DE10032568A1 - Device and method for electrically contacting biological cells suspended in a liquid - Google Patents

Device and method for electrically contacting biological cells suspended in a liquid

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DE10032568A1
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Alfred Stett
Wilfried Nisch
Hugo Haemmerle
Thomas Knott
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NMI Naturwissenschaftliches und Medizinisches Institut an der Universitaet Tuebingen
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Abstract

The invention relates to a device for making electrical contact with biological cells (11), suspended in a fluid (14), comprising a substrate with at least one opening and a means of immobilising a cell (11) on the opening. Furthermore, an electrode for making electrical contact with the immobilised cell (11) is provided. A contact unit with a contact point (23) is arranged at the opening, the upper end of which extends into the opening, such that the said end contacts the cell membrane of an immobilised cell (11). The contact point (23) comprises a contact channel opening at the upper end thereof, by means of which a hydrodynamic vacuum may be played on the cell membrane and the electrode is in electrical contact with the contact channel. The invention further relates to a method for making electrical contact with biological cells suspended in a fluid, whereby a cell is immobilised above an opening in a substrate and the cell contacted by at least one electrode. In order to make contact with the immobilised cell (11), a contact point (23), extending through the opening, produces a hydrodynamic vacuum on the cell membrane of the cell (11), whereby the electrode makes electrical contact with the cell (11) by means of the contact point (23).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum elek­ trischen Kontaktieren von in einer Flüssigkeit in Suspension befindlichen biologischen Zellen, mit einem zumindest eine Öff­ nung aufweisenden Substrat, mit Mitteln zum Immobilisieren ei­ ner Zelle auf der Öffnung, vorzugsweise einem in die Öffnung ragenden Einsaugkanal, über den an der Öffnung ein hydrodynami­ scher Unterdruck zum Immobilisieren einer Zelle auf der Öffnung erzeugbar ist, und zumindest einer Elektrode für die elektri­ sche Kontaktierung der immobilisierten Zelle. The present invention relates to a device for elec trical contact in suspension in a liquid located biological cells, with at least one opening tion having substrate, with means for immobilizing egg ner cell on the opening, preferably one in the opening protruding intake duct, through which a hydrodynami at the opening negative pressure to immobilize a cell on the opening can be generated, and at least one electrode for the electri Contacting the immobilized cell.  

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum elektrischen Kontaktieren von in einer Flüssigkeit in Suspension befindli­ chen biologischen Zelle, mit den Schritten:
The invention further relates to a method for electrically contacting a biological cell in suspension in a liquid, comprising the steps:

  • - Immobilisieren einer Zelle oberhalb einer in einem Substrat vorgesehenen Öffnung, vorzugsweise durch Erzeugen eines hydrodynamischen Unterdruckes, und- Immobilize a cell above one in one Substrate provided opening, preferably by creating a hydrodynamic vacuum, and
  • - Kontaktieren der immobilisierten Zelle über zumindest eine Elektrode.- Contacting the immobilized cell via at least one Electrode.

Eine Vorrichtung sowie ein Verfahren der vorstehend genannten Art sind aus der DE 197 12 309 A1 bekannt.An apparatus and a method of the above Art are known from DE 197 12 309 A1.

Die bekannte Vorrichtung umfaßt eine Mikroelektrodenanordnung, bei der die Zellen in Mikroküvetten eingefangen werden, an de­ ren Boden sich eine Elektrode befindet. Die Elektrode ist mit einem zentralen Ansaugkanal versehen, in dem über geeignete Verbindungskanäle, die unterhalb der Elektroden verlaufen, ein Unterdruck erzeugt werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, einzelne Zellen zielgerichtet an die Elektroden heranzuziehen und sie unter einem gewissen Kontaktdruck auf den Elektroden zu immobilisieren. Mit der bekannten Vorrichtung können dann Mes­ sungen an den Zellen, jedoch nur von deren Membranaußenseite her, durchgeführt werden.The known device comprises a microelectrode arrangement, where the cells are captured in microcuvettes, de There is an electrode on the bottom. The electrode is with a central intake duct, in which suitable Connecting channels that run below the electrodes Vacuum can be generated. In this way it is possible pull individual cells towards the electrodes and they close to the electrodes under a certain contact pressure immobilize. With the known device Mes solutions on the cells, but only from the outside of the membrane forth.

Derartige Mikroelektrodenanordnungen werden allgemein zum Un­ tersuchen von biologischen Zellen verwendet. Die Mikroelektro­ denanordnungen dienen dabei z. B. zum Stimulieren der Zellen oder zum Ableiten von Potentialen. Die Untersuchungen können in einer biologischen Umgebung oder in einer artifiziellen Umgebung durchgeführt werden. Die Anordnungen umfassen dabei in ei­ nem Trägerkörper, also auf einem Substrat, eine Vielzahl von Mikroelektroden, deren Abmessungen etwa in der Größenordnung der Zellen liegen, also im Bereich von einigen µm bis einigen 10 µm.Such microelectrode arrangements are generally the Un tests of biological cells used. The microelectro the arrangements serve z. B. to stimulate the cells or to derive potentials. The investigations can be done in in a biological environment or in an artificial environment  be performed. The arrangements include in egg Nem carrier body, ie on a substrate, a variety of Microelectrodes, the dimensions of which are of the order of magnitude of cells are in the range of a few µm to a few 10 µm.

Bei herkömmlichen Mikroelektrodenanordnungen ist man mehr oder weniger auf den Zufall angewiesen, ob sich die eine oder die andere Zelle auf einer bestimmte Elektrode niederläßt oder nicht. In der Praxis lassen sich die Zellen im allgemeinen nur unter teilweiser Überdeckung auf einer Elektrode nieder, so daß die Stimulation der Zelle bzw. die Ableitung eines Zellpotenti­ als auf diese Teilfläche beschränkt ist.In conventional microelectrode arrangements, one is more or less dependent on chance, whether one or the other another cell on a particular electrode or Not. In practice, the cells can generally only be partially covered on an electrode so that the stimulation of the cell or the derivation of a cell potenti than is limited to this partial area.

Diese Nachteile werden durch die aus der eingangs genannten DE 197 12 309 A1 bekannte Vorrichtung zwar größtenteils besei­ tigt, insbesondere wird dafür gesorgt, daß auf einer Mikroelek­ trode nur eine Zelle zu liegen kommt. Andererseits bleibt es nach wie vor dem Zufall überlassen, ob eine Zelle und welche Zelle in der Mikroküvette eingefangen wird. Dabei ist ferner nicht auszuschließen, daß in der Flüssigkeit befindliche Parti­ kel in die Mikroküvette eingesogen werden, die zwar die Durch­ führung einer Messung ermöglichen, deren Ergebnisse jedoch nicht verwertbar sind.These disadvantages are caused by those mentioned in the introduction DE 197 12 309 A1 known device for the most part tigt, in particular it is ensured that on a microelectr trode only one cell comes to rest. On the other hand, it remains still left to chance whether a cell and which Cell is captured in the microcuvette. It is also not to be ruled out that parts in the liquid be sucked into the microcuvette, although the through enable a measurement to be carried out, but the results are not usable.

Ein weiterer Nachteil bei der bekannten Vorrichtung und dem be­ kannten Verfahren besteht darin, daß nur Messungen an der Au­ ßenseite der Zellmembran durchgeführt werden können. Intrazel­ luläre Messungen sind nicht möglich. Another disadvantage of the known device and the be known method is that only measurements on the Au can be carried out on the outside of the cell membrane. Intrazel lular measurements are not possible.  

Derartige intrazelluläre Messungen lassen sich jedoch mit der sogenannten Patch-Clamp-Technik durchführen, bei der eine soge­ nannte Membranfleck-Klemme eingesetzt wird; siehe z. B. Neher und Sakmann: "Die Erforschung von Zellsignalen mit der Patch- Clamp-Technik", Spektrum der Wissenschaften, Mai 1992, S. 48.Such intracellular measurements can, however, be made with the perform so-called patch clamp technology, in which a so-called called membrane spot clamp is used; see e.g. B. Neher and Sakmann: "The study of cell signals with the patch Clamp technology ", Spectrum of Sciences, May 1992, p. 48.

Bei dieser Technik wird eine mit elektrisch leitender Flüssig­ keit gefüllte Mikropipette gezielt an eine adhärente Zelle her­ angeführt und auf deren Membran aufgesetzt, so daß sich diese leicht nach innen wölbt. Daraufhin wird der von der Pipetten­ spitze eingeschlossene Membranfleck durch Unterdruck leicht an­ gesogen, wodurch dieser gegenüber der umgebenden Flüssigkeit abgedichtet und elektrisch isoliert wird. Diese Isolation wird auch als "Gigaseal" bezeichnet.This technique uses an electrically conductive liquid filled micropipette targeted to an adherent cell cited and placed on their membrane, so that this bulges slightly inwards. Thereupon the of the pipettes tip trapped membrane stain slightly due to negative pressure sucked, causing this to the surrounding liquid sealed and electrically isolated. This isolation will also known as "Gigaseal".

Auf diese Weise ist es möglich, z. B. Messungen an Ionenkanälen auf der Membranaußenseite durchzuführen.In this way it is possible e.g. B. Measurements on ion channels to be carried out on the outside of the membrane.

Wenn die abgedichtete Membran jedoch weiter angesaugt wird, wird der Membranfleck perforiert, so daß ein hydrodynamisch und elektrisch gegenüber der umgebenden Flüssigkeit abgedichteter Zugang durch die Pipettenöffnung zum Zellinneren besteht, so daß intrazelluläre Messungen und Stimulationen möglich sind (sogenannter "Whole-Cell-Patch").However, if the sealed membrane continues to be sucked in, the membrane spot is perforated, so that a hydrodynamic and electrically sealed from the surrounding liquid There is access through the pipette opening to the cell interior, so that intracellular measurements and stimulations are possible (so-called "whole cell patch").

Bei der Patch-Clamp-Technik ist von Nachteil, daß sie nur an adhärenten oder anderweitig immobilisierten Zellen durchgeführt werden kann, an die die fragile Glaspipette jeweils mittels ei­ nes Mikromanipulators herangeführt werden muß. Aus diesem Grund ist die Anzahl gleichzeitig kontaktierbarer Zellen äußerst beschränkt, so daß mehrere Zellen nur sequentiell abgearbeitet werden können.The disadvantage of the patch clamp technique is that it only works adherent or otherwise immobilized cells performed to which the fragile glass pipette can be attached using an egg Nes micromanipulator must be introduced. For this reason the number of cells that can be contacted simultaneously is extremely limited,  so that several cells are only processed sequentially can be.

Diese Methode ist daher ungeeignet für Massenuntersuchungen, wie sie z. B. im Bereich des Pharmascreening, des Substanzscree­ ning etc. erforderlich wären.This method is therefore unsuitable for mass examinations, as they e.g. B. in the field of pharmaceutical screening, substance screening ning etc. would be required.

Ein weiterer Nachteil bei der konventionellen Patch-Clamp- Technik besteht darin, daß sie nicht automatisierbar ist, son­ dern manuell von Personal durchgeführt wird, das große Erfah­ rung mitbringen und viel Fingerspitzengefühl aufweisen muß.Another disadvantage with conventional patch clamp Technology is that it can not be automated, son which is carried out manually by personnel, the great experience bring along and have a lot of tact.

Aus der DE 198 27 957 A1 ist es bekannt, eine Zelle auf einem Glasträger zu immobilisieren, dessen Oberfläche eine ringstruk­ turförmige Profilierung aufweist, um die Zelladhäsion zu ver­ bessern. Auf dem Glasträger ist im Bereich der Auflagefläche für die Zelle eine kegelförmig vorspringende Elektrode angeord­ net, die mit ihrer scharfen, ringförmigen Spitze in die Zell­ membran einschneidet und für intrazelluläre Messungen vorgese­ hen ist. Die Elektrode kann als Zylinderelektrode mit einem Hohlkanal ausgelegt sein, durch den auf die Zellmembran ein Un­ terdruck zum Fixieren der Zelle und/oder Perforieren der Zell­ membran ausgeübt werden kann.From DE 198 27 957 A1 it is known to have one cell on one Immobilize glass supports, the surface of which is a ring structure has door-shaped profiling in order to ver the cell adhesion improve. On the glass support is in the area of the support surface a cone-shaped projecting electrode is arranged for the cell net with its sharp, ring-shaped tip into the cell cuts the membrane and pre-cuts for intracellular measurements hen is. The electrode can be used as a cylindrical electrode with a Hollow channel can be designed, through which an Un on the cell membrane terdruck to fix the cell and / or perforate the cell membrane can be exercised.

Wie die Zelle auf den Auflagebereich gelangt, ist nicht be­ schrieben. Nachteilig ist bei der bekannten Vorrichtung, daß die elektrische Abdichtung auf der ringförmigen Elektrodenspit­ ze nur durch die "Haltekraft" der Zelle auf der profilierten Oberfläche bestimmt wird. Die Durchführung von Massenuntersu­ chungen ist mit der bekannten Vorrichtung nicht möglich. How the cell gets on the support area is not wrote. A disadvantage of the known device is that the electrical seal on the ring-shaped electrode tip ze only by the "holding force" of the cell on the profiled Surface is determined. Carrying out mass investigations chungen is not possible with the known device.  

Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung der ein­ gangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, daß die vorste­ hend genannten Nachteile vermieden werden. Insbesondere soll eine automatisierbare, effiziente und universell einsetzbare Möglichkeit für das elektrische Kontaktieren der Zellen ge­ schaffen werden, um so Messungen sowohl an der Außenseite der Membran als auch intrazellulär durchführen zu können. Das neue Verfahren soll dabei einfach und automatisierbar durchzuführen sein, wobei die neue Vorrichtung konstruktiv einfach aufgebaut sein soll.Against this background, the present invention Task based on a method and an apparatus of the gangs mentioned in such a way that the first disadvantages mentioned can be avoided. In particular, should an automatable, efficient and universally applicable Possibility for electrical contacting of the cells will be able to make measurements both on the outside of the To be able to perform membrane as well as intracellularly. The new The process should be simple and automatable be, the new device is structurally simple should be.

Bei der eingangs erwähnten Vorrichtung wird diese Aufgabe da­ durch gelöst, daß an die Öffnung eine Kontakteinheit mit einer Kontaktspitze angeordnet ist, deren oberes Ende so in die Öff­ nung hineinragt, daß sie mit einer Zellmembran einer immobili­ sierten Zelle in Anlage gelangt, die Kontaktspitze einen an ih­ rem oberen Ende mündenden Kontaktkanal aufweist, über den auf die Zellmembran ein hydrodynamischer Unterdruck ausübbar ist, und die Elektrode elektrisch mit dem Kontaktkanal in Verbindung steht.In the device mentioned at the beginning, this task is there solved by that at the opening a contact unit with a Contact tip is arranged, the upper end so in the public protrudes that it has a cell membrane of an immobili sied cell comes into contact, the contact tip one at ih Rem has the upper end opening contact channel, on the the cell membrane can be subjected to a hydrodynamic negative pressure, and the electrode is electrically connected to the contact channel stands.

Bei dem eingangs genannten Verfahren wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß zum Kontaktieren der immobilisierten Zelle durch eine in die Öffnung ragende Kontaktspitze hindurch auf die Zellmembran der Zelle ein hydrodynamischer Unterdruck ausgeübt wird, wobei die Elektrode durch die Kontaktspitze hindurch mit der Zelle elektrisch in Kontakt gelangt.In the method mentioned at the beginning, this makes this task solved that by contacting the immobilized cell a contact tip protruding into the opening onto the Cell membrane of the cell exerted a hydrodynamic negative pressure with the electrode through the contact tip the cell comes into electrical contact.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Wei­ se vollkommen gelöst. The object of the invention is based on this Wei se completely solved.  

Unabhängig von der Immobilisierung, die vorzugsweise durch Un­ terdruck in dem Ansaugkanal erfolgt, ragt in die Öffnung eine Patch-Clamp-Spitze hinein, über die außen an der Membran und/oder intrazellulär elektrische Signale gemessen und/oder zugeführt werden können. Dabei ist der Haltedruck unabhängig und getrennt von dem Kontaktdruck, so daß die Kontaktspitze ei­ nen sehr kleinen Durchmesser aufweisen kann, der einen zuver­ lässigen Gigaseal und eine gute Perforation ermöglicht. Der Durchmesser der Öffnung ist deutlich größer, so daß sich ein sehr großer Haltedruck ergibt, ohne daß die Zelle in den An­ saugkanal oder gar in den Kontaktkanal eingezogen wird.Regardless of the immobilization, preferably by Un ter pressure in the intake duct, protrudes into the opening Patch clamp tip in, over the outside of the membrane and / or electrical signals measured intracellularly and / or can be supplied. The holding pressure is independent and separate from the contact pressure so that the contact tip is egg NEN can have a very small diameter that a verver casual gigaseal and good perforation. The Diameter of the opening is significantly larger, so that a very large holding pressure results without the cell in the An suction channel or even drawn into the contact channel.

Auf diese Weise sind stabile Langzeitmessungen auch unter Per­ fusion möglich, wenn die Zelle außen mit Substanzen angespült wird, um bestimmte Reaktionen der Zelle hervorzurufen, die wie­ derum über die Elektrode erfaßt werden sollen.In this way, stable long-term measurements are also possible under Per fusion possible if the cell is washed with substances on the outside to induce certain cell responses that like which are to be detected via the electrode.

Weil die Kontaktspitze in die Öffnung hineinragt, ergibt sich beim Ansaugen der Zelle auf die Öffnung mittels des Ansaugka­ nals eine Einwölbung der Zellmembran im Bereich der Kontakt­ spitze, wie es auch bei der manuellen Patch-Clamp-Technik wün­ schenswert ist, um für einen guten Gigaseal zu sorgen, wenn durch den Kontaktkanal ein leichter Unterdruck auf den Membran­ fleck ausgeübt wird. Durch kurzfristiges, stoßweises Erhöhen des Unterdrucks im Kontaktkanal läßt sich in an sich bekannter Weise der Membranfleck jetzt reproduzierbar perforieren.Because the contact tip protrudes into the opening, it results when the cell is sucked onto the opening by means of the suction ka nals an arching of the cell membrane in the area of contact great, as would also be the case with the manual patch clamp technique is worth it to ensure a good gigaseal, if a slight negative pressure on the membrane through the contact channel stain is exercised. With a short, intermittent increase of the negative pressure in the contact channel can be known Perforate the membrane stain reproducibly.

Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben erkannt, daß durch die Trennung von Ansaugkanal und Kontaktkanal eine zuver­ lässige und damit automatisierbare Positionierung von Zellen über der Öffnung und deren Kontaktierung nach der Patch-Clamp- Technik möglich wird.The inventors of the present application have recognized that by separating the intake duct and the contact duct casual and therefore automatable positioning of cells  over the opening and its contact after the patch clamp Technology becomes possible.

Aus der prioritätsälteren, aber nicht vorveröffentlichten DE 199 48 473 A1 ist eine Vorrichtung bekannt, bei der eine Zelle durch einen Ansaugkanal auf eine Öffnung in einem Substrat gesaugt wird, wobei stromabwärts im Ansaugkanal eine Elektrode angeordnet ist, die über die elektrisch leitende Flüssigkeit in dem Ansaugkanal Messungen sowohl an der Außen­ seite der Zellmembran als auch intrazelluläre Messungen ermög­ licht, wenn durch einen kurzen Druckstoß zuvor der von dem An­ saugkanal eingeschlossene Membranfleck perfundiert wurde.From the older, but not prepublished DE 199 48 473 A1 discloses a device in which one Cell through an intake port to an opening in one Substrate is sucked, with a downstream in the suction channel Electrode is arranged over the electrically conductive Liquid in the intake duct measurements both on the outside side of the cell membrane as well as intracellular measurements light, if by a short pressure surge that of the on suction channel enclosed membrane spot was perfused.

Bei dieser Vorrichtung ist nur ein Kanal vorhanden, der sowohl als Ansaug- als auch als Kontaktkanal dient und daher einen re­ lativ großen Innendurchmesser aufweisen muß, um eine entspre­ chende Haltekraft auf die Zelle ausüben zu können. Zwar wird auch hier durch das Anlegen des Unterdrucks ein Gigaseal er­ zeugt, dieser ist jedoch nach Erkenntnis der Erfinder nicht so zuverlässig wie bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Ferner ergibt sich keine Einwölbung in der Membran der angesogenen Zelle, sondern die Membran wird vielmehr nach außen gewölbt und in den Ansaugkanal eingezogen, so daß sich über der Zeit die effektive Membranfläche verändern kann, so daß keine stabilen Langzeitmessungen möglich sind.In this device there is only one channel, which both serves as a suction as well as a contact channel and therefore a re must have a relatively large inner diameter in order to correspond to be able to exert sufficient holding force on the cell. It will a Gigaseal here too by applying the negative pressure testifies, however, according to the inventors, this is not the case reliable as in the device according to the invention. Further there is no arching in the membrane of the suction Cell, rather the membrane is rather curved outwards and drawn into the intake duct, so that the effective membrane area can change, so that no stable Long-term measurements are possible.

In einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es bevorzugt, wenn die Kontakteinheit abnehmbar an der Öffnung an­ geordnet ist, wobei weiter vorzugsweise die Kontaktspitze aus­ wechselbar angeordnet ist. In a development of the device according to the invention, it is preferred if the contact unit is removable at the opening is ordered, with the contact tip also preferably being made is interchangeably arranged.  

Hier ist von Vorteil, daß die Kontakteinheit und/oder die Kon­ taktspitze leicht ausgewechselt werden können, während die üb­ rigen Bestandteile der neuen Vorrichtung wieder verwendbar sind. Dieser Maßnahme liegt die Erkenntnis zugrunde, daß Patch- Clamp-Spitzen nur einmal verwendet werden können, bereits bei einem zweiten Einsatz wird kein ausreichender Gigaseal bzw. keine zuverlässige Membranperforation mehr erreicht.It is advantageous here that the contact unit and / or the con clock tip can be easily replaced while the practice Other components of the new device reusable are. This measure is based on the knowledge that patch Clamp tips can only be used once, already at a second use does not result in a sufficient Gigaseal or no reliable membrane perforation achieved.

Dabei ist es bevorzugt, wenn der Ansaugkanal in dem Substrat verläuft, wobei andererseits der Ansaugkanal auch zumindest ab­ schnittsweise in der Kontakteinheit verlaufen kann.It is preferred if the suction channel in the substrate runs, on the other hand, the intake duct at least from can run in sections in the contact unit.

Wenn der Ansaugkanal in dem Substrat verläuft, ist von Vorteil, daß die Kontakteinheit sehr einfach und preiswert aufgebaut sein kann. Verläuft der Ansaugkanal dagegen zumindest ab­ schnittsweise in der Kontakteinheit, so kann der Außenanschluß sowohl des Ansaugkanals als auch des Kontaktkanals auf einfache Weise an der Kontakteinheit selbst erfolgen, was das Handling und den Aufbau vereinfacht.If the suction channel runs in the substrate, it is advantageous that the contact unit is very simple and inexpensive can be. In contrast, the intake duct at least runs off in sections in the contact unit, so the external connection both the intake duct and the contact duct in a simple manner Way done on the contact unit itself, what the handling and simplified the structure.

Weiter es ist bevorzugt, wenn die Kontakteinheit ein austausch­ bares, die Kontaktspitze aufweisendes Oberteil sowie ein wie­ derverwendbares, die Elektrode und einen ersten Abschnitt des Kontaktkanals aufweisendes Unterteil aufweist, wobei die Kon­ takteinheit vorzugsweise im Bereich der Öffnung außen an dem Substrat anliegt und die Öffnung nach außen flüssigkeitsdicht abschließt, wobei weiter vorzugsweise das Oberteil unter Druck außen an dem Substrat und das Unterteil unter Druck an dem Oberteil anliegt. Furthermore, it is preferred if the contact unit is replaced cash, the contact tip having top and a like the usable, the electrode and a first portion of the Has contact channel lower part, the Kon clock unit preferably in the area of the opening on the outside The substrate rests and the opening is liquid-tight to the outside completes, further preferably the upper part under pressure outside on the substrate and the lower part under pressure on the Top fits.  

Bei diesen Maßnahmen ist von Vorteil, daß zum Auswechseln der Kontaktspitze lediglich das Oberteil der Kontakteinheit ausge­ wechselt werden muß. Weil Unterteil und Oberteil aneinander bzw. an dem Substrat unter Druck anliegen, sind keine Schraub­ arbeiten oder ähnliche Manipulationen erforderlich, der Aus­ tausch kann automatisiert z. B. mit Hilfe eines Mikromanipula­ tors auf einfache Weise erfolgen.These measures have the advantage that to replace the Contact tip only out the top of the contact unit must be changed. Because bottom part and top part together or are under pressure on the substrate are not screw work or similar manipulations required the out exchange can be automated e.g. B. with the help of a micromanipula tors easily done.

Dabei ist es bevorzugt, wenn zwischen dem Substrat und dem Oberteil und/oder zwischen dem Oberteil und dem Unterteil ein Dichtmittel vorgesehen ist, das vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe: Silikonpaste, Zwei-Komponenten-Elastomer und Poly­ dimethylsiloxan-Elastomer (SylgardTM).It is preferred if a sealant is provided between the substrate and the upper part and / or between the upper part and the lower part, which is preferably selected from the group: silicone paste, two-component elastomer and poly dimethylsiloxane elastomer (Sylgard TM ) ,

Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, daß schon bei geringem Druck eine gute flüssigkeitsdichte Abdichtung zwischen Substrat, Oberteil und Unterteil erfolgt, so daß an den Mikro­ manipulator sowohl hinsichtlich Genauigkeit als auch hinsicht­ lich Druckausübung geringere Anforderungen zu stellen sind, als wenn bspw. ein O-Ring zur Abdichtung verwendet würde.This measure has the advantage that even at low Print a good liquid tight seal between Substrate, upper part and lower part is made so that the micro manipulator both in terms of accuracy and respect pressure requirements are lower than if, for example, an O-ring was used for sealing.

Weiter ist es bevorzugt, wenn in dem Unterteil eine Kammer vor­ gesehen ist, in die die Elektrode hineinragt und der erste Ab­ schnitt des Kontaktkanals mündet.It is further preferred if there is a chamber in the lower part seen into which the electrode protrudes and the first Ab cut of the contact channel opens.

Hier ist von Vorteil, daß die Elektrode und der erste Abschnitt des Kontaktkanals in dem wiederverwendbaren Unterteil angeord­ net sind, so daß die Kosten für die Durchführung einer Messung nur durch das austauschbare Oberteil bestimmt werden, daß le­ diglich die Kontaktspitze sowie einen zweiten Abschnitt des Kontaktkanals trägt. The advantage here is that the electrode and the first section of the contact channel in the reusable lower part are net, so the cost of performing a measurement can only be determined by the replaceable upper part that le diglich the contact tip and a second section of the Contact channel carries.  

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn in dem Oberteil ein der Kammer zugeordneter, die Kontaktspitze durchsetzender trichterförmiger zweiter Abschnitt des Kontaktkanals angeordnet ist.In this context, it is preferred if in the top one assigned to the chamber and passing through the contact tip funnel-shaped second section of the contact channel arranged is.

Weiter ist es bevorzugt, wenn zwischen dem Oberteil und dem Substrat um die Kontaktspitze herum ein Ring ausgebildet ist, der auf das Unterteil zuweisend einen Durchbruch aufweist, der einem ersten Abschnitt des Ansaugkanals in dem Unterteil zuge­ ordnet ist.It is further preferred if between the upper part and the A ring is formed around the contact tip, which has an opening pointing towards the lower part, which a first section of the intake duct in the lower part is arranged.

Auf diese einfache Weise kann der Ansaugkanal in die Kontak­ teinheit integriert werden. Der Ansaugkanal läuft jetzt von dem Unterteil über den Durchbruch in den Ringraum um die Kontakt­ spitze und saugt dort die Zelle auf die Öffnung und gegen die Kontaktspitze. Auch hier ist weiter von Vorteil, daß nur ein sehr einfach aufgebautes Oberteil, das wie alle anderen Kompo­ nenten in Mikrosystemtechnik, also mikrostrukturiert herge­ stellt sein kann, ausgetauscht werden muß.In this simple way, the suction channel in the contact unit can be integrated. The intake duct now runs from that Lower part over the opening in the annulus around the contact point and suck the cell there on the opening and against the Contact tip. It is also advantageous here that only one very simply constructed top, which like all other compos components in microsystem technology, i.e. microstructured can be replaced.

In einer Weiterbildung ist es bevorzugt, wenn der Ringraum auf das Substrat zuweisend mit einer Membran abgedichtet ist, in der ein die Kontaktspitze mit Abstand umgebender Durchlaß vor­ gesehen ist.In a further development, it is preferred if the annular space is open the substrate is sealed with a membrane, in of a passage surrounding the contact tip at a distance is seen.

Hier ist von Vorteil, daß die Öffnung in dem Substrat deutlich größer sein kann als der Durchlaß, durch den der Ansaugkanal die Zelle auf die Öffnung saugt. Auf diese Weise sind an die Manipuliergenauigkeit des Mikromanipulators geringere Anforde­ rungen zu stellen, da nur sichergestellt werden muß, daß der Durchlaß im Bereich der Öffnung angeordnet ist, die Abdichtung nach außen erfolgt durch die Membran, die vorteilhafterweise an dem Oberteil befestigt ist.The advantage here is that the opening in the substrate is clear can be larger than the passage through which the intake duct the cell sucks on the opening. In this way, the Manipulation accuracy of the micromanipulator lower requirements to make, since it only has to be ensured that the Passage is arranged in the region of the opening, the seal  to the outside through the membrane, which is advantageously on the top is attached.

Allgemein ist es bevorzugt, wenn im Bereich der Öffnung eine Referenzelektrode in die Flüssigkeit hineinragt.In general, it is preferred if a Reference electrode protrudes into the liquid.

Bei dieser Maßnahme ist von Vorteil, daß durch die räumliche Nähe von Elektrode und Referenzelektrode sehr zuverlässig und reproduzierbar Potentiale auf der Zellmembran oder intrazellu­ lär gemessen werden können.This measure has the advantage that the spatial Proximity of electrode and reference electrode very reliable and reproducible potentials on the cell membrane or intracellu can be measured.

Allgemein ist es bevorzugt, wenn auf dem Substrat um die Öff­ nung herum eine funktionelle Beschichtung als Mittel zur Immo­ bilisierung der Zellen vorgesehen ist.In general, it is preferred if on the substrate around the opening a functional coating as a means of real estate bilization of the cells is provided.

Diese Maßnahme dient in vorteilhafter Weise der Selektion der zu kontaktierenden Zellen. Die Maßnahme ist bei einer gattungs­ gemäßen Vorrichtung sowie einem gattungsgemäßen Verfahren auch für sich genommen neu und erfinderisch. Durch den Einsatz einer funktionellen Beschichtung ist es jetzt möglich, aus einer Sus­ pension verschiedener Zellen eine bestimmte Art von Zellen zu selektieren und zu kontaktieren. Nur die Zellen, die an der auf die Zellen selbst abgestimmten funktionellen Beschichtung immo­ bilisiert werden, werden auch zur Messung herangezogen.This measure advantageously serves to select the cells to be contacted. The measure is at a generic device and a generic method also in itself new and inventive. By using a functional coating it is now possible from a sus Pension different cells to a certain type of cells select and contact. Only the cells that are on the the cells self-coordinated functional coating immo are also used for measurement.

Die funktionelle Beschichtung ist dabei ausgewählt aus der Gruppe: Polyanionen; Polykationen; Polyethylenimin; Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle wie Integrine (z. B. Fibronektin) oder Lektine; und magnetische Beschichtung. The functional coating is selected from the Group: polyanions; polycations; polyethyleneimine; antibody against cell surface molecules such as integrins (e.g. fibronectin) or lectins; and magnetic coating.  

Durch die Wahl der Polyanionen, Polykationen und Polyimine kann für eine geeignete chemische Immobilisierung gesorgt werden, während durch Immobilisierung geeigneter Antikörper in der funktionellen Beschichtung eine Spezifität für beliebige Zelloberflächenmoleküle hergestellt werden kann.By choosing the polyanions, polycations and polyimines appropriate chemical immobilization is provided, while by immobilizing suitable antibodies in the functional coating a specificity for any Cell surface molecules can be made.

Wenn die funktionelle Beschichtung eine magnetische Beschich­ tung umfaßt, so lassen sich auf diese Weise magnetische Anti­ körper einfangen, die der Zellsuspension zuvor zugegeben wurden und sich an bestimmte Zelloberflächenmoleküle angelagert haben. Durch die Wahl eines speziellen magnetischen Antikörpers können auf diese Weise genau vorherbestimmbare Zellen aus der Zellsus­ pension immobilisiert werden. An magnetische Partikel gekoppel­ te Antikörper sind aus dem Stand der Technik bekannt, sie wer­ den beispielsweise von Per Septive Diagnostics Incorporated, Cambrigde, Massachusetts, vertrieben; siehe Ahern: "Antibodies Making Their Way From The Clinic To The Research Lab", The Sci­ entist, Band 9, 1995, S. 18-19.If the functional coating comprises a magnetic coating device, it is possible in this way to capture magnetic antibodies which have previously been added to the cell suspension and have accumulated on certain cell surface molecules. By choosing a special magnetic antibody, precisely predeterminable cells from the cell suspension can be immobilized in this way. Antibodies coupled to magnetic particles are known from the prior art; they are sold, for example, by Per Septive Diagnostics Incorporated, Cambrigde, Massachusetts; see Ahern: "Antibodies Making Their Way From The Clinic To The Research Lab", The Sci entist, Volume 9 , 1995 , pp. 18-19.

Dabei ist es weiter bevorzugt, wenn eine Positioniereinheit vorgesehen ist, um eine Zelle über der Öffnung zu positionie­ ren, wobei die Positioniereinheit eine Laserpinzette umfassen kann, ein elektromagnetisches Feld aufbauen oder eine hydrody­ namische Kraft erzeugen kann.It is further preferred if a positioning unit is provided to position a cell over the opening ren, wherein the positioning unit comprise a laser tweezers can build up an electromagnetic field or a hydrody can generate namic force.

Die Positioniereinheit kann damit einerseits bereits durch den Ansaugkanal repräsentiert sein, der eine hydrodynamische Kraft erzeugt, wobei aber auch unabhängig von dem Ansaugkanal oder zusätzlich zu dem Ansaugkanal z. B. eine Laserpinzette oder ein elektromagnetisches Feld vorgesehen sein können. The positioning unit can therefore already on the one hand by the Intake duct can be represented by a hydrodynamic force generated, but also independently of the intake duct or in addition to the intake duct z. B. a laser tweezers or a electromagnetic field can be provided.  

Laserpinzetten sind aus dem Stand der Technik allgemein be­ kannt, bei diesen optischen Pinzetten handelt es sich um opti­ sche Manipulatoren, die auf dem Impulserhaltungssatz basieren.Laser tweezers are generally known from the prior art knows, these optical tweezers are opti manipulators based on the conservation of momentum.

Ein für das Laserlicht weitgehend transparentes Objekt absor­ biert kaum Energie, lenkt den Strahl jedoch nach dem Brechungs­ gesetz aus der ursprünglichen Richtung ab. Diese Brechung über­ trägt auf eine Zelle einen Impuls, der die Zelle bewegt. Ein Paar symmetrischer Laserstrahlen bildet so eine Falle, in der die Zelle gehalten wird. Durch Verfahren der Strahlen läßt sich die Zelle bewegen; siehe Berns: "Mit Laserwerkzeugen ins Zell­ innere", Spektrum der Wissenschaften, Juli 1998, S. 56.An object that is largely transparent to laser light barely bears energy, but directs the beam after refraction law from the original direction. This refraction over carries a pulse on a cell that moves the cell. On Pair of symmetrical laser beams thus forms a trap in which the cell is held. By moving the rays you can move the cell; see Berns: "With laser tools into the cell Inner ", Spectrum of Sciences, July 1998, p. 56.

Mittels der Positioniereinheit kann z. B. eine Zelle auf die funktionelle Beschichtung aufgesetzt werden. Wird die Zelle da­ nach von der Positioniereinheit freigegeben, so verbleibt sie nur über der Öffnung, wenn sie durch die funktionelle Beschich­ tung immobilisiert werden kann. Auf diese Weise läßt sich eine einfache Selektion von Zellen vornehmen. Wenn die Zelle von der Transportströmung in der Vorrichtung nach dem Freigeben durch die Positioniereinheit weiterbewegt, hat eine negative Selekti­ on stattgefunden, andernfalls eine positive Selektion.By means of the positioning unit z. B. a cell on the functional coating can be put on. The cell will be there released by the positioning unit, it remains only over the opening when through the functional coating can be immobilized. In this way one can make simple selection of cells. If the cell from the Transport flow in the device after being released moving the positioning unit has a negative selection on, otherwise a positive selection.

Auf diese Weise lassen sich aus einer Suspension unterschiedli­ cher Zellen genau die Zellen heraussuchen, die mit der Vorrich­ tung kontaktiert werden sollen. Auch diese Selektion ist bei einer gattungsgemäßen Vorrichtung und einem gattungsgemäßen Verfahren für sich genommen neu und erfinderisch.In this way, a suspension can be differentiated cells select exactly the cells that are connected to the device tion should be contacted. This selection is also included a generic device and a generic The process itself is new and inventive.

Dabei ist es bevorzugt, wenn das Substrat integraler Bestand­ teil einer Wandung eines Strömungskanals ist, durch den die Flüssigkeit mit definierter und/oder einstellbarer Transport­ strömung zu der Öffnung geleitet wird, wobei vorzugsweise eine Sensoreinheit vorgesehen ist, die auf einen Parameter der Zelle anspricht und die Positioniereinheit und/oder den Ansaugkanal ansteuert.It is preferred if the substrate is integral is part of a wall of a flow channel through which the  Liquid with defined and / or adjustable transport Flow is directed to the opening, preferably a Sensor unit is provided which is based on a parameter of the cell responds and the positioning unit and / or the intake duct controls.

Auch die Sensoreinheit dient der Selektion von Zellen und ist für sich genommen genauso wie die funktionelle Beschichtung bei einer Vorrichtung und einem Verfahren der gattungsgemäßen Art neu und erfinderisch.The sensor unit also serves for the selection of cells and is taken individually as well as the functional coating a device and a method of the generic type new and inventive.

Der Parameter ist dabei ausgewählt aus der Gruppe: optische Pa­ rameter wie beispielsweise Fluoreszenz, Absorption, Reflexion, Beugung, Brechung; geometrische Parameter wie beispielsweise Größe, Länge, Durchmesser, Form; elektrische Parameter wie bei­ spielsweise Kapazität, Widerstand; und biologische, chemische, physikalische Zellparameter.The parameter is selected from the group: optical Pa parameters such as fluorescence, absorption, reflection, Diffraction, refraction; geometric parameters such as Size, length, diameter, shape; electrical parameters as for for example capacity, resistance; and biological, chemical, physical cell parameters.

Die Sensoreinheit ist dabei vorzugsweise stromaufwärts von der Öffnung angeordnet.The sensor unit is preferably upstream of the Opening arranged.

Die Sensoreinheit ermöglicht insbesondere im Zusammenhang mit der einstellbaren Transportströmung und/oder der Positio­ niereinheit eine Selektion von Zellen. Wenn die Sensoreinheit anhand der gemessenen Zellparameter eine zu kontaktierende Zel­ le erkennt, wird dies an die Positioniereinheit und/oder den Ansaugkanal weitergegeben, die dann in Kenntnis der eingestell­ ten Transportströmung zu dem Zeitpunkt tätig werden, zu dem sich die von der Sensoreinheit selektierte Zelle in ihrem Be­ reich befindet. Es ist auch möglich, kurz vor dem Ansaugkanal eine weitere Sensoreinheit vorzusehen, die zur Lokalisierung einer Zelle dient und deren momentanen Ort an den Ansaugkanal und/oder die Positioniereinheit meldet.The sensor unit enables in particular in connection with the adjustable transport flow and / or the position a selection of cells. If the sensor unit a cell to be contacted based on the measured cell parameters le recognizes this to the positioning unit and / or the Intake duct passed on, which is then set knowing the transport flow at the time when the cell selected by the sensor unit rich located. It is also possible just before the intake duct to provide a further sensor unit for localization  serves a cell and its current location on the intake duct and / or the positioning unit reports.

Die Sensoreinheit sowie die gegebenenfalls vorgesehene weitere Sensoreinheit ermöglichen damit eine deutlich effizientere Se­ lektion von Zellen als die funktionelle Beschichtung, wobei durch Kombination von Sensoreinheit(en), Positioniereinheit und funktioneller Beschichtung eine sehr scharfe Selektion der zu kontaktierenden Zellen möglich wird.The sensor unit as well as the further one that may be provided Sensor unit thus enable a significantly more efficient Se lesson of cells as the functional coating, where by combining sensor unit (s), positioning unit and functional coating a very sharp selection of the contacting cells is possible.

Allgemein ist es bevorzugt, wenn stromaufwärts von der Öffnung eine Mikroperfusionseinheit angeordnet ist, um eine immobili­ sierte Zelle mit Testsubstanzen zu umspülen, wobei vorzugsweise die Komponenten der Vorrichtung in Mikrosystemtechnik herge­ stellt sind.Generally it is preferred if upstream of the opening a micro perfusion unit is arranged to immobilize Washed cell with test substances, preferably the components of the device in microsystem technology represents are.

Auf diese Weise ist es möglich, die immobilisierte Zelle mit geringen Substanzmengen anzuspülen, so daß kostensparend gear­ beitet werden kann.In this way it is possible to use the immobilized cell to wash up small amounts of substance, so that cost-saving gear can be processed.

Bei dem neuen Verfahren ist es bevorzugt, wenn vor jedem Kon­ taktieren die Kontaktspitze ausgetauscht wird.In the new method, it is preferred if before each con clock the contact tip is exchanged.

Hier ist von Vorteil, daß für jedes neue Kontaktieren eine neue Kontaktspitze verwendet wird, was für die sichere Ausbildung eines Gigaseals sowie eine zuverlässige Perforation des um­ schlossenen Membranflecks sorgt, sofern dies gewünscht ist.The advantage here is that for each new contact a new one Contact tip is used for safe training of a gigaseal as well as a reliable perforation of the um closed membrane stain, if desired.

Weiter ist es bevorzugt, wenn die Flüssigkeit mit einstellbarer Transportströmung durch einen Kanal zu der Öffnung geleitet wird. It is further preferred if the liquid is adjustable Transport flow directed through a channel to the opening becomes.  

Hier ist von Vorteil, daß die suspendierten Zellen in bekannter Zeitabfolge an der Öffnung vorbeischwimmen, so daß eine Ablauf­ steuerung den Ansaugkanal jeweils rechtzeitig ansteuern kann.The advantage here is that the suspended cells in known Swim past the opening so that there is a drain control can actuate the intake duct in good time.

Weiter ist es bevorzugt, wenn die Zelle durch Anhaften an einer funktionellen Beschichtung immobilisiert wird, die um die Öff­ nung herum auf dem Substrat angeordnet ist, wobei die Zelle vorzugsweise durch eine Positioniereinheit über der Öffnung po­ sitioniert wird und weiter vorzugsweise vor dem Positionieren einer Zelle ein Parameter der Zelle gemessen und in Abhängig­ keit von dem Parameter die Zelle für die Positionierung ausge­ wählt wird.It is further preferred if the cell adheres to a cell functional coating is immobilized around the public voltage is arranged around on the substrate, the cell preferably by a positioning unit over the opening po is sitioned and further preferably before positioning a cell a parameter of the cell measured and dependent The positioning cell depends on the parameter is chosen.

Hier ist von Vorteil, daß nicht mit völlig reinen Zellpopula­ tionen gearbeitet werden muß, sondern daß auch aus gemischten Zellsuspensionen gewünschte Zelltypen zur Kontaktierung ausge­ wählt werden können.The advantage here is that not with completely pure cell popula tion must be worked, but that also from mixed Cell suspensions selected desired cell types for contacting can be chosen.

Dabei ist es bevorzugt, wenn eine Zelle dadurch selektiert wird, daß sie mittels der Positioniereinheit auf der funktio­ nellen Beschichtung positioniert und dann von der Positio­ niereinheit freigegeben wird, so daß nur Zellen immobilisiert bleiben, die auf die funktionelle Beschichtung ansprechen.It is preferred if a cell is selected as a result is that it uses the positioning unit on the functio positioned and then from the position kidney unit is released so that only cells are immobilized remain that respond to the functional coating.

Hier ist von Vorteil, daß quasi jede an der Positioniereinheit vorbeischwimmende Zelle über die funktionelle Beschichtung dar­ aufhin getestet wird, ob sie kontaktiert werden soll oder aber freigegeben werden kann. The advantage here is that almost everyone on the positioning unit floating cell over the functional coating thereupon it is tested whether or not it should be contacted can be released.  

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Zelle zusätzlich zu der funk­ tionellen Beschichtung durch hydrodynamischen Unterdruck immo­ bilsiert wird.It is preferred if the cell is in addition to the radio tional coating by hydrodynamic vacuum immo is provided.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, daß eine zuverlässie Haltekraft auf eine über die funktionelle Beschichtung selektierte Zelle ausgewählt wird, so daß sie während einer Langzeitmessung z. B. mit Perfusion sicher gehalten werden kann.This measure has the advantage that a reliable holding force on a cell selected via the functional coating is selected so that during a long-term measurement z. B. can be held securely with perfusion.

Schließlich ist es noch bevorzugt, wenn die Zelle von der Öff­ nung entfernt wird, indem der zur Immobilisierung angelegte Un­ terdruck zu einem Überdruck aufgebaut wird.Finally, it is still preferred if the cell from the public voltage is removed by the Un is built up to an overpressure.

Hier ist von Vorteil, daß nach dem Ende einer Meß- und Stimula­ tionsphase die Zelle aktiv wieder abgestoßen werden kann. Zusammenfassend bieten die neue Vorrichtung sowie das neue Ver­ fahren also die Möglichkeit, Einzelzellen aus einer Suspension nach mindestens einem Kriterium, also einem Zellparameter, zu selektieren und die selektierten Einzelzellen aus der Suspensi­ on an einer Ableitstelle, also an der Öffnung, zu positionieren und zu immobilisieren. Die Immobilisierung erfolgt dabei entwe­ der über einen Ansaugkanal, also mit hydrodynamischem Unter­ druck, und/oder aber über eine funktionelle Beschichtung.The advantage here is that after the end of a measurement and stimula phase, the cell can be actively rejected. In summary, the new device and the new Ver So drive the possibility of single cells from a suspension according to at least one criterion, i.e. a cell parameter select and the selected single cells from the Suspensi to be positioned at a discharge point, i.e. at the opening and immobilize. The immobilization takes place either the one via an intake duct, i.e. with a hydrodynamic sub printing, and / or via a functional coating.

Entsprechend dem Verfahren der klassischen Patch-Clamp-Technik wird die Zelle zum Zwecke der Bildung eines hochomigen Seals durch den Kontaktkanal angesaugt, wobei die angesaugte und ab­ gedichtete Membran wahlweise durch einen Druckpuls durchbrochen werden kann. According to the procedure of the classic patch clamp technique becomes the cell for the purpose of forming a high-key seal sucked through the contact channel, the sucked in and down sealed membrane optionally broken by a pressure pulse can be.  

Die immobilisierte und kontaktierte Zelle kann mit Flüssigkei­ ten perfundiert werden, die Testsubstanzen enthalten, so daß serielle Untersuchungen an vielen Zellen automatisierbar durch­ geführt werden können, wobei gleichzeitig die Vorteile der klassischen Patch-Clamp-Technik genutzt werden.The immobilized and contacted cell can be filled with liquid can be perfused, which contain test substances, so that Serial examinations on many cells can be automated can be performed, while taking advantage of classic patch clamp technology can be used.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der Beschreibung und der bei­ gefügten Zeichnung.Further advantages result from the description and the at added drawing.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above and the following standing features to be explained not only in each specified combination, but also in other combinations or can be used alone, without the scope of to leave the present invention.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigen:Embodiments of the invention are in the drawing are shown and are described in more detail in the following description explained. Show it:

Fig. 1 eine schematische Übersicht über die neue Vorrich­ tung; Figure 1 is a schematic overview of the new Vorrich device.

Fig. 2 eine vergrößerte Darstellung eines Ausschnitts der Vorrichtung aus Fig. 1 im Bereich der Kontaktier- und Meßeinheit; FIG. 2 shows an enlarged illustration of a section of the device from FIG. 1 in the area of the contacting and measuring unit; FIG.

Fig. 3 den schematischen Ablauf einer elektrischen Kontak­ tierung einer Zelle sowie des Austauschs der Kon­ taktspitze; Figure 3 shows the schematic flow of an electrical contact processing a cell and the exchange of the contact tip.

Fig. 4 ein erstes Ausführungsbeispiel einer austauschbaren Kontaktspitze, bei der der Ansaugkanal im Substrat angeordnet ist; Fig. 4 shows a first embodiment of a replaceable contact tip, wherein the suction duct is arranged in the substrate;

Fig. 5 ein Ausführungsbeispiel wie Fig. 4, bei dem jedoch die Kontakteinheit in auswechselbares Oberteil und wiederverwendbares Unterteil aufgeteilt ist; FIG. 5 shows an embodiment as in FIG. 4, but in which the contact unit is divided into an exchangeable upper part and a reusable lower part;

Fig. 6 eine Kontakteinheit wie in Fig. 5, wobei jedoch der Ansaugkanal in der Kontakteinheit ausgebildet ist; und FIG. 6 shows a contact unit as in FIG. 5, but the suction channel is formed in the contact unit; and

Fig. 7 eine Kontakteinheit wie in Fig. 6, jedoch mit größe­ rer Öffnung im Substrat. Fig. 7 shows a contact unit as in Fig. 6, but with a larger opening in the substrate.

In Fig. 1 ist mit 10 eine Vorrichtung zum elektrischen Kontak­ tieren von Zellen 11 gezeigt, die in einer in einem Vorratsbe­ hälter 12 vorrätig gehaltenen Flüssigkeit 14 in Suspension sind.In Fig. 1, 10 shows a device for electrical contact animals of cells 11 which are in suspension in a reservoir 12 in a Vorratsbe liquid 14 held in suspension.

Der Vorratsbehälter 12 ist mit einem Umschaltventil 15 verbun­ den, durch das die Flüssigkeit 14 in einen Strömungskanal 16 geleitet wird, in dem in noch zu beschreibender Weise die elek­ trische Kontaktierung der Zellen 11 erfolgt.The reservoir 12 is connected to a changeover valve 15 through which the liquid 14 is passed into a flow channel 16 , in which the electrical contacting of the cells 11 takes place in a manner to be described.

An das Umschaltventil 15 ist ferner ein Einlaß 17 für eine Waschlösung angeschlossen, so daß der Strömungskanal 16 nach erfolgter Messung an einer Zelle 11 mit der Waschlösung durch­ spült werden kann. An inlet 17 for a washing solution is also connected to the switching valve 15 , so that the flow channel 16 can be flushed with the washing solution after measurement on a cell 11 .

Längs des Strömungskanals 16 ist zunächst eine Sensoreinheit 18 angeordnet, über die Parameter der Zellen 11 gemessen werden. An die Sensoreinheit 18 schließt sich eine Mikroperfusionsein­ heit 19 an, über die Perfusionslösungen 20 in den Strömungska­ nal 16 eingeleitet werden können, um eine kontaktierte Zelle zu perfundieren, also mit Testsubstanzen anzuspülen.A sensor unit 18 is initially arranged along the flow channel 16 , via which the parameters of the cells 11 are measured. The sensor unit 18 is followed by a microperfusion unit 19 , via which perfusion solutions 20 can be introduced into the flow channel 16 in order to perfuse a contacted cell, that is to say to wash it with test substances.

An die Mikroperfusionseinheit 19 schließt sich eine Positio­ niereinheit 21 an, über die Zellen 11 in einer Kontaktier- und Meßeinheit 22 positioniert und dort immobilisiert werden kön­ nen.The micro perfusion unit 19 is followed by a positioning unit 21 , via which cells 11 can be positioned in a contacting and measuring unit 22 and immobilized there.

Die Positioniereinheit 21 wird z. B. in Abhängigkeit von Aus­ gangssignalen der Sensoreinheit 18 gesteuert.The positioning unit 21 is, for. B. controlled as a function of output signals from the sensor unit 18 .

In Fig. 1 ist in der Kontaktier- und Meßeinheit 22 noch eine konventionelle Patch-Clamp-Spitze 23 angedeutet, über die Mes­ sungen an der Außenseite einer Membran der Zelle 11 sowie in­ trazelluläre Messungen in noch zu beschreibender Weise automa­ tisch durchgeführt werden können.In Fig. 1, a conventional patch clamp tip 23 is indicated in the contacting and measuring unit 22 , via the measurement solutions on the outside of a membrane of the cell 11 and in tracellular measurements can be carried out automatically in a manner yet to be described.

Vor der Patch-Clamp-Spitze 23 kann eine weitere Sensoreinheit 18' angeordnet sein, die bei dem in Fig. 1 gezeigten Ausfüh­ rungsbeispiel in der Kontaktier- und Meßeinheit 22 angeordnet ist. Die weitere Sensoreinheit 18' kann über optische und ande­ re Methoden Einzelzellen im Strömungskanal 16 lokalisieren und mit ihrem Meßkanal das Ansaugen dieser Einzelzelle steuern, wie es im einzelnen weiter hinten noch beschrieben wird. Before the patch clamp tip 23 , a further sensor unit 18 'can be arranged, which is arranged in the exemplary embodiment shown in FIG. 1 in the contacting and measuring unit 22 . The further sensor unit 18 'can locate individual cells in the flow channel 16 via optical and other methods and control the suctioning of this single cell with its measuring channel, as will be described in detail further below.

Während die Sensoreinheit 18 zur Selektion einer anzusaugenden Zelle dient, ist es Aufgabe der weiteren Sensoreinheit 18', ei­ ne Einzelzelle zu lokalisieren und deren momentanen Ort derart zu bestimmen, daß sie über die Positioniereinheit 21 und/oder durch Ansaugen in Kontakt mit der Patch-Clamp-Spritze 23 ge­ bracht werden kann.While the sensor unit 18 serves to select a cell to be sucked in, it is the task of the further sensor unit 18 'to locate a single cell and to determine its current location in such a way that it comes into contact with the patch via the positioning unit 21 and / or by suction. Clamp syringe 23 can be brought ge.

An die Kontaktier- und Meßeinheit 22 schließt sich eine zweite Sensoreinheit 24 und daran eine Steuerung 25 für eine bei 26 angedeutete Transportströmung der Flüssigkeit 14 in dem Strö­ mungskanal 16 an. Der Strömungskanal 16 mündet schließlich in einen Auffangbehälter 27 für Flüssigkeit 14 und Waschlösung 17.The contacting and measuring unit 22 is followed by a second sensor unit 24 and a control 25 for a transport flow of the liquid 14 in the flow channel 16 indicated at 26. The flow channel 16 finally opens into a collecting container 27 for liquid 14 and washing solution 17 .

Schließlich ist in Fig. 1 noch eine Ablaufsteuerung und Meßda­ tenverarbeitung 28 gezeigt, über die die einzelnen Komponenten der Vorrichtung gesteuert und funktionell miteinander verbunden werden.Finally, in Fig. 1 a sequence control and Meßda tenverarbeitung 28 is shown, via which the individual components of the device are controlled and functionally connected.

Über die Ablaufsteuerung und Meßdatenverarbeitung 28 wird die Transportströmung 26 dabei so eingestellt, daß jeweils eine einzige Zelle an der Sensoreinheit 18 vorbeiströmt, dort bezüg­ lich bestimmter Parameter vermessen wird und dann im Falle ih­ rer Auswahl durch die Positioniereinheit 21 in der Kontaktier- und Meßeinheit positioniert wird.Via the sequence control and measurement data processing 28 , the transport flow 26 is set so that a single cell flows past the sensor unit 18 , measured there with respect to certain parameters and then positioned in the contacting and measuring unit in the event of their selection by the positioning unit 21 becomes.

Die Positioniereinheit 21 kann dabei z. B. eine Laserpinzette sein, oder aber ein elektromagnetisches Feld aufbauen, über das an magnetische Partikel gekoppelte Antikörper, die auf der Oberfläche der Zellen 11 sitzen, zur Meß- und Ableitstelle transportiert werden. The positioning unit 21 can, for. B. be a pair of laser tweezers, or build up an electromagnetic field via which antibodies coupled to magnetic particles that sit on the surface of the cells 11 are transported to the measuring and discharge point.

Darüber hinaus ist es auch möglich, statt oder zusätzlich zur Positioniereinheit 21 in der Kontaktier- und Meßeinheit 22 ei­ nen hydrodynamischen Unterdruck zum Immobilisieren einer Zelle 11 vorzusehen, wie dies nachstehend im Zusammenhang mit Fig. 2 beschrieben wird.In addition, it is also possible instead of or in addition to the positioning unit 21 in the contacting and measuring unit 22 to provide a hydrodynamic negative pressure for immobilizing a cell 11 , as will be described below in connection with FIG. 2.

Die Sensoreinheit 18 ist dabei dazu ausgelegt, einen optischen, elektrischen, geometrischen oder sonstigen biologischen, chemi­ schen oder physikalischen Zellparameter zu erfassen und an die Ablaufsteuerung und Meßdatenverarbeitung 28 zu melden, die dar­ aufhin die Positioniereinheit 21 und/oder die Kontaktier- und Meßeinheit 22 entsprechend ansteuert, wenn die anhand ihres Pa­ rameters als geeignet erkannte Zelle aufgrund der bekannten Transportströmung 26 in den Bereich der Kontaktier- und Meßein­ heit 22 gelangt ist.The sensor unit 18 is designed to detect an optical, electrical, geometric or other biological, chemical or physical cell parameter and to report it to the sequence control and measurement data processing 28 , which thereupon the positioning unit 21 and / or the contacting and measuring unit 22 controls accordingly if the cell identified as suitable on the basis of its parameter has reached the area of the contacting and measuring unit 22 due to the known transport flow 26 .

Die Kontaktier- und Meßeinheit 22 ist dabei in Mikrosystemtech­ nik als mikrostrukturiertes Teil ausgelegt, weist also sehr ge­ ringe Abmaße auf.The contacting and measuring unit 22 is designed in Mikrosystemtech technology as a microstructured part, so it has very small dimensions.

In Fig. 2 ist ein Ausschnitt der Vorrichtung 10 aus Fig. 1 in vergrößertem Maßstab und in schematischer Seitenansicht ge­ zeigt. Der Strömungskanal 16 weist als Wandung ein Substrat 31 auf, in dem eine Öffnung 32 vorgesehen ist, auf der eine zu kontaktierende Zelle 11 positioniert wird. In der Öffnung 32 mündet ein Ansaugkanal 33, der mit einer Pumpe 34 verbunden ist, über die in der Öffnung 32 zum Ansaugen einer Zelle 11 ein hydrodynamischer Unterdruck eingestellt werden kann.In Fig. 2 is a section of the device 10 of FIG. 1 in an enlarged scale and in a schematic side view shows ge. The flow channel 16 has a substrate 31 as a wall, in which an opening 32 is provided, on which a cell 11 to be contacted is positioned. An opening 33 opens into the opening 32 , which is connected to a pump 34 , via which a hydrodynamic negative pressure can be set in the opening 32 for drawing in a cell 11 .

Um die Öffnung 32 herum ist der Zelle 11 zugewandt auf dem Substrat 31 eine funktionelle Beschichtung 35 angeordnet, die zusätzlich zum Ansaugkanal 33 zum Immobilisieren einer Zelle 11 dient. Wenn die Zelle 11 auf der Öffnung 32 positioniert wurde, wird der Unterdruck der Pumpe 34 abgestellt, so daß die Zelle 11 nur auf der funktionellen Beschichtung 35 haften bleibt, wenn sie auf die Beschichtung anspricht, ansonsten wird sie durch die Transportströmung 26 weggewaschen. Für die eigentli­ che Messung wird die Pumpe 34 dann jedoch wieder eingeschaltet, so daß die Zelle 11 sicher auf der Öffnung 32 immobilisiert wird.Around the opening 32 , facing the cell 11, a functional coating 35 is arranged on the substrate 31 , which in addition to the suction channel 33 serves to immobilize a cell 11 . When the cell 11 has been positioned on the opening 32 , the vacuum of the pump 34 is switched off, so that the cell 11 only adheres to the functional coating 35 when it responds to the coating, otherwise it is washed away by the transport flow 26 . For the actual measurement, however, the pump 34 is then switched on again, so that the cell 11 is securely immobilized on the opening 32 .

Die erste Positionierung auf der Öffnung 32 diente also ledig­ lich dem Test, ob die Zelle 11 auf die funktionelle Beschich­ tung 35 anspricht, die für eine chemische Immobilisierung oder eine Immobilisierung über ihrerseits immobilisierte Antikörper sorgt. Die funktionelle Beschichtung 35 kann auch eine magneti­ sche Beschichtung sein, die an magnetische Partikel gekoppelte Antikörper festhält, die ihrerseits auf der Zelle 11 sitzen. Diese erste Positionierung der Zelle 11 auf der Öffnung 32 kann außer über den Ansaugkanal 33 auch über die Positioniereinheit 21 aus Fig. 1 erfolgen.The first positioning on the opening 32 thus served only to test whether the cell 11 responds to the functional coating 35 which ensures chemical immobilization or immobilization by means of antibodies immobilized on its part. The functional coating 35 can also be a magnetic coating which holds antibodies coupled to magnetic particles, which in turn sit on the cell 11 . This first positioning of the cell 11 on the opening 32 can take place not only via the intake duct 33 but also via the positioning unit 21 from FIG. 1.

Von der Zelle 11 abgelegen sitzt an dem Substrat 31 eine ab­ nehmbare Kontakteinheit 36, an der eine auswechselbare Kontakt­ spitze 37 angeordnet ist. Die Kontaktspitze 37 liegt mit ihrem oberen Ende 38 an einer Zellmembran 39 der Zelle 11 an und wölbt diese leicht nach innen.Remote from the cell 11 sits on the substrate 31 from a removable contact unit 36 on which an interchangeable contact tip 37 is arranged. The contact tip 37 bears with its upper end 38 against a cell membrane 39 of the cell 11 and bulges it slightly inwards.

Die Kontaktspitze 37 wird von einem Kontaktkanal 41 durchsetzt, der am oberen Ende 38 der Kontaktspitze 37 mündet. Anderen Endes ist der Kontaktkanal 41 mit einer Pumpe 42 verbunden, über die ein hydrodynamischer Unterdruck einstellbar ist.The contact tip 37 is penetrated by a contact channel 41 , which opens at the upper end 38 of the contact tip 37 . At the other end, the contact channel 41 is connected to a pump 42 , by means of which a hydrodynamic vacuum can be set.

In den Kontaktkanal 41 ragt eine Elektrode 43 hinein, die über in den Kontaktkanal 41 vorhandene elektrisch leitende Flüssig­ keit mit der Zellmembran 39 in elektrischer Verbindung ist. Als Gegenelektrode dient eine Referenzelektrode 44, die in den Strömungskanal 16 im Bereich der Öffnung 32 hineinragt.In the contact channel 41 protrudes an electrode 43 which is in the contact channel 41 existing in the electrically conductive liquid speed with the cell membrane 39 in electrical connection. A reference electrode 44 , which projects into the flow channel 16 in the region of the opening 32, serves as the counter electrode.

Durch den Ansaugkanal 33 wird die Zelle 11 auf der Öffnung 32 immobilisiert, während die Kontaktierung - wie bei der üblichen Patch-Clamp-Technik - durch Anlegen eines leichten Unterdrucks im Kontaktkanal 41 erfolgt. Wenn im Kontaktkanal 41 ein Druck­ stoß erzeugt wird, wird der von der Kontaktspitze 37 umschrie­ bene Membranfleck perforiert, so daß intrazelluläre Messungen und Stimulierungen möglich werden.The cell 11 is immobilized on the opening 32 through the suction channel 33 , while the contacting - as in the usual patch-clamp technique - takes place by applying a slight negative pressure in the contact channel 41 . If a pressure surge is generated in the contact channel 41, the membrane spot circumscribed by the contact tip 37 is perforated, so that intracellular measurements and stimulations are possible.

In den Strömungskanal 16 mündet ferner noch ein Perfusionskanal 45, durch den eine Perfusionslösung 20 zu der immobilisierten und kontaktierten Zelle 11 geleitet werden kann, um diese mit Testsubstanzen zu umspülen und die Reaktion der Zelle 11 auf die Testsubstanzen zu messen.A perfusion channel 45 also opens into the flow channel 16 , through which a perfusion solution 20 can be passed to the immobilized and contacted cell 11 , in order to flush it with test substances and to measure the reaction of the cell 11 to the test substances.

In Fig. 3 ist in einer schematischen Bildabfolge der Vorgang einer Kontaktierung und Messung/Stimulierung einer Zelle 11 ge­ zeigt.In Fig. 3, the process of contacting and measuring / stimulating a cell 11 is shown in a schematic image sequence.

In dem ersten Bild in der oberen Reihe wird der Strömungskanal 16 von einer Flüssigkeit 14 durchströmt, die eine Zelle 11 mit sich trägt. Durch den Ansaugkanal 33 wird ebenfalls Flüssigkeit 14 in das Innere des Strömungskanals 16 eingespült. In the first picture in the upper row, the flow channel 16 is flowed through by a liquid 14 which carries a cell 11 with it. Liquid 14 is also flushed into the interior of the flow channel 16 through the suction channel 33 .

Wenn die Zelle 11 den Bereich der Öffnung 32 erreicht hat, wird über den Ansaugkanal 33 ein hydrodynamischer Unterdruck er­ zeugt, so daß die Zelle 11 auf die Öffnung 32 zugesogen wird, wie es im zweiten Bild der ersten Reihe gezeigt ist.When the cell 11 has reached the area of the opening 32 , a hydrodynamic negative pressure is generated via the intake duct 33 , so that the cell 11 is drawn towards the opening 32 , as shown in the second image of the first row.

Das letzte Bild der ersten Reihe zeigt, daß die Zelle 11 mit ihrer Membran 39 nach innen gewölbt auf dem oberen Ende 38 der Kontaktspitze 37 zum Liegen kommt, wie es bei der klassischen Patch-Clamp-Technik auch der Fall ist. Im Gegensatz zur klassi­ schen Technik erfolgt die Kontaktierung bei der neuen Vorrich­ tung und dem neuen Verfahren jedoch dadurch, daß die Zelle 11 zu der Kontaktspitze transportiert und dort automatisch immobi­ lisiert wird.The last picture of the first row shows that the cell 11, with its membrane 39 arched inwards, lies on the upper end 38 of the contact tip 37 , as is also the case with the classic patch-clamp technique. In contrast to classic technology, contacting in the new device and the new method takes place in that the cell 11 is transported to the contact tip and is automatically immobilized there.

In der zweiten Zeile im ersten Bild ist zu erkennen, daß ein Unterdruck an den Kontaktkanal 41 angelegt wird, so daß die im­ mobilisierte Zelle in der in der Patch-Clamp-Technik üblichen Weise kontaktiert wird. Wenn der Unterdruck in dem Kontaktkanal 41 pulsartig erhöht wird, reist der Membranfleck auf, so daß eine intrazelluläre Messung möglich ist, wie es im zweiten Bild der zweiten Zeile gezeigt ist.In the second line in the first picture it can be seen that a negative pressure is applied to the contact channel 41 , so that the cell mobilized in the cell is contacted in the manner customary in patch-clamp technology. If the negative pressure in the contact channel 41 is increased in a pulse-like manner, the membrane spot opens up, so that an intracellular measurement is possible, as shown in the second image of the second line.

Wenn die Messung/Stimulierung beendet wurde, wird der Unter­ druck im Kontaktkanal 41 abgeschaltet und im Ansaugkanal 43 wird ein Überdruck angelegt, so daß die Zelle 11 wieder in die Transportströmung 26 freigegeben und durch diese wegtranspor­ tiert wird.When the measurement / stimulation has ended, the negative pressure in the contact channel 41 is switched off and an excess pressure is applied in the suction channel 43 , so that the cell 11 is released again into the transport flow 26 and transported away by this.

In der dritten Zeile im linken Bild ist zu erkennen, daß danach die Kontaktspitze aus der Öffnung 32 entfernt und eine neue Kontaktspitze 37 eingesetzt wird, was im zweiten Bild der drit­ ten Zeile angedeutet ist.In the third line in the left picture it can be seen that the contact tip is then removed from the opening 32 and a new contact tip 37 is inserted, which is indicated in the second picture of the third line.

Nachdem die Kontaktspitze 37 ausgewechselt wurde, werden der Strömungskanal 16 sowie der Ansaugkanal 33 und der Kontaktkanal 41 zunächst mit Flüssigkeit durchspült, um das System für die Kontaktierung einer neuen Zelle 11 vorzubereiten.After the contact tip 37 has been replaced, the flow channel 16 and the suction channel 33 and the contact channel 41 are first flushed with liquid in order to prepare the system for contacting a new cell 11 .

Das Auswechseln der Kontaktspitze 37 erfolgt automatisch mit­ tels eines Mikromanipulators, so daß mit der neuen Vorrichtung 10 automatisiert nacheinander viele Zellen kontaktiert und ge­ messen/stimuliert werden können.The exchange of the contact tip 37 is carried out automatically by means of a micromanipulator, so that with the new device 10 many cells can be contacted and measured / stimulated one after the other in an automated manner.

In Fig. 4 ist ein erstes, sehr einfach aufgebautes Ausführungs­ beispiel für eine auswechselbare Kontaktspitze 37 gezeigt.In Fig. 4, a first, very simply constructed execution example for an interchangeable contact tip 37 is shown.

In dem gezeigten Ausführungsbeispiel ist die Kontaktspitze eine übliche Patch-Clamp-Spitze 23, wie sie aus Fig. 1 bereits be­ kannt ist. Die Patch-Clamp-Spitze 23 ist in einen Kunststoff­ block 46 eingegossen, der von außen gegen das Substrat 31 ge­ drückt wird, so daß die Patch-Clamp-Spitze 23 in die Öffnung 32 hineinragt. Durch Dichtmittel 47, die vorzugsweise durch Syl­ gardTM gebildet werden, wird die Öffnung 32 flüssigkeitsdicht nach außen abgeschlossen.In the exemplary embodiment shown, the contact tip is a conventional patch clamp tip 23 , as is already known from FIG. 1. The patch clamp tip 23 is cast into a plastic block 46 , which is pressed from the outside against the substrate 31 ge, so that the patch clamp tip 23 protrudes into the opening 32 . The opening 32 is closed to the outside in a liquid-tight manner by means of sealing means 47 , which are preferably formed by Syl gard TM .

Die Patch-Clamp-Spitze 23 ragt in dem gezeigten Ausführungsbei­ spiel etwas über das Substrat 31 hervor in den Strömungskanal 16 hinein, so daß eine über den Ansaugkanal 33 auf die Öffnung 32 gesaugte Zelle 11 eine bei 48 angedeutete Einwölbung ihrer Zellmembran 39 ausbildet, wie es auch von Hand durchgeführter Patch-Clamp-Technik eingestellt wird. The patch clamp tip 23 protrudes somewhat in the exemplary embodiment shown, out over the substrate 31 into the flow channel 16 , so that a cell 11 sucked via the suction channel 33 onto the opening 32 forms a bulge indicated at 48 in its cell membrane 39 , such as it is also set by hand using the patch clamp technique.

In Fig. 4 ist im oberen Bild die Anlage des Kunststoffblocks 46 an den Strömungskanal 16 gezeigt, während im unteren Bild der Kunststoffblock 46 mit in dem Kontaktkanal 41 angeordneter Elektrode 43 gezeigt ist. An dem Kunststoffblock 46 greift ein Mikromanipulator an, der lediglich schematisch dargestellt ist. Der Mikromanipulator 49 drückt den Kunststoffblock 45 gegen das Substrat 31 und hält den Kunststoffblock 46 unter Druck in An­ lage mit dem Substrat 31, so daß der bereits erwähnte flüssig­ keitsdichte Abschluß erreicht wird.In FIG. 4, in the upper installation of the plastic block is shown in the flow channel 16 46, while shown in the lower view of the plastic block 46 which is arranged in the contact channel 41 electrode 43. A micromanipulator, which is only shown schematically, acts on the plastic block 46 . The micromanipulator 49 presses the plastic block 45 against the substrate 31 and holds the plastic block 46 under pressure in position with the substrate 31 so that the liquid-tight seal already mentioned is achieved.

Die in Fig. 4 gezeigte Kontakteinheit 36 ist sehr einfach auf­ gebaut, sie besteht im wesentlichen aus einer konventionellen Patch-Clamp-Spitze 23, die in den Kunststoffblock 46 eingegos­ sen wurde.The contact unit 36 shown in Fig. 4 is very simple to build, it consists essentially of a conventional patch clamp tip 23 , which was poured into the plastic block 46 sen.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Kontakteinheit 36 ist in Fig. 5 gezeigt. Die Kontakteinheit 36 aus Fig. 5 weist ein aus­ zuwechselndes Oberteil 51 sowie ein wiederverwendbares Unter­ teil 52 auf. An dem Oberteil 51 ist die Kontaktspitze 37 mit dem Kontaktkanal 41 angeordnet, wobei in dem Unterteil 52 eine Kammer 53 vorgesehen ist, in die die Elektrode 43 hineinragt. In die Kammer 53 führt ebenfalls ein erster Abschnitt 54 des Kontaktkanals 41, dessen zweiter, trichterförmiger Abschnitt 55 im Oberteil 51 angeordnet ist.Another embodiment of a contact unit 36 is shown in FIG. 5. The contact unit 36 from FIG. 5 has an interchangeable upper part 51 and a reusable lower part 52 . The contact tip 37 with the contact channel 41 is arranged on the upper part 51 , a chamber 53 being provided in the lower part 52 , into which the electrode 43 projects. A first section 54 of the contact channel 41 also leads into the chamber 53 , the second, funnel-shaped section 55 of which is arranged in the upper part 51 .

Zwischen Oberteil 51 und Unterteil 52 sitzen die schon aus Fig. 4 bekannten Dichtmittel 47, die auch zwischen Oberteil 51 und Substrat 31 angeordnet sind. Between the upper part 51 and the lower part 52 are the sealing means 47 known from FIG. 4, which are also arranged between the upper part 51 and the substrate 31 .

Die Kontakteinheit 36 aus Fig. 5 ist sehr einfach aufgebaut und leicht zu positionieren, wobei zum Auswechseln der Kontaktspit­ ze 37 lediglich das Oberteil 51 ausgewechselt werden muß.The contact unit 36 of Fig. 5 is very simple and easy to position, only the upper part 51 has to be replaced to replace the contact tip 37 .

Hierzu wird über einen Mikromanipulator die gesamte Konaktein­ heit 36 von dem Substrat 31 entfernt, woraufhin das Oberteil 51 ausgetauscht und das Unterteil 52 mit neuem Oberteil 51 wieder gegen das Substrat 31 gedrückt wird. Dieses Auswechseln kann automatisch erfolgen, was gegenüber dem manuellen Austausch ei­ ne merkliche Zeitersparnis bringt.For this purpose, the entire contact unit 36 is removed from the substrate 31 via a micromanipulator, whereupon the upper part 51 is replaced and the lower part 52 is pressed against the substrate 31 again with a new upper part 51 . This exchange can take place automatically, which brings a noticeable time saving compared to manual exchange.

In dem Ausführungsbeispiel der Kontakteinheit 36 aus Fig. 6 ist zwischen dem Oberteil 51 und dem Substrat 31 ein Ringraum 58 ausgebildet, der die Kontaktspitze 37 umgibt. Der Ringraum 58 führt über einen Durchbruch 59 im Oberteil 51 zu einem ersten Abschnitt 61 des Ansaugkanals 33, der bei diesem Ausführungs­ beispiel auch in der Kontakteinheit 36 angeordnet ist.In the exemplary embodiment of the contact unit 36 from FIG. 6, an annular space 58 is formed between the upper part 51 and the substrate 31 , which surrounds the contact tip 37 . The annular space 58 leads through an opening 59 in the upper part 51 to a first section 61 of the intake duct 33 , which is also arranged in the contact unit 36 in this embodiment, for example.

Wenn das Oberteil 51 gegen das Substrat 31 gedrückt wurde, wozu das Unterteil 52 gegen das Oberteil 51 gedrückt wird, sorgen die bereits bekannten Dichtmittel 47 wieder für einen flüssig­ keitsdichten Abschluß.When the upper part 51 has been pressed against the substrate 31 , for which the lower part 52 is pressed against the upper part 51 , the already known sealing means 47 again ensure a liquid-tight seal.

Bei dem Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 6 sind sämtliche hydro­ dynamischen Anschlüsse am Unterteil 52 vorgesehen, wobei in be­ kannter Weise der Ansaugkanal 33 in der Öffnung mündet.In the embodiment of FIG. 6, all hydro dynamic connections are provided on the lower part 52 , the suction channel 33 opening in the opening in a known manner.

Bei dem Ausführungsbeispiel für die Kontakteinheit 36 in Fig. 7 ist gegenüber dem Ausführungsbeispiel der Fig. 6 der Ringkanal 58 zum hier sehr dünn ausgebildeten Substrat 31 hin durch eine Membran 62 abgeschlossen, die um die Kontaktspitze 37 herum ei­ nen Durchlaß 63 bildet.In the exemplary embodiment for the contact unit 36 in FIG. 7, compared to the exemplary embodiment in FIG. 6, the annular channel 58 to the very thin substrate 31 is closed off by a membrane 62 which forms a passage 63 around the contact tip 37 .

Im Vergleich zu Fig. 6 ist zu erkennen, daß die Öffnung 32 im Substrat 31 erheblich größer ist, so daß die Kontakteinheit 36 sehr leicht an dem Substrat 31 positioniert werden kann. Im üb­ rigen entspricht die Kontakteinheit 36 aus Fig. 7 der Kontak­ teinheit 36 aus Fig. 6.In comparison to FIG. 6 it can be seen that the opening 32 in the substrate 31 is considerably larger, so that the contact unit 36 can be positioned very easily on the substrate 31 . Otherwise, the contact unit 36 from FIG. 7 corresponds to the contact unit 36 from FIG. 6.

Claims (37)

1. Vorrichtung zum elektrischen Kontaktieren von in einer Flüssigkeit (14) in Suspension befindlichen biologischen Zellen (11), mit einem zumindest eine Öffnung (32) aufwei­ senden Substrat (31), mit Mitteln (35, 33) zum Immobili­ sieren einer Zelle (11) auf der Öffnung (32), vorzugsweise einem in die Öffnung (32) mündenden Ansaugkanal (33), über den an der Öffnung (32) ein hydrodynamischer Unterdruck zum Immobilisieren einer Zelle (11) auf der Öffnung (32) erzeugbar ist, und zumindest einer Elektrode (43) für die elektrische Kontaktierung einer immobilisieren Zelle (11), dadurch gekennzeichnet, daß an der Öffnung (32) eine Kon­ takteinheit (36) mit einer Kontaktspitze (37) angeordnet ist, deren oberes Ende (38) so in die Öffnung (32) hinein­ ragt, daß sie mit einer Zellmembran (39) einer immobili­ sierten Zelle (11) in Anlage gelangt, die Kontaktspitze (37) einen an ihrem oberen Ende (38) mündenden Kontaktka­ nal (31) aufweist, über die auf die Zellmembran (39) ein hydrodynamischer Unterdruck ausübbar ist, und die Elektro­ de (43) elektrisch mit dem Kontaktkanal (41) in Verbindung steht.1. Device for electrically contacting biological cells ( 11 ) in suspension in a liquid ( 14 ), with a substrate ( 31 ) having at least one opening ( 32 ), with means ( 35 , 33 ) for immobilizing a cell ( 11) on the opening (32), preferably one in the orifice (32) opens the intake passage (33) through which at the opening (32) is a hydrodynamic low pressure can be generated for immobilizing a cell (11) on the opening (32) and at least one electrode ( 43 ) for the electrical contacting of an immobilized cell ( 11 ), characterized in that a contact unit ( 36 ) with a contact tip ( 37 ) is arranged at the opening ( 32 ), the upper end ( 38 ) of which protrudes into the opening ( 32 ) that it comes into contact with a cell membrane ( 39 ) of an immobilized cell ( 11 ), the contact tip ( 37 ) has a contact channel ( 31 ) opening at its upper end ( 38 ), Via which a hydrodynamic negative pressure can be exerted on the cell membrane ( 39 ), and the electrical de ( 43 ) is electrically connected to the contact channel ( 41 ).
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontakteinheit (36) abnehmbar an der Öffnung (32) an­ geordnet ist.2. Device according to claim 1, characterized in that the contact unit ( 36 ) is arranged removably at the opening ( 32 ).
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die Kontaktspitze (23, 37) auswechselbar angeord­ net ist. 3. Apparatus according to claim 1 or 2, characterized in that the contact tip ( 23 , 37 ) is replaceably angeord net.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Ansaugkanal (33) in dem Substrat (31) verläuft.4. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the suction channel ( 33 ) in the substrate ( 31 ).
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Ansaugkanal (33) zumindest ab­ schnittsweise in der Kontakteinheit (36) verläuft.5. Device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the suction channel ( 33 ) extends at least in sections in the contact unit ( 36 ).
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Kontakteinheit ein austauschbares, die Kontaktspitze (37) aufweisendes Oberteil (51) sowie ein wiederverwendbares, die Elektrode (43) und einen er­ sten Abschnitt (54) des Kontaktkanals (41) aufweisendes Unterteil (52) aufweist.6. Device according to one of claims 1 to 5, characterized in that the contact unit has an interchangeable, the contact tip ( 37 ) having upper part ( 51 ) and a reusable, the electrode ( 43 ) and one of the most he section ( 54 ) of the contact channel ( 41 ) having lower part ( 52 ).
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Kontakteinheit (36) im Bereich der Öffnung (32) außen an dem Substrat (31) anliegt und die Öffnung (32) nach außen flüssigkeitsdicht abschließt.7. Device according to one of claims 1 to 6, characterized in that the contact unit ( 36 ) in the region of the opening ( 32 ) bears on the outside of the substrate ( 31 ) and the opening ( 32 ) closes liquid-tight to the outside.
8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 6 und 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Oberteil (51) unter Druck außen an dem Substrat (31) und das Unterteil (52) unter Druck an dem Oberteil (51) anliegt.8. Device according to claims 6 and 7, characterized in that the upper part ( 51 ) bears under pressure on the outside of the substrate ( 31 ) and the lower part ( 52 ) under pressure on the upper part ( 51 ).
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Substrat (31) und Oberteil (51) und/oder zwischen Oberteil (51) und Unterteil (52) ein Dichtmittel (47) vor­ gesehen ist. 9. The device according to claim 8, characterized in that between the substrate ( 31 ) and upper part ( 51 ) and / or between the upper part ( 51 ) and lower part ( 52 ), a sealant ( 47 ) is seen before.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Dichtmittel (47) ausgewählt ist aus der Gruppe: Sili­ konpaste, Zwei-Komponenten-Elastomer, Polydimethylsiloxan- Elastomer.10. The device according to claim 9, characterized in that the sealant ( 47 ) is selected from the group: Silicon paste, two-component elastomer, polydimethylsiloxane elastomer.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in dem Unterteil (52) eine Kammer (53) vorgesehen ist, in die die Elektrode (43) hineinragt und ein erster Abschnitt (54) des Kontaktkanals (41) mündet.11. Device according to one of claims 6 to 10, characterized in that in the lower part ( 52 ) a chamber ( 53 ) is provided, into which the electrode ( 43 ) protrudes and a first section ( 54 ) of the contact channel ( 41 ) empties.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Oberteil (51) ein der Kammer (53) zugeordneter, die Kontaktspitze (37) durchsetzender, trichterförmiger zwei­ ter Abschnitt (55) des Kontaktkanals (41) angeordnet ist.12. The apparatus according to claim 11, characterized in that in the upper part ( 51 ) associated with the chamber ( 53 ), the contact tip ( 37 ) penetrating, funnel-shaped two-th section ( 55 ) of the contact channel ( 41 ) is arranged.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zwischen Oberteil (51) und Substrat (31) um die Kontaktspitze (37) herum ein Ringraum (58) ausge­ bildet ist, der auf das Unterteil (52) zuweisend einen Durchbruch (59) aufweist, der einem ersten Abschnitt (61) des Ansaugkanals (33) in dem Unterteil (51) zugeordnet ist.13. Device according to one of claims 6 to 12, characterized in that between the upper part ( 51 ) and the substrate ( 31 ) around the contact tip ( 37 ) around an annular space ( 58 ) is formed, which points to the lower part ( 52 ) has an opening ( 59 ) which is assigned to a first section ( 61 ) of the intake duct ( 33 ) in the lower part ( 51 ).
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Ringraum (58) auf das Substrat (31) zuweisend mit ei­ ner Membran (62) abgedichtet ist, in der ein die Kontakt­ spitze (37) mit Abstand umgebender Durchlaß (63) vorgese­ hen ist.14. The apparatus according to claim 13, characterized in that the annular space ( 58 ) on the substrate ( 31 ) facing with egg ner membrane ( 62 ) is sealed, in which the contact tip ( 37 ) surrounds the passage ( 63 ) at a distance hen is.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (62) am Oberteil (51) befestigt ist. 15. The apparatus according to claim 14, characterized in that the membrane ( 62 ) on the upper part ( 51 ) is attached.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in die Flüssigkeit (14) im Bereich der Öffnung (32) eine Referenzelektrode (44) hineinragt.16. The device according to one of claims 1 to 15, characterized in that a reference electrode ( 44 ) projects into the liquid ( 14 ) in the region of the opening ( 32 ).
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch ge­ kennzeichnet, daß auf dem Substrat (31) um die Öffnung (32) herum eine funktionelle Beschichtung (35) als Mittel zur Immobilisierung der Zellen (11) vorgesehen ist.17. Device according to one of claims 1 to 16, characterized in that on the substrate ( 31 ) around the opening ( 32 ) around a functional coating ( 35 ) is provided as a means for immobilizing the cells ( 11 ).
18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Beschichtung ausgewählt ist aus der Grup­ pe: Polyanionen; Polykationen; Polyethylenimin; Antikörper gegen Zelloberflächenmoleküle wie Integrine (z. B. Fibro­ nektin), oder Lektine; und magnetische Beschichtung.18. The apparatus according to claim 17, characterized in that the functional coating is selected from the group pe: polyanions; polycations; polyethyleneimine; antibody against cell surface molecules such as integrins (e.g. Fibro nectin), or lectins; and magnetic coating.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, gekenn­ zeichnet durch eine Positioniereinheit (21), um eine Zelle (11) über der Öffnung (32) zu positionieren.19. Device according to one of claims 1 to 18, characterized by a positioning unit ( 21 ) to position a cell ( 11 ) over the opening ( 32 ).
20. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Positioniereinheit (21) eine Laserpinzette umfaßt.20. The apparatus according to claim 19, characterized in that the positioning unit ( 21 ) comprises laser tweezers.
21. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Positioniereinheit (21) ein elektromagnetisches Feld aufbaut.21. The apparatus according to claim 19, characterized in that the positioning unit ( 21 ) builds up an electromagnetic field.
22. Vorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Positioniereinheit (21) eine hydrodynamische Kraft er­ zeugt. 22. The apparatus according to claim 19, characterized in that the positioning unit ( 21 ) generates a hydrodynamic force.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Substrat (31) integraler Bestandteil einer Wandung eines Strömungskanals (16) ist, durch den die Flüssigkeit (14) mit definierter und/oder einstellba­ rer Transportströmung (26) zu der Öffnung (32) geleitet wird.23. Device according to one of claims 1 to 22, characterized in that the substrate ( 31 ) is an integral part of a wall of a flow channel ( 16 ) through which the liquid ( 14 ) with a defined and / or adjustable transport flow ( 26 ) is directed to the opening ( 32 ).
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, gekenn­ zeichnet durch eine Sensoreinheit (18), die auf einen Pa­ rameter der Zellen (11) anspricht und eine Positionierein­ heit (21) und/oder den Ansaugkanal (33) ansteuert.24. Device according to one of claims 1 to 23, characterized by a sensor unit ( 18 ) which responds to a parameter of the cells ( 11 ) and controls a positioning unit ( 21 ) and / or the suction channel ( 33 ).
25. Vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Parameter ausgewählt ist aus der Gruppe: optische Pa­ rameter wie beispielsweise Fluoreszenz, Absorption, Refle­ xion, Beugung, Brechung; geometrische Parameter wie bei­ spielsweise Größe, Länge, Durchmesser, Form; elektrische Parameter wie beispielsweise Kapazität, Widerstand; und biologische, chemische, physikalische Zellparameter.25. The device according to claim 24, characterized in that the parameter is selected from the group: optical Pa parameters such as fluorescence, absorption, reflect xion, diffraction, refraction; geometric parameters as for for example size, length, diameter, shape; electrical Parameters such as capacitance, resistance; and biological, chemical, physical cell parameters.
26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeich­ net, daß die Sensoreinheit (18) stromaufwärts von der Öff­ nung (32) angeordnet ist.26. The apparatus of claim 24 or 25, characterized in that the sensor unit ( 18 ) upstream of the opening ( 32 ) is arranged.
27. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß stromaufwärts von der Öffnung (32) eine Mikroperfusions­ einheit (19) angeordnet ist, um eine immobilisierte Zelle (11) mit Testsubstanzen zu umspülen. 27. The apparatus according to claim 23, characterized in that a micro perfusion unit ( 19 ) is arranged upstream of the opening ( 32 ) in order to wash around an immobilized cell ( 11 ) with test substances.
28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie zumindest teilweise in Mikrosystem­ technik hergestellt ist.28. Device according to one of claims 1 to 27, characterized ge indicates that they are at least partially in microsystem technology is made.
29. Verfahren zum elektrischen Kontaktieren von in einer Flüs­ sigkeit (14) in Suspension befindlichen biologischen Zel­ len (11) mit den Schritten:
  • - Immobilisieren einer Zelle (11) oberhalb einer in einem Substrat (31) vorgesehenen Öffnung (32), vor­ zugsweise durch Erzeugen eines hydrodynamischen Un­ terdrucks, und
  • - Kontaktieren der immobilisierten Zelle (11) über zu­ mindest eine Elektrode (43),
dadurch gekennzeichnet, daß zum Kontaktieren der immobili­ sierten Zelle (11) durch eine in die Öffnung (32) ragende Kontaktspitze (37) hindurch auf eine Zellmembran (39) der Zellen (11) ein hydrodynamischer Unterdruck ausgeübt wird, wobei die Elektrode (43) durch die Kontaktspitze (37) hin­ durch mit der Zelle (11) elektrisch in Kontakt gelangt.
29. A method for electrically contacting biological cells ( 11 ) in suspension in a liquid ( 14 ), comprising the steps:
  • - Immobilizing a cell ( 11 ) above an opening ( 32 ) provided in a substrate ( 31 ), preferably by generating a hydrodynamic vacuum, and
  • - Contacting the immobilized cell ( 11 ) via at least one electrode ( 43 ),
characterized in that for contacting the immobilized cell ( 11 ) through a contact tip ( 37 ) projecting into the opening ( 32 ) onto a cell membrane ( 39 ) of the cells ( 11 ), a hydrodynamic negative pressure is exerted, the electrode ( 43 ) through the contact tip ( 37 ) through electrically with the cell ( 11 ).
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß vor jedem Kontaktieren die Kontaktspitze (37, 23) ausge­ tauscht wird.30. The method according to claim 29, characterized in that the contact tip ( 37 , 23 ) is exchanged before each contact.
31. Verfahren nach Anspruch 29 und 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit (14) mit einstellbarer Transportströ­ mung (26) durch einen Strömungskanal (16) zu der Öffnung (32) geleitet wird. 31. The method according to claim 29 and 30, characterized in that the liquid ( 14 ) with adjustable Transportströ tion ( 26 ) through a flow channel ( 16 ) to the opening ( 32 ) is passed.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zelle (11) durch Anhaften an einer funktionellen Beschichtung (35) immobilisiert wird, die um die Öffnung (32) herum auf dem Substrat (31) angeordnet ist.32. The method according to any one of claims 29 to 31, characterized in that the cell ( 11 ) is immobilized by adhering to a functional coating ( 35 ) which is arranged around the opening ( 32 ) on the substrate ( 31 ).
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zelle (11) durch eine Positio­ niereinheit (21) über der Öffnung (32) positioniert wird.33. The method according to any one of claims 29 to 32, characterized in that the cell ( 11 ) is positioned by a positioning unit ( 21 ) over the opening ( 32 ).
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Positionieren einer Zelle (11) ein Parameter der Zelle (11) gemessen und in Abhängigkeit von dem Parameter die Zelle (11) für die Positionierung ausgewählt wird.34. A method according to claim 33, characterized in that prior to positioning a cell (11) measured a parameter of the cell (11) and the cell (11) is selected for positioning in dependence upon the parameters.
35. Verfahren nach Anspruch 32 und 33, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zelle (11) dadurch selektiert wird, daß sie mit­ tels der Positioniereinheit (21) auf der funktionellen Be­ schichtung (35) positioniert und dann von der Positio­ niereinheit (21) freigegeben wird, so daß nur Zellen immo­ bilisiert bleiben, die auf die funktionelle Beschichtung (35) ansprechen.35. The method according to claim 32 and 33, characterized in that a cell ( 11 ) is selected in that it is positioned by means of the positioning unit ( 21 ) on the functional coating ( 35 ) and then released by the positioning unit ( 21 ) is, so that only cells remain immobilized that respond to the functional coating ( 35 ).
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle zusätzlich zu der funktionellen Beschichtung (35) durch hydrodynamischen Unterdruck immobilisiert wird.36. The method according to claim 35, characterized in that the cell is immobilized in addition to the functional coating ( 35 ) by hydrodynamic vacuum.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 36, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zelle von der Öffnung (32) entfernt wird, indem der zur Immobilisierung angelegte Unterdruck zu einem Überdruck aufgebaut wird.37. The method according to any one of claims 29 to 36, characterized in that the cell is removed from the opening ( 32 ) by the underpressure applied for immobilization being built up to an overpressure.
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