR spectrum and their assignment.
Die Erfindung betrifft auch pharmakologisch wirksame Derivate des Galiella- Lactons und deren Verwendung analog dem Galiella-Lacton.The invention also relates to pharmacologically active derivatives of Galiella Lactons and their use analogous to the Galiella lactone.
In den Dreißiger Jahren des letzten Jahrhunderts wurden die zu Veränderungen in Organsystemen führenden Entzündungserscheinungen zum ersten Mal eingehender untersucht. Dies führte zur Entdeckung des C-reactive Proteins (so benannt, da es mit dem C-Polysaccharid von Pneumococcen reagiert) im Plasma von Patienten während der akuten Phase einer von Pneumococcen ausgelösten Pneumonie. Seitdem werden alle mit einer Entzündung einhergehenden systemischen Veränderungen unter dem Begriff 'Acute Phase Response' zusammengefasst, dies gilt auch für chronische Entzündungserscheinungen. In the thirties of the last century, the changes in Organ systems leading to inflammation for the first time in depth examined. This led to the discovery of the C-reactive protein (so named because it is associated with the C polysaccharide of pneumococci) in the plasma of patients during the acute phase of pneumonia caused by pneumococci. Since then all systemic changes associated with inflammation under the The term 'acute phase response' summarized, this also applies to chronic Inflammation.
Eher willkürlich werden zwei Aspekte der 'Acute Phase Response' unterschieden: So werden zum einen Konzentrationsänderungen von vielen Proteinen im Plasma, den sog. 'Acute Phase' Proteinen (AP Proteinen), beobachtet (siehe Tabelle 4) und zum anderen treten Änderungen im Verhalten und im allgemeinen physiologischen Zustand auf (siehe Tabelle 5). Letztere werden natürlich von Ersteren bedingt. Ein Protein wird per definitionem in die Gruppe der AP Proteine eingeordnet, wenn seine Plasmakonzentration während entzündlicher Erkrankungen um mindestens 25% steigt (positive AP Proteine) oder sinkt (negative AP Proteine) (vgl. z. B. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982, 389: 406-18). Die Konzentrationsänderungen der AP Proteine gehen hauptsächlich auf ihre veränderte Syntheserate in der Leber zurück. Two aspects of the 'acute phase response' are distinguished rather arbitrarily: on the one hand, changes in the concentration of many proteins in plasma, the So-called 'acute phase' proteins (AP proteins), observed (see Table 4) and at others occur changes in behavior and in general physiological Condition on (see table 5). The latter are of course conditioned by the former. On Protein is by definition classified in the group of AP proteins if its Plasma concentration during inflammatory diseases by at least 25% increases (positive AP proteins) or decreases (negative AP proteins) (see e.g. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1982, 389: 406-18). The concentration changes of the AP proteins are mainly due to their altered synthesis rate in the liver.
Die Höhe der Induktion der einzelnen Proteine ist sehr unterschiedlich. So steigt der Plasmaspiegel von Ceruloplasmin gerade um 50%, während der des C-reactive Proteins um den Faktor 1000 steigt.The level of induction of the individual proteins is very different. So it rises Plasma levels of ceruloplasmin just around 50%, while that of the C-reactive Protein increases by a factor of 1000.
'Signal Transducer and Activator of Transcription 3' (Stat3) nimmt eine besondere
Rolle zur Steuerung der Expression von Genen ein, die in ihrer Promotorsequenz ein
'IL-6 Responsive Element der Klasse II' (IL-6RE II, synonym mit 'Acute Phase
Responsive Element', APRE) aufweisen (5'-TTNNNNAA-3' oder 5'-TTNNN-
NNAA-3'). Insofern ist Stat3 ein Transkriptionsfaktor. Die physiologische Aktivität
von Stat3 zur Kontrolle der Genexpression unterliegt jedoch dem folgenden
Regulationsprinzip:
Durch Bindung von IL-6 an einen Rezeptor-Komplex bestehend aus dem IL-6
Rezeptor und zwei gp130 Molekülen kommt es zur Aktivierung der gp130-
assoziierten Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2. Diese phosphorylieren zunächst Tyrosin-
Reste im cytoplasmatischen Teil von gp130, welche dadurch zu Bindungsstellen für
die SH2-Domänen von Stat1 und Stat3 werden. Nach Bindung der Stats werden
diese von den Jaks an spezifischen Tyrosin-Resten phosphoryliert und bilden
anschließend Homo- oder Hetero-dimere aus. Die aktivierten Dimere werden in den
Kern transloziert, binden dort an IL-6RE II und induzieren nachfolgend die
Transkription der Zielgene. Auf ihrem Weg in den Zellkern oder im Zellkern werden
die Dimere noch an spezifischen Serin-Resten von einer noch unbekannten Serin-
Kinase phosphoryliert (Biochem. J., 1998, 334: 297-314).'Signal Transducer and Activator of Transcription 3' (Stat3) plays a special role in controlling the expression of genes which have an 'IL-6 Responsive Element of Class II' (IL-6RE II, synonymous with 'Acute Phase' in their promoter sequence Responsive Element ', APRE) have (5'-TTNNNNAA-3' or 5'-TTNNN-NNAA-3 '). In this respect, Stat3 is a transcription factor. However, the physiological activity of Stat3 to control gene expression is subject to the following regulatory principle:
By binding IL-6 to a receptor complex consisting of the IL-6 receptor and two gp130 molecules, the gp130-associated kinases Jak1, Jak2 and Tyk2 are activated. These first phosphorylate tyrosine residues in the cytoplasmic part of gp130, which thereby become binding sites for the SH2 domains of Stat1 and Stat3. After binding of the stats, the Jaks phosphorylate them on specific tyrosine residues and then form homo- or hetero-dimers. The activated dimers are translocated into the nucleus, bind there to IL-6RE II and subsequently induce the transcription of the target genes. On their way into the cell nucleus or in the cell nucleus, the dimers are phosphorylated on specific serine residues by an as yet unknown serine kinase (Biochem. J., 1998, 334: 297-314).
Ein entscheidendes Merkmal von Stat3 gegenüber anderen Transkriptionsfaktoren ist, dass Stat3 ein primärer Transkriptionsfaktor ist. Primäre Transkriptionsfaktoren sind in inaktiver Form bereits in der Zelle vorhanden und werden nach einem entsprechenden Stimulus aktiviert, um ihre Wirkung sehr schnell entfalten zu können. Primäre Transkriptionsfaktoren werden nicht erst durch die Aktivierung des zugehörigen Gens und anschließende Transkription und Translation gebildet.A key feature of Stat3 compared to other transcription factors is that Stat3 is a primary transcription factor. Primary transcription factors are already present in the cell in inactive form and are appropriate stimulus activated to develop its effect very quickly can. Primary transcription factors are not only activated by activating the associated gene and subsequent transcription and translation.
Da die oben erwähnten gp130-assoziierten Kinasen Jak1, Jak2 und Tyk2 auch an anderen intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sind, die aufgrund der hieraus resultierenden unerwünschten Wirkungen nicht inhibiert werden sollen, stellen sie keine geeigneten Ziele für eine selektive Inhibition der Stat3 vermittelten Genexpression dar. Eine chemische Verbindung, die selektiv die Bindung von Stat3 an seine DNA-Bindungsstellen (IL-6RE II, siehe oben) verhindert, soll dagegen als Pharmazeutikum zur Unterdrückung von Stat3- und somit auch IL-6-vermittelten Krankheitsprozessen Verwendung finden.Since the gp130-associated kinases Jak1, Jak2 and Tyk2 mentioned above also appear other intracellular signal transduction pathways involved, which are due to the undesirable effects resulting therefrom should not be inhibited, do not set appropriate targets for selective inhibition of Stat3 mediated Gene expression. A chemical compound that selectively binds Stat3 to its DNA binding sites (IL-6RE II, see above), is said to be Pharmaceutical for the suppression of Stat3- and thus also IL-6-mediated Find disease processes.
Primär kann Stat3 alle pathophysiologischen Prozesse fördern, an denen Gene beteiligt sind, die in ihrem Promotor die Stat3 Bindesequenz (IL-6RE II) aufweisen. Namentlich sind dies Gene, die bei immunologischen Komplikationen, bei Entzündungskrankheiten, septischem Schock, degenerativen Erkrankungen wie der sekundären Amyloidose oder aber auch bei chronisch-entzündlichen Krankheiten wie der Leberzirrhose eine entscheidende ursächliche Rolle spielen. Einen Überblick über die bei der gesteigerten Aktivität von Stat3 auftretenden Veränderungen gibt Tab. 5.Stat3 can primarily promote all pathophysiological processes involving genes are involved, which have the Stat3 binding sequence (IL-6RE II) in their promoter. These are genes that are involved in immunological complications Inflammatory diseases, septic shock, degenerative diseases like that secondary amyloidosis or even in chronic inflammatory diseases such as cirrhosis play a crucial causal role. An overview of the changes that occur with the increased activity of Stat3 are given in Table 5.
Die 'Acute Phase Response' tritt auf bei Infektionen, Traumata, Operationen, Verbrennungen, Organschäden und fortgeschrittenen Stadien von malignen Erkran kungen.The 'acute phase response' occurs in infections, trauma, surgery, Burns, organ damage and advanced stages of malignant disease fluctuations.
Der Hauptmediator der 'Acute Phase Response' ist Interleukin-6 (IL-6). Darüber hinaus nimmt IL-6 Einfluss auf eine Vielzahl physiologischer Prozesse. Genannt seien beispielsweise Metabolismus der Knochen, Hämatopoese, Immunantwort, Endzündungsprozesse, Entwicklung der Nervenzellen sowie Zellproliferation. Von entscheidender Bedeutung ist jedoch die Rolle von IL-6 bei der Entstehung der Leberzirrhose (Gastroenterology 1994, 107: 789-98). Bei Patienten mit Leberzirrhose wird eine positive Korrelation zwischen dem Plasmaspiegel an IL-6 und dem Organversagen sowie der gesteigerten Sekretion an IgA und IgG durch periphere Monocyten beobachtet (Gastroenterology 1992, 103: 1296-301; Jama 1995; 274: 58- 65). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass IL-6 die Expression von Fibrinogen in der Leber induziert (Science 1996, 274: 1379-83). Von diesen Veränderungen wird angenommen, dass sie eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von fibrösem Gewebe in der erkrankten Leber spielen, welches letztlich zur Leberzirrhose führt (Drug Discovery Today 1998, 3: 202-13).The main mediator of the acute phase response is interleukin-6 (IL-6). About that IL-6 also influences a large number of physiological processes. Called Examples include bone metabolism, hematopoiesis, immune response, Inflammatory processes, development of nerve cells and cell proliferation. Of however, the role of IL-6 in the emergence of Liver cirrhosis (Gastroenterology 1994, 107: 789-98). In cirrhotic patients there is a positive correlation between the plasma level at IL-6 and the Organ failure and the increased secretion of IgA and IgG by peripheral Monocytes observed (Gastroenterology 1992, 103: 1296-301; Jama 1995; 274: 58- 65). Furthermore it could be shown that IL-6 expresses fibrinogen in the liver induced (Science 1996, 274: 1379-83). Of these changes believed to play a pivotal role in the development of fibrous tissue play in the diseased liver, which ultimately leads to cirrhosis of the liver (drug Discovery Today 1998, 3: 202-13).
Die erfindungsgemäße Wirkung des Galiella-Lactons beruht auf der spezifischen Hemmung der IL-6 Signalinduktion. Galiella-Lacton eignet sich daher generell zur Prophylaxe und/oder Behandlung entzündlicher Prozesse und ihrer Folgeerscheinungen.The effect of the Galiella lactone according to the invention is based on the specific Inhibition of IL-6 signal induction. Galiella lactone is therefore generally suitable for Prophylaxis and / or treatment of inflammatory processes and their Sequelae.
Stat3 ist ebenfalls ein wesentlicher Faktor bei der Regulation des Zellwachstums, des Überlebens von Zellen und bei der Zelldifferenzierung (Oncogene 2000, 19: 2548- 2556). Es konnte gezeigt werden, dass z. B. in Rattentumoren und humanen Prostata tumoren Stat3 konstitutiv aktiviert ist und dass diese Aktivierung mit dem malignen Potential der Tumore korreliert (Cancer Research 2000, 60: 1225-1228). Die Inhibition von Stat3 inhibiert das Wachstum von Prostata-Tumorzellen signifikant. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aktivierung von Stat3 essentiell ist für die Pro gression von Prostata-Tumorzellen und dass deren Inhibierung ein großes therapeu tisches Potential zur Behandlung von Prostatatumoren besitzt.Stat3 is also an essential factor in regulating cell growth, the Survival of cells and in cell differentiation (Oncogene 2000, 19: 2548- 2556). It could be shown that e.g. B. in rat tumors and human prostate tumors Stat3 is constitutively activated and that this activation with the malignant Potential of the tumors correlated (Cancer Research 2000, 60: 1225-1228). The Inhibition of Stat3 significantly inhibits the growth of prostate tumor cells. These results show that the activation of Stat3 is essential for the pro gression of prostate tumor cells and that their inhibition is a great therapeu has potential for the treatment of prostate tumors.
Die Bedeutung der Aktivierung von Stat3 ist auch für andere Tumorarten be schrieben worden, so z. B. für die im Englischen als Head- and Neck Cancer zusammengefassten Tumore im Kopf-, Hals- und Nackenbereich (nachstehend als Kopf und Halskrebs bezeichnet), für Brustkrebs und Gebärmutterkrebs (Internatio nal Journal of Onkology 2000, 17: 23-28) sowie Melanome (Hautkrebs), Tumore am Eierstock, Gliome (Gehirntumore) und Lungentumore (Molecular Medicine Today 1999, 5. 406-412).The importance of Stat3 activation is also important for other types of tumors have been written, e.g. B. for head and neck cancer summarized tumors in the head, neck and neck area (hereinafter referred to as Head and neck cancer), for breast cancer and uterine cancer (Internatio nal Journal of Onkology 2000, 17: 23-28) and melanoma (skin cancer), tumors on Ovary, glioma (brain tumors) and lung tumors (Molecular Medicine Today 1999, 5,406-412).
Insbesondere eignet sich Galiella-Lacton zur Prophylaxe und Behandlung von
Galiella lactone is particularly suitable for the prophylaxis and treatment of
- - fibrotischen Erkrankungen der Leber und anderer Organe,- fibrotic diseases of the liver and other organs,
- - zerebrovaskulären Erkrankungen wie z. B. Schlaganfall, traumatische Verletzun gen des Gehirns oder Rückenmarks und deren Folgen,- Cerebrovascular diseases such as B. stroke, traumatic injury brain or spinal cord and their consequences,
- - Autoimmunkrankheiten, die das ZNS oder PNS betreffen, wie z. B. Multiple Sklerose, periphere Autoimmunneuropathien,- Autoimmune diseases affecting the CNS or PNS, such as B. Multiple Sclerosis, peripheral autoimmune neuropathies,
- - chronisch neurodegenerative Erkrankungen wie z. B. Alzheimer'sche Erkrankung, Parkinson'sche Krankheit,- chronic neurodegenerative diseases such as B. Alzheimer's disease, Parkinson's disease,
- - Erkrankungen der Psyche wie z. B. Depressionen, Angst, Psychosen,- Diseases of the psyche such as B. depression, anxiety, psychosis,
- - periphere Neuropathien verschiedener Ursache wie z. B. diabetische Neuropathie,- peripheral neuropathies of various causes such as B. diabetic neuropathy,
- - Behandlung von Schmerz verursacht durch sowohl zentrale als auch periphere pathophysiologische Mechanismen,- Treatment of pain caused by both central and peripheral pathophysiological mechanisms,
- - kardiovaskuläre Erkrankungen wie koronare Herzerkrankungen, Arteriosklerose und Restenose, - Cardiovascular diseases such as coronary heart diseases, arteriosclerosis and restenosis,
- - Entzündungskrankheiten des Gastrointestinaltraktes wie Crohn'sche Krankheit (Enteritis regionalis),Inflammatory diseases of the gastrointestinal tract such as Crohn's disease (Regional enteritis),
- - Amyloidosen wie rheumatoide Arthritis und- amyloidoses such as rheumatoid arthritis and
- - Stat3 abhängigen Tumoren wie Kopf und Hals-, Brust-, Gebärmutter- und Prostatakrebs sowie Melanomen, Eierstocktumoren, Gliomen und Lungen karzinomen.- Stat3 dependent tumors such as head and neck, breast, uterus and Prostate cancer as well as melanoma, ovarian tumors, gliomas and lungs carcinomas.
Zur vorliegenden Erfindung gehören auch pharmazeutische Zubereitungen, die neben inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfs- und Trägerstoffen Galiella- Lacton enthalten, oder die aus Galiella-Lacton bestehen, sowie Verfahren zur Her stellung dieser Zubereitungen.The present invention also includes pharmaceutical preparations which, in addition to inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients and carriers Galiella Contain lactone, or which consist of Galiella lactone, and methods for Her provision of these preparations.
Galiella-Lactone soll in diesen Zubereitungen in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-%, bevorzugt von 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.Galiella lactones are said to have a concentration of 0.1 to 99.5% by weight, preferably from 0.5 to 95% by weight, of the total mixture may be present.
Neben Galiella-Lacton können die pharmazeutischen Zubereitungen auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.In addition to galiella lactone, the pharmaceutical preparations can also do other things contain active pharmaceutical ingredients.
Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können in üblicher Weise nach bekannten Methoden hergestellt werden, beispielsweise mit dem oder den Hilfs- oder Trägerstoffen.The pharmaceutical preparations listed above can be used in a conventional manner are produced by known methods, for example with the auxiliary or carriers.
Üblicherweise sollen Galiella-Lactone in Gesamtmengen von etwa 0,01 bis etwa 100 mg/kg, bevorzugt in Gesamtmengen von etwa 1 mg/kg bis 50 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung des ge wünschten Ergebnisses verabreicht werden.Usually Galiella lactones in total amounts from about 0.01 to about 100 mg / kg, preferably in total amounts of about 1 mg / kg to 50 mg / kg body weight 24 hours each, possibly in the form of several individual doses, to achieve the ge desired result.
Es kann aber gegebenenfalls vorteilhaft sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von der Art und vom Körpergewicht des behandelten Objekts, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament der Art und Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung und Applikation, sowie dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichung erfolgt.However, it may be advantageous to deviate from the quantities mentioned, depending on the type and body weight of the person being treated Object, of individual behavior towards the drug of the kind and Severity of the disease, the type of preparation and application, and the Time or interval at which the administration takes place.
Die Wirkung wird anhand der folgenden Beispiele belegt, ohne dass eine Beschrän kung daraus abzuleiten ist. The effect is demonstrated by the following examples, without any limitation derive from this.
Für grundlegende Beispielversuche zum Nachweis der Hemmung der IL-6 und Stat3 vermittelten Genexpression wurde folgender biologischer Test durchgeführt:For basic example experiments to demonstrate the inhibition of IL-6 and Stat3 mediated gene expression, the following biological test was carried out:
Als Ausgangsvektor fand der Vektor pTK/SEAP (Biochem. Biophys. Res.
Commun., 1996, 226: 214-21) Verwendung (siehe Fig. 1), welcher als Reportergen
das Gen der Sekretierten Alkalischen Phosphatase (SEAP) enthält. Dieser wurde mit
dem Restriktionsenzym NheI linearisiert und anschließend dephosphoryliert. Die
folgenden Oligonucleotide
The vector pTK / SEAP (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, 226: 214-21) was used as the starting vector (see FIG. 1), which contains the gene of the secreted alkaline phosphatase (SEAP) as a reporter gene. This was linearized with the restriction enzyme NheI and then dephosphorylated. The following oligonucleotides
die eine Bindungsstelle für Stat3- und Stat1-Proteine enthalten (vgl. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 3041-5), wurden phosphoryliert, ligiert und mit Ethanol präzipitiert. Die charakteristische Konkatemer-Leiter wurde mittels Polyacrylamid gelelektrophorese (PAGE) überprüft.which contain a binding site for Stat3 and Stat1 proteins (cf. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 1995, 92: 3041-5), were phosphorylated, ligated and with ethanol precipitated. The characteristic concatemer ladder was made using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) checked.
Der linearisierte Vektor wurde mit den Konkatemeren ligiert. Der Vektor, der 8 hintereinander insertierte Kopien der oben dargestellten Oligonucleotide mit der Stat3/1-Erkennungssequenz enthielt, wurde ausgewählt (siehe Fig. 2). Dadurch wird die Expression der SEAP im so entstandenen rekombinanten Plasmid durch die Bindungsstellen für Stat3/1 reguliert. Dieses Expressionskonstrukt wurde zur Analyse der DNA-Sequenzierung unterworfen und in die humane Leberkarzinom zellinie HepG2 (American Type Culture Collection, 12301 Parklane Drive, Rockville, Maryland 20852, USA) transfiziert. The linearized vector was ligated to the concateres. The vector containing 8 consecutively inserted copies of the oligonucleotides shown above with the Stat 3/1 recognition sequence was selected (see FIG. 2). This regulates the expression of the SEAP in the resulting recombinant plasmid through the binding sites for Stat3 / 1. This expression construct was subjected to DNA sequencing analysis and transfected into the human liver carcinoma cell line HepG2 (American Type Culture Collection, 12301 Parklane Drive, Rockville, Maryland 20852, USA).
Die HepG2-Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C in 50 ml DMEM-Medium (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Dieselstr. 5, 76344 Eggenstein) mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin ( 100 iu) in 600 ml Zellkulturflaschen kultiviert. 24 h vor Versuchsbeginn wurde das Medium erneuert. Am Versuchstag wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung abgelöst und bei 1000×g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet in 0,2 ml kaltem Hebs-Puffer (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4, 6 mM Dextrose, pH 7,05) resuspendiert. Mit Hilfe einer Zählkammer wurde die Zellzahl bestimmt und auf 6-8 × 106 Zellen/ml eingestellt.The HepG2 cells were in a moist atmosphere with 5% CO 2 at 37 ° C in 50 ml DMEM medium (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein) with 10% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu) cultivated in 600 ml cell culture bottles. The medium was replaced 24 hours before the start of the experiment. On the day of the experiment, the cells were detached by trypsin treatment and centrifuged at 1000 × g and 4 ° C. The supernatant was decanted and the cell pellet resuspended in 0.2 ml of cold Hebs buffer (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na 2 HPO 4 , 6 mM dextrose, pH 7.05). The cell number was determined with the aid of a counting chamber and set to 6-8 × 10 6 cells / ml.
In sterilen Elektroporationsküvetten (Elektrodenabstand 0,4 cm) wurde je 100 µg Plasmid-DNA vorgelegt, pro Küvette jeweils 400 µl Zellsuspension zugegeben und gründlich gemischt. Dieser Ansatz wurde 10 min auf Eis vorinkubiert. Die Elektroporation erfolgte bei 200 Volt und 960 µF mit Zeitkonstanten zwischen 40-60 ms (Gene Pulser™, Fa. BioRAD, München). Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 21 ml OptiMEM-Medium (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Dieselstr. 5, 76344 Eggenstein) mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin (100 iu) suspendiert und je 200 µl dieser Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-Lochmikrotiterplatte pipettiert.In sterile electroporation cuvettes (electrode spacing 0.4 cm) 100 µg each Plasmid DNA submitted, 400 ul cell suspension added to each cuvette and mixed thoroughly. This approach was pre-incubated on ice for 10 min. The Electroporation was performed at 200 volts and 960 µF with time constants between 40-60 ms (Gene Pulser ™, BioRAD, Munich). After 10 minutes incubation at The cells were room temperature in 21 ml OptiMEM medium (Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Dieselstr. 5, 76344 Eggenstein) with 10% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu) suspended and 200 ul of this cell suspension pipetted into the wells of a 96-well microtiter plate.
Nach der Elektroporation wurden die Zellen 24 h inkubiert. Anschließend wurde das OptiMEM-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin ( 100 iu) gegen OptiMEM-Medium mit 0,5% fötalem Kälberserum und Penicillin/ Streptomycin ( 100 iu) ausgetauscht. In diesem waren zuvor die zu testenden Verbin dungen in den jeweiligen Konzentrationen aufgenommen worden. Zusätzlich wurde bei jedem Ansatz als Induktor IL-6 (Endkonzentration: 10 ng/ml) zugegeben. Als Kontrollen dienten stimulierte und nicht stimulierte Ansätze. After electroporation, the cells were incubated for 24 hours. Then that was OptiMEM medium with 10% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu) against OptiMEM medium with 0.5% fetal calf serum and penicillin / Streptomycin (100 iu) exchanged. This was previously the verb to be tested in the respective concentrations. In addition added to each batch as an inducer IL-6 (final concentration: 10 ng / ml). As Controls served stimulated and non-stimulated approaches.
Cytotoxische Effekte der Verbindungen auf die Zellen wurden mikroskopisch nach 24 h untersucht. Ebenfalls nach 24 h wurde mit Hilfe des Phospha-Light™ Chemo lumineszenz-Assays (Fa. Perkin-Elmer Applied Biosystems, Langen) die SEAP- Aktivität bestimmt, welche unter den gewählten Bedingungen direkt proportional zur SEAP-Konzentration in der analysierten Probe ist. Die Chemolumineszenz wurde in 96-Lochmikrotiterplatten mit einem Luminometer (Labsystems Luminoskan RT, Fa. Labsystems, Frankfurt/M) gemessen.Cytotoxic effects of the compounds on the cells were examined microscopically Examined 24 h. The Phospha-Light ™ chemo was also used after 24 hours luminescence assays (from Perkin-Elmer Applied Biosystems, Langen) the SEAP Activity determines which is directly proportional to the under the chosen conditions SEAP concentration is in the analyzed sample. The chemiluminescence was in 96-well microtiter plates with a luminometer (Labsystems Luminoskan RT, Fa. Labsystems, Frankfurt / M) measured.
Beispielsweise betragen nach Induktion mit IL-6 die Konzentration der halbmaxi malen SEAP Synthese-Inhibition (IC50) der Verbindung der Formel (I) (Galiella- Lacton) 50-100 nM. Diese Verbindung stellt damit einen potenten Inhibitor der IL-6 induzierten und Stat3 vermittelten SEAP Synthese dar.For example, after induction with IL-6, the concentration of the half-maximum SEAP synthesis inhibition (IC 50 ) of the compound of the formula (I) (Galiella lactone) is 50-100 nM. This compound is a potent inhibitor of IL-6-induced and Stat3-mediated SEAP synthesis.
Ein entscheidender Schritt bei der IL-6 abhängigen intrazellulären Signaltransduktion stellt die Phosphorylierung von Tyrosin-705 bei Stat3 bzw. Tyrosin-701 bei Stat1 dar. Wird diese Phosphorylierung verhindert, so wird auch die IL-6 abhängige Signalkaskade unterbrochen und es kommt nicht zu der ansonsten zu beobachtenden IL-6 induzierten Expression der Zielgene. Jedoch werden durch Inhibitoren, welche die Stat3 bzw. Stat1 Phosphorylierung hemmen, auch andere Signalkaskaden maß geblich beeinflusst, daher sollten pharmazeutisch einsetzbare Inhibitoren der IL-6 abhängigen Genexpression in dem Konzentrationsbereich, in dem sie ihre pharmako logische Wirkung entfalten, die Stat3 bzw. Stat1 Phosphorylierung nicht oder nur gering beeinflussen.A crucial step in IL-6 dependent intracellular signal transduction represents the phosphorylation of tyrosine-705 at Stat3 and tyrosine-701 at Stat1 If this phosphorylation is prevented, the IL-6 also becomes dependent Signal cascade interrupted and the otherwise observable does not occur IL-6 induced expression of the target genes. However, inhibitors, which the Stat3 or Stat1 inhibit phosphorylation, also measured other signal cascades influenced, so pharmaceutically acceptable inhibitors of IL-6 dependent gene expression in the concentration range in which they pharmaco Develop a logical effect, the Stat3 or Stat1 phosphorylation not or only influence little.
Daher wurde zum weiteren Nachweis der Hemmung der IL-6 induzierten Phosphory lierung von Stat3 und Stat1 folgender biologischer Test durchgeführt. Therefore, the IL-6 induced phosphory was further inhibited Stat3 and Stat1 following biological test carried out.
Im folgenden ist die Vorgehensweise für diesen Nachweis dargestellt:
HepG2-Zellen in Petrischalen (Durchmesser: 10 cm) aussäen (OptiMEM-Medium)
mit 10% fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin ( 100 iu) Zelldichte:
5 × 105 Zellen/ml). Für 24 h in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C
inkubieren. Medium gegen frisches OptiMEM-Medium mit 0,5% fötalem Kälber
serum und Penicillin/Streptomycin ( 100 iu) austauschen und weitere 48 h inkubieren.
Medium gegen frisches OptiMEM-Medium mit 0,5% fötalem Kälberserum und
Penicillin/Streptomycin ( 100 iu) austauschen, Testsubstanzen in verschiedenen
Konzentrationen zugeben und für 60 min inkubieren. Pro Ansatz (10 ml) wurden 5 µl
der in Ethanol gelösten Substanzen zugegeben bzw. nur Ethanol (Kontrollen). Zellen
durch Zugabe von IL-6 (Endkonzentration 50 ng/ml) induzieren.The procedure for this verification is shown below:
Sow HepG2 cells in Petri dishes (diameter: 10 cm) (OptiMEM medium) with 10% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu) cell density: 5 × 10 5 cells / ml). Incubate for 24 h in a humid atmosphere with 5% CO 2 at 37 ° C. Exchange medium for fresh OptiMEM medium with 0.5% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu) and incubate for a further 48 h. Exchange medium for fresh OptiMEM medium with 0.5% fetal calf serum and penicillin / streptomycin (100 iu), add test substances in different concentrations and incubate for 60 min. 5 µl of the substances dissolved in ethanol were added per batch (10 ml) or only ethanol (controls). Induce cells by adding IL-6 (final concentration 50 ng / ml).
Nach 20 min Medium entfernen und Zelirasen zweimal mit jeweils 1,5 ml eiskaltem PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4 × 2H2O, 1,5 mM KH2PO4) waschen. 1,5 ml Extraktionspuffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 500 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 : 50 Complete Protease-Inhibitor-Cocktail (Roch Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemi cals, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Deutschland), pH 7,5) zugeben, Zellen mit einem Zellschaber abschaben und in ein 10 ml- Zentrifugenröhrchen überführen. Petrischale mit 1,5 ml Extraktionspuffer waschen und die erhaltene Suspension mit der aus Punkt 7. vereinigen. Suspension bei 4°C für 30 min (3000 × g) pelletieren. Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen. 90 µl Protein-A-Sepharose (50 : 50 in PBS) zugeben und 2 h bei 4°C 'end-over-end' rotieren. Suspension bei 4°C für 5 min (3000 × g) pelletieren. Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen über führen. 5 µl Stat3-Antikörper zugeben und über Nacht bei 4°C 'end-over-end' rotieren. 90 µl Protein-A-Sepharose (50 : 50 in PBS) zugeben und 2 h bei 4°C 'end over-end' rotieren. Suspension bei 4°C für 5 min (3000 × g) pelletieren. Überstand verwerfen. Pellet zweimal mit Wasch-Puffer 1 (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,2% NP-40, pH 7,5), einmal mit Wasch-Puffer 2 (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0,2% NP-40, pH 7,5) und einmal mit Wasch-Puffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5) waschen. Suspension bei 4°C für 10 min (3000 × g) pelle tieren und Überstand sorgfältig entfernen. Nach Zugabe von 80 µl Waschpuffer 3 und 40 µl SDS-Gelpuffer (50 mM, Tris-HCl, 100 mM Dithiothreitol, 2% SDS, 0,1% Bromphenol Blau, 10% Glyzerin) zum Pellet wird dieses für 5 min im Wasserbad gekocht. Suspension bei 4°C für 1 min (10000 × g) pelletieren.After 20 min remove the medium and wash the cellulose grass twice with 1.5 ml ice-cold PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4 × 2H 2 O, 1.5 mM KH 2 PO 4 ) , 1.5 ml extraction buffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 2 mM EGTA, 500 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 , 1:50 Complete Protease Inhibitor- Add cocktail (Roch Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Germany), pH 7.5), scrape cells with a cell scraper and transfer them to a 10 ml centrifuge tube. Wash the Petri dish with 1.5 ml extraction buffer and combine the suspension obtained with that from point 7. Pellet suspension at 4 ° C for 30 min (3000 × g). Transfer the supernatant to a new centrifuge tube. Add 90 µl Protein-A-Sepharose (50:50 in PBS) and rotate 'end-over-end' at 4 ° C for 2 h. Pellet suspension at 4 ° C for 5 min (3000 × g). Transfer the supernatant into a new centrifuge tube. Add 5 µl Stat3 antibody and rotate end-over-end at 4 ° C overnight. Add 90 µl Protein-A-Sepharose (50:50 in PBS) and rotate 'end over-end' at 4 ° C for 2 h. Pellet suspension at 4 ° C for 5 min (3000 × g). Discard the supernatant. Pellet twice with wash buffer 1 (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.2% NP-40, pH 7.5), once with wash buffer 2 (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0.2% NP-40, pH 7.5) and wash once with wash buffer 3 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5). Pellet the suspension at 4 ° C for 10 min (3000 × g) and carefully remove the supernatant. After adding 80 µl washing buffer 3 and 40 µl SDS gel buffer (50 mM, Tris-HCl, 100 mM dithiothreitol, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol) to the pellet, this is boiled for 5 min in a water bath , Pellet suspension at 4 ° C for 1 min (10000 × g).
20 µl des Überstandes wurden auf einem 6,5-%igen SDS-Polyacrylamidgel mit ei nem 5-%igen Sammelgel (16 × 18 cm) elektrophoretisch aufgetrennt (7°C, 10 V/cm, 25 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3). Nach Ende der Elektrophorese wurden die Gele in Elektrotrans-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Metha nol, pH 8,3) äquilibriert. Anschließend wurden die Proteine mit Hilfe eines Elektro blotters (Trans-Blot SD, Fa. BioRad, München) bei 25 V auf eine vliesverstärkte Nitrocellulosemembran (Optitran, Fa. Schleicher & Schüll, Dassel) transferiert.20 ul of the supernatant were on a 6.5% SDS polyacrylamide gel with egg a 5% bulk gel (16 × 18 cm) electrophoresed (7 ° C, 10 V / cm, 25mM Tris, 250mM Glycine, 0.1% SDS, pH 8.3). After electrophoresis the gels were dissolved in electrotrans buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% metha nol, pH 8.3) equilibrated. The proteins were then removed using an electro blotters (Trans-Blot SD, BioRad, Munich) at 25 V on a fleece-reinforced Nitrocellulose membrane (Optitran, Schleicher & Schüll, Dassel) transferred.
Vor Applikation der jeweiligen Antikörper wurden die Membranen in Blocking- Puffer I (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5% (w/v) Magermilch pulver, 0,1% Tween-20) über Nacht bei 4°C inkubiert. Primäre Phospho-Stat3- Antikörper wurden 1 : 2500 in Blocking-Puffer II (250 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5% (w/v) Rinderserumalbumin, 0,1% Tween-20) verdünnt und über Nacht bei 4°C mit der Membran inkubiert. Die Vorgehensweise bei den sekundären Antikörpern war analog, jedoch wurde hier der Blocking-Puffer I verwendet. Zwi schen den Applikationen der Antikörper wurde mehrmals für 20 min mit Wasch- Puffer (25 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Tween-20) gewaschen. Um die Proteine sichtbar zu machen, wurden als sekundäre Antikörper Konjugate mit der Meerrettich-Peroxidase gewählt. Der Nachweis geschieht hierbei mittels Chemolumineszenz und erfolgte gemäß Herstellerangaben (Fa. New England Biolabs, Beverly, USA).Before applying the respective antibodies, the membranes were blocked Buffer I (25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 5% (w / v) skim milk powder, 0.1% Tween-20) incubated overnight at 4 ° C. Primary Phospho-Stat3- Antibodies were 1: 2500 in blocking buffer II (250 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5% (w / v) bovine serum albumin, 0.1% Tween-20) and diluted Incubated overnight at 4 ° C with the membrane. The procedure with the secondary Antibodies were analogous, but blocking buffer I was used here. Zwi The applications of the antibodies were washed several times for 20 minutes with Buffer (25mM Tris-HCl, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.1% Tween-20) was washed. To make the proteins visible, conjugates were used as secondary antibodies chosen with the horseradish peroxidase. The proof is done by means of Chemiluminescence and was carried out according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs, Beverly, USA).
Die Verbindung der Formel (I) (Galiella-Lacton) hatte bei allen getesteten Konzen tration (bis 16 µg/ml entspr. 165 µM) keinen Einfluss auf die Phosphorylierung von Stat3 oder Stat1. The compound of formula (I) (Galiella lactone) had in all the tested conces tration (up to 16 µg / ml corresponding to 165 µM) has no influence on the phosphorylation of Stat3 or Stat1.
In Fig. 3 ist der Einfluss von Galiella-Lacton auf die Tyrosin-Phosphorylierung von Stat3 dargestellt. Die Tyrosin-Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat3- (Tyr705)-Antikörper nachgewiesen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat3-Antikörper behandelt (untere Reihe).In Fig. 3, the influence of Galiella-lactone to the tyrosine phosphorylation of Stat3 is shown. Tyrosine phosphorylation was detected with a Phospho-Stat3 (Tyr705) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat3 antibody (bottom row).
In Fig. 4 ist der Einfluss von Galiella-Lacton auf die Serin-Phosphorylierung von Stat3 dargestellt. Die Serin-Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat3- (Ser727)-Antikörper nachgewiesen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat3-Antikörper behandelt (untere Reihe).In FIG. 4, the influence of Galiella-lactone to the serine phosphorylation of Stat3 is shown. Serine phosphorylation was demonstrated with a Phospho-Stat3 (Ser727) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat3 antibody (bottom row).
In Fig. 5 ist der Einfluss von Galiella-Lacton auf die Tyrosin-Phosphorylierung von Stat1 dargestellt. Die Tyrosin-Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat1- (Tyr701)-Antikörper nachgewiesen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat1-Antikörper behandelt (untere Reihe). FIG. 5 shows the influence of Galiella lactone on the tyrosine phosphorylation of Stat1. Tyrosine phosphorylation was detected with a phospho-Stat1 (Tyr701) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat1 antibody (bottom row).
Die DNA-Bindung von aktivierten Stat3-Dimeren an ihre Bindungsstellen in den Promotoren der Zielgene ist die Grundvoraussetzung für die transkriptionelle Aktivierung dieser Gene. Zugleich ist dieser Schritt für Stat3 spezifisch, d. h. durch Hemmung dieses Schrittes würde eine spezifische Inhibition der IL-6 induzierten und Stat3 vermittelten Expression der Zielgene gelingen ohne gleichzeitiger Be einflussung anderer Signalkaskaden. Um den Einfluss verschiedener Verbindung auf die DNA-Bindefähigkeit der phosphorylierten und damit aktivierten Stat3-Dimere zu analysieren, wurden 'Electrophoretic Mobility Shift Assays' (EMSAs, 'Gelshift- Assays') durchgeführt. The DNA binding of activated Stat3 dimers to their binding sites in the Promoters of the target genes are the basic requirement for the transcriptional Activation of these genes. At the same time, this step is specific to Stat3, i. H. by Inhibition of this step would induce specific inhibition of IL-6 and Stat3-mediated expression of the target genes succeed without simultaneous loading influence of other signal cascades. To see the influence of different connection the ability of the phosphorylated and thus activated Stat3 dimers to bind to DNA 'electrophoretic mobility shift assays' (EMSAs,' Gelshift- Assays').
Die Durchführung erfolgte nach Nature, 1993, 362: 79-83 und Mol. Cell. Biol., 1998,
18: 2108-17. Als DNA-Probe fand das mit 32P-markierte, doppelsträngige Oligonuc
leotid mit der m67SIE-Erkennungssequenz (S2) (Wildtyp) (vgl. EMBO J., 1995, 14:
1421-9)
The procedure was carried out according to Nature, 1993, 362: 79-83 and Mol. Cell. Biol., 1998, 18: 2108-17. The 32 P-labeled, double-stranded oligonucleotide with the m67SIE recognition sequence (S2) (wild type) was found as a DNA sample (cf. EMBO J., 1995, 14: 1421-9)
Die Verbindung der Formel (I) (Galiella-Lacton) verhindert beispielsweise schon bei einer Konzentration von 16 ng/ml (82 nM) vollständig die Bindung der aktivierten Stat3-Dimere an ihre Erkennungssequenz. Durch Kontrollansätze, bei denen die induzierte Kontrolle mit Phospho-Stat3(Tyrosin705)-spezifischen Antikörpern vor inkubiert wurde, konnte gezeigt werden, dass es am Tyrosin-Rest 705 phosphorylier tes Stat3 ist, welches an die m67SIE-Probe bindet (Siehe Fig. 6).The compound of formula (I) (Galiella lactone), for example, completely prevents the activated Stat3 dimers from binding to their recognition sequence even at a concentration of 16 ng / ml (82 nM). Control approaches in which the induced control was pre-incubated with phospho-Stat3 (tyrosine 705) -specific antibodies showed that it is phosphorylated Stat3 at the tyrosine residue 705 that binds to the m67SIE sample (see FIG. 6 ).
In Fig. 6 bedeuten:
Mean in Fig. 6:
- - Komp. (100×): Kontrollansatz, zu dem ein 100-facher Überschuß der nicht markierten Probe zugegeben wurde.- Comp. (100 ×): control approach, to which a 100-fold excess of the labeled sample was added.
- - o. P.: Ansatz, bei dem kein Zellextrakt zugegeben wurde.- o. P .: Approach in which no cell extract was added.
- - p-Stat3-Ab: Ansatz, zu dem 1 µg eines Phospho-Stat3(Tyrosin 705)-spezifischen Antikörpers zugegeben wurde.- p-Stat3-Ab: Approach to which 1 µg of a Phospho-Stat3 (Tyrosine 705) -specific Antibody was added.
- - Stat3-Ab: Ansatz, zu dem 1 µg Stat3-Antikörper zugegeben wurde.- Stat3-Ab: Approach to which 1 µg of Stat3 antibody was added.
Fig. 1 Vektorkarte des Ausgangsvektors pTK/SEAP mit den Schnittstellen für die ver wendeten Restriktionsenzyme sowie einer Auswahl singulärer Schnittstellen. Dar gestellt sind weiterhin das Gen der Sekretierten Alkalischen Phosphatase (SEAP), der Thymidin-Kinase Promotor (TK Pro), das mRNA Polyadenylierungssignal des SV40 Viruses (SV40 poly (A)), der Replikationsursprung aus der pUC-Plasmidfamilie (ori), die 'Multiple Cloning Site' (MCS) sowie der Einzelstrangreplikationsursprung des Phagen fl (fl). Fig. 1 vector map of the starting vector pTK / SEAP with the interfaces for the restriction enzymes used and a selection of singular interfaces. Also shown are the gene of secreted alkaline phosphatase (SEAP), the thymidine kinase promoter (TK Pro), the mRNA polyadenylation signal of the SV40 virus (SV40 poly (A)), the origin of replication from the pUC plasmid family (ori) 'Multiple Cloning Site' (MCS) and the single strand replication origin of the phage fl (fl).
Fig. 2 Vektorkarte von pMW-IRF7 mit einer Auswahl singulärer Schnittstellen. Fig. 2 vector map of pMW-IRF7 with a selection of singular interfaces.
Fig. 3 Einfluss von Galiella-Lacton auf die Tyrosin-Phosphorylierung von Stat3. Die Tyro sin-Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat3(Tyr705)-Antikörper nach gewiesen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat3- Antikörper behandelt (untere Reihe). Fig. 3 Influence of Galiella lactone on the tyrosine phosphorylation of Stat3. The tyrosine phosphorylation was demonstrated with a Phospho-Stat3 (Tyr705) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat3 antibody (bottom row).
Fig. 4 Einfluss von Galiella-Lacton auf die Serin-Phosphorylierung von Stat3. Die Serin- Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat3(Ser727)-Antikörper nachgewie sen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat3-Antikörper behandelt (untere Reihe). Fig. 4 Influence of Galiella lactone on the serine phosphorylation of Stat3. Serine phosphorylation was detected with a Phospho-Stat3 (Ser727) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat3 antibody (bottom row).
Fig. 5 Einfluss von Galiella-Lacton auf die Tyrosin-Phosphorylierung von Stat1. Die Tyro sin-Phosphorylierung wurde mit einem Phospho-Stat1(Tyr701)-Antikörper nach gewiesen (obere Reihe). Derselbe Blot wurde 'gestrippt' und mit einem Stat1- Antikörper behandelt (untere Reihe). Fig. 5 Influence of Galiella lactone on the tyrosine phosphorylation of Stat1. The tyrosine phosphorylation was demonstrated with a phospho-Stat1 (Tyr701) antibody (top row). The same blot was 'stripped' and treated with a Stat1 antibody (bottom row).
Fig. 6 Einfluss von Galiella-Lacton auf die Bindung von aktivierten Stat3-Dimeren an ihre DNA-Erkennungssequenz. Verwendete Probe: m67SIE; Induktionsdauer: 20 min. Zellinie: HepG2. Fig. 6 Influence of Galiella lactone on the binding of activated Stat3 dimers to their DNA recognition sequence. Sample used: m67SIE; Induction time: 20 min. Cell line: HepG2.
Claims (8)
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