DE10041238A1 - A method for identifying specific cleavable peptide, and use of such peptide sequences - Google Patents

A method for identifying specific cleavable peptide, and use of such peptide sequences

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DE10041238A1
DE10041238A1 DE2000141238 DE10041238A DE10041238A1 DE 10041238 A1 DE10041238 A1 DE 10041238A1 DE 2000141238 DE2000141238 DE 2000141238 DE 10041238 A DE10041238 A DE 10041238A DE 10041238 A1 DE10041238 A1 DE 10041238A1
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nucleic acid
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fusion molecules
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peptide
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Ralph Reimholz
Frank Ploeger
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    • G01N33/6803General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818Sequencing of polypeptides

Abstract

The invention relates to methods for detecting and identifying peptides that can be specifically cleaved, using a defined amino acid sequence based on a library of nucleic acid peptide fusion molecules. According to said methods, the variable part of the peptides is coded by the respective nucleic acid fused thereto, using proteolytically active solutions. The invention also relates to the use of said peptides for the targeted release of chemical active ingredients and for diagnosis.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden und Identifizieren spezifisch spaltbarer Peptide mit einer definierten Aminosäuresequenz unter Einsatz proteolytisch wirkender Lösungen und die Verwendung dieser Peptide zur gezielten Freisetzung von chemischen Wirkstoffen und zur Diagnostik. The invention relates to methods for locating and identifying specific cleavable peptides having a defined amino acid sequence using proteolytically-acting solutions and the use of these peptides for the controlled release of chemical agents and diagnostics.

Ein Verfahren zum Nachweis von spezifisch gespaltenen Peptiden unter Verwendung eines spezifischen Proteinkonstruktes, das bei proteolytischer Spaltung des Konstruktes fluoresziert, ist in US 5981200 beschrieben. A method for detecting specifically cleaved peptides by using a specific protein construct which fluoresces at proteolytic cleavage of the construct is described in US 5,981,200th Die Methode beruht auf der Fluoreszenz-Resonanzenergie-Technik (FRET). The method is based on fluorescence resonance energy technology (FRET). Ein Vorteil dieser Methode ist, dass sie auch zum in vivo-Nachweis von Proteinspaltungsereignissen eingesetzt werden kann. An advantage of this method is that it can also be used for in vivo detection of protein cleavage events. Nachteilig ist demgegenüber, dass nur spezifische Peptide markiert werden können oder im Falle einer Untersuchung von unterschiedlichen markierten Proteinen eine genaue Zuordnung des Spaltungsereignisses zu der jeweiligen Sequenz mit hohem Aufwand verbunden wäre. would other hand, is disadvantageous that only specific peptides can be marked or in the case of an investigation of different tagged proteins accurate assignment of the cleavage event to the particular sequence associated with high costs. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist, dass relativ große Mengen an markierten Substraten eingesetzt werden müssen, um ein detektierbares Signal zu erhalten. A further disadvantage of this method is that relatively large amounts have to be used labeled substrates in order to obtain a detectable signal.

Ein weiteres Verfahren, das zur selektiven Identifizierung von Enzymsubstraten verwendet werden kann, ist das Phage-Display (z. B. niedergelegt in WO 97/47314). Another method that can be used to selectively identify enzyme substrates, phage display (eg. As set out in WO 97/47314). Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass die Phage-Display Peptidbibliotheken gegenüber anderen Oberflächen-repräsentierten Peptidbibliotheken eine geringere Zahl möglicher verschiedener Sequenzen aufweisen und das die anschließende Aufarbeitung der Phagenpartikel und die Bestimmung der identifizierten Substrate relativ aufwendig ist. A disadvantage of this process is that the phage display peptide libraries compared to other surface represented peptide libraries have a lower number of possible various sequences and is relatively expensive subsequent work-up of the phage particles and the determination of the identified substrates.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Auffinden und Identifizieren von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden zu entwickeln sowie Substanzen bereitzustellen, die eine zielgerichtete Freisetzung von chemischen Wirkstoffen erlaubt. The object of the present invention is to develop a method for detection and identification of specifically proteolytically cleavable peptides and provide substances which allows targeted release of chemical agents.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden gelöst, das folgende Verfahrensschritte umfaßt: The object is achieved by a method for identifying specifically proteolytically cleavable peptides, comprising the steps of:

  • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a peptide nucleic acid encoding a proteolytically active sample,
  • b) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, b) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
  • c) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der isolierten Fusionsmoleküle. c) determining the sequence of the nucleic acid component of the isolated fusion molecules.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Verwendung von Fusionsmolekülen, die einen phänotypischen Peptidteil und einen genotypischen Nukleinsäureteil enthalten, der eine den Peptidteil codierende Sequenz besitzt. The inventive method is based on the use of fusion molecules that contain a phenotypic peptide part and a genotypic nucleic acid portion having a peptide portion of coding sequence. Der Peptidteil ist dabei über einen geeigneten Linker mit dem Nukleinsäureteil verknüpft. The peptide portion is linked via a suitable linker to the nucleic acid part. Als Linker wird bevorzugt ein Proteinakzeptor, z. As linker is preferably a protein acceptor such. B. Puromycin verwendet, der kovalent am Nukleinsäureteil gebunden ist. B. puromycin used which is covalently bound to the nucleic acid portion. Der Linker kann weitere Bestandteile wie z. The linker can further components such. B. eine nicht kodierende Nukleinsäuresequenz, bevorzugt eine poly-A-Sequenz, umfassen. B. a non-coding nucleic acid sequence, preferably a poly-A sequence, include. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Nukleinsäureteil weitere in seiner Sequenz konstante Regionen, die ein oder beidseitig der codierenden Region liegen. In a preferred embodiment, the nucleic acid portion contains additional constant in its sequence regions that are one or both sides of the coding region. Diese konstanten Nukleinsäureregionen können z. These constant nucleic acid regions such can. B. als Primerbindungsstellen zur Durchführung einer PCR oder als Restriktionsenzymschnittstellen dienen. B. serve as primer binding sites for carrying out a PCR or restriction enzyme cleavage sites. Die codierende Region des Nukleinsäureteils der Fusionsmoleküle enthält einen variablen Teil, der für mindestens zwei Aminosäuren, bevorzugt für mindestens vier, besonders bevorzugt für sieben bis zwölf Aminosäuren codiert. The coding region of the nucleic acid portion of the fusion molecules containing a variable part for at least two amino acids, preferably at least four, more preferably encodes seven to twelve amino acids. Dazu können weitere konstante codierende Nukleotidsequenzen treten. These more constant coding nucleotide sequences can occur. Die konstanten Nukleinsäuresequenzen können Peptidabschnitte codieren, die z. The constant nucleic acid sequences may encode peptide sections z. B. eine einfache Fixierung des peptidischen Teils des Fusionsmoleküls an einer festen Oberfläche erlauben oder die interessante Strukturelemente erzeugen. B. allow easy fixation of the peptide portion of the fusion molecule to a solid surface or produce interesting structural elements. Solche Strukturelemente sind z. Such structural elements are z. B. Epitope für Antikörper, Tags zur Reinigung oder zum Nachweis der Konstrukte oder Elemente die bestimmte Tertiärstrukturen determinieren. B. epitopes for antibodies, tags for purification or detection of the constructs or elements determine the specific tertiary structures.

Die Herstellung solcher Fusionsmoleküle kann z. The production of such fusion molecules such can. B. gemäß WO 98/31700 erfolgen. For example, WO 98/31700 done according to. Dort ist ein System beschrieben, bei dem an die Nukleinsäure, vorzugsweise RNA, über einen geeigneten Linker ein Proteinakzeptor, beispielsweise ein Puromycin, gebunden ist. There, a system is described, in which, linked to the nucleic acid, preferably RNA, via a suitable linker, a protein acceptor such as a puromycin. Hierdurch wird erreicht, dass kurz vor Ende der in vitro Translation der RNA in das entsprechende Protein, das synthetisierte Protein kovalent an seine kodierende RNA gebunden und so näher charakterisiert werden kann. Hereby is achieved that the in vitro translation of the RNA into the corresponding protein, the protein synthesized may be covalently linked to its encoding RNA and characterized so detail shortly before the end. Vergleichbare Systeme, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise in DE 196 46 372 C1, WO 98/16636, US 5843701 oder WO 94/13623 beschrieben. Comparable systems that can be used for the present invention are described for example in DE 196 46 372 C1, WO 98/16636, US 5,843,701 or WO 94/13623.

In einer bevorzugten Ausfertigung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Fusionsmoleküle über ihren peptidischen Teil an einer Oberfläche (Träger) fixiert. In a preferred execution of the method according to the invention the fusion molecules on their peptidic part on a surface (support) to be fixed. Unter dem Begriff "Träge" versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung Material, das in fester oder auch gelartiger Form vorliegt. is meant by the term "carrier" material according to the present invention, which is in solid or gel form. Als Trägermaterialien eignen sich beispielsweise Keramik, Metall, insbesondere Halbleiter, Edelmetall, Gläser, Kunststoffe, kristalline Materialien bzw. dünne Schichten des Trägers, insbesondere der genannten Materialien, oder (bio)molekulare Filamente wie Cellulose, Gerüstproteine. Suitable carrier materials are, for example, ceramic, metal, in particular semiconductors, precious metals, glasses, plastics, crystalline materials or thin layers of the carrier, in particular the materials mentioned, or (bio) molecular filaments are such as cellulose, scaffold proteins. Als Träger kommen aber nicht nur flächige Materialien sondern auch Partikel in Frage, wie z. As support not only flat materials but also particles come into consideration such. B. mit Proteinen beladbare Materialien zur Säulenchromatographie oder Beads aus organischen Polymeren. B. with proteins loadable materials for column chromatography or beads of organic polymers. Die Trägerung erfolgt im allgemeinen kovalent, quasi-kovalent, supramolekular oder physikalisch. The application to a support is generally covalently, quasi-covalent, supramolecular or physically.

Der Peptidteil der Fusionsmoleküle kann z. The peptide portion of the fusion molecules can for. B. über Biotin-Streptavidinbindung an den Träger fixiert sein, aber auch spezifische Domänen des Peptidteils der Fusionsmoleküle, wie z. be fixed via biotin-streptavidin binding to the carrier as well as specific domains of the peptide portion of the fusion molecules such. B. metallbindende Domänen (z. B. His-Tag), terminale Cysteinreste oder Domänen, die von spezifischen Antikörpern erkennbare Epitope enthalten, können eine solche Fixierung vermitteln. As metal-binding domains (eg. B. His-tag), terminal cysteine ​​residues or domains that contain specific antibodies detectable epitopes may convey such a fixation.

Bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren sind Bibliotheken deren Fusionsmoleküle alle möglichen Permutationen bezüglich des variablen Teils der Peptidsequenz enthalten. Preferably, in the inventive process libraries are their fusion molecules contain all possible permutations on the variable portion of the peptide sequence. Praktisch noch handhabbare Bibliotheken solcher Fusionsproteine haben eine Größe von ca. 10 13 verschiedener Sequenzen und sind damit im Vergleich zu anderen, bekannten Peptidbibliotheken um das 10 3 -10 4 fache (z. B. Phage Display) bzw. 10 6 -10 7 fache (klassische, chemisch synthetisierte Bibliotheken) größer. Practically still manageable libraries of such fusion proteins have a size of approximately 10 13 different sequences and are thus compared to other known peptide libraries by the 10 3 -10 4 times (z. B. Phage Display) or 10 6 -10 7 fold (classical, chemically synthesized libraries) larger. Um alle Permutationen abzudecken ist ein variabler Peptidteil von unter 11 Aminosäuren bevorzugt, besonders bevorzugt sind variable Peptidteile aus sieben oder acht Aminosäuren. To cover all permutations a variable peptide part of less than 11 amino acids is preferred, particularly preferred are variable peptide parts of seven or eight amino acids. Es können natürlich auch Bibliotheken erstellt werden, die längere variable Peptidteile in ihren Fusionsmolekülen enthalten, dann ist aber eine vollständige Abdeckung der Sequenzvielfalt nicht mehr möglich. It can of course libraries are built, the longer variable peptide components contained in their fusion molecules, but then full coverage of sequence diversity is no longer possible. Da die bisher bekannten, spezifische Peptidbindungen spaltenden Proteasen, eine Erkennungssequenz von mindestens vier Aminosäuren benötigen sind Bibliotheken mit einem variablen Peptidteil von mindestens vier Aminosäuren bevorzugt. Since the previously known, specific peptide bonds cleaving proteases, a recognition sequence will need at least four amino acids libraries are preferred with a variable peptide part of at least four amino acids.

Die Bibliothek aus Fusionsmolekülen wird entweder in Lösung oder bevorzugt fixiert an einen Träger einer proteolytisch aktiven Probe ausgesetzt. The library of fusion molecules is exposed either in solution or, preferably, fixed to a support of a proteolytically active sample. Als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe kommen vor allem gewebespezifische Extrakte tierischen, menschlichen oder pflanzlichen Ursprungs, Extrakte bestimmter Zellkompartimente, wie z. As proteolytically active sample laboratory test or control sample are mainly tissue-specific extracts of animal, human or plant origin, extracts of certain cell compartments such. B. zytosolische Extrakte, subzelluläre Extrakte, Extrakte von Membranbestandteilen, extrazelluläre Extrakte oder Mischungen solcher Extrakte in Frage. B. cytosolic extracts, subcellular extracts, extracts of membrane components, extracellular extracts or mixtures of such extracts in question. Von besonderem Interesse sind auch Extrakte aus krankhaftem Gewebe, wie z. Of particular interest also extracts from diseased tissue, such are. B. aus Karzinomen. B. from carcinomas. Aber auch Extrakte, die die gesamte oder Teile der proteolytischen Aktivität eines Organismus, insbesondere von Viren, Mikroorganismen, wie Bakterien oder Protisten, repräsentieren, können verwendet werden. But extracts that represent all or part of the proteolytic activity of an organism, in particular viruses, microorganisms, such as bacteria or protists, can be used. Als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe können auch bekannte Proteasen enthaltende Lösungen eingesetzt werden. As a proteolytically active sample, laboratory test or control sample also known proteases containing solutions can be used.

Die Inkubation der Bibliothek mit der proteolytisch aktiven Probe erfolgt bevorzugt unter physiologischen Bedingungen, bevorzugt bei Temperaturen zwischen 0°C und 45°C. The incubation of the library with the proteolytically active sample is preferably carried out under physiological conditions, preferably at temperatures between 0 ° C and 45 ° C. Dazu können die auf ihre proteolytische Aktivität zu untersuchenden Extrakte direkt verwendet werden oder die Extrakte werden in einem geeigneten Lösemittel, wie z. These can be used on their proteolytic activity to be examined extracts directly or extracts are used in a suitable solvent such. B. einer physiologischen Kochsalzlösung aufgenommen und zur Inkubation verwendet. As a physiological saline solution was added and used for the incubation.

Während der Inkubation werden die variablen Peptidbestandteile der Fusionsmoleküle durch die in der Probe enthaltenden Proteasen gespalten. During the incubation, the variable peptide components of the fusion molecules are cleaved by the proteases contained in the sample. Es ergibt sich ein spezifisches, für den verwendeten Proben-Extrakt charakteristisches, proteolytisches Spaltungsmuster. This results in a specific, characteristic for the used sample extract, proteolytic cleavage patterns. Dabei sind die abgespaltenen Teile der Fusionsmoleküle durch den Nukleinsäureteil codiert. The split-off parts of the fusion molecules are encoded by the nucleic acid part.

Nach der Inkubation der Bibliothek mit der zu untersuchenden, proteolytisch aktiven Probe werden die proteolytisch abgespaltenen Fusionsmolekülteile isoliert und die Sequenz des codierenden Nukleinsäureteils bestimmt. After incubation of the library with the to be examined, the proteolytically active sample, the proteolytically cleaved fusion molecule portions are isolated and determined the sequence of the nucleic acid encoding part. Damit sind die durch die Probe spaltbaren Peptidsequenzen identifiziert. In order for the fissile through the sample peptide sequences are identified.

Die Isolierung der geschnittenen Fusionsproteine nach Inkubation von Bibliothek und proteolytisch aktivem Extrakt in Lösung kann wie folgt durchgeführt werden. The isolation of the cut fusion proteins after incubation of the library and proteolytically active extract in solution can be carried out as follows.

Zur Isolierung der Nukleinsäurebereiche der geschnittenen von den ungeschnittenen Fusionsproteinen kann z. To isolate the nucleic acid regions of the cut z can from the uncut fusion proteins. B. ein konstantes Strukturmerkmal, z. As a constant structural feature such. B. ein bekanntes Epitop für einen Antikörper, in demjenigen Peptidteil ausgenutzt werden, welches durch die proteolytische Spaltung nicht mehr mit dem Rest des Fusionsmoleküls, beinhaltend den Nukleinsäureteil, verbunden ist. B. a known epitope for an antibody can be utilized in the one part of the peptide, which is connected by the proteolytic cleavage no longer with the rest of the fusion molecule comprising the nucleic acid portion. Dazu wird mit dem Ansatz eine Affinitätschromatographie, ausnutzend z. To this end, with the approach of affinity chromatography, taking advantage of z. B. besagten Antikörper, durchgeführt. B. said antibodies run. Der Nukleinsäureteil der geschnittenen Fusionsproteine kann nicht binden, wird von den Nukleinsäuren der ungeschnittenen Fusionsproteinen getrennt, und ist somit im Eluat enthalten. The nucleic acid portion of the cut fusion proteins can not bind, is separated from the nucleic acids of the uncut fusion proteins, and is therefore included in the leachate. Es können auch andere Strukturmerkmale wie z. There may be other structural features such as well. B. ein His-Tag oder Strep-Tag zur Abtrennung verwendet werden. B. used a His-tag or Strep-tag for separation. Die an der Affinitätsmatrix verbleibenden Fusionsmoleküle können eluiert und in Lösung oder vorteilhaft direkt im fixierten Zustand weiter verwendet werden. The remaining on the affinity matrix fusion molecules can be eluted and used directly in solution or, advantageously, in the fixed state on.

Die Isolierung der geschnittenen Fusionsproteine nach Inkubation von fixierter Bibliothek mit Extrakt kann mit unterschiedlichen Methoden erfolgen. The isolation of the cut fusion proteins after incubation of fixed library extract can be done with different methods.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Inkubation der fixierten Bibliothek mit dem Extrakt der Nukleinsäureteil der geschnittenen Fusionsmoleküle direkt im Eluat erhalten. In a preferred embodiment of the method according to the invention the fixed library with the extract of the nucleic acid portion of the fusion molecules of cut is obtained directly in the eluate after incubation.

Die Identifizierung der Sequenzen der gespaltenen Peptide kann im einfachsten Fall direkt durch PCR-Amplifizierung der im Eluat enthaltenen Nukleinsäureteile der gespaltenen Fusionsproteine mit anschließender Klonierung und Sequenzierung erfolgen. The identification of the sequences of the cleaved peptides can be effected in the simplest case directly by PCR amplifying the nucleic acid parts of the cleaved fusion proteins followed by cloning and sequencing contained in the eluate. Es ist aber auch möglich zunächst durch eine weitere Affinitätschromatographie unter Ausnutzung spezifischer Strukturen im Peptid- oder Nukleinsäureteil der gespaltenen Fusionsproteine zunächst eine Reinigung der gespaltenen Fusionsproteine gegenüber weiteren im Eluat vorhandenen Bestandteilen durchzuführen. but it is also possible initially to first perform a cleaning of the cleaved fusion proteins compared to other existing in the leachate constituents by another affinity chromatography taking advantage of specific structures in the peptide or nucleic acid portion of the cleaved fusion proteins. Nach Elution der gespaltenen Fusionsproteine vom chromatographischen Material, z. After elution of the cleaved fusion proteins by chromatographic material such. B. durch Inkubation mir einer KOH Lösung, kann die Sequenz der gespaltenen Peptide wieder mittels PCR, Klonierung und Sequenzierung erfolgen. For example, by incubation me a KOH solution can be effected the sequence of cleaved peptides again by PCR, cloning and sequencing.

Daneben sind eine Reihe weiterer chromatographischer oder elektrophoretischer Methoden zur Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Fusionsmolekülteile möglich. In addition, a number of other chromatographic or electrophoretic methods for the isolation of the proteolytically cleaved fusion molecule portions are also possible. Dazu ist es vorteilhaft, wenn die Fusionsmoleküle zur leichteren Identifizierung markiert oder modifiziert sind. For this it is advantageous if the fusion molecules for ease of identification marks or are modified. So kann z. Thus, can. B. der Nukleinsäureteil der Fusionsmoleküle z. As the nucleic acid part of the fusion molecules z. B. fluoreszenzmarkiert oder radioaktiv markiert sein. B. fluorescently labeled or radioactively labeled. Eine magnetische Markierung des Nukleinsäureteils der Fusionsmoleküle ist besonders bevorzugt, sie kann auch in Verbindung mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einer radioaktiven Markierung verwendet werden. A magnetic marker of the nucleic acid portion of the fusion molecules is particularly preferred, they can also be used in conjunction with a fluorescent label or a radioactive label. Die magnetische Isolierung der abgespaltenen Fusionsmolekülteile kann sehr einfach und selektiv durchgeführt werden. The magnetic isolation of the cleaved fusion molecule parts can be carried out very easily and selectively. Die Auswertung des proteolytischen Musters erfolgt z. The analysis of the proteolytic pattern z. B. über eine Hybridisierung der isolierten Nukleinsäuresequenzen auf einem Biochip wie er z. As a hybridization of isolated nucleic acid sequences on a biochip as such. B. von Affymetrix oder Nanogen erhältlich ist. B. Affymetrix or Nanogen is available. So kann direkt die isolierte Mischung aus abgespaltenen Fusionsmolekülteilen enthaltend unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen analytisch untersucht werden. Thus directly the isolated mixture are examined analytically from the cleaved fusion molecule parts containing different nucleic acid sequences.

Bei der Herstellung der zu untersuchenden Extrakte muss darauf geachtet werden, dass die Proteasen in ihrer aktiven Form isoliert werden. In the preparation of the extracts to be tested must be taken to ensure that the proteases are isolated in their active form. Gleichzeitig sollen aber DNA-abbauende Nukleasen möglichst inaktiviert werden. At the same time DNA-degrading nucleases to be inactivated as possible.

Die proteolytisch aktive Probe kann dazu mechanisch wie folgt aufgearbeitet werden: Das komplette Gewebe wird ggf. durch äußeres Waschen in kaltem Puffer gereinigt (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT; Dignam, JD, Preparation of Extracts from Higher Eukaryotes. Aus: Deutscher, MP (ed.) Guide to Protein Purification. Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, (1990). Seite 194-202). The proteolytically active sample can to be mechanically worked up as follows: The entire fabric is optionally purified by external washing in cold buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT ; Dignam, JD, Preparation of Extracts from Higher eukaryotes. Off: German, MP (ed.) Guide to protein Purification Methods in Enzymology, Vol 182, Academic Press, (1990) page 194-202)... Das Gewebe wird im kalten Puffer zerkleinert, und gegebenenfalls von Komponenten wie z. The tissue is minced in cold buffer, and optionally of components such. B. Bindegewebe, Haut, Blutgefäße entfernt. As connective tissue, skin, blood vessels removed. Die Gewebestückchen können mit Homogenisierungspuffer nach Kobayashi et al. The tissue pieces can with homogenization by Kobayashi et al. (Kobayashi, H., Fujishiro, S., Terao,T., Cancer Res. (1994) 54, 6539-6548): 0.01 M HEPES-Puffer, pH 7,2, 0,25 M Sucrose, 0.5% Triton X-100 im Volumenverhältnis 1 : 2 bis 1 : 5 (w/w) versetzt und in einem entsprechend geeigneten Gewebehomogenisator (su) unter Eiskühlung zum Homogenat verarbeitet werden. (Kobayashi, H., Fujishiro, S., Terao, T, Cancer Res (1994) 54, 6539-6548..): 0.01 M HEPES buffer, pH 7.2, 0.25 M sucrose, 0.5% Triton X -100 in the volume ratio 1: 2 to 1: 5 are added (w / w) and other appropriate tissue homogenizer (see below) are processed under ice-cooling to the homogenate. Die Methode muss auf den gewünschten Gewebetyp angepaßt werden. The method must be adapted to the desired tissue type. Geeignete Gewebehomogenisatoren sind z. Suitable are, for Gewebehomogenisatoren. B.: B .:

  • - Mixer: ZB Leber läßt sich gut in einem Mixer zu Brei verarbeiten, dann weiter durch ein engmaschiges Nylonnetz reiben. - Mixer: For example, the liver can be good in a blender process to a pulp, then rub through a fine nylon mesh. Es entsteht ein feines Gewebehomogenat. The result is a fine tissue homogenate.
  • - Homogenisator "Potter": rotierender Glasstab, der eng in einem passenden Gefäß eingeführt ist, so dass das Gewebe zwischen der Gefäßwand und dem Glasstab zerrieben wird. - homogenizer "Potter": rotating glass rod, which is closely inserted into a suitable vessel so that the tissue between the vessel wall and the glass rod is ground. Dabei muss auf ständige Kühlung geachtet werden. Care must be taken on continuous cooling.
  • - Dispergiermaschinen: Homogenisatoren mit rotierenden Messern in einem Schaft. - Dispersing: homogenizers with rotating blades in a shaft.

Das homogenisierte Gewebe wird mit weiterem Homogenisierungspuffer versetzt und bei 4-8°C bis zu 45 min geschüttelt. The homogenized tissue is added with additional homogenization buffer and shaken at 4-8 ° C for up to 45 min. Anschließend wird das Gewebehomogenat bei 4°C mit 16.000 g zentrifugiert und der Überstand direkt oder, z. Subsequently, the tissue homogenate is centrifuged at 4 ° C at 16,000 g and the supernatant directly, or z. B. über Säulenchromatographie oder Dialyse, weiter aufgereinigt und zur Analyse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. B., further purified by column chromatography or dialysis and analysis according to the inventive method.

Wird statt frischem Gewebe gefrorenes Material verwendet, sollte die Methode abgewandelt werden. Is frozen material used instead of fresh tissue, the method should be modified. Gefrorenes Gewebe nicht einfach auftauen lassen, da sonst aus Lysosomen freigesetzte Proteasen die Enzyme inaktivieren. can not be simply frozen tissue thawed, otherwise released from lysosomes proteases inactivate the enzymes. Das Gewebe wird bevorzugt unter ständiger Kühlung mit flüssigem Stickstoff in einem Mörser pulverisiert und das Pulver über Nacht in einem Lyophylisator gefriergetrocknet. The tissue is preferably pulverized under constant cooling with liquid nitrogen in a mortar and the powder freeze-dried overnight in a lyophylisator. Das trockene Pulver läßt sich dann weiter verwenden. The dry powder can then be reused.

Im folgenden wird als Beispiel eine geeignete Aufarbeitung von Gehirngewebe und dessen Trennung in Kernfraktion, zytosolische Fraktion, Membranfraktion und Zytoskelettfraktion gegeben. In the following, a suitable processing of the brain tissue and its separation in nuclear fraction, cytosol fraction and membrane fraction Zytoskelettfraktion is given as an example. Die erhaltenen Extrakte können direkt oder unter Zusatz von weiteren Hilfsstoffen als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe verwendet werden. The obtained extracts may be used as proteolytically active sample, laboratory test or control sample either directly or with the addition of further auxiliaries.

Gehirne, z. Brains, z. B. aus Mäusen, aus mehreren Präparationen (ca. 50 Stück) werden in ca. 25 ml Lösungspuffer 1 (LP1) gegeben (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) und mit dem Ultraturrax 1 min bei maximaler Geschwindigkeit homogenisiert. B. from mice from several preparations (approximately 50 pieces) are placed in about 25 ml buffer solution 1 (LP1) (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA) and homogenized with an Ultraturrax for 1 min at maximum speed. Alternativ wird bei weniger Material der Glaspotter eingesetzt. Alternatively, the glass Potter is used in less material.

Zur Isolierung einer Kernfraktion kann das Homogenat 10 min bei 1000 × g bei 4°C zentrifugiert werden. In order to isolate a nuclear fraction, the homogenate can be centrifuged for 10 min at 1000 x g at 4 ° C. Der Überstand wird für weitere Präparationen gesammelt. The supernatant was collected for further preparations. Das Zentrifugat (Zellkernpellet) wird in 12 ml LP1 resuspendiert und wie zuvor zentrifugiert. The centrifugate (nuclear pellet) is resuspended in 12 ml of LP1 and centrifuged as before. Das Zellkernpellet wird in LP2 (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40) resuspendiert. The nuclear pellet is resuspended in LP2 (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40) resuspended.

Die gesammelten Überstände können zur Isolierung und Reinigung einer zytosolischen Fraktion verwendet werden. The collected supernatants can be used for the isolation and purification of a cytosolic fraction. Dazu werden sie bei 100.000 × g, 1 h, 4°C zentrifugiert. For this they are at 100,000 × g, 1 h, centrifuged 4 ° C. Der Überstand bildet den zytosolische Proteine enthaltende Extrakt. The supernatant forms the cytosolic proteins containing extract.

Zur Isolierung der Membranfraktion wird das Pellet aus der zytosolischen Abtrennung dreimal in LP1 gewaschen und bei 100.000 × g, 1 h, 4°C zentrifugiert. To isolate the membrane fraction, the pellet is washed three times from the cytosolic separation in LP1 and h at 100,000 x g, 1, centrifuged 4 ° C. Nach dem dritten Waschschritt wird das Pellet in 15 ml LP2 resuspendiert und über Nacht solubilisiert. After the third wash step, the pellet is resuspended in 15 ml LP2 and solubilized overnight. Anschließend wird bei 100.000 × g, 1 h, 4°C zentrifugiert. 4 ° C is then at 100,000 x g, 1 h, centrifuged. Der Überstand bildet die Membranfraktion. The supernatant constitutes the membrane fraction.

Zum Erhalt einer Zytoskelettfraktion wird das Pellet aus der Membranfraktionabtrennung dreimal in LP2 gewaschen und bei 100.000 × g, 1 h, 4°C zentrifugiert. To obtain a Zytoskelettfraktion the pellet is washed from the membrane fraction separation three times in LP2 and h at 100,000 x g, 1, centrifuged 4 ° C. Nach dem dritten Waschschritt wird das Pellet in LP3 (12,5 mM Tris- HCl pH 7,5; 0,4% SDS) resuspendiert und bei 95°C solubilisiert. After the third wash step the pellet is in LP3 (12.5 mM Tris-HCl pH 7.5; 0.4% SDS), and solubilized at 95 ° C. Abschließende Zentrifugation bei 20.800 × g, 15 min RT. Final centrifugation at 20,800 × g, 15 min RT. Der Überstand enthält die Zytoskelettfraktion. The supernatant containing the Zytoskelettfraktion.

Zur Gewinnung von proteolytisch aktiven Extrakten aus Zellen und Geweben, die sezernierte Proteasen enthalten, werden z. For the production of proteolytically active extracts from cells and tissues containing secreted proteases, z. B. humane Zellen oder Zelllinien in der Zellkultur als Monolayer kultiviert. B. Cell culture cultured human cells or cell lines as a monolayer. Die Zellen werden mit Zellkulturmedium dreimal gewaschen. The cells are washed with cell culture medium three times. Anschließend wird das Medium gegen frisches Medium ersetzt. Then the medium with fresh medium is replaced. Dabei werden die sekretorischen Proteasen bei 37°C in das Medium sezerniert. The secretory proteases are secreted at 37 ° C in the medium. Die geeignete Sezernierungsdauer liegt bei 1 bis 3 h. The appropriate Sezernierungsdauer is 1 to 3 hours. In gleicher Weise kann mit Gewebestücken oder Gewebeschnitten verfahren werden. In the same way can be moved with pieces of tissue or tissue sections.

Zur Gewinnung von Gewebeflüssigkeit aus Gewebeverbänden können z. For the production of tissue fluid from tissue associations such can. B. Organe bzw. Gewebe mit Schere und Skalpell vorsichtig zerkleinert werden. B. organs or tissues are crushed carefully with scissors and scalpel. Die Gewebestücke werden mehrfach mit Gewebepuffer gewaschen. The pieces of tissue are washed several times with tissue buffer. Die Gewebestücke oder auch kleine Organe werden in physiologischem Puffer oder Medium bei 37°C für 1-3 Stunden inkubiert. The tissue pieces or small organs are incubated in physiological buffer or medium at 37 ° C for 1-3 hours. Nach der Inkubation läßt man die Gewebestücke in einem 15 ml Spitzgefäß sedimentieren, das Medium wird abgenommen und kann weiter untersucht werden. After incubation the tissue pieces is allowed in a 15-ml egg vessel sediment, the medium is removed and can be further studied.

Alternativ können die Gewebe in Zentrifugtionsgefäße überführt und schonend zentrifugiert werden. Alternatively, the tissue can be transferred to Zentrifugtionsgefäße and gently centrifuged. Der Überstand enthält die Proteasen der interstitiellen Flüssigkeit aus den Gewebezwischenräumen. The supernatant containing the proteases of the interstitial fluid from the tissue spaces.

Alternativ können Proteinextrakte auch nach folgender Methode gewonnen werden: Zerkleinerung des Gewebes in eiskaltem RIPA Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1% NP-40, 0,25% Natriumdeoxycholat, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3V04; 1 mM NaF und je 1 µg/ml Aprotonin, Leupeptin und Pepstatin), einfrieren des zerkleinerten Gewebes und anschließendem zermörsern. Alternatively, protein extracts can also be obtained by the following method: comminution of the tissue in ice cold RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3V04, 1 mM NaF and 1 ug / ml aprotinin, leupeptin and pepstatin), and then freeze the minced tissue Grind animal. Zur Homogenisierung des Gewebes wird RIPA Puffer im Volumenverhältnis 1 zu 2 zugegeben und der Ansatz wird danach aufgetaut. For homogenization of the tissue RIPA buffer in the volume ratio 1 to 2 is added and the mixture is then thawed.

Nach 15 min wird das Lysat bei 13.000 × g, 4°C, 10 min lang zentrifugiert. the lysate at 13,000 × g, 4 ° C, centrifuged for 10 min after 15 min. Das Lysat kann aliquotiert, schock-gefroren und in Flüssigstickstoff gelagert werden. The lysate can be aliquoted, shock-frozen and stored in liquid nitrogen.

In einem weiteren abgewandelten Verfahren kann die proteolytische Aktivität einer unbekannten Probe gegenüber einer Vergleichsprobe bestimmt werden. In another modified method, the proteolytic activity of an unknown sample against a reference sample can be determined. Das Verfahren zur differenziellen Bestimmung der proteolytischen Aktivität umfaßt dabei folgende Verfahrensschritte: The method for differentially determining the proteolytic activity thereby comprises the following steps:

  • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure, mit einer proteolytisch aktiven Probe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide, comprising a proteolytically active sample,
  • b) Inkubation der gleichen Bibliothek aus Fusionsmolekülen in mindestens einem parallelen Ansatz, mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vergleichsprobe, b) incubation of the same library of fusion molecules in at least a parallel approach, with at least one proteolytically active comparative sample,
  • c) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, c) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
  • d) Erstellen einer differenziellen Nukleinsäurebank d) creating a differential nucleic acid Bank
  • e) Bestimmung der Sequenz der ermittelten Nukleinsäuren. e) determining the sequence of the nucleic acids determined.

Die differenzielle Bestimmung der proteolytisch abgespaltenen Nukleinsäureteüe der Fusionsmoleküle kann z. The differential determination of proteolytically cleaved Nukleinsäureteüe of the fusion molecules such can. B. durch Aufbringung eines Überschusses an einzelsträngigen Nukleinsäureteilen, die aus der Vergleichsprobe isoliert wurden, auf einem geeigneten Träger, Absättigung der freien Bindungsstellen des Trägers und anschließender Hybridisierung mit einzelsträngigen Nukleinsäureteilen, die aus der Probe isoliert wurde, erfolgen. For example, by application of an excess of single stranded nucleic acid parts which have been isolated from the comparative sample on a suitable support, saturation of free binding sites of the support and subsequent hybridization with single-stranded nucleic acid parts, which was isolated from the sample take place. Die abtrennbaren, nicht hybridisierten Nukleinsäureteile, repräsentieren spezifisch nur in der Probe geschnittenen Peptidsequenzen. The detachable, non-hybridized nucleic acid parts representing specific only in the sample cut peptide sequences.

In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren wird die proteolytische Aktivität einer Probe gegenüber mindestens einer Vorprobe ermittelt. In a further process of the invention the proteolytic activity of a sample is determined relative to at least one preliminary test. Durch das sukzessive Inkubieren der Fusionsmolekülbibliothek mit Vorprobe und Probe kann deren differenzielle proteolytische Aktivität bestimmt werden. By successively incubating the fusion molecule library with laboratory test sample and the differential proteolytic activity can be determined. Das Verfahren umfaßt folgende Verfahrensschritte: The method comprises the following steps:

  • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vorprobe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide having at least one proteolytically active laboratory test sample,
  • b) Entfernen der abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, b) removing the cleaved components of the fusion molecules
  • c) Inkubation der so präparierten Bibliothek mit einer proteolytisch aktiven Probe, c) incubating the thus prepared library with a proteolytically active sample,
  • d) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, d) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
  • e) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten Fusionsmoleküle. e) determining the sequence of the nucleic acid component of the separated fusion molecules.

In bevorzugten Ausführungsformen aller drei erfindungsgemäßen Verfahrensvarianten werden die Nukleinsäureteile der proteolytisch gespaltenen und isolierten Fusionsmolekülteile mittels PCR vervielfältigt. In preferred embodiments of all three variants of the method according to the invention, the nucleic acid portions of the proteolytically cleaved and isolated fusion molecule portions are amplified by PCR. Dazu werden Fusionsmoleküle verwendet, deren Nukleinsäureteil beidseitig von der codierenden Nukleinsäuresequenz konstante Nukleinsäuresequenzen als Primerbindungsstellen besitzen. These fusion molecules are used, the nucleic acid portion having both sides constant of the nucleic acid sequence encoding nucleic acid sequences as a primer binding sites.

Um sowohl die Menge an Fusionsmolekül, welches im untersuchten Extrakt geschnitten wird, als auch die Spezifität des Selektionsschrittes (Spaltung im proteolytische aktiven Extrakt) stark zu erhöhen wird bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren die isolierte Nukleinsäure der gespaltenen Fusionsproteine mittels PCR amplifiziert und in vitro transkribiert. In order to increase both the amount of fusion molecule, which is cut in the examined extract, as well as the specificity of the selection step (cleavage at the proteolytic active extract) strongly the isolated nucleic acid of the cleaved fusion proteins is preferably amplified by PCR, and transcribed in vitro process of the invention. Ausgehend von der so hergestellten RNA wird wieder durch bereits beschriebene Methoden eine neue Bibliothek von Fusionsproteinen hergestellt und mit demselben Extrakt enthaltend proteolytische Aktivitäten inkubiert. Based on the thus-prepared RNA is again prepared by methods already described a new library of fusion proteins and incubated with the same extract containing proteolytic activities. Dieser Zyklus kann mehrfach wiederholt werden. This cycle can be repeated several times.

In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens können PCR, in vitro Transkription und/oder in vitro Translation in einem oder mehreren der beschriebenen Zyklen mit einer höheren als normal auftretenden Fehlerrate durchgeführt werden. In a further variant of the inventive method can PCR, in vitro transcription and / or in vitro translation more of the cycles described with a higher than normal error rate occurring are carried out in one or. Dadurch wird eine Erhöhung der verfügbaren, zu testenden Peptidsequenzen erreicht (in vitro Protein-Evolution). As a result, an increase of the available test peptide sequences obtained (in vitro protein evolution).

Ebenso ist es durch die Variante der gerichteten in vitro Protein-Evolution schnell und einfach möglich bekannte Spaltsequenzen so zu verändern, dass sich andere kinetische Eigenschaften bezüglich der schneidenden Proteasen ergeben. It is also changing by the variant of the directed in vitro protein evolution known quick and easy cleavage sequences so that there are other kinetic properties with respect to the cutting proteases.

Der proteolytisch aktiven Probe können weitere Zusatzstoffe, wie z. The proteolytically active sample, additional additives such. B. spezifisch wirkende Proteaseinhibitoren oder Nukleaseinhibitoren bzw. unspezifische RNA und/oder DNA zur Absättigung möglicher Nukleasen, hinzugefügt werden. As protease inhibitors, nuclease inhibitors or specific acting or non-specific RNA and / or DNA, are added to saturate possible nucleases.

Insbesondere wenn die verwendeten Proben-Extrakte unspezifisch schneidende lysosomale oder endosomale Proteasen (saure Peptidasen, wie Aspartatpeptidasen) enthalten ist die Zugabe eines spezifisch gegen diese Proteasen wirkenden Inhibitors, wie z. Specifically, when the sample extracts used unspecific cutting lysosomal or endosomal proteases (peptidases acid as Aspartatpeptidasen) is the addition of a specific acting against these proteases inhibitor such. B. die Zugabe von Pepstatin A, empfehlenswert. For example, the addition of pepstatin A, is recommended.

Auch die spezifische Hemmung von Exoproteasen kann von Vorteil sein, um den Abbau der in der Probe, Vergleichsprobe oder Vorprobe enthaltenden Proteine, insbesondere der anderer Proteasen und deren peptidischen Cofaktoren zu verhindern. Also, the specific inhibition of exoproteases can be advantageous to prevent the degradation of the contained in the sample, control sample or laboratory test proteins, in particular other proteases and their peptidic cofactors. Die fixierten Fusionsmoleküle selbst müssen nicht gegen Exoproteasen geschützt werden, da keine freien N- oder C-terminalen Peptideriden vorhanden sind. The fixed fusion molecules themselves do not need to be protected from Exoproteases because no free N- or C-terminal peptides Riden are available. Der Abbau des Peptidanteils der proteolytisch gespaltenen Fusionsmoleküle ist für den weiteren Verfahrensablauf unerheblich. The degradation of the peptide portion of the proteolytically cleaved fusion molecules is irrelevant for the further procedure.

Die Entfernung von Nukleaseaktivitäten aus Gewebeextrakten zum Schutz der Nukleinsäureteile der Fusionsmoleküle kann im frisch präparierten Gewebehomogenat schon während der Gewebeaufarbeitung und den nachfolgenden Schritten durch Behandlung mit RNAse- bzw. DNAse-Inhibitoren erreicht werden. The distance from nuclease from tissue extracts to protect the nucleic acid components of the fusion molecules can be achieved in freshly prepared tissue homogenate already during tissue reprocessing and subsequent steps by treatment with RNase and DNase inhibitors. In einer weiteren Ausführungsform können die Nukleaseinhibitoren kovalent an Partikel oder geeignete Säulenmaterialien gekoppelt sein. In another embodiment, the nuclease may be covalently coupled to the particles or suitable column materials. Nukleasen, die an oberflächen-gekoppelte Nukleaseinhibitoren binden, werden so von dem übrigem Gewebehomogenat abgetrennt. Nucleases that bind to surface-coupled nuclease are so separated from the übrigem tissue homogenate. Eine Alternative zur Inhibition der Nukleasen, ist der Schutz des Nukleinsäureanteils der Fusionsmoleküle durch Hilfsstoffe. An alternative to the inhibition of nucleases, is to protect the nucleic acid portion of the fusion molecules by auxiliaries. Die Hilfsstoffe umgeben die DNA und RNA, bilden einen Komplex und schützen sie so vor Nukleasen (Katayose, S. (1998) J. Pharm. Sci., 87: 160-163). The excipients surrounding the DNA and RNA to form a complex and protect them from nucleases (Katayose, S. (1998) J. Pharm Sci., 87:. 160-163). Diese Hilfsstoffe sind insbesondere Polyethylenimin oder PEG-PLL, können aber auch Proteine oder Chaparone sein. These excipients are, in particular polyethyleneimine or PEG-PLL, but can also be proteins or Chaparone. Ein Schutz vor Nukleasen ist ebenfalls denkbar, indem artifizielle Nukleinsäuren im Fusionsmolekül verwendet werden, wie z. Protection against nucleases is also possible by artificial nucleic acids are used in the fusion molecule such. B. PNA. B. PNA. Die Nukleinsäuren können auch zur Erhöhung der Stabilität chemisch modifiziert werden, z. The nucleic acids can also be chemically modified to increase stability, for. B. durch Methylierung. For example, by methylation.

Die Inkubationszeiten von Bibliothek und Extrakt hängen von der proteolytischen Aktivität der eingesetzten Probe ab. Incubation of the library and extract depend on the proteolytic activity of the sample. In einer erweiterten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Verfahren, bei Variation der Inkubationszeiten, wiederholt durchgeführt. In an enhanced embodiment, the inventive methods are repeatedly performed with variation of the incubation times. Das hat den Vorteil, dass kinetische Aussagen betreffend der Probe und deren peptidischen Substrate, die die Bibliothek aus Fusionsmolekülen beinhalten, getroffen werden können. This has the advantage that kinetic statements that may be made concerning the sample and the peptide substrates that include the library of fusion molecules. Peptidische Substrate die bei kurzen Inkubationszeiten proteolytisch gespalten werden, weisen eine hohe Geschwindigkeitskonstante gegenüber proteolytisch aktiver Bestandteile der Probe auf. Peptidic substrates are cleaved proteolytically at short incubation times, have a high rate constant on opposite proteolytically active components of the sample.

Eine weitere einfache Möglichkeit kinetische Aussagen über die proteolytische Aktivität der Probe treffen zu können besteht entweder in der Variation der Konzentration der Fusionsmoleküle der Bibliothek, die die peptidischen Substrate bilden, oder bevorzugt in der Variation der Konzentration der zur Inkubation vorgesehenen Probe. be able to make another easy way kinetic statements on the proteolytic activity of the sample is either to varying the concentration of the fusion molecules of the library, which make up the peptide substrates, or preferably in the variation of the concentration of the sample provided for incubation.

Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die proteolytische Aktivität der untersuchten Probe phänomenologisch, das heißt ohne vollständige Kenntnis über die proteolytische aktiven Bestandteile der Probe, beschrieben werden kann. A great advantage of the inventive method is that the proteolytic activity of the sample investigated phenomenologically, that is, without full knowledge of the proteolytic active components of the sample can be described. Beim Vergleich verschiedener Proben ist es unerheblich, ob eine unterschiedliche proteolytische Aktivität auf dem Vorliegen verschiedener Proteasen, oder auf einer direkten Mutation einer Protease, was eher selten der Fall ist, beruht, oder auf eine Fehlregulation eines Proteasegens oder eines Proteaseinhibitors oder -aktivators zurückgeht. When comparing different samples, it is irrelevant whether a different proteolytic activity in the presence of various proteases, or on a direct mutation of a protease, which is rarely the case, is due, or is due to dysregulation of a protease gene or a protease inhibitor or -aktivators. Auch Veränderungen der proteolytischen Aktivität, die über extrazelluläre Signale induziert werden, können mit den vorliegenden Verfahren erfaßt werden. Also, changes in proteolytic activity, which are induced on extracellular signals can be detected with the present method. Es ist bekannt, dass z. It is known that for. B. durch die Bindung von Liganden, wie z. For example, by the binding of ligands, such. B. Hormone an Transmembranrezeptoren die Kinase und/oder Phosphataseaktivität im Zytosol einer Zelle verändert werden kann. B. Hormones to transmembrane receptors, the kinase and / or phosphatase activity can be altered in the cytosol of a cell. Der Phophorylierungsgrad spielt bei der Regulation von Enzymaktivitäten in den Zellen eine entscheidende Rolle und hat somit auch einen entscheidenden Einfluß auf die Proteaseaktivität. The Phophorylierungsgrad plays a crucial role in the regulation of enzyme activity in the cells and thus also has a decisive influence on the protease activity. Eine deregulierte intrazelluläre Phosphatase- und, gekoppelt daran, der Proteaseaktivität spielt z. A deregulated intracellular phosphatase and, coupled thereto, of the protease activity plays z. B. bei der Krebsentstehung eine entscheidende Rolle. B. a crucial role in cancer development.

Vorteilhaft ist vor allem die differenzielle Bestimmung von spezifisch spaltbaren Peptiden im Hinblick auf Extrakte aus gesundem und krankhaftem Gewebe, sowie aus gesundem und mit Krankheitserregern infiziertem Gewebe. is advantageous especially the differential determination of specifically cleavable peptides in terms of extracts from healthy and diseased tissue, as well as from healthy and infected with pathogens tissue. Ebenfalls von besonderem Interesse ist das Auffinden spezifisch spaltbarer Peptide im Vergleich einzelner Organismen. Also of particular interest is the finding is specific cleavable peptides in comparison of individual organisms.

Es können mit den erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin schnell und einfach Sequenzen von Peptiden ermittelt werden, die durch die untersuchte Probe geschnitten, insbesondere spezifisch geschnitten werden. It can still quickly and easily sequences of peptides are determined with the inventive method, the cut by the sample under study, in particular specifically cleaved. Andererseits sind ebenfalls Sequenzen auffindbar, die keiner proteolytischen Spaltung durch die untersuchte Probe unterliegen. On the other hand sequences are also found, which are not subject to proteolytic cleavage by the sample under investigation.

Neben der Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen, können die oben beschriebenen Verfahren auch zur Auffindung von spezifisch wirkenden Inhibitoren oder Aktivatoren genutzt werden, ohne dass im Einzelfall die zu hemmenden Proteasen bekannt sein müssen. In addition to the identification of specifically proteolytically cleavable peptide sequences, the methods described above can also be used for the detection of specifically acting inhibitors or activators, without any individual case, the to be inhibited proteases must be known. Dazu wird einfach der Probenlösung ein potentieller Inhibitor oder Aktivator hinzugesetzt und die differenzielle proteolytische Aktivität zwischen Probe und potentielle Inhibitoren oder Aktivatoren enthaltende Proben bestimmt. For this purpose the sample solution, a potential inhibitor or activator is simply added and the differential proteolytic activity between the sample and potential inhibitors or activators containing samples determined. Verringert sich die Zahl der gespaltenen Sequenzen handelt es sich um einen Inhibitor, erhöht sich die Zahl der gespaltenen Sequenzen handelt es sich um einen Aktivator. the number of cleaved sequences decreases is an inhibitor, the number of cleaved sequences increases If it is an activator.

Zur Identifizierung von Inhibitoren wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine vorselektierte Bibliothek aus Fusionsmolekülen verwendet, die nach mehreren Selektionszyklen mit der proteolytisch aktiven Probe erhalten wurde. For identifying inhibitors of a pre-selected library of fusion molecules is used in a preferred embodiment, which was obtained after several cycles of selection with the proteolytically active sample. Alternativ können auch die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten, spezifisch spaltbaren Peptide direkt zum Screening von Inhibitoren, wie z. Alternatively, the peptides identified with the process of this invention can specifically cleavable directly for screening inhibitors such. B. in einem FRET- Assay, verwendet werden. For example, be used in a FRET assay.

Somit steht ein schnell und einfach durchführbares Verfahren zum Screening von Protease-Inhibitoren zur Verfügung. Thus, a fast and simple to carry out method for screening of protease inhibitors is available.

Durch das schnelle und einfache Screening von Protease-Inhibitoren besteht auch die Möglichkeit viele wirksame Inhibitoren in einer Wirkstoffmischung zu verbinden, um das Auftreten von Resistenzen zu verhindern. The rapid and easy screening of protease inhibitors is also possible to connect many effective inhibitors in a drug mixture to prevent the emergence of resistance.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind proteolytisch spaltbare Substanzen, die eine mit einem der beschriebenen Verfahren erhältliche Peptidsequenz enthalten. Another object of the present invention are proteolytically cleavable substances containing an obtainable with a method described peptide sequence.

Die spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen können zur Synthese von spezifisch wirkenden Inhibitoren verwendet werden. The specifically proteolytically cleavable peptide sequences can be used for the synthesis of specifically acting inhibitors. Dazu werden z. These z. B. chemische Modifikationen an der Peptidsequenz vorgenommen oder es werden ein oder mehrere α-Aminosäuren des Peptids gegen β-Aminosäuren oder L-Aminosäuren gegen D-Aminosäuren ausgetauscht, um eine Proteolyse zu verhindern (siehe z. B. Werder M. & Hauser H. (1999) Helvetica Chimica Acta, 82, 1774-1783). B. made chemical modifications to the peptide sequence or be replaced one or more α-amino acids of the peptide to β-amino acids or L-amino acids against D-amino acids to prevent proteolysis (see, eg. B. M. Werder & Hauser H . (1999) Helvetica Chimica Acta, 82, 1774-1783).

Die mit den vorliegenden Verfahren identifizierbaren spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden können zur Konstruktion von Drug-Delivery-Systemen verwendet werden, um eine selektive Wirkstofffreisetzung am Zielort zu erreichen. The identifiable with the present methods specifically proteolytically cleavable peptides can be used for the construction of drug delivery systems to achieve selective release at the destination. Dabei kann es sich beim Zielort z. This may be the final destination for. B. um ein bestimmtes Organ, Gewebe, einen bestimmten Zelltyp, ein subzelluläres Kompartiment oder um krankes gegenüber gesundem Gewebe oder um mikrobiell befallene gegenüber unbefallenen Geweben oder Zellen handeln. Example, be a specific organ, tissue, a particular cell type, subcellular compartment or to diseased versus healthy tissue or microbially infected compared to uninfested tissues or cells.

Im Falle eines durch Proteasespaltung aktivierbaren Wirkstoffes können die spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen als kovalent gebundene Inhibitoren verwendet werden. In the case of activated by protease cleavage agent which specifically proteolytically cleavable substances can be used as covalently bound inhibitors. Die spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide können auch als Linker verwendet werden, um einen Wirkstoff mit einem Targeting Liganden, wie z. The specifically proteolytically cleavable peptides may also be used as linker to a drug with a targeting ligand such. B. einem spezifischen Antikörper oder einem spezifischen Rezeptor-Liganden, zu verbinden. to connect as a specific antibody or a specific receptor ligand. Aber auch die Konstruktion von wirkstoffbeldadenen Systemen, die mit spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen verschlossen werden, ist möglich (Minko T. et al., (2000) Int. J. Cancer, 86 : 108-117). But the construction of wirkstoffbeldadenen systems that are closed with specific proteolytic fissile substances is possible (Minko T. et al, (2000) Int J Cancer, 86:.. 108-117).

Durch die Variante der gerichteten in vitro Protein-Evolution ist es möglich bekannte peptidische Spaltsequenzen so zu verändern, dass sich andere Spaltungskinetiken ergeben. By variation of the directed in vitro protein evolution, it is possible to change known peptide cleavage sequences so that other kinetics of cleavage yield. Damit kann das zeitliche Profil der Wirkstofffreisetzung gesteuert werden. Thus the time profile of drug release can be controlled.

Mit Hilfe der spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide können folglich, über eine zielgesteuerte Wirkstofffreisetzung, Krankheiten effizienter bekämpft werden, bei denen gegenüber dem gesunden Zustand veränderte proteolytische Aktivitäten am gewünschten Wirkort auftreten oder die auf eine Fehlregulation oder Mutation von spezifischen Proteasen oder deren Aktivatoren oder Inhibitoren zurückzuführen sind. With the aid of specifically proteolytically cleavable peptides diseases may thus, a targeted controlled release of active ingredient, more efficiently fight in which altered proteolytic activities occur with respect to the healthy state at the desired site of action or due to dysregulation or mutation of specific proteases or their activators or inhibitors , Beispiele für Krankheiten mit gestörter Proteaseaktivität sind z. Examples of disorders affecting protease activity are for. B. Asthma-, Osteoporose, Krebserkrankungen, wie Leukämie, Brustkrebs, Darmkrebs, Schlaganfall, neuronale Erkrankungen, wie Alzheimer, Arthritis, Pancreatitis, Bluthochdruck, Thrombosen, Erkältungen oder Schistosmiasis. B. asthma, osteoporosis, cancers such as leukemia, breast cancer, colon cancer, stroke, neuronal diseases such as Alzheimer's, arthritis, pancreatitis, hypertension, thrombosis, colds or Schistosmiasis.

Durch die zielgerichtete Freisetzung von Wirkstoffen können die Nebenwirkungen dieser Wirkstoffe minimiert und die einzusetzende Wirkstoffmenge kann aufgrund der veränderten Verteilungsprofile im Organismus reduziert werden. Through the targeted release of active ingredients, the side effects of these drugs can be minimized and to be employed amount of active ingredient may be reduced due to the changed distribution profiles in the organism. Interessant sind vor allem pharmazeutische Wirkstoffe z. Particularly interesting are pharmaceutical agents for. B. gegen Bakterien, Pilze, Viren oder gegen erkrankte Gewebezellen, aber auch Herbizide, Fungizide oder Insektizide können eingesetzt werden. As against bacteria, fungi, viruses or against diseased tissue cells, as well as herbicides, fungicides or insecticides may be used.

Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren liegt in der Verwendung als diagnostischer Assay. Another application of the method according to the invention lies in the use as a diagnostic assay. Der Assay kann z. The assay can,. B. auf einem Vergleich des Profils der proteolytischen Aktivität von Extrakten gegenüber einer in ihrer Zusammensetzung definierten Bibliothek aus Fusionsmolekülen zwischen krankhaftem Gewebe, z. Example, on a comparison of the profile of the proteolytic activity of extracts against a defined composition in their library of fusion molecules between diseased tissue, for example. B. aus Krebszellen, und einer zu untersuchenden Probe basieren. B. of cancer cells, and to test sample based. Bevorzugt sind aber Assays, die gegenüber einer Vergleichs- oder Vorprobe auf ausschließlich von krankhaftem Gewebe proteolytisch spaltbaren Peptiden beruhen. but assays based to a settlement or pretrial on proteolytically cleavable only by diseased tissue peptides are preferred. Bei einem solchen selektiven Assay kann der nach Abtrennung der abgespaltenen Teile der Fusionsmoleküle vorgesehene Sequenzierungsschritt entfallen. In such a selective assay of the provided after separation of the cleaved parts of the fusion molecules sequencing step can be omitted. Die Identifizierung des Vorhandenseins einer bestimmten, krankheitsspezifischen Proteaseaktivität kann in diesem Falle unter Verwendung einer Hybridisierungssonde erfolgen. The identification of the presence of a particular disease-specific protease activity can be carried out in this case using a hybridization probe. Ein solches Verfahren kann hoch integriert werden, indem viele als krankheitsspezifische Marker identifizierte spaltbare Peptide in einem solchen Assay verwendet werden. Such a process can be highly integrated, by many identified as disease-specific marker cleavable peptides can be used in such an assay.

Alternativ können auch die mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten spezifisch spaltbaren Peptide direkt zum Screening von Inhibitoren, wie z. Alternatively, the identified with the method of this invention specifically cleavable peptides can directly for screening inhibitors such. B. in einem FRET-Assay, verwendet werden. For example, be used in a FRET assay. Die spezifisch spaltbaren Sequenzen können auch in vivo als Substrat für FRET-Assays verwendet werden. The specifically cleavable sequences may also be used in vivo as a substrate for FRET assay.

Eine weitere Verwendung der spezifisch von einer proteolytisch aktiven Probe spaltbaren Peptide ist zur Isolierung der diese Peptidsequenz spaltende Protease (siehe z. B. Li YM (2000) Nature, 405: 689-694). Another use of the specifically cleavable by a proteolytically active sample for isolation of the peptides is this peptide sequence cleaving protease (see, e.g., Li YM (2000) Nature, 405:. 689-694).

Ein anwendbares Verfahren zur Isolation von Serin-Proteasen ist z. An applicable method for the isolation of serine proteases is z. B. in US 5843701 beschrieben. As described in US Pat 5,843,701th Serin Proteasen sind Proteinenzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb von Proteinen katalysieren. Serine proteases are protein enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds within proteins. Häufig wird das Zielprotein, aufgrund der spezifischen Peptidverknüpfung innerhalb des Substrats, selektiv geschnitten. Frequently, the target protein is selectively cut due to the specific peptide linkage within the substrate. Zu den Serin-Proteasen gehören unter anderem Gewbeplasminogenaktivator, Trypsin, Elastase, Chymotrypsin, Thrombin und Plasmin. Among the serine proteases include Gewbeplasminogenaktivator, trypsin, elastase, chymotrypsin, thrombin and plasmin. Viele Krankheitsstadien können mit Serinproteaseinhibitoren behandelt werden, wie zum Beispiel Erkrankungen der Blutgerinnung. Many disease states can be treated with serine protease inhibitors, such as diseases of the blood clotting. Elastase Inhibitoren können das klinische Fortschreiten von Emphysemen reduzieren. Elastase inhibitors can reduce the clinical progression of emphysema.

Zur Isolierung von Proteasen können die gemäß den oben beschriebenen Verfahren ermittelten spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptide z. For the isolation of proteases found in accordance with the method described above specifically proteolytically cleavable peptides can, for. B. mit Standardmethoden an Säulenmaterial gekoppelt und eine Affinitätschromatographie der proteolytisch aktiven Proben daran durchgeführt werden. B. coupled to standard methods of column material and an affinity chromatography of the proteolytically active samples are performed thereon. Der Puffer der während den Bindungszyklen verwendet wird darf nicht denaturierend sein, damit die Protease nicht inaktiviert wird. The buffer used during the binding cycles may not be denaturing, so that the protease is not inactivated. Die mit den Peptiden wechselwirkenden Proteasen können bei Bedarf durch gängige Crosslinking-Verfahren zusätzlich an die fixierten Peptide gebunden werden. The interacting with the peptides proteases can be bound by common crosslinking process in addition to the fixed peptides as needed. Dazu können auch β-Aminosäuren enthaltende Spaltsequenzen benutzt werden, die von Proteasen spezifisch erkannt, aber nicht gespalten werden können. This also β-amino acids containing cleavage sequences can be used that can be specifically recognized by proteases, but not cleaved.

Claims (34)

  1. 1. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: 1. A method for identifying specifically proteolytically cleavable peptides comprising the steps of:
    • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a peptide nucleic acid encoding a proteolytically active sample,
    • b) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, b) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
    • c) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten Fusionsmoleküle. c) determining the sequence of the nucleic acid component of the separated fusion molecules.
  2. 2. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: 2. A method for identifying specifically proteolytically cleavable peptides comprising the steps of:
    • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit einer proteolytisch aktiven Probe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a peptide nucleic acid encoding a proteolytically active sample,
    • b) Inkubation der gleichen Bibliothek aus Fusionsmolekülen in einem parallelen Ansatz, mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vergleichsprobe, b) incubation of the same library of fusion molecules in a parallel approach, with at least one proteolytically active comparative sample,
    • c) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, c) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
    • d) Erstellen einer differenziellen Nukleinsäurebank d) creating a differential nucleic acid Bank
    • e) Bestimmung der Sequenz der ermittelten Nukleinsäuren. e) determining the sequence of the nucleic acids determined.
  3. 3. Verfahren zur Identifizierung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden umfassend die Verfahrensschritte: 3. A method for identifying specifically proteolytically cleavable peptides comprising the steps of:
    • a) Inkubation einer Bibliothek aus Fusionsmolekülen, enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure mit mindestens einer proteolytisch aktiven Vorprobe, a) incubation of a library of fusion molecules containing a peptide and a nucleic acid encoding the peptide having at least one proteolytically active laboratory test sample,
    • b) Abtrennung der abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, b) separation of the cleaved components of the fusion molecules
    • c) Inkubation der so präparierten Bibliothek mit einer proteolytisch aktiven Probe, c) incubating the thus prepared library with a proteolytically active sample,
    • d) Isolierung der proteolytisch abgespaltenen Bestandteile der Fusionsmoleküle, d) isolation of the cleaved proteolytically components of the fusion molecules
    • e) Bestimmung der Sequenz des Nukleinsäurebestandteils der abgetrennten Fusionsmoleküle. e) determining the sequence of the nucleic acid component of the separated fusion molecules.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bibliothek aus Fusionsmolekülen enthaltend ein Peptid und eine das Peptid codierende Nukleinsäure, die ein- oder beidseitig von bekannten Nukleotidsequenzen flankiert ist, verwendet wird. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a library of fusion molecules comprising a peptide and a nucleic acid encoding the peptide that is flanked on one or both of known nucleotide sequences, is used.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Bibliothek aus Fusionsmolekülen bestehend aus einem Peptid das über ein Puromycin an eine Poly-A-Nukleinsäuresequenz geknüpft ist an die sich die das Peptid codierende Region und eine oder mehrere bekannte Nukleinsäuresequenzen anschließen, verwendet wird. to which the connecting 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a library of fusion molecules of a peptide which is linked via a puromycin to a poly-A nucleic acid sequence comprising the peptide coding region, and one or more known nucleic acid sequences, is used.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle enthaltend Peptide aus mindestens 4 variablen Aminosäuren verwendet werden. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules are used containing peptides of at least 4 variable amino acids.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle enthaltend Peptide aus 7 bis 11 variablen Aminosäuren verwendet werden. 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules are used containing peptides from 7 to 11 variable amino acids.
  8. 8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle verwendet werden, die Peptide enthalten, die neben dem variablen Sequenzbereich mindestens einen konstanten Sequenzbereich besitzen. 8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules are used that contain peptides having a constant sequence region adjacent to the variable sequence region at least.
  9. 9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle mit markiertem Nukleinsäurebestandteil und/oder Peptidbestandteil verwendet werden. 9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules are used with labeled nucleic acid component and / or peptide component.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Fusionsmoleküle mit einer magnetischen Markierung, einer radioaktiven Markierung, einer Fluoreszenzmarkierung des Nukleinsäurebestandteils und/oder Peptidbestandteils oder einer Markierung mit einer spezifischen bekannten Nukleinsäuresequenz und/oder einer bekannten spezifischen Aminosäuresequenz verwendet werden. 10. The method according to claim 9, characterized in that fusion molecules with a magnetic label, a radioactive label, a fluorescent label of the nucleic acid component and / or peptide component, or of a marker having a specific known nucleic acid sequence and / or a known specific amino acid sequence are used.
  11. 11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusionsmoleküle der Bibliothek auf einer festen Oberfläche fixiert werden. 11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules of the library are fixed to a solid surface.
  12. 12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fusionsmoleküle der Bibliothek auf festen Partikeln fixiert werden. 12. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the fusion molecules of the library are fixed to solid particles.
  13. 13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die bekannten Nukleinsäuresequenzen mit Restriktionsenzymen geschnitten werden und nur der ab- oder ausgeschnittene Nukleinsäureteil weiter verwendet wird. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the known nucleic acid sequences are cleaved with restriction enzymes, and only the off or cut-nucleic acid portion is used.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass nach Isolierung der von der proteolytisch aktiven Probe geschnittenen Fusionsmolekülbestandteile zur Vervielfältigung der Nukleinsäurebestandteile eine PCR durchgeführt wird. 14. A method according to any one of claims 4 to 13, characterized in that after isolation of the cut of the proteolytically active sample fusion molecule components to reproduce the nucleic acid components of a PCR is performed.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die amplifizierte Nukleinsäure zur Erstellung einer neuen Bibliothek aus Fusionsmolekülen verwendet wird und mit dieser Bibliothek erneut ein Verfahrenszyklus gemäß der Ansprüche 1 bis 3 durchgeführt wird. 15. The method according to claim 14, characterized in that the amplified nucleic acid to create a new library of fusion molecules is used, and is carried out with this library again a process cycle according to the claims 1 to. 3
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 14, zur in vitro Protein-Evolution, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR, die in vitro Transkription und/oder die in vitro Translation mit erhöhter Fehlerrate abläuft. 16. The method according to claim 14, for in vitro protein evolution, characterized in that the PCR, the running in vitro transcription and / or translation in vitro with an increased error rate.
  17. 17. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als proteolytisch aktive Probe, Vorprobe und Vergleichsprobe ein Gesamtzellextrakt, ein zytosolischer Extrakt, ein Membranextrakt, ein extrazellulärer Extrakt, ein subzellulärer Extrakt, eine Kombination dieser Extrakte oder eine Lösung aus bekannten Proteasen verwendet wird. 17. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that used as the proteolytically active sample, laboratory test sample and comparative sample a total cell extract, a cytosolic extract, a membrane extract, an extracellular extract, a subcellular extract, a combination of these extracts or a solution of known proteases becomes.
  18. 18. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Probe, Vorprobe oder Vergleichsprobe krankheitsspezifische und/oder gewebespezifische und/oder oganspezifische und/oder organismusspezifische Extrakte verwendet werden. 18. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that as the sample, laboratory test or reference sample, disease-specific and / or tissue-specific and / or oganspezifische and / or specific organism extracts are used.
  19. 19. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die proteolytisch aktive Probe und/oder Vorprobe unter physiologischen Bedingungen im Verfahren verwendet werden. 19. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the proteolytically active sample and / or laboratory test can be used under physiological conditions in the process.
  20. 20. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe und/oder Vorprobe weitere Hilfsstoffe zugegeben werden. 20. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sample and / or other excipients may be added to laboratory test.
  21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstoffe spezifisch wirkende Proteaseinhibitoren und/oder Nukleaseinhibitoren zugesetzt werden. 21. The method according to claim 20, characterized in that are added as auxiliaries specific acting protease inhibitors and / or nuclease.
  22. 22. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe potentielle Proteaseinhibitoren oder -aktivatoren zugesetzt werden. 22. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sample potential protease inhibitors or activators are added.
  23. 23. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte wiederholt oder bei unterschiedlicher Inkubationsdauer und/oder unterschiedlicher Probenkonzentration wiederholt durchgeführt werden. 23. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the method steps are repeated or repeatedly performed at different incubation times and / or different sample concentration.
  24. 24. Verwendung der gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 23, ermittelten Nukleinsäuresequenzen zur Herstellung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen. 24. Use of the nucleic acid sequences determined according to the method according to claims 1 to 23, for the preparation of specifically proteolytically cleavable substances.
  25. 25. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanzen enthaltend einen Peptid erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23. 25. Specifically, proteolytically cleavable substances comprising a peptide obtainable by a process according to any one of claims 1 to 23rd
  26. 26. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz gemäß Anspruch 25 enthaltend einen chemischen Wirkstoff. 26. Specifically, proteolytically cleavable substance according to claim 25 comprising a chemical agent.
  27. 27. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der chemische Wirkstoff durch proteolytische Freisetzung aktivierbar ist. 27. Specifically, proteolytically cleavable substance according to claim 26, characterized in that the chemical agent can be activated by proteolytic release.
  28. 28. Spezifisch proteolytisch spaltbare Substanz nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Substanz weitere Hilfs- und Zusatzstoffe zugesetzt werden. 28. Specifically, proteolytically cleavable substance according to any one of claims 25 to 27, characterized in that the substance further auxiliaries and additives are added.
  29. 29. Verwendung der spezifisch proteolytisch spaltbaren Substanzen gemäß Ansprüche 25 bis 28 zur Herstellung von Medikamenten gegen Asthma, Osteoporose, Krebserkrankungen, Schlaganfall, neuronale Erkrankungen, Arthritis, Pancreatitis, Bluthochdruck, Thrombosen, Erkältungen oder Schistosmiasis. 29. The use of the specifically proteolytically cleavable substances according to claims 25 to 28 for the preparation of medicaments for asthma, osteoporosis, cancer, stroke, neural diseases, arthritis, pancreatitis, hypertension, thrombosis, colds or Schistosmiasis.
  30. 30. Diagnostische Marker enthaltend proteolytisch spaltbare Peptide erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23. 30. A diagnostic marker containing proteolytically cleavable peptides obtainable by a process according to any one of claims 1 to 23rd
  31. 31. Verfahren zum Nachweis spezifisch wirkender Proteasen gemäß Anspruch 1 bis 23 enthaltend diagnostische Marker gemäß Anspruch 30. 31. A method for the detection of specifically acting protease according to claim 1 to 23 comprising diagnostic marker according to claim 30th
  32. 32. Verwendung von Substanzen enthaltend spezifisch proteolytisch spaltbare Peptide ermittelt nach einem Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 23 zur Identifizierung der diese Peptide spaltenden Proteasen. 32. The use of substances containing specifically proteolytically cleavable peptides determined by a method according to the claims 1 to 23 for the identification of these peptides cleaving proteases.
  33. 33. Verwendung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptiden ermittelt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 23 zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren. 33. The use of specifically proteolytically cleavable peptides determined by a method of claims 1 to 23 for identifying protease inhibitors.
  34. 34. Verwendung von spezifisch proteolytisch spaltbaren Peptidsequenzen ermittelt nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung von Inhibitoren. 34. Use of specifically proteolytically cleavable peptide sequences determined by a method of claims 1 to 23 for the manufacture of inhibitors.
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