DE10042892A1 - New butynol I esterase, for stereospecific hydrolysis or transesterification of esters, to produce optically active reaction products - Google Patents

New butynol I esterase, for stereospecific hydrolysis or transesterification of esters, to produce optically active reaction products

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DE10042892A1
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Abstract

A protein (I) with butynol I esterase (BIE) activity comprising at least one of 4 partial sequence polypeptides (S1-4) and their functional equivalents, is new. A protein (I) with butynol I esterase (BIE) activity comprises at least one of 4 partial sequence polypeptides (S1-4) and their functional equivalents. Independent claims are also included for the following: (1) polynucleotides (II) that encode (I), and complementary polynucleotides and sequences that hybridize to them; (2) an expression cassette (EC) comprising at least one (II), operably linked to regulators; (3) a recombinant vector for transforming eukaryotic or prokaryotic hosts, containing (II) or EC; (4) preparation of (I) by culturing organisms that produce (I), either endogenously or after transformation; (5) (I) produced by the method in (4); Pseudomonas glumae Lu2023 (DSM 13176), or its variants or mutants; (6) microorganisms containing the vector of (4); (7) method for enantioselective ester hydrolysis or transesterification using (I); and (8) optically active alcohols, carboxylic acids or esters prepared using (I). Phe-Ile-Glu-Thr-Leu-Gly-Leu-Glu-Arg-Pro-Val-Leu-Val-Gly-His-Ser-Leu-Gl y-Gly-Ala-Ile-Ala-Leu-Ala-Val-Gly-Leu-Asp-Tyr-Pro-Glu-Arg (S1) Ile-Ala-Leu-Ile-Ala-Pro-Leu-Thr-His-Thr-Glu-Thr-Glu-Pro (S2) Gly-Gly-Gly-Met-Met-Gly-Leu-Arg-Pro-Glu-Ala-Phe-Tyr-Ala-Ala-Ser-Ser-As p-Leu-Val (S3) Ala-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Ala-Pro-Glu-Pro-Val (S4)

Description

Esterasen und Lipasen gehören zu den Hydrolasen, die zur Synthese optisch aktiver, organischer Verbindungen in technischen Prozes­ sen eingesetzt werden können und sich durch hohe Substratspezifi­ tät auszeichnen. Sie können in einem den Serinproteasen ähnlichen Mechanismus Acylgruppen auf Nukleophile, wie z. B. Carbonylgrup­ pen, übertragen oder Esterbindungen hydrolytisch spalten. Den Esterasen, Lipasen und Serinproteasen ist die katalytische Triade gemeinsam, ein Sequenzmotiv aus den Aminosäuren Ser, His und Asp, wobei das aktive Ser das Carbonylkohlenstoffatom nukleophil an­ greift und es unter Beteiligung der anderen beiden Aminosäuren zu einer Ladungsverteilung kommt. Esterasen und Lipasen können Acyl­ gruppen auch auf andere Nukleophile, wie Thiogruppen eines Thioe­ thers oder aktivierte Amine, übertragen.Esterases and lipases are hydrolases that are used for synthesis optically active, organic compounds in technical processes can be used and are characterized by high substrate speci award. You can in a serine protease similar Mechanism of acyl groups on nucleophiles, e.g. B. Carbonyl group pen, transfer or hydrolytically cleave ester bonds. The Esterases, lipases and serine proteases are the catalytic triad together, a sequence motif from the amino acids Ser, His and Asp, the active Ser nucleophilically at the carbonyl carbon atom accesses it with the participation of the other two amino acids a charge distribution comes. Esterases and lipases can be acyl groups also on other nucleophiles, such as thio groups of a thioe thers or activated amines.

Lipasen hydrolysieren langkettige Glycerinester und zeichnen sich durch Grenzflächenaktivierung aus, d. h. dass das aktive Zentrum nur in Gegenwart des Lipidsubstrats zugänglich wird. Lipasen sind in nicht-wässrigen organischen Lösungsmitteln stabil und werden in zahlreichen technischen Prozessen zur kinetischen Racematspal­ tung eingesetzt, d. h. ein Enantiomer wird wesentlich schneller als das andere umgesetzt. Dieses läßt sich nachfolgend aufgrund unterschiedlicher physikalischer und chemischer Eigenschaften aus der Reaktionslösung gewinnen.Lipases hydrolyze long-chain glycerol esters and excel by interface activation, d. H. that the active center is only accessible in the presence of the lipid substrate. Are lipases stable and become stable in non-aqueous organic solvents in numerous technical processes for the kinetic Racematspal used, d. H. an enantiomer becomes much faster implemented as the other. This can be explained below different physical and chemical properties win the reaction solution.

Nakamura (Nakamura, K. et al., Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439) beschreibt die Racematspaltung von 1-Alkyn-3-ol durch Umesterung mit Hilfe käuflich erhältlicher Lipasen (Amano AK, AH und PS; Amano Pharmaceuticals Co. Ltd.) in hydrophoben Lösungs­ mitteln, wobei die Enantioselektivität mit der Kettenlänge des Acyldonors steigt und sterisch große Reste (Chloracetat, Vinyl­ benzoat) die Reaktion negativ beeinflussen. Yang (Yang, H. et al., J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712) beschreibt die enan­ tioselektive Herstellung optisch aktiver Säuren durch Umesterung mit Vinylestern unter Verwendung der Lipase B aus Candida antarc­ tica als Katalysator. Ethylester führen hier zu einer deutlich geringeren Reaktionsgeschwindigkeit und Selektivität. Eine aus Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii oder glumae) DSM 6535 isolierte Lipase wird zur enantioselektiven Acylierung race­ mischer Amine mit Hilfe von Ethylmethoxyacetat eingesetzt (Bal­ kenhohl, F. et al., J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384). Nakamura (Nakamura, K. et al., Tetrahedron; Asymmetry 9, (1999), 4429-4439) describes the resolution of 1-alkyn-3-ol by Transesterification with the help of commercially available lipases (Amano AK, AH and PS; Amano Pharmaceuticals Co. Ltd.) in hydrophobic solution mean, the enantioselectivity with the chain length of the Acyl donors increases and sterically large residues (chloroacetate, vinyl benzoate) negatively affect the reaction. Yang (Yang, H. et al., J. Org. Chem. 64, (1999), 1709-1712) describes the enan tioselective production of optically active acids by transesterification with vinyl esters using Lipida B from Candida antarc tica as a catalyst. Ethyl esters clearly lead to one lower reaction speed and selectivity. One out Burkholderia plantarii (Pseudomonas plantarii or glumae) DSM 6535 isolated lipase is used for enantioselective acylation race Mixer amines used with the help of ethyl methoxyacetate (Bal kenhohl, F. et al., J. Prakt. Chem. 339, (1997), 381-384).  

Esterasen katalysieren enantioselektiv die Bildung und Auflösung von Esterbindungen (Hin- und Rückreaktion). Bei der Umesterung zur Gewinnung optisch aktiver Alkohole werden vorzugsweise Vinyl­ ester eingesetzt, da die Alkoholfunktion des Esters nach der Um­ setzung durch Tautomerisierung zu Aldehyd oder Keton nicht mehr zur Verfügung steht und damit die Rückreaktion vermieden werden kann. Esterasen sind im Gegensatz zu Lipasen nicht grenzflächen­ aktiviert und setzen auch organische Verbindungen kürzerer Ket­ tenlänge um. Aus verschiedenen Organismen wurden Esterasen unter­ schiedlicher Substratspezifität isoliert.Esterases catalyze the formation and dissolution enantioselectively of ester bonds (back and forth reaction). When transesterification vinyl is preferably used to obtain optically active alcohols ester used because the alcohol function of the ester after Um no longer set by tautomerization to aldehyde or ketone is available and thus the reverse reaction can be avoided can. In contrast to lipases, esterases are not interfaces activates and also set organic compounds of shorter ket length around. Esterases were taken from various organisms different substrate specificity isolated.

So findet die Esterase aus Pseudocardia thermophila FERM-BP-6275 Verwendung bei der Hydrolyse optisch aktiver Chromanessigsäure­ ester (EP-A-0 892 044).This is how the esterase from Pseudocardia thermophila finds FERM-BP-6275 Use in the hydrolysis of optically active chromanacetic acid ester (EP-A-0 892 044).

Eine Esterase aus Bacillus acidocaldarius hydrolysiert Ester ei­ nes engen Substratspektrums und mit niedriger Enantioselektivität (Manco, G. et al., Biochem. J. 332, (1998), 203-212).An esterase from Bacillus acidocaldarius hydrolyzes esters narrow substrate spectrum and with low enantioselectivity (Manco, G. et al., Biochem. J. 332, (1998), 203-212).

Acylase 1 aus Aspergillus wird zur Gewinnung sekundärer Alkohole durch Umesterung mit Vinylestern in organischen unpolaren Lö­ sungsmitteln verwendet, wobei bevorzugt sekundäre Alkohole mit kurzen Seitenketten umgesetzt werden (Faraldos, J. et al., Syn­ lett 4, (1997), 367-370). Aus Pseudomonas fluorescens DSM 50 106 wurde eine Membran-gebundene Lacton-spezifische Esterase kloniert (Khalameyzer, V. et al., Appl. and Environ. Microbiol. 65(2), (1999), 477-482), und aus der Q-Mutante von E. coli eine Acetyle­ sterase (Peist, R. et al., J. Bacteriol. 179, (1997), 7679-7686). Jedoch wurden Enantioselektivität und Substratspezifität dieser beiden Esterasen nicht näher untersucht wurden. Rhodococcus sp. NCBM 11216 exprimiert 4 Esterasen, RR1 bis RR4, die unterschied­ liche Spezifität aufweisen. Bei der Estersynthese aus Naphthol und einer Säure bevorzugen RR1 und RR2 Säuren mit kurzen Kohlen­ stoffketten, während RR3 und RR4 spezifisch Säuren mit längeren Kohlenstoffketten und sterisch größeren Resten umsetzen (Gudelj, M. et al., J. Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).Acylase 1 from Aspergillus is used to obtain secondary alcohols by transesterification with vinyl esters in organic non-polar solvents used solvents, preferably secondary alcohols with short side chains are implemented (Faraldos, J. et al., Syn lett 4, (1997), 367-370). From Pseudomonas fluorescens DSM 50 106 a membrane-bound lactone-specific esterase was cloned (Khalameyzer, V. et al., Appl. And Environ. Microbiol. 65 (2), (1999), 477-482), and an acetyle from the Q mutant of E. coli sterase (Peist, R. et al., J. Bacteriol. 179, (1997), 7679-7686). However, enantioselectivity and substrate specificity have been identified both esterases were not examined in detail. Rhodococcus sp. NCBM 11216 expresses 4 esterases, RR1 to RR4, which differed have specificity. In the synthesis of esters from naphthol and an acid prefer RR1 and RR2 acids with short carbons fabric chains, while RR3 and RR4 specifically acids with longer ones Implement carbon chains and sterically larger residues (Gudelj, M. et al., J. Mol. Cat. B, Enzymatic 5, (1998), 261-266).

Zur Herstellung kleiner organischer Moleküle, wie optisch aktiver Alkohole, Säuren oder Ester mit kurzen Kohlenstoffketten, stehen jedoch keine Esterasen zur Verfügung, die ein breites Substrat­ spektrum besitzen, eine hohe Enantioselektivität aufweisen und in technischen Prozessen eingesetzt werden können. Aufgabe der vor­ liegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Esterasen, welche wenigstens eine der oben genannten Eigenschaften aufweisen. For the production of small organic molecules, such as optically active ones Alcohols, acids or esters with short carbon chains however, no esterases are available that have a broad substrate possess spectrum, have a high enantioselectivity and in technical processes can be used. Task of before Invention is to provide esterases which have at least one of the abovementioned properties.  

Diese Aufgabe konnte überraschenderweise durch die Bereitstellung einer Butinol I Esterase gelöst werden, welche wenigstens eine der folgenden Aminosäuresequenzen umfasst:
This task was surprisingly achieved by providing a butinol I esterase which comprises at least one of the following amino acid sequences:

jeweils angegeben im Aminosäure-Einbuchstabencode, wobei die je­ weils erste Aminosäure dem jeweiligen aminoterminalen Ende ent­ spricht; sowie deren funktionale Äquivalente.each specified in the amino acid one-letter code, the respective because the first amino acid corresponds to the respective amino terminal end speaks; as well as their functional equivalents.

Funktionale Äquivalente der erfindungsgemäßen Esterasen umfassen wenigstens eine von den obigen Teilsequenzen abgeleitete Amino­ säuresequenz, in der gegenüber der obenstehenden Aminosäurese­ quenz eine oder mehrere Aminosäuren substituiert, deletiert, in­ vertiert oder addiert sind, ohne dass sich die Esteraseaktivität um mehr als ±50%, vorzugsweise nicht um mehr als ±30% von der Esteraseaktivität der Butinol I Esterase unterscheidet. Die Butinol I Esterase weist ein Molekulargewicht von etwa 40 bis 42 kDa, insbesondere etwa 41,3 kDa auf. Sie ist insbesondere aus Pseudomonas glumae Lu 2023 der Hinterlegungsnummer DSM 13176 er­ hältlich. Weitere Stammvarianten sind z. B. ausgehend von Pseudo­ monas glumae Lu 8093 durch Selektion, wie beispielsweise durch Kultur auf Minimalmedium-Platten, mit Ethylphenylacetat als ein­ ziger Kohlenstoffquelle, zugänglich.Include functional equivalents of the esterases of the invention at least one amino derived from the above partial sequences acid sequence, in the opposite to the above amino acid quenz one or more amino acids substituted, deleted, in are vertically or added without the esterase activity by more than ± 50%, preferably not more than ± 30% of the esterase activity of butinol I esterase differs. The Butinol I esterase has a molecular weight of about 40 to 42 kDa, in particular about 41.3 kDa. She is particularly out Pseudomonas glumae Lu 2023 with the deposit number DSM 13176 er hältlich. Other stem variants are e.g. B. starting from pseudo monas glumae Lu 8093 by selection, such as by Culture on minimal medium plates, with ethylphenylacetate as one source of carbon, accessible.

Die Erfindung umfasst auch Polynukleotide, die für die Butinol I Esterase kodieren. Erfindungsgemäß umfasst sind auch deren funk­ tionale Äquivalente sowie damit hybridisierbare oder dazu komple­ mentäre Sequenzen. Funktionale Äquivalente erfindungsgemäßer Po­ lynukleotide weisen eine durch Nukleotidsubstitution, -Deletion, -Inversion oder -Addition veränderte Sequenz auf, kodieren jedoch ebenfalls für eine Butinol I Esterase mit gleicher oder ver­ gleichbarer Esteraseaktivität.The invention also encompasses polynucleotides which are suitable for butinol I Encode esterase. According to the invention, their radio is also included national equivalents as well as hybridisable or complete mental sequences. Functional equivalents of Po according to the invention lynucleotides have a nucleotide substitution, deletion, -Inversion or -Addition changed sequence, but code also for a butinol I esterase with the same or ver comparable esterase activity.

Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, die we­ nigstens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid umfassen, das mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft ist. Vorzugsweise liegt 5'-stromaufwärts vom erfindungsgemäßen Polynu­ kleotid eine Promotorsequenz und ermöglicht auf diese Weise eine kontrollierte Expression der Butinol I Esterase. Besonders bevor­ zugt liegt 3'-stromabwärts vom erfindungsgemäßen Polynukleotid eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regu­ latorische Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der die Butinol I Esterase kodierenden Sequenz. Unter einer operati­ ven Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weite­ rer regulatorische Elemente derart, dass jedes der regulatori­ schen Elemente seine Funktion vor, während oder nach Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für weitere operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Se­ quenzen sowie Translationsverstärker, Enhancer, Polyadenylie­ rungssignale und dergleichen. Weitere brauchbare regulatorische Elemente umfassen selektierbare Marker, Reportergene, Amplifika­ tionssignale, Replikationsursprünge und dergleichen.The invention also relates to expression cassettes which we at least comprise a polynucleotide according to the invention which is associated with regulatory nucleic acid sequences is operatively linked. It is preferably 5 'upstream of the polynu according to the invention kleotid a promoter sequence and thus enables one controlled expression of butinol I esterase. Especially before Zug is located 3 'downstream of the polynucleotide according to the invention a terminator sequence and, if necessary, other usual regu regulatory elements, each operatively linked to the the sequence encoding butinol I esterase. Under an operati Linking means the sequential arrangement of the promoter,  coding sequence, terminator and possibly wide rer regulatory elements such that each of the regulatory elements before, during or after expression can fulfill the coding sequence as intended. Examples for further operably linkable sequences are targeting Se sequences as well as translation enhancers, enhancers, polyadenyls tion signals and the like. More useful regulatory Elements include selectable markers, reporter genes, amplifiers tion signals, origins of replication and the like.

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die na­ türliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürli­ che Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Die Expressionskassette kann aber auch einfacher aufgebaut sein, d. h. es werden keine zu­ sätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht ent­ fernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mu­ tiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette enthal­ ten sein.In addition to the artificial regulatory sequences, the na door regulatory sequence before the actual structural gene to be available. Through genetic modification, this can be natural che regulation possibly switched off and the expression of the genes are increased or decreased. The expression cassette can also be constructed more simply, d. H. there will be none inserted additional regulatory signals in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed removed. Instead, the natural regulatory sequence becomes so that no more regulation takes place and gene expression is increased or decreased. The nucleic acid sequences can contain one or more copies in the expression cassette be.

Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder 1-PL-Promotor, die vorteilhafter­ weise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung indu­ zierbarer Promotoren, wie z. B. licht- und insbesondere temperatu­ rinduzierbarer Promotoren, wie der PrPl-Promotor.Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc -, ara, SP6, 1-PR or 1-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; as well as the gram-positive promoters amy and SPO2, the yeast promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos or the Ubiquitin or phaseolin promoter. The use of inducible promoters, such as, for. B. light and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P l promoter.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regula­ tionssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch syn­ thetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.In principle, all natural promoters can use their regulations tion sequences are used. In addition, syn theoretical promoters can be used advantageously.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Ex­ pression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression er­ möglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus be­ deuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überex­ primiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexpri­ miert wird. The regulatory sequences mentioned are intended to target Ex pression of nucleic acid sequences and protein expression possible. This can be depending on the host organism, for example indicate that the gene is expressed or overex only after induction is primed, or that it is immediately expressed and / or overexpri is lubricated.  

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs­ weise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf Transkriptionsebene erfolgen, in­ dem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhan­ cer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA erhöht wird.The regulatory sequences or factors can be preferred wise influence the expression positively and thereby increase or humiliate. This can strengthen regulatory Elements advantageously take place at the transcription level in the strong transcription signals such as promoters and / or "Enhan cer "can also be used Translation possible by, for example, the stability of the mRNA is increased.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette er­ folgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einem geeigne­ ten die Butinol I Esterase kodierenden Polynukleotid, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gän­ gige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispiels­ weise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.The production of an expression cassette according to the invention follows by fusion of a suitable promoter with a suitable one ten butynol I esterase encoding polynucleotide, and a Terminator or polyadenylation signal. For this you use gän existing recombination and cloning techniques, such as in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinante Vektoren zur Transformation von eukaryontischen und prokaryontischen Wirten, die ein erfindungsgemäßes Polynukleotid oder eine erfindungsge­ mäße Expressionskassette tragen. Diese Vektoren erlauben in einem geeigneten Wirtsorganismus eine Expression der Butinol I Este­ rase. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können bei­ spielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Un­ ter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phas­ mide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chro­ mosomal repliziert werden.The invention also relates to recombinant vectors for Transformation of eukaryotic and prokaryotic hosts, which is a polynucleotide according to the invention or an inventive one carry a moderate expression cassette. These vectors allow in one suitable host organism an expression of Butinol I Este rase. Vectors are well known to those skilled in the art and can be found in for example from "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985). Un Apart from plasmids, all other vectors are also known to the person skilled in the art known vectors, such as phages, viruses, such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, Phas to understand mide, cosmids, and linear or circular DNA. This Vectors can replicate autonomously in the host organism or chro be replicated mosomally.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikro­ organismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens ei­ nem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produk­ tion rekombinanter Esterase eingesetzt werden können. Vorteilhaf­ terweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombi­ nanten Expressionskassetten als Teil eines Expressionsvektors in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei wer­ den vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Mole­ cular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, beschrieben.With the help of the vectors according to the invention are recombinant micro organisms can be produced, for example with at least one egg nem vector according to the invention are transformed and the product tion of recombinant esterase can be used. Vorteilhaf tually the recombi according to the invention described above expression cassettes as part of an expression vector in a suitable host system is introduced and expressed. Here who the common cloning and preferably known to those skilled in the art Transfection methods are used to isolate the nucleic acids mentioned to bring to expression in the respective expression system. suitable  Systems are described, for example, in Current Protocols in moles cular Biology, F. Ausubel et al., ed., Wiley Interscience, New York 1997.

Als Wirtsorganismen zur Transformation mit erfindungsgemäßen Vek­ toren sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expres­ sion der erfindungsgemäßen Polynukleotide, ihrer Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Orga­ nismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, As­ pergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotika­ resistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion kataly­ sieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert wer­ den. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Organismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsen­ tiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatogra­ phie genutzt werden.As host organisms for transformation with Vek according to the invention In principle, all organisms that express an sion of the polynucleotides according to the invention, their allele variants, enable their functional equivalents or derivatives. Under Host organisms are, for example, bacteria, fungi, yeasts, understand plant or animal cells. Preferred organization nisms are bacteria, such as those of the genera Escherichia, such as z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, As pergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells. The selection was successful transformed organisms can be done by marker genes that also contained in the vector or in the expression cassette are. Examples of such marker genes are genes for antibiotics resistance and for enzymes that catalyze a coloring reaction sieren, which causes staining of the transformed cell. This can then be selected using automatic cell sorting the. Organisms successfully transformed with a vector can carry an appropriate antibiotic resistance gene by means of appropriate media or nutrient media containing antibiotics select. Marker proteins that are present on the cell surface can be used for selection by means of affinity chromatography phie be used.

Gegenstand der Erfindung sind somit auch Mikroorganismen, die ei­ nen erfindungsgemäßen Vektor tragen sowie die Pseudomonas glumae- Mutante, Lu 2023, mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176, die die Butinol I Esterase endogen exprimiert.The invention thus also relates to microorganisms that egg bear a vector according to the invention and the Pseudomonas glumae- Mutante, Lu 2023, with the deposit number DSM 13176, which the Butinol I esterase expressed endogenously.

Die erfindungsgemäßen Butinol I Esterasen sind insbesondere da­ durch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine der folgenden Re­ aktionen katalysieren:
The butinol I esterases according to the invention are characterized in that they catalyze at least one of the following reactions:

  • a) enantioselektive Hydrolyse optisch aktiver Ester der For­ mel I
    R1-COO-R2 (I),
    worin R1 für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenen­ falls ein- oder mehrfach substituiertes C1-C10-Alkyl, C2-C20-Alkenyl, C2-C10-Alkinyl und R2 für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach sub­ stituiertes C1-C10-Alkyl, C2-C10-Alkenyl, C2-C10-Alkinyl, C7-C15-Aralkyl oder für einen ein- oder mehrkernigen, ge­ gebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten aromati­ schen Rest steht,
    R1 und/oder R2 wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstof­ fatom umfasst,
    wobei besonders bevorzugt entweder das mit dem Kohlen­ stoffatom oder das mit dem Sauerstoffatom der Esterbin­ dung verbundene Kohlenstoffatom aus R1 bzw. R2 ein asym­ metrisches Kohlenstoffatom ist; und    a) enantioselective hydrolysis of optically active esters of formula I
    R 1 -COO-R 2 (I),
    wherein R 1 for straight-chain or branched, optionally mono- or polysubstituted C 1 -C 10 alkyl, C 2 -C 20 alkenyl, C 2 -C 10 alkynyl and R 2 for straight-chain or branched, optionally mono- or multi-substituted C 1 -C 10 alkyl, C 2 -C 10 alkenyl, C 2 -C 10 alkynyl, C 7 -C 15 aralkyl or for a mono- or polynuclear, optionally mono- or polysubstituted aromati the rest,
    R 1 and / or R 2 comprises at least one asymmetric carbon fat atom,
    with particular preference either the carbon atom from R 1 or R 2 connected to the carbon atom or to the oxygen atom of the ester bond is an asymmetric carbon atom; and
  • b) enantioselektive Umesterung eines Esters der Formel I mit einem optisch aktiven Alkohol der Formel II
    R2-OH (II),
    worin R2 eine der obenstehenden Bedeutungen besitzt, und gegebenenfalls wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstof­ fatom aufweist,
    wobei besonders bevorzugt, das Kohlenstoffatom, welches die OH-Gruppe trägt, ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist.    b) enantioselective transesterification of an ester of the formula I with an optically active alcohol of the formula II
    R 2 -OH (II),
    in which R 2 has one of the meanings given above and optionally has at least one asymmetric carbon atom,
    with particular preference the carbon atom which carries the OH group is an asymmetric carbon atom.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur enantioselekti­ ven Esterhydrolyse unter Verwendung der Butinol I Esterase, wobei die Butinol I Esterase mit einem Stereoisomerengemisch eines op­ tisch aktiven Esters der Formel I in Kontakt gebracht wird und die bei der stereoselektiven Hydrolyse eines der beiden Stereoi­ somere anfallenden optisch aktiven Verbindungen und/oder das nicht hydrolysierte Esterenantiomer aus dem Reaktionsmedium ge­ wonnen wird. Die Butinol I Esterase kann aber auch solche Ester der Formel I hydrolysieren, die nicht optisch aktiv sind.The invention also relates to methods for enantioselecti ven ester hydrolysis using the Butinol I esterase, wherein the butinol I esterase with a stereoisomer mixture of an op table active ester of formula I is brought into contact and that in stereoselective hydrolysis of one of the two stereoi somere resulting optically active compounds and / or that unhydrolyzed ester enantiomer from the reaction medium is won. Butinol I esterase can also be such esters of formula I hydrolyze that are not optically active.

Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren zur enantioselekti­ ven Umesterung, wobei ein Stereoisomerengemisch eines optisch ak­ tiven Alkohols der Formel II mit einem Ester der Formel I in Ge­ genwart der Butinol I Esterase in Kontakt gebracht wird und das nicht umgesetzte Alkoholstereoisomer aus dem Reaktionsmedium ge­ wonnen wird, oder ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I mit einem Alkohol der Formel II in Gegenwart der Butinol I Esterase in Kontakt gebracht wird und ein Stereoi­ somer des im Ester enthaltenen optisch aktiven Alkohols aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird. Vorzugsweise werden zur Umesterung Vinylester als Acylierungsmittel für einen optisch aktiven Alko­ hol verwendet. Dies ist deshalb vorteilhaft, weil die Alkoholfunktion des Vinylesters nach der Umsetzung durch Tautomerisie­ rung nicht mehr für die Rückreaktion zur Verfügung steht. Die Bu­ tinol I Esterase katalysiert auch Umesterungsprozesse, bei denen weder der Ester noch der Alkohol optisch aktiv sind.The invention also relates to methods for enantioselecti ven transesterification, where a mixture of stereoisomers of an optically ak tive alcohol of formula II with an ester of formula I in Ge the butinol I esterase is brought into contact and that unreacted alcohol stereoisomer from the reaction medium is won, or a stereoisomer mixture of an optically active Esters of formula I with an alcohol of formula II in the presence the butinol I esterase is contacted and a stereoi somer of the optically active alcohol contained in the ester from the Reaction medium is obtained. Preferably used for transesterification Vinyl ester as an acylating agent for an optically active alcohol hol used. This is advantageous because of the alcohol function  of the vinyl ester after implementation by tautomerization tion is no longer available for the reverse reaction. The Bu tinol I esterase also catalyzes transesterification processes in which neither the ester nor the alcohol are optically active.

Bevorzugte Substrate zur Esterhydrolyse sind Ester des Ethanols, Propanols, Butanols und besonders bevorzugt Butinylester (Butino­ lester, Ester des 1-Methyl-prop-2-ynols) mit Carbonsäuren wie beispielsweise Essigsäure, Propansäure, Buttersäure, Pentansäure, Hexansäure, Heptansäure, Octansäure, Milchsäure, 2-Ethylhexan­ säure, 3-Methylbuttersäure, Methoxyessigsäure, 2-Methylpropions­ äure, 2-Butensäure, 3-Chlorpropionsäure und 2-Methylpentansäure. Besonders bevorzugt sind Buttersäure- (Butinylbutyrat) und Me­ thylbuttersäurebutinylester.Preferred substrates for ester hydrolysis are esters of ethanol, Propanols, butanols and particularly preferably butinyl esters (butino lester, esters of 1-methyl-prop-2-ynol) with carboxylic acids such as for example acetic acid, propanoic acid, butyric acid, pentanoic acid, Hexanoic acid, heptanoic acid, octanoic acid, lactic acid, 2-ethylhexane acid, 3-methylbutyric acid, methoxyacetic acid, 2-methylpropions acid, 2-butenoic acid, 3-chloropropionic acid and 2-methylpentanoic acid. Butyric acid (butynyl butyrate) and Me are particularly preferred thylbuttersäurebutinylester.

Bevorzugte Alkohole bei der Umesterung sind Ethanol, Propanol und Butanol, besonders bevorzugt ist Butinol.Preferred alcohols in the transesterification are ethanol, propanol and Butanol, butinol is particularly preferred.

Bevorzugte Ester bei der Umesterung sind Vinylester, wie bei­ spielsweise Essigsäure-, Propionsäure- und Buttersäurevinylester.Preferred esters in the transesterification are vinyl esters, as in for example vinyl acetate, propionic acid and butyric acid.

Als Reaktionsmedium werden in oben stehenden Verfahren organische Lösungsmittel verwendet, wie beispielsweise Alkane, Ether, To­ luol, Dioxan, Methylisobutylketon, Methyl-tertiär-butylether (MTBE) und dergleichen. Bei der Esterhydrolyse können auch Gemi­ sche aus der verwendeten Pufferlösung und organischen Lösungsmit­ teln wie beispielsweise MTBE und Heptan oder Toluol verwendet werden.Organic as the reaction medium in the above processes Solvents used, such as alkanes, ethers, to toluene, dioxane, methyl isobutyl ketone, methyl tertiary butyl ether (MTBE) and the like. In the ester hydrolysis, Gemi from the buffer solution and organic solvent used agents such as MTBE and heptane or toluene become.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch obenstehende Verfah­ ren unter Verwendung der Butinol I Esterase hergestellten optisch aktiven Alkohole, Carbonsäuren oder Ester.The invention also relates to the method described above ren optically produced using the Butinol I esterase active alcohols, carboxylic acids or esters.

Die Racematspaltung, d. h. die Enantioselektivität, und Reaktions­ geschwindigkeit sind über Größe und Hydrophobizität des Säure­ teils beeinflußbar. Die Reaktion wird vorzugsweise bei Raumtempe­ ratur bei einem pH-Wert von 6 bis 9, besonders bevorzugt bei ei­ nem pH-Wert von 7,0 bis 7,4 durchgeführt. Dabei kann die Esterase in Form von isoliertem oder aufgereinigtem Enzym, Zellen des die Esterase exprimierenden Mikroorganismus, dessen Kulturüberstand, Zelllysat oder Extrakt, oder als immobilisierte Esterase einge­ setzt werden. Die Reaktionsprodukte können aus der Reaktionslö­ sung durch dem Fachmann bekannte chemische oder physikalische Trennverfahren isoliert werden. Die Butinol I Esterase kann aus dem Reaktionsgemisch durch Membranfiltration isoliert werden. The resolution of racemates, i. H. the enantioselectivity, and response rates are about size and hydrophobicity of the acid partly influenceable. The reaction is preferably at room temperature rature at a pH of 6 to 9, particularly preferably at egg nem pH from 7.0 to 7.4 carried out. The esterase in the form of isolated or purified enzyme, cells of the Microorganism expressing esterase, its culture supernatant, Cell lysate or extract, or inserted as an immobilized esterase be set. The reaction products can from the reaction solution solution by chemical or physical known to those skilled in the art Separation processes are isolated. The butinol I esterase can be from the reaction mixture can be isolated by membrane filtration.  

Die Immobilisierung der Esterase kann mit Hilfe von Polyacryla­ mid, Alginsäure oder Carragenen erfolgen. Die Esterase läßt sich auch mittels bekannter Methoden kovalent oder durch Absorption an passende Carrier binden. Vorzugsweise wird die Butinol I Esterase durch Lyophilisation auf Kieselgur oder durch Ammoniumsulfatfäl­ lung immobilisiert.The immobilization of the esterase can be done with the help of Polyacryla mid, alginic acid or carragenen. The esterase can be also covalently or by absorption using known methods bind suitable carriers. Preferably the butinol I esterase by lyophilization on diatomaceous earth or by ammonium sulfate precipitation immobilized.

Wie oben erwähnt ist die Butinol I Esterase aus Pseudomonas glu­ mae Lu 2023 erhältlich. Sie läßt sich allerdings auch mittels be­ kannter Peptidsyntheseverfahren herstellen.As mentioned above, the butinol I esterase is from Pseudomonas glu mae Lu 2023 available. However, you can also be Known peptide synthesis process.

Weiterhin ist die Butinol I Esterase auch aus eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen erhältlich, wenn diese die Butinol I Esterase exprimieren, wie beispielsweise Mikroorganismen, die ei­ nen erfindungsgemäßen Vektor tragen.Furthermore, the butinol I esterase is also from eukaryotic or prokaryotic organisms available if these the Butinol I Express esterase, such as microorganisms that wear a vector according to the invention.

Gegenstand der Erfindung sind somit auch Verfahren zur Herstel­ lung der Butinol I Esterase, wobei man Mikroorganismen, welche die Butinol I Esterase produzieren, oder einen mit einem erfin­ dungsgemäßen Vektor transformierten Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Butinol I Esterase induziert und die Butinol I Esterase aus der Kultur isoliert. Die Mikroor­ ganismen können nach bekannten Verfahren kultiviert und fermen­ tiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Me­ dium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kulti­ vierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrie­ ben.The invention thus also relates to processes for the production butinol I esterase, where microorganisms which that produce butinol I esterase, or one with an invented one cultivated according to the vector transformed microorganism, optionally induced the expression of butinol I esterase and the butinol I esterase was isolated from the culture. The microor ganisms can be cultivated and fermented according to known methods be animals. Bacteria can, for example, in TB or LB-Me dium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH can be increased from 6 to 9. In particular, suitable cultures conditions for example in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ben.

Nach Kultivierung werden die Zellen aufgeschlossen und die Buti­ nol I Esterase durch Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultra­ schall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen En­ zymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren, vorzugsweise Glaskugelmühlen, oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden. Nach einer Zentri­ fugation bleiben Proteine und andere lösliche Moleküle im Über­ stand. Durch Ausfällen der DNA mit Manganchlorid kann eine Lösung mit deutlich niedrigerer Viskosität erhalten werden. Proteine können durch "Aussalzen" beispielsweise unter Verwendung von Am­ moniumsulfat oder Kaliumphosphat selektiv präzipitiert werden. Die Präzipitation kann auch durch pH- oder Temperaturveränderung oder durch organische Lösungsmittel wie Methanol, Ethanol oder Aceton erfolgen. Nach der Präzipitation durch Salze können diese wieder durch Dialyse entfernt werden.After cultivation, the cells are disrupted and the buti nol I esterase by protein isolation method from the lysate won. The cells can be selected using high-frequency Ultra sound, due to high pressure, such as B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic en zymmen or organic solvents, by homogenizers, preferably glass ball mills, or by combining several of the listed procedures are unlocked. After a centri proteins and other soluble molecules remain in excess was standing. By precipitating the DNA with manganese chloride a solution can be found can be obtained with significantly lower viscosity. proteins can be "salted out", for example, using Am monium sulfate or potassium phosphate can be selectively precipitated. The precipitation can also be done by changing pH or temperature or by organic solvents such as methanol, ethanol or  Acetone done. After precipitation by salts, these can can be removed again by dialysis.

Eine weitere Aufreinigung der Butinol I Esterase kann mit bekann­ ten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekular­ sieb-Chromatographie (Gelfiltration), Q-Sepharose-Chromatogra­ phie, Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatogra­ phie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation und nativer Gelelektrophorese.A further purification of the butinol I esterase can be known th, chromatographic methods can be achieved, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), Q-Sepharose chromatography phie, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography phie, as well as with other common methods such as ultrafiltration, Crystallization and native gel electrophoresis.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden nicht limitierenden Beispiele näher erläutert.The invention is not limited by the following Examples explained in more detail.

Beispiel 1example 1 Selektion einer Butinol I Esterase exprimierenden Mutante von Pseudomonas glumaeSelection of a Butinol I Esterase Expressing Mutant of Pseudomonas glumae

Ausgangsstamm des Screenings war der Lipase-Produzent Pseudomonas (Burkholderia) glumae Lu 8093. Mit der von diesem Stamm produ­ zierten Lipase lassen sich eine ganze Reihe interessanter Reak­ tionen durchführen (Balkenhohl, F. et al., J. prakt. Chem. 339, (1997), 381-384). Milchsäureester, Methylbuttersäureester und Phenylessigsäureester sind jedoch kein Substrat für die Lipase und können auch sonst nicht von diesem Stamm hydrolysiert werden.The starting strain of the screening was the lipase producer Pseudomonas (Burkholderia) glumae Lu 8093. With the produ graced lipase can be a whole range of interesting reak cations (Balkenhohl, F. et al., J. Prakt. Chem. 339, (1997), 381-384). Lactic acid ester, methyl butyric acid ester and However, phenylacetic acid esters are not a substrate for lipase and can’t be hydrolyzed by this strain.

Die Hydrolyseprodukte sind jedoch als Kohlenstoffquelle verwert­ bar. Es wurde deshalb nach Mutanten von Lu 8093 gesucht, die diese Ester hydrolysieren können und mit den Hydrolyseprodukten als Kohlenstoffquelle wachsen können. Mutanten mit neuer Estera­ seaktivität sollten sich daher durch Wachstum auf diesen Estern zu erkennen geben.However, the hydrolysis products are used as a carbon source bar. We therefore searched for mutants of Lu 8093 that these esters can hydrolyze and with the hydrolysis products can grow as a carbon source. Mutants with a new Estera Sea activity should therefore increase through growth on these esters make known.

Selektionsbedingungen: Lu 8093 wurde auf Medium für 16 h kulti­ viert und durch Zentrifugation geerntet. Die Zellen wurden 2 mal mit Saline gewaschen. 106 Zellen wurden auf Minimalmedium Platten, die 0,5 bzw. 1,0 g/l Ethylphenylacetat als einzige Kohlenstoff­ quelle enthielten, ausplattiert. Zunächst zeigte sich jedoch kein Wachstum. Erst nach 4 bis 6 Tagen waren einzelne Kolonien zu er­ kennen. Deren Zahl nahm in den nächsten Tagen weiter zu.Selection conditions: Lu 8093 was cultured on medium for 16 h and harvested by centrifugation. The cells were washed twice with saline. 10 6 cells were plated on minimal medium plates containing 0.5 and 1.0 g / l ethylphenylacetate as the only carbon source. At first, however, there was no growth. Individual colonies were only recognized after 4 to 6 days. The number continued to increase over the next few days.

Von den so erhaltenen Esterase-positiven Mutanten wurde die Mu­ tante Lu 2023 ausgewählt. Überraschenderweise war die neue Este­ rase-Aktivität auch zur selektiven Hydrolyse kleiner organischer Moleküle geeignet. Am Beispiel von Butinolester wurde die selek­ tive Hydrolyse gezeigt. From the esterase-positive mutants obtained in this way, the Mu aunt Lu 2023 selected. Surprisingly, the new Este was rase activity also for the selective hydrolysis of small organic Suitable molecules. Using the example of butynol ester, the selek tive hydrolysis shown.  

Beispiel 2Example 2 Fermentation von Pseudomonas glumae Lu 2023Fermentation of Pseudomonas glumae Lu 2023

Zur Gewinnung der Butinol I Esterase wurde Pseudomonas glumae Lu 2023 im 14 l-Maßstab kultiviert und die aktive Biomasse geerntet.To obtain the butinol I esterase, Pseudomonas glumae Lu Cultivated on a 14 l scale in 2023 and the active biomass harvested.

Im Labor wurde Pseudomonas glumae Lu 2023 auf Agarplatten mit Mi­ neralsalzmedium M12 mit 1 g/l EPA ausgestrichen und bei 28°C für 36 bis 48 Stunden inkubiert. Die Platten konnten dann bei 4°C vier Wochen gelagert werden.In the laboratory, Pseudomonas glumae Lu 2023 was grown on agar plates with Mi mineral salt medium M12 with 1 g / l EPA and at 28 ° C for Incubated for 36 to 48 hours. The plates could then four at 4 ° C Weeks.

Die Fermentation des Stammes wurde in einem 14 l-Fermenter Infors xxy durchgeführt. Für die Vorkultur wurden 250 ml Medium mit 2 bis 3 Pt-Ösen beimpft und 24 h bei 200 Upm und 28°C inkubiert. Die Hauptkultur wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
Temperatur: 28°C,
Zuluft: 7 l/min,
Rührung: 600 Upm,
Fermentationslaufzeit etwa 24 h,
Eingebaute pH- und pO2-Messung;
Medium für Vorkultur und Hauptkultur:
15 g/l Springer Hefeautolysat 65%,
1,6 g/l Magnesiumsulfat × 7 Wasser,
0,02 g/l Calciumchlorid × 2 Wasser,
3,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat,
3,5 g/l Dikaliumhydrogenphosphat,
5 g/l di-Ammoniumhydrogenphosphat,
6 ml Pluriol P2000 Antischaummittel.The strain was fermented in a 14 liter Infors xxy fermenter. For the preculture, 250 ml of medium were inoculated with 2 to 3 Pt eyes and incubated for 24 h at 200 rpm and 28 ° C. The main culture was carried out under the following conditions:
Temperature: 28 ° C,
Supply air: 7 l / min,
Stirring: 600 rpm,
Fermentation time about 24 h,
Built-in pH and pO 2 measurement;
Medium for pre-culture and main culture:
15 g / l Springer yeast autolysate 65%,
1.6 g / l magnesium sulfate × 7 water,
0.02 g / l calcium chloride × 2 water,
3.5 g / l potassium dihydrogen phosphate,
3.5 g / l dipotassium hydrogen phosphate,
5 g / l di-ammonium hydrogen phosphate,
6 ml Pluriol P2000 antifoam.

Die obenstehenden Inhaltsstoffe wurden in VE-Wasser gelöst und mit 25% Ammoniaklösung den pH auf 6,5 eingestellt. 5 ml/l Trace Elements (Spurensalzlsg.) und 2 g/l Glucose wurden separt steril­ filtriert.The above ingredients were dissolved in deionized water and adjusted the pH to 6.5 with 25% ammonia solution. 5 ml / l trace Elements (trace salt solution) and 2 g / l glucose became separately sterile filtered.

Nach dem Sterilisieren und Komplettieren des Mediums wurden 0,5 g/l Ethylphenylacetat in den Fermenter gegeben. Während der Fermentation auftretender Schaum wurde durch die Zugabe von Plu­ riol P2000 eingedämmt. Die Fermentation wurde abgebrochen, wenn der pO2-Wert im Fermenter wieder über 85% anstieg. Der Fermenter­ inhalt wurde dann bei einer Temperatur von unter 1500 und etwa 9000 bis 10000 g zentrifugiert und der Klarlauf verworfen. Die Zellmasse wurde bei -16°C eingefroren. After sterilizing and completing the medium, 0.5 g / l of ethylphenylacetate was added to the fermenter. Foam occurring during the fermentation was contained by adding Pluriol P2000. The fermentation was stopped when the pO 2 in the fermenter rose again to over 85%. The fermenter contents were then centrifuged at a temperature below 1500 and approximately 9000 to 10000 g and the clear run was discarded. The cell mass was frozen at -16 ° C.

Beispiel 3Example 3 Reinigung der Butinol I Esterase aus Pseudomonas glumae Lu 2023Purification of butinol I esterase from Pseudomonas glumae Lu 2023

Zellen (100 ml, 50 g Feuchtmasse) von Pseudomonas glumae (Lu 2023) wurden in einer Glaskugelmühle (100 ml Glaskugeln, Durchmesser 0,5 mm) bei 4°C und 3000 Upm aufgeschlossen. Nach Zen­ trifugation (30 min, 10000 rpm) und Waschen der Glaskugeln wurde mit dem Überstand (300 ml) eine Manganchloridfällung (pH 7 bis 7,5; 50 mM Endkonzentration) durchgeführt. Nach erneuter Zentri­ fugation wurde der pH des Überstandes auf 8,0 eingestellt und EDTA zu einer Konzentration von 50 mM zugegeben. Dieses Volumen wurde durch Chromatographie an Q-Sepharose (300 ml) gereinigt. Nach der Aufgabe der Probe wurde die Säule mit 50 mM Tris/HCl gespült. Die Wertfraktion wurde gesammelt und durch Ultrafiltra­ tion (100 kDa) konzentriert. Durch Molekularsiebchromatographie (5 cm Durchmesser, 90 cm Höhe; S-300 Material) wurde die Butinol Esterase von einer unspezifischen Esterase getrennt. Die erhal­ tene aktive Fraktion war trübe und wurde erneut konzentriert. Die Esterase war offensichtlich membrangebunden. Die Membranfraktion wurde nun zunächst mit einer Protease verdaut (Trypsin, Gewichts­ verhältnis 1 : 50 bis 1 : 100). Dabei verschwanden alle Proteine aus der Membranfraktion bis auf wenige Banden in der SDS-Polyacryla­ midgelelektrophorese (Abb. 1). Die Aktivität blieb erhalten. Diese Banden wurden durch eine native Gelelektrophorese (0,04% SDS) voneinander getrennt und ein Aktivitätstest in diesem nati­ ven Gel identifizierte die Esterase. Diese wurde aus dem Gel eluiert und zeigte sich nun als saubere Bande in einer denaturie­ renden SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese.Cells (100 ml, 50 g wet weight) of Pseudomonas glumae (Lu 2023) were disrupted in a glass ball mill (100 ml glass balls, diameter 0.5 mm) at 4 ° C. and 3000 rpm. After centrifugation (30 min, 10000 rpm) and washing of the glass balls, a manganese chloride precipitation (pH 7 to 7.5; final concentration 50 mM) was carried out with the supernatant (300 ml). After centrifugation again, the pH of the supernatant was adjusted to 8.0 and EDTA was added to a concentration of 50 mM. This volume was purified by chromatography on Q-Sepharose (300 ml). After loading the sample, the column was rinsed with 50 mM Tris / HCl. The value fraction was collected and concentrated by ultrafiltration (100 kDa). Molecular sieve chromatography (5 cm diameter, 90 cm height; S-300 material) separated the butinol esterase from an unspecific esterase. The active fraction obtained was cloudy and was concentrated again. The esterase was obviously membrane bound. The membrane fraction was first digested with a protease (trypsin, weight ratio 1:50 to 1:100). All proteins except a few bands disappeared from the membrane fraction in SDS-Polyacryla midgel electrophoresis ( Fig. 1). The activity remained. These bands were separated by native gel electrophoresis (0.04% SDS) and an activity test in this native gel identified the esterase. This was eluted from the gel and was now shown to be a clean band in a denaturing SDS polyacrylamide gel electrophoresis.

Das so gereinigte Protein wurde auf eine PVDF-Membran durch Blot­ ten überführt und sequenziert oder die Peptide wurden nach Tryp­ sinspaltung durch Reversed-Phase HPLC getrennt und sequenziert. Da der Aminoterminus des Proteins blockiert war, wurden nur tryp­ tische Peptide erhalten. Die verschiedenen Aminosäuresequenzen wiesen schwache Homologien zu einer Muconatcycloisomerase, EC 5.5.1.1, aus Acinetobacter Iwoffii und Pseudomonas putida, sowie zur Lactonesterase aus Pseudomonas fluoreszens auf. Das Peptid mit der Sequenz AIDAIFAPEGV (SEQ ID NO: 5) wies Homologie zu Pec­ tinesterasen (EC 3.1.1.11) auf.The protein thus purified was blotted onto a PVDF membrane transferred and sequenced or the peptides were tryp Sin splitting separated and sequenced by reversed phase HPLC. Since the amino terminus of the protein was blocked, only tryps became get table peptides. The different amino acid sequences showed weak homologies to a muconate cycloisomerase, EC 5.5.1.1, from Acinetobacter Iwoffii and Pseudomonas putida, and to lactonesterase from Pseudomonas fluoreszens. The peptide with the sequence AIDAIFAPEGV (SEQ ID NO: 5) showed homology to Pec tinesterases (EC 3.1.1.11).

Beispiel 4Example 4 Immobilisierung der Butinol I EsteraseImmobilization of butinol I esterase

Zur Immobilisierung wurden verschiedene Methoden eingesetzt. Various methods were used for the immobilization.  

  • 1. Die Butinol I Esterase wurde durch Fällung mit Aceton in Ge­ genwart von Kieselgur weitgehend inaktiviert. 25 mg Protein wurde mit 3,5 g Kieselgur (Merck) versetzt und 1,4 l Aceton (-20°C) wurde für 10 min zugegeben. Der beladene Träger wurde dann über eine G3 Glasnutsche abgetrennt, der Filterkuchen mit kaltem Aceton gewaschen und getrocknet.1. The Butinol I esterase was by precipitation with acetone in Ge largely inactivated by diatomaceous earth. 25 mg protein 3.5 g of diatomaceous earth (Merck) were added and 1.4 l of acetone (-20 ° C) was added for 10 min. The loaded carrier was then separated over a G3 glass filter, the filter cake washed with cold acetone and dried.
  • 2. Die Butinol I Esterase bindet nicht an Accurel (Akzo).2. Butinol I esterase does not bind to Accurel (Akzo).
  • 3. Die Butinol I Esterase konnte durch (2,3 Units/g, EPA-Test) Lyophilisation auf Kieselgur immobilisiert werden. Dazu wurde die Enzymlösung mit Kieselgur vermischt und bei -80°C gefro­ ren. Anschließend wurde der Feststoff durch Lyophilisation getrocknet.3. The butinol I esterase could be (2.3 units / g, EPA test) Lyophilization can be immobilized on diatomaceous earth. This was done the enzyme solution mixed with kieselguhr and frozen at -80 ° C The solid was then removed by lyophilization dried.
  • 4. Die Butinol I Esterase wurde (454 mUnits/g, EPA-Test) durch Ammoniumsulfatfällung immobilisiert. Dazu wurde das Enzym mit einer Sättigung von 80% an Ammoniumsulfat in Gegenwart von Kieselgur gefällt.4. The butinol I esterase was (454 mUnits / g, EPA test) by Immobilized ammonium sulfate precipitation. For this, the enzyme was included a 80% saturation of ammonium sulfate in the presence of Diatomaceous earth precipitated.
Beispiel 5Example 5 Racematspaltung mit der Butinol I Esterase aus Pseudomonas glumae Lu 2023Racemate resolution with the butinol I esterase from Pseudomonas glumae Lu 2023 Durchführung (Standardansatz)Implementation (standard approach)

100 Units Butinol I Esterase wurden mit 20 mMol Butinol-butyrat (Buttersäure-1-methyl-prop-2-ynyl-ester) in Phosphatpuffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) unter Rühren umgesetzt. Der pH-Wert wurde kontinuierlich gemessen und durch Zugabe von Natronlauge auf ca. pH 7,4 gehalten. Zu den in der Tabelle 1 angegebenen Zei­ ten wurden Proben entnommen, mit Methyl-tertiär-butylether (MTBE) zweimal ausgeschüttelt und die organische Phase durch GC (Chiral­ dex GTA) analysiert. Die Butinol I Esterase konnte durch Membran­ filtration aus dem Reaktionsgemisch entfernt werden.100 units of butinol I esterase were mixed with 20 mmol of butinol butyrate (Butyric acid 1-methyl-prop-2-ynyl ester) in phosphate buffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7.4) reacted with stirring. The pH was measured continuously and by adding sodium hydroxide solution kept at about pH 7.4. At the time specified in Table 1 samples were taken with methyl tertiary butyl ether (MTBE) Shaken twice and the organic phase by GC (Chiral dex GTA) analyzed. The butinol I esterase was able to cross through membrane filtration can be removed from the reaction mixture.

Mit steigender Anreicherung des weniger bevorzugten Esterenantio­ mers, wurde dieses in steigendem Maße umgesetzt. Dies führte nach etwa 45 Minuten zu einem Absinken des ee-Wertes von S-Butinol im Reaktionsgemisch. Der ee-Wert des Produkts erreichte sein Maximum nach ca. 30 bis 40 min mit 84% (83-97,9%). Der ee-Wert des Eduk­ tes stieg im Verlauf von 90 Minuten auf über 99%. Der ee-Wert (Enantiomerenüberschuß) ist definiert als die Menge des bevorzugt umgesetzten Enantiomers in Prozent abzüglich der Menge des weni­ ger bevorzugt umgesetzten Enantiomers in Prozent. Dieser Wert entspricht in den meisten Fällen der optischen Reinheit. Der pH- Abfall bis zum Zeitpunkt 30 Minuten verlief linear. Ab ca. 100 Minuten war die pH-Wert-Änderung vernachlässigbar.With increasing accumulation of the less preferred ester enantio mers, this was implemented to an increasing extent. This followed about 45 minutes to a decrease in the ee value of S-butinol in the Reaction mixture. The ee value of the product reached its maximum after about 30 to 40 min with 84% (83-97.9%). Eduk's ee value tes rose to over 99% over 90 minutes. The ee value (Enantiomeric excess) is defined as the amount of the preferred converted enantiomer in percent minus the amount of weni ger preferred converted enantiomers in percent. This value corresponds to the optical purity in most cases. The pH  Decline up to 30 minutes was linear. From approx. The change in pH was negligible for 100 minutes.

Die Restaktivität der Esterase in der wässrigen Phase betrug nach dem Ausschütteln noch ca 50%.The residual activity of the esterase in the aqueous phase was after about 50% after shaking.

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 1 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Butinol-butyrat mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit von der Zeit. R- und S-Konfiguration definieren, nach der R/S-Nomen­ klatur von Cahn, Prelog und Ingold, die beiden Enantiomeren eines chiralen Moleküls. Der Umsatz ist der Anteil des umgesetzten Esters im Reaktionsgemisch.Table 1 shows the enantiomeric excess in the conversion of Butinol butyrate with the Butinol I esterase depending on currently. Define R and S configuration, according to the R / S noun Klatur von Cahn, Prelog and Ingold, the two enantiomers of one chiral molecule. The turnover is the share of the implemented Ester in the reaction mixture.

Beispiel 6Example 6 Abhängigkeit der Spezifität der Butinol I Esterase von der Größe und Hydrophobizität/Ladung des Säureteils des EstersDependence of the specificity of butinol I esterase on the size and hydrophobicity / charge of the acid part of the ester StandardansatzStandardized approach

100 Units Butinol I Esterase wurden mit 20 mMol Butinolester in Phosphatpuffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7,4) unter Rühren umge­ setzt. Der pH-Wert wurde kontinuierlich gemessen und durch konti­ nuierliche Titration auf pH 7,0 gehalten. Entnommene Proben wur­ den mit Methyl-tertiär-butylether (MTBE) zweimal ausgeschüttelt und die organische Phase durch GC (Chiraldex GTA) analysiert.100 units of butinol I esterase were mixed in with 20 mmol of butynol ester Phosphate buffer (200 ml, 10 mmolar, pH 7.4) vice versa with stirring puts. The pH was measured continuously and by continuous Nuclear titration kept at pH 7.0. Samples were taken shaken twice with methyl tertiary butyl ether (MTBE) and the organic phase analyzed by GC (Chiraldex GTA).

ErgebnisResult

Die Qualität der Racematspaltung und die Reaktionsgeschwindigkeit waren von Größe und Hydrophobizität des Säureteils abhängig. Die besten Substrate für die Butinolesterase waren die Buttersäure- und Methylbuttersäure-butinolester. Lipasen sind gegenüber diesen Substraten inaktiv. Dies gilt auch für langkettige Ester wie n- Decansäurebutinylester.The quality of the resolution and the reaction rate depended on the size and hydrophobicity of the acid part. The the best substrates for butinol esterase were butyric acid and methyl butyric acid butinol ester. Lipases are against these Substrates inactive. This also applies to long-chain esters such as n- Decansäurebutinylester.

Tabelle 2 Table 2

Tabelle 2 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Estern mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit vom Säureteil des umgesetzten Esters.Table 2 shows the enantiomeric excess in the conversion of Esters with the butinol I esterase depending on the acid part of the converted ester.

Beispiel 7Example 7 Umesterung in organischem Medium unter Verwendung der Butinol I EsteraseTransesterification in organic medium using Butinol I esterase

10 mmol rac.-Butinol und 5 mmol Buttersäurevinylester wurden in 50 ml Methyl-tertiär-butylether (MTBE) gelöst und mit 9 Units Bu­ tinol I Esterase (3,3 g) geträgert auf Kieselgur versetzt und für 24 h bei RT geschüttelt. Nach Filtration wurde das Lösungsmittel entfernt und das Produktgemisch per GC charakterisiert.10 mmol rac.-butinol and 5 mmol vinyl butyric acid were in 50 ml of methyl tertiary butyl ether (MTBE) dissolved and with 9 units of Bu tinol I esterase (3.3 g) added to diatomaceous earth and for Shaken for 24 h at RT. After filtration, the solvent removed and the product mixture characterized by GC.

Zurück blieb bei 47% Umsatz (R)-Butinol (18% ee) und das Butyrat des (S)-Butinols (45% ee).What remained was 47% conversion (R) -butinol (18% ee) and the butyrate des (S) -butinol (45% ee).

In Methylisobutylketon wurde bei 43% Umsatz (R)-Butinol mit 16% ee und das Butyrat des (S)-Butinols mit 52% ee erhalten.In methyl isobutyl ketone with 43% conversion (R) -butinol with 16% ee and the butyrate of (S) -butinol with 52% ee.

Tabelle 3 zeigt den Enantiomerenüberschuß bei der Umsetzung von Estern mit der Butinol I Esterase in Abhängigkeit vom Säureteil des umgesetzten Esters. Table 3 shows the enantiomeric excess in the conversion of Esters with the butinol I esterase depending on the acid part of the converted ester.  

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims (17)

1. Butinol I Esterase, umfassend wenigstens eine der folgenden Aminosäuresequenzen:
sowie deren funktionale Äquivalente.1. Butinol I esterase, comprising at least one of the following amino acid sequences:
as well as their functional equivalents. 2. Butinol I Esterase gemäß Anspruch 1, umfassend eine Polypep­ tidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 41300 Da.2. Butinol I esterase according to claim 1, comprising a polypep tid chain with a molecular weight of about 41300 Da. 3. Butinol I Esterase gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie aus Pseudomonas glumae Lu 2023 mit der Hin­ terlegungsnummer DSM 13176 erhältlich ist.3. Butinol I esterase according to claim 1 or 2, characterized records that it from Pseudomonas glumae Lu 2023 with the Hin application number DSM 13176 is available. 4. Butinol I Esterase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der folgenden Reaktionen katalysiert:
  • a) enantioselektive Hydrolyse optisch aktiver Ester der For­ mel I
    R1-COO-R2 (I),
    worin R1 für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenen­ falls ein- oder mehrfach substituiertes C1-C10-Alkyl, C2-C10-Alkenyl, C2-C10-Alkinyl und R2 für geradkettiges oder verzweigtes, gegebenenfalls ein- oder mehrfach sub­ stituiertes C1-C10-Alkyl, C2-C10-Alkenyl, C2-C10-Alkinyl, C7-C15-Aralkyl oder für einen ein- oder mehrkernigen, ge­ gebenenfalls ein- oder mehrfach substituierten aromati­ schen Rest steht,
    R1 und/oder R2 wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstof­ fatom umfasst; und
  • b) enantioselektive Umesterung eines Esters der Formel I mit einem optisch aktiven Alkohol der Formel II
    R2-OH (II),
    worin R2 eine der obenstehenden Bedeutungen besitzt, und gegebenenfalls wenigstens ein asymmetrisches Kohlenstof­ fatom aufweist.
4. Butinol I esterase according to one of the preceding claims, characterized in that it catalyzes at least one of the following reactions:
  • a) enantioselective hydrolysis of optically active esters of formula I
    R 1 -COO-R 2 (I),
    wherein R 1 for straight-chain or branched, optionally mono- or polysubstituted C 1 -C 10 alkyl, C 2 -C 10 alkenyl, C 2 -C 10 alkynyl and R 2 for straight-chain or branched, optionally mono- or multi-substituted C 1 -C 10 alkyl, C 2 -C 10 alkenyl, C 2 -C 10 alkynyl, C 7 -C 15 aralkyl or for a mono- or polynuclear, optionally mono- or polysubstituted aromati the rest,
    R 1 and / or R 2 comprises at least one asymmetric carbon fat atom; and
  • b) enantioselective transesterification of an ester of the formula I with an optically active alcohol of the formula II
    R 2 -OH (II),
    wherein R 2 has one of the meanings above, and optionally has at least one asymmetric carbon atom.
5. Polynukleotid, das für die Butinol I Esterase gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche kodiert, sowie dessen funktionale Äquivalente dazu komplementäre Polynukleotide, und die damit hybridisierbaren Nukleinsäuresequenzen.5. Polynucleotide, which for the Butinol I esterase according to one of the previous claims encoded, as well as its functional Equivalents to complementary polynucleotides, and so on hybridizable nucleic acid sequences. 6. Expressionskassette, wenigstens ein Polynukleotid gemäß An­ spruch 5 umfassend operativ verknüpft mit regulatorischen Nu­ kleinsäuresequenzen.6. Expression cassette, at least one polynucleotide according to An saying 5 comprehensively operationally linked with regulatory nu acid sequences. 7. Rekombinanter Vektor zur Transformation eines eukaryontischen oder prokaryontischen Wirts, umfassend ein Polynukleotid ge­ mäß Anspruch 5, oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 6.7. Recombinant vector for transforming a eukaryotic or prokaryotic host comprising a polynucleotide according to claim 5, or an expression cassette according to claim 6th 8. Verfahren zur Herstellung der Butinol I Esterase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei man einen Mikroorganismus, wel­ cher die Esterase endogen produziert, oder einen mit einem Vektor gemäß Anspruch 7 transformierten Mikroorganismus kul­ tiviert und die Butinol I Esterase aus der Kultur isoliert.8. Process for the preparation of the butinol I esterase according to one of claims 1 to 4, wherein a microorganism, wel that produces the esterase endogenously, or one with one Vector according to claim 7 transformed microorganism kul tiviert and the Butinol I esterase isolated from the culture. 9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei der Mikroorganismus Pseudo­ monas glumae Lu 2023 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176 ist.9. The method according to claim 8, wherein the microorganism is pseudo monas glumae Lu 2023 with the deposit number DSM 13176 is. 10. Butinol I Esterase, erhältlich nach einem Verfahren gemäß ei­ nem der Ansprüche 8 oder 9.10. Butinol I esterase, obtainable by a process according to egg nem of claims 8 or 9. 11. Pseudomonas glumae Lu 2023 mit der Hinterlegungsnummer DSM 13176 und Varianten und Mutanten davon.11. Pseudomonas glumae Lu 2023 with the deposit number DSM 13176 and variants and mutants thereof. 12. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Vektor gemäß Anspruch 7 trägt.12. Microorganism, characterized in that it is a vector according to claim 7. 13. Verfahren zur enantioselektiven Esterhydrolyse unter Verwen­ dung der Butinol I Esterase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei
  • a) die Butinol I Esterase mit einem Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I in Kontakt ge­ bracht wird; und
  • b) die bei der stereoselektiven Hydrolyse eines der Stereoi­ someren anfallenden optisch aktiven Verbindungen und/oder das nicht hydrolysierte Esterenantiomer aus dem Reakti­ onsmedium gewonnen wird.
13. A method for enantioselective ester hydrolysis using butinol I esterase according to any one of claims 1 to 4, wherein
  • a) the butinol I esterase is brought into contact with a stereoisomer mixture of an optically active ester of the formula I; and
  • b) the optically active compounds and / or the non-hydrolyzed ester enantiomer obtained from the reaction medium in the stereoselective hydrolysis of one of the stereo isomers.
14. Verfahren zur enantioselektiven Umesterung, wobei
  • a) ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Alkohols der Formel II mit einem Ester der Formel I in Gegenwart einer Butinol I Esterase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kontakt gebracht wird und das nicht umgesetzte Alko­ holstereoisomer aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird, oder
  • b) ein Stereoisomerengemisch eines optisch aktiven Esters der Formel I mit einem Alkohol der Formel II in Gegenwart einer Butinol I Esterase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kontakt gebracht wird und ein Stereoisomer des im Ester enthaltenen optisch aktiven Alkohols aus dem Reak­ tionsmedium gewonnen wird.
14. Process for enantioselective transesterification, where
  • a) a stereoisomer mixture of an optically active alcohol of the formula II is brought into contact with an ester of the formula I in the presence of a butynol I esterase according to one of claims 1 to 4 and the unreacted alcohol stereoisomer is obtained from the reaction medium, or
  • b) a stereoisomer mixture of an optically active ester of the formula I is brought into contact with an alcohol of the formula II in the presence of a butinol I esterase according to one of claims 1 to 4 and a stereoisomer of the optically active alcohol contained in the ester is obtained from the reaction medium ,
15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei man zur Umesterung einen Vinylester als Acylierungsmittel für einen optisch aktiven Alkohol verwendet.15. The method according to claim 14, wherein one for the transesterification Vinyl ester as an acylating agent for an optically active Alcohol used. 16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13, 14 oder 15, wobei als Reaktionsmedium ein organisches Lösungsmittel verwendet wird.16. The method according to any one of claims 13, 14 or 15, wherein as An organic solvent is used for the reaction medium. 17. Optisch aktive Alkohole, Carbonsäuren oder Ester, hergestellt unter Verwendung der Butinol I Esterase.17. Optically active alcohols, carboxylic acids or esters using the Butinol I esterase.
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Free format text: HAUER, BERNHARD, DR., 67136 FUSSGOENHEIM, DE FRIEDRICH, THOMAS, DR., 64283 DARMSTADT, DE NUEBLING, CHRISTOPH, DR., 67454 HASSLOCH, DE STUERMER, RAINER, DR., 67127 ROEDERSHEIM-GRONAU, DE LADNER, WOLFGANG, DR., 67136 FUSSGOENHEIM, DE

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