DE10032040A1

DE10032040A1 - Antibodies against special forms of proPSA and their use in immunoassays

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Publication number: DE10032040A1
Application number: DE10032040A
Authority: DE
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2001-11-29

Abstract

The invention relates to antibodies against particular forms of enzymatically-inactive precursors of the prostate specific antigen (PSA), the production and use thereof in immunoassays for the determination of the [-5,-6,-7]-proPSA and application of the measured values from said assays, for an improved diagnosis in the field of prostate carcinomas.

Description

Die Erfindung betrifft Antikörper gegen spezielle Formen der enzymatisch nicht aktiven Vorstufen des prostataspezifischen Antigens (PSA), deren Herstellung, deren Verwendung in Immunoassays zur Bestimmung des [-5, -6, -7]-proPSA, sowie den Einsatz der Messwerte aus diesen Assays für eine verbesserte Diagnostik im Umfeld des Prostata-Karzinoms.The invention relates to antibodies against special forms of the enzymatically inactive precursors of prostate specific antigen (PSA), their preparation, their use in immunoassays for Determination of the [-5, -6, -7] -proPSA, and the use of the measured values from these assays for a improved diagnostics in the area of prostate carcinoma.

description

Das Prostata-Karzinom (PCa) ist in den USA der am meisten diagnostizierte Krebs bei Männern, Parker, S.L. et al., CA Cancer J. Clin., 46: 5-27, 1996. Das prostataspezifische Antigen, oder auch PSA genannt, wurde als verläßlicher Prognose-Marker im großen Umfang für die Behandlung von an Prostatakrebs erkrankten Patienten benutzt. Catalona, W.J. et al., N. Engl. J. Med., 324: 1156-1161, 1991; Osterling, J.E., J. Urol., 145: 907-923, 1991. Als Tumormarker hat es den großen Vorteil, dass es im Blut von gesunden Männern nicht oder nur in ganz geringen Konzentrationen nachweisbar ist. Im fortgeschrittenen Krankheitsstadium werden in aller Regel stark erhöhte PSA-Werte gemessen.Prostate carcinoma (PCa) is the most diagnosed cancer in the United States in men, Parker, S.L. et al., CA Cancer J. Clin., 46: 5-27, 1996. The prostate-specific antigen, or also called PSA, has been used as a reliable prognostic marker on a large scale for the treatment of prostate cancer sick patient. Catalona, W.J. et al., N. Engl. J. Med., 324: 1156-1161, 1991; Osterling, J.E., J. Urol., 145: 907-923, 1991. As a tumor marker, it has the great advantage that it is healthy in the blood Men are not detectable or only in very low concentrations. In the advanced As a rule, the stage of the disease is measured by greatly increased PSA values.

Eine diagnostische Frage von enormer Bedeutung ist die frühzeitige, sichere Erkennung eines PCa und die Unterscheidung von PCa und gutartiger Prostata Hyperplasie (BPH). Es ist eines der größten Probleme der heutigen PSA-Tests, dass diese Unterscheidung zwischen BPH und PCa nicht gewährleistet ist, McCormack, R.T. et al., Urology, 45: 729-744, 1995. So kann bei PSA-Konzentration im Bereich von 2-15 ng/ml Serum nicht unbedingt auf das Vorliegen einer malignen Erkrankung geschlossen werden, da solche PSA Werte auch durch eine BPH verursacht sein können. Es sind daher zusätzlich zu der PSA- Bestimmung weitere, z. T. aufwendige und schmerzhafte Untersuchungen (z. B. rektale Biopsien) notwendig, um das Vorliegen eines PCa abzuklären.A diagnostic question of enormous importance is the early, reliable detection of a PCa and the Differentiation between PCa and benign prostatic hyperplasia (BPH). It is one of the biggest problems today's PSA tests that this distinction between BPH and PCa is not guaranteed, McCormack, R.T. et al., Urology, 45: 729-744, 1995. Thus, at PSA concentration in the range of 2-15 ng / ml serum cannot necessarily be concluded that there is a malignancy, since such PSA values can also be caused by BPH. Therefore, in addition to the PSA Determination of other, e.g. T. complex and painful examinations (e.g. rectal biopsies) necessary to clarify the existence of a PCa.

Um die diagnostische Genauigkeit des PSA-Nachweises aus Serum zu verbessern, wurden verschiedene alternative Vorgehensweisen vorgeschlagen, wie z. B. PSA-Dichte, PSA-Geschwindigkeit, Verhältnis zwischen freiem und gesamtem PSA oder zwischen komplexiertem und gesamtem PSA, Benson, M.C. et al., J. Urol., 147 : 815-816, 1992; Carter, H.B. et al., J. Am. Med. Assoc., 267: 2215-2220, 1992; Oesterling, J.E. et al., J. Am. Med. Assoc., 270: 860-864, 1993. In order to improve the diagnostic accuracy of PSA detection from serum, several alternative approaches proposed, such as. B. PSA density, PSA speed, ratio between free and total PSA or between complexed and total PSA, Benson, M.C. et al., J. Urol., 147: 815-816, 1992; Carter, H.B. et al., J. Am. Med. Assoc., 267: 2215-2220, 1992; Oesterling, J.E. et al., J. Am. Med. Assoc., 270: 860-864, 1993.

PSA gehört zu einer als "Kallikreine" bekannten Gruppe von Proteinen/Enzymen. Die menschliche Kallikrein-Familie besteht aus drei Mitgliedern, beschrieben als hK1, hK2 und hK3 (PSA). Clements, J.A., Endocr. Rev., 10: 393-419, 1989; Carbini, L.A. et al., J. Hypertens., 11: 893-898, 1993.PSA belongs to a group of proteins / enzymes known as "kallikreine". The human The Kallikrein family consists of three members, described as hK1, hK2 and hK3 (PSA). Clements, J.A., Endocr. Rev., 10: 393-419, 1989; Carbini, L.A. et al., J. Hypertens., 11: 893-898, 1993.

hK1 wird hauptsächlich in den Nieren, der Bauchspeicheldrüse und den submandibularen Speicheldrüsen produziert. Fukushima, D. et al., Biochemistry, 24 : 8037-8043, 1985.hK1 is mainly found in the kidneys, pancreas and submandibular salivary glands produced. Fukushima, D. et al., Biochemistry, 24: 8037-8043, 1985.

hK2, wie PSA, wird vorherrschend im Prostata Epithelium produziert (Morris, B.J., Clin. Exp. Pharm. Phys., 16: 345-351, 1989) und hat 78% Homologie mit PSA (Schedlich, L.J. et al., DNA, 6: 429-437, 1987; Lilja, H., World J. Urol., 11: 188-191, 1993). Die Eigenschaften des hK2 als potenzieller Prostatakrebs- Marker wurde im Rahmen eines Übersichtsartikels diskutiert, Young, C.Y.F. et al., The Prostata Supplement, 7: 17-24, 1996.hK2, like PSA, is predominantly produced in the prostate epithelium (Morris, B.J., Clin. Exp. Pharm. Phys., 16: 345-351, 1989) and has 78% homology with PSA (Schedlich, L.J. et al., DNA, 6: 429-437, 1987; Lilja, H., World J. Urol., 11: 188-191, 1993). The properties of hK2 as a potential prostate cancer Marker was discussed in an overview article, Young, C.Y.F. et al., The Prostate Supplement, 7: 17-24, 1996.

Das Prostata spezifische Antigen (PSA) oder hK3 ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca. 29 kDa. Es wird in den Prostata-Epithelzellen gebildet und ist ein Bestandteil der Samenflüssigkeit. PSA hat die enzymatische Aktivität einer neutralen Serinprotease. Seine Hauptfunktion besteht in der Spaltung der Seminogeline I und II sowie des Fibronektins, die als wesentliche Komponenten des Ejakulats die Beweglichkeit der Spermien blockieren. Durch die Hydrolyse dieser Proteine bewirkt PSA die Verflüssigung des Samenkoagulums und ermöglicht so die Mobilität der Spermien.The prostate specific antigen (PSA) or hK3 is a glycoprotein with a molecular weight of approx. 29 kDa. It is formed in the prostate epithelial cells and is a component of the seminal fluid. PSA has the enzymatic activity of a neutral serine protease. Its main function is Cleavage of the Seminogeline I and II as well as the fibronectin, which are essential components of the Ejaculate block sperm motility. The hydrolysis of these proteins causes PSA the liquefaction of the semen coagulum and thus enables the mobility of the sperm.

PSA ist eine Chymotrypsin-ähnliche Protease, wogegen hK2 eine Trypsin-ähnliche Protease ist.PSA is a chymotrypsin-like protease, whereas hK2 is a trypsin-like protease.

Es ist bekannt, dass das PSA in unterschiedlichen molekularen Formen im Serum vorkommt. Der bei weitem größte Anteil des PSA liegt in Form inaktiver Komplexe vor, wobei vor allem das α1-Anti- Chymotrypsin das PSA komplexiert und dadurch auch dessen enzymatische Aktivität inhibiert.It is known that the PSA occurs in different molecular forms in the serum. The at By far the largest proportion of PSA is in the form of inactive complexes, the α1-anti- Chymotrypsin complexes the PSA and thereby also inhibits its enzymatic activity.

Weitere Komplexe können mit anderen Serin-Protease-Inhibitoren (Serpine), wie α1-Antitrypsin und Protein C-Inhibitor gebildet werden, die aber im Vergleich zu PSA-ACT nur in sehr untergeordnetem Maße im Serum vorhanden sind. Darüberhinaus bildet PSA auch noch mit einem anderen Typ von Protease-Inhibitor, nämlich dem α2-Makroglobulin (α2-M) einen Komplex, über dessen Gehalt im Serum in der Literatur unterschiedliche Angaben gemacht werden, vor allem da das PSA in diesem Komplex immunologisch nicht zugänglich ist. Unter der Bezeichnung Gesamt-PSA ist nachfolgend die Summe von freiem und mit Serpinen komplexiertem PSA gemeint, da der PSA Komplex mit α2-M in allen bisherigen immunologischen Bestimmungen nicht erfaßt wird (Tewari und Bluestein, J. Clin. Ligand Assay 1995, Vol. 18, S. 186-196). Neben der Bezeichnung Gesamt-PSA wird oft auch der Begriff PSA total mit gleicher Bedeutung verwendet. Other complexes can be combined with other serine protease inhibitors (serpins), such as α1-antitrypsin and Protein C inhibitor are formed, but in comparison to PSA-ACT only in very minor Measurements are present in the serum. In addition, PSA also forms with another type of Protease inhibitor, namely the α2-macroglobulin (α2-M) a complex, the content of which in Serum different information can be given in the literature, especially since the PSA in this Complex is not immunologically accessible. Under the designation total PPE is below Sum of free PSA complexed with serpins, since the PSA complex with α2-M in all previous immunological determinations are not covered (Tewari and Bluestein, J. Clin. Ligand Assay 1995, Vol. 18, pp. 186-196). In addition to the term total PPE, the term PSA is often also total used with the same meaning.

In Analogie hierzu gilt auch für die anderen beiden Kallikreine hK1 und hK2 die gleiche Definition für Gesamt-Kallikreine, welche oft ebenso als Kallikrein (total) oder PSA (total) bezeichnet wird.In analogy to this, the same definition applies to the other two kallikreins hK1 and hK2 Total kallikreine, which is often also called kallikrein (total) or PSA (total).

Neben komplexiertem PSA kommt im Serum noch enzymatisch inaktives, freies PSA vor, das keine Komplexe eingehen kann. Petterson et al., Clin. Chem. Vol. 41, (No. 10), Seite 1480-1488, (1995), beschreiben, dass etwa 15% bis 20% des Gesamt-PSA in freier (nicht komplexierter) Form im Serum vorliegen. Es wurde deshalb von Petterson et al. und anderen Arbeitsgruppen diskutiert, dass dieses freie, enzymatisch nicht aktive PSA, eventuell eine pro-Enzymform darstellt oder vielleicht durch interne Spaltung der Lys-Lys-Verbindungen zwischen den Aminosäuren 145 und 146 des PSA, inaktiviert worden sein könnte.In addition to complexed PSA, there is enzymatically inactive, free PSA in the serum, which none Complex. Petterson et al., Clin. Chem. Vol. 41, (No. 10), page 1480-1488, (1995), describe that about 15% to 20% of total PSA is in free (uncomplexed) form in serum available. It was therefore by Petterson et al. and other working groups discussed that this free, enzymatically inactive PSA, possibly a pro-enzyme form, or perhaps internal Cleavage of the Lys-Lys connections between amino acids 145 and 146 of the PSA could be.

Das PSA-Molekül wird als prä-pro-Form bestehend aus insgesamt 261 Aminosäuren synthetisiert. Das 17 Aminosäuren lange Signal-Peptid wird bereits im endoplasmatischen Retikulum abgespalten. Das enzymatisch nicht aktive proPSA (Zymogen) ist demnach noch 244 Aminosäuren lang.The PSA molecule is synthesized as a pre-pro form consisting of a total of 261 amino acids. The 17th Signal peptide amino acids long is already cleaved in the endoplasmic reticulum. The proPSA (zymogen), which is not enzymatically active, is therefore still 244 amino acids long.

Durch Abspaltung des proPeptids (7 Aminosäuren) entsteht das enzymatisch aktive "reife" PSA (z. B. Melegos + Diamandis, Clin. Biochem., 29 (3), 193-200, 1996).By splitting off the proPeptide (7 amino acids) the enzymatically active "mature" PSA (e.g. Melegos + Diamandis, Clin. Biochem., 29 (3), 193-200, 1996).

Das proPSA-Molekül mit den 7 N-terminalen Aminosäuren des PSA-propeptids wird auch als [-7] proPSA bezeichnet. proPSA-Moleküle mit N-terminal verkürzter Sequenz werden entsprechend der Länge des proPeptid-Anteils als [-6], [-5], [-4] etc. proPSA bezeichnet.The proPSA molecule with the 7 N-terminal amino acids of the PSA propeptide is also called [-7] called proPSA. proPSA molecules with an N-terminal shortened sequence are corresponding to the Length of the proPeptide portion referred to as [-6], [-5], [-4] etc. proPSA.

Die in menschlichem Serum vorkommenden PSA-Formen sind in ihrer genauen Struktur bisher im Detail nicht bestimmt oder analysiert worden. So ist vor allem nicht geklärt, wie die genaue Struktur des in Serum frei, d. h. also nicht in Komplexen vorliegenden PSA aussieht (Paus et al., (1998) J. of Urology 159, 1599-1605). Der Grund dafür ist vor allem, dass die Konzentration des freien PSA in Serum so niedrig ist, dass es sehr schwierig ist, genügend Material zu isolieren und es einer Analytik zugänglich zu machen. Noldus et al. J. of Urology 158, 1606-1609 (1997) hatten aus 230 ml eines Gemisches von hochtitrigen PSA Seren (PSA total < 2000 ng/ml) mit einer Ausbeute von ca. 25% freies PSA in unreiner Form isoliert und es durch N-terminale Sequenzierung analysiert. Sie fanden Hinweise auf das Vorliegen eines normalen N-Terminus sowie auf eine Spaltung der PSA-Kette zwischen den Aminosäuren 145 und 146, welche erklären könnte, dass dieses PSA in nicht komplexierter Form vorliegt. Hinweise auf proPSA- Formen, d. h. auf PSA-Moleküle mit zusätzlichen Aminosäuren am N-terminalen Ende wurden von ihnen nicht gefunden. The exact structure of the PSA forms occurring in human serum are currently in the Detail has not been determined or analyzed. Above all, it is not clear how the exact structure of the free in serum, d. H. PSA does not appear in complexes (Paus et al., (1998) J. of Urology 159, 1599-1605). The main reason for this is that the concentration of free PSA in serum is so What is low is that it is very difficult to isolate enough material and make it accessible for analysis do. Noldus et al. J. of Urology 158, 1606-1609 (1997) had from 230 ml of a mixture of high titre PSA sera (total PSA <2000 ng / ml) with a yield of approx. 25% free PSA in impure Form isolated and analyzed by N-terminal sequencing. They found evidence of the existence a normal N-terminus and a cleavage of the PSA chain between amino acids 145 and 146, which could explain that this PSA is in an uncomplexed form. Notes on proPSA Shapes, d. H. on PSA molecules with additional amino acids at the N-terminal end were from not found them.

In WO 98/49323 wurden Antikörper gegen PSA eingesetzt, um die in biologischen Proben vorhandenen molekularen Formen des freien PSA zu identifizieren und molekular zu charakterisieren. Dort konnte gezeigt werden, dass ein signifikanter Anteil des freien PSA als [-4]-proPSA, d. h. als ein N-terminal um 4 Aminosäuren der proPSA-Sequenz verlängertes PSA-Molekül im Serum vorkommt.Antibodies against PSA were used in WO 98/49323 to remove those present in biological samples to identify and characterize molecular forms of free PSA. There could can be shown that a significant proportion of the free PSA as [-4] -proPSA, i.e. H. as an N-terminal around 4 Amino acids of the proPSA sequence extended PSA molecule occurs in the serum.

Im Stand der Technik sind keine spezifischen diagnostischen Verfahren für freie PSA-Moleküle, die noch Anteile des proPeptids enthalten, gezeigt. Eben so wenig ist bekannt, ob außer dem in WO 98/4932 3 beschriebenen [-4]proPSA noch andere proPSA-Formen in Probenflüssigkeiten humanen Ursprungs vorkommen.In the prior art there are no specific diagnostic procedures for free PSA molecules that still exist Contain portions of the proPeptide shown. Just as little is known whether in addition to that in WO 98/4932 3 described [-4] proPSA and other forms of proPSA in sample liquids of human origin occurrence.

Im Stand der Technik finden sich zudem keinerlei Daten zur diagnostischen Wertigkeit von freiem PSA mit unterschiedlich langen proPSA-Sequenzanteilen.In addition, there is no data in the prior art relating to the diagnostic value of free PSA with different lengths of proPSA sequence parts.

Aufgabe der Erfindung war es daher, diagnostische Werkzeuge herzustellen, die einen spezifischen Nachweis bestimmter proPSA-Formen ermöglichen und zu überprüfen, ob diese neuartigen Tests zu einer verbesserten Diagnostik im Umfeld des Prostata-Karzinoms, insbesondere bei der Unterscheidung von BPH und PCa beitragen können.The object of the invention was therefore to produce diagnostic tools that have a specific Allow detection of certain forms of proPSA and check whether these novel tests too an improved diagnosis in the area of prostate carcinoma, especially in the differentiation of BPH and PCa.

In einem ersten Schritt wurde deshalb untersucht, ob sich durch den Einsatz modernster analytischer Methoden Hinweise auf andere proPSA-Formen, welche nicht dem [-4]-proPSA aus WO 98/49323 entsprechen, finden lassen. Es konnte überraschenderweise Hinweise auf mindestens drei zusätzliche proPSA-Formen [-2, -5, -7]-proPSA gefunden werden. Aufgrund dieser Voruntersuchungen wurde die Frage der diagnostischen Relevanz dieser proPSA-Formen untersucht.In a first step, it was therefore examined whether the use of the most modern analytical Methods Notes on other forms of proPSA that do not contain the [-4] -proPSA from WO 98/49323 match, find. Surprisingly, there was evidence of at least three additional ones proPSA forms [-2, -5, -7] -proPSA can be found. Based on these preliminary examinations, the The question of the diagnostic relevance of these proPSA forms was examined.

Um die erfindungsgemäße Aufgabenstellung zu bearbeiten, wurden Antikörper hergestellt und gezielt ausgewählt, welche mit [-5, -6, -7]-proPSA reagieren, aber kürzere proPSA-Formen [-4], [-3], usw. nicht signifikant erkennen.In order to work on the task according to the invention, antibodies were produced and targeted selected which react with [-5, -6, -7] -proPSA, but shorter proPSA forms [-4], [-3], etc. do not recognize significantly.

Synthetische Peptide, welche den N-terminalen Sequenzen der verschieden langen proPSA-Formen entsprechen, wurden hergestellt und sowohl für Immunisierungs-, wie auch für Screening- und Charakterisierungszwecke eingesetzt.Synthetic peptides containing the N-terminal sequences of the different lengths of proPSA correspond, were produced and for immunization as well as for screening and Characterization purposes used.

Es wurden Antikörper entwickelt und isoliert, welche die erfindungsrelevanten Spezifitäten aufweisen. Solche Antikörper reagieren mit [-5, -6, -7]-proPSA, zeigen aber keine signifikanten Bindeeigenschaften gegen Peptide des [-4]-proPSA oder kürzere proPSA-Peptide.Antibodies have been developed and isolated which have the specificities relevant to the invention. Such antibodies react with [-5, -6, -7] -proPSA, but show no significant binding properties against peptides of [-4] -proPSA or shorter proPSA peptides.

Eine bevorzugte Ausführungsform stellen deshalb Antikörper gegen proPSA dar, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie an [-5, -6, -7]-proPSA binden, aber mit [-4]-proPSA oder weiter verkürzten pro-PSA-Formen, im Wesentlichen keine Reaktion zeigen. A preferred embodiment is therefore antibodies against proPSA, which thereby are characterized as binding to [-5, -6, -7] -proPSA, but shortened with [-4] -proPSA or further pro-PSA forms, showing essentially no reaction.

Diese Antikörper wurden zudem nach üblichen Verfahren gereinigt, modifiziert, derivatisiert und in Immunoassays zum Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA eingesetzt.These antibodies were also purified, modified, derivatized and in by conventional methods Immunoassays used to detect [-5, -6, -7] -proPSA.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass native Proben einen messbaren Anteil an [-5, -6, -7]-proPSA enthalten. Darüber hinaus konnte weiterhin überraschend beobachtet und festgestellt werden, dass diese speziellen proPSA-Formen relativ stabil sind und sogar in solch signifikanter Konzentration in den untersuchten Proben vorkommen, dass diese über Immunoassays gemessen werden können.It was surprisingly found that native samples have a measurable proportion [-5, -6, -7] -proPSA included. In addition, it was still surprisingly observed and ascertained that these special proPSA forms are relatively stable and even more significant Concentration in the examined samples occur that they are measured via immunoassays can.

Die über die erfindungsgemäßen Methoden ermittelten [-5, -6, -7]-proPSA-Werte wurden bezüglich der klinisch/diagnostischen Relevanz mit anderen aus dem Stand der Technik bekannten PSA-Assays verglichen.The [-5, -6, -7] -proPSA values determined using the methods according to the invention were compared to the clinical / diagnostic relevance with other PSA assays known from the prior art compared.

Wie eingangs erwähnt, ist eines der Hauptprobleme bei der Verwendung von PSA-Messungen in der klinischen Diagnostik der Bereich mit niedrigen, schwach erhöhten PSA-Werten. Die Unterscheidung zwischen PBH und PCa ist mit Gesamt-PSA-Werten nicht möglich. Der erfindungsgemäße Test auf spezielle Formen des proPSA liefert in diesem klinisch besonders kritischen Entscheidungsbereich, d. h. bei Gesamt-PSA-Konzentration unter 20 ng/ml (z. B. bestimmt mit Elecsys®-Test auf Gesamt-PSA der Fa. Roche Diagnostics) wichtige und diagnostisch relevante Zusatzinformationen und trägt damit zu einer besseren Unterscheidung zwischen PCa und BPH bei.As mentioned at the beginning, one of the main problems when using PSA measurements is in the clinical diagnosis of the area with low, slightly elevated PSA values. The distinction between PBH and PCa is not possible with total PSA values. The test according to the invention special forms of proPSA deliver in this clinically particularly critical decision area, i. H. at total PSA concentration below 20 ng / ml (e.g. determined with Elecsys® test for total PSA of Roche Diagnostics) important and diagnostically relevant additional information and thus contributes a better distinction between PCa and BPH.

Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist deshalb die Verwendung der [-5, -6, -7]-proPSA- Werte für diagnostische Fragestellungen im Umfeld des Prostata-Korzinoms.Another preferred embodiment of the invention is therefore the use of [-5, -6, -7] -proPSA- Values for diagnostic questions in the area of prostate corcinoma.

Mit den erfindungsgemäßen Antikörpern und den damit etablierten immunologischen Verfahren ist es erstmals möglich, Quotienten aus der Gesamtmenge an freiem PSA und [-5, -6, -7]-proPSA zu bilden. Da sich überraschend erwiesen hat, dass dieser Quotient die klinisch/diagnostische Aussage erheblich verbessert, stellt die Verwendung eines Quotienten aus freiem PSA zu [-5, -6, -7]-proPSA eine weitere besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung dar.It is with the antibodies according to the invention and the immunological processes established therewith possible for the first time to form quotients from the total amount of free PSA and [-5, -6, -7] -proPSA. There Surprisingly, it has been shown that this quotient makes a significant clinical / diagnostic statement improved, the use of a quotient from free PSA to [-5, -6, -7] -proPSA is another represents a particularly preferred embodiment of the invention.

Legend to the illustrations Fig. 1: (Pro) PSA peptides from the MALDI-TOF analysis

Das freie PSA aus einem PCa Plasma wurde mit Hilfe von Immunsorption isoliert, auf einem SDS Gel aufgetrennt und die freie PSA Bande mit Endo Lys C verdaut. 0,5 µl dieser Probe wurden auf dem MALDI Probenteller mit 0,5 mL Matrix (10 mg/ml Sinapinsäure in 0,1% TFA : Acetonitril, 7 : 3, v : v) gemischt und das Massenspektrum ermittelt. Die Bezeichnungen der Peptide oberhalb der Massenzahlen (z. B. 114-145 geben den Bereich der Aminosäuresequenz von PSA an. Das dem [M+H]⁺-Ionenpeak 1939.10 entsprechende Peptid ist das unvollständig gespaltene Peptid mit dem Aminosäurebereich 222- 237 von PSA. Die pro Sequenz des PSA reicht von der Aminosäureposition -7 bis -1.The free PSA from a PCa plasma was isolated using immunosorption, separated on an SDS gel and the free PSA band digested with Endo Lys C. 0.5 µl of this sample was mixed on the MALDI sample plate with 0.5 mL matrix (10 mg / ml sinapic acid in 0.1% TFA: acetonitrile, 7: 3, v: v) and the mass spectrum was determined. The names of the peptides above the mass numbers (e.g. 114-145 indicate the range of the amino acid sequence of PSA. The peptide corresponding to the [M + H] ⁺ ion peak 1939.10 is the incompletely cleaved peptide with the amino acid range 222-237 of PSA The per sequence of the PSA ranges from amino acid position -7 to -1.

Fig. 2: Competition test with free proPSA peptides

ProPSA aus einem PCa Plasma wurde über einen biotinylierten Antikörper gegen freies PSA an eine mit Streptavidin beschichteten Festphase gebunden. Die Bindung bzw. die Verdrängung des MAK 1.023.6 durch unterschiedlich lange proPSA-Peptide wurde ermittelt und ist in dieser Abbildung wiedergegeben.ProPSA from a PCa plasma was passed on to a person using a biotinylated antibody against free PSA Streptavidin coated solid phase bound. The binding or displacement of the MAK 1.023.6 was determined by different lengths of proPSA peptides and is shown in this figure.

Fig. 3: ROC analysis of the significance of various PSA parameters

Die Abbildung zeigt die über ROC-Analyse berechneten AUC-Werte (AUC = area under the curve). Je größer der AUC-Wert, desto besser ist ein Parameter (oder das Verhältnis von Parametern) bezüglich klinischer Genauigkeit und Aussagekraft im Hinblick auf Sensitivität und Spezifität.The figure shows the AUC values (AUC = area under the curve) calculated using ROC analysis. Each the larger the AUC value, the better a parameter (or the ratio of parameters) is in terms clinical accuracy and meaningfulness in terms of sensitivity and specificity.

The invention is described in detail below

Der Vorläufer des PSA-Moleküls ist das sogenannte prä-pro-PSA, welches aus insgesamt 261 Aminosäuren besteht. Das Signal-Peptid ist 17 Aminosäuren lang und wird im endoplasmatischen Retikulum abgespalten, sobald das prä-pro-PSA in die sekretorischen Drüsen übertritt. Das dabei entstehende enzymatisch inaktive proPSA (diese inaktive Vorstufe des PSA wird auch als Zymogen bezeichnet) wird durch Freisetzung (Abspaltung) der sieben N-terminalen Aminosäuren des Pro-Peptids in das enzymatisch aktive, "reife" PSA überführt. Diese reife, enzymatisch aktive Form hat insgesamt 237 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von ca. 29 kD.The precursor of the PSA molecule is the so-called pre-pro-PSA, which consists of a total of 261 Amino acids. The signal peptide is 17 amino acids long and is endoplasmic Split off the reticulum as soon as the pre-pro-PSA passes into the secretory glands. That included resulting enzymatically inactive proPSA (this inactive precursor of the PSA is also called a zymogen is called) by release (elimination) of the seven N-terminal amino acids of the pro-peptide transferred to the enzymatically active, "mature" PSA. This mature, enzymatically active form has a total of 237 Amino acids and a molecular weight of approx. 29 kD.

Es ist bekannt, dass das PSA, aber auch die beiden anderen Kallikreine hK1 und hK2 in der Zirkulation zum größten Teil in Form inaktiver Komplexe, d. h. gebunden an verschiedene Protease-Inhibitoren, vorliegen. Der bei weitem größte Teil ist komplexiert mit α1-Anti-Chymotrypsin.It is known that the PSA, but also the two other kallikreins hK1 and hK2 are in circulation mostly in the form of inactive complexes, i.e. H. bound to various protease inhibitors, available. The vast majority is complexed with α1-anti-chymotrypsin.

Das proPeptid des [-7]-proPSA ist 7 Aminosäuren - wie oben ausgeführt - lang. Es hat die Aminosäuresequenz Alanin-Prolin-Leucin-Isoleucin-Leucin-Serin-Arginin (APLILSR). Für hK2 lautet die proPeptid-Sequenz Valin-Prolin-Leucin-Isoleucin-Glutamin-Serin-Arginin (VPLIQSR). Die erste N- terminale Aminosäure des PSA ist ein Isoleucin. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass Antikörper mit dem erfindungsgemäßen Reaktionsspektrum, d. h. guter Bindung an die proPSA-Formen [-5], [-6] und [-7] erhalten werden können, wenn zur Immunisierung ein synthetisches Peptid, welches dem [6]-proPSA entspricht, eingesetzt wird. Das konkret verwendete Peptid enthielt zudem noch die erste Aminosäure aus dem reifen PSA. Seine Sequenz lautet somit PLILSRI. The pro-peptide of the [-7] -proPSA is 7 amino acids long, as stated above. It has that Amino acid sequence alanine-proline-leucine-isoleucine-leucine-serine-arginine (APLILSR). For hK2 that is pro peptide sequence valine-proline-leucine-isoleucine-glutamine-serine-arginine (VPLIQSR). The first- terminal amino acid of the PSA is an isoleucine. It was surprisingly found that Antibodies with the reaction spectrum according to the invention, d. H. good binding to the proPSA forms [-5], [-6] and [-7] can be obtained if a synthetic peptide which corresponds to the [6] -proPSA. The specific peptide used also contained the first Amino acid from the mature PSA. His sequence is therefore PLILSRI.

Bekanntermaßen sind kurze Peptide per se wenig oder nicht immunogen. Zum Zwecke der Immunisierung ist es deshalb meist erforderlich, dass Peptide an geeignete Trägerstrukturen, z. B. Rinderserumalbumin oder keyhole limpet hemocyanine gekoppelt werden. Gegebenenfalls wird die Immunantwort zusätzlich durch Zugabe sogenannter adjuvanter Reagenzien verstärkt. Eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sind deshalb Immunogene, die [-5, -6, -7] proPeptide des PSA enthalten. Besonders bevorzugt sind Immunogene, die durch Verwendung des Peptids der SEQ ID No: 2 erhältlich sind.It is known that short peptides per se are little or not immunogenic. For the purpose of Immunization therefore usually requires that peptides be attached to suitable support structures, e.g. B. Bovine serum albumin or keyhole limpet hemocyanine can be coupled. If necessary, the Immune response additionally enhanced by the addition of so-called adjuvant reagents. A preferred one Embodiments of the invention are therefore immunogens which contain [-5, -6, -7] proPeptides of the PSA. Immunogens which are obtainable by using the peptide of SEQ ID No: 2 are particularly preferred are.

Durch geeignete Kombination von anderen Immunogenen, wie z. B. einem [-7]-proPSA-Peptid oder von Mimetopen, z. B. des [-6]-proPSA mit den untenstehenden Screening-Kriterien können die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls erhalten werden.By a suitable combination of other immunogens, such as. B. a [-7] -proPSA peptide or of Mimetopes, e.g. B. the [-6] -proPSA with the screening criteria below can Antibodies according to the invention can also be obtained.

Ein Gegenstand der Erfindung sind somit Antikörper mit Spezifität für [-5, -6, -7]-proPSA, die mit [-4]-proPSA und kürzeren proPSA-Formen im Wesentlichen nicht reaktiv sind. Die unterschiedlichen proPSA-Formen [-7], [-6] und [-5]-proPSA werden von solchen Antikörpern effizient gebunden, während das [-4]-proPSA im Wesentlichen nicht reaktiv ist.The invention thus relates to antibodies with specificity for [-5, -6, -7] -proPSA which are associated with [-4] -proPSA and shorter proPSA forms are essentially non-reactive. The different proPSA forms [-7], [-6] and [-5] -proPSA are efficiently bound by such antibodies while the [-4] -proPSA is essentially non-reactive.

Das PLILSRI-Peptid wurde nach Standardmethoden synthetisch hergestellt (Peptide, Hans-Dieter Jakubke, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1996). Erfahrungsgemäß sind kurze Peptide als solche wenig immunogen. Zur Immunisierung wird deshalb das synthetische PLILSRI-Peptid an ein geeignetes Trägerprotein, wie z. B. Keyhole Limpet Hemocyanine, Rinderserum Albumin oder Edestin gebunden.The PLILSRI peptide was synthesized using standard methods (Peptide, Hans-Dieter Jakubke, Spektrum Verlag, Heidelberg, 1996). Experience has shown that short peptides as such are little immunogenic. For the immunization, the synthetic PLILSRI peptide is therefore attached to a suitable one Carrier protein, such as B. Keyhole Limpet Hemocyanine, bovine serum albumin or edestin bound.

Die Immunisierung erfolgt in den hierfür üblicherweise verwendeten Laboratoriumstieren, vorzugsweise werden Mäuse, Ratten, Kaninchen oder Schafe immunisiert. Zur Steigerung der Immunantwort können die üblicherweise verwendeten adjuvanten Substanzen (z. B. Freunds Adjuvants) eingesetzt werden.The immunization is preferably carried out in the laboratory animals usually used for this mice, rats, rabbits or sheep are immunized. Can increase the immune response the commonly used adjuvant substances (e.g. Freund's adjuvants) are used.

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden Milzzellen, vorzugsweise aus Mäusen, der entsprechend immunisierten Tiere, nach Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, immortalisiert. Besonders bevorzugte Verfahren sind hierbei die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495-497) oder die Transformation mit Eppstein-Barr-Virus (EBV-Transformation [Monoclonal Antibody Production Techiques and Application, Lawrence B. Schook, ed., Marcel Dekker Verlag, 1987]).To produce monoclonal antibodies, spleen cells, preferably from mice, are used appropriately immunized animals, immortalized by methods known to those skilled in the art. Hybridoma technology (Köhler and Milstein, Nature 256 (1975), 495-497) or the transformation with Eppstein-Barr virus (EBV transformation [Monoclonal Antibody Production Techiques and Application, Lawrence B. Schook, ed., Marcel Dekker Verlag, 1987]).

Die Qualität der Immunantwort schwankt stark von Tier zu Tier, sowie von Spezies zu Spezies. Aus diesem Grund ist es notwendig, geeignete Screeningverfahren einzusetzen, welche sicherstellen, dass die gewonnenen Antikörper auch die erforderlichen Eigenschaften aufweisen. The quality of the immune response varies greatly from animal to animal and from species to species. Out For this reason, it is necessary to use suitable screening methods that ensure that the obtained antibodies also have the required properties.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Herstellungsverfahren für Antikörper, welches ein geeignetes Screeningsystem umfasst. Dieses Screeningsystem stellt sicher, dass die durch obige Immunisierung gewonnenen Antikörper geeignete Bindeeigenschaften an [-5, -6, -7]-proPSA zeigen und mit [-4]-proPSA und kürzeren proPSA-Formen im Wesentlichen nicht reaktiv sind.Another object of the invention is therefore a manufacturing method for antibodies, which a suitable screening system. This screening system ensures that the above Antibodies obtained by immunization show suitable binding properties to [-5, -6, -7] -proPSA and are essentially non-reactive with [-4] -proPSA and shorter proPSA forms.

Ein besonders geeignetes Screeningsystem enthält das 7 Aminosäure lange PLILSRI-Peptid, welches besonders bevorzugt in biotinylierter Form an Streptavidin-Festphasen beschichtet ist. Alternativ kann das PSA-pro-Peptid auch an Proteine gebunden und über diese auf Festphasen adsorbiert werden. In all diesen Screeningsystemen werden besonders bevorzugt solche Varianten eingesetzt, welche sicherstellen, dass sowohl das Trägerprotein, wie auch die Kopplungschemie sich von der zur Immunogenherstellung verwendeten Einsatzstoffen unterscheiden, d. h. besonders bevorzugt werden alternative Trägerproteine und andersartige Linkerstrukturen eingesetzt.A particularly suitable screening system contains the 7 amino acid long PLILSRI peptide, which is particularly preferably coated in biotinylated form on streptavidin solid phases. Alternatively, you can the PSA-pro peptide is also bound to proteins and adsorbed onto solid phases. In all These screening systems are particularly preferably used in such variants which ensure that both the carrier protein and the coupling chemistry differ from that for immunogen production differentiate the input materials used, d. H. alternative carrier proteins are particularly preferred and different linker structures are used.

Ein weiteres besonders geeignetes Screeningsystem ist ein kompetitiver Immunoassay mit biotinyliertem PSA-[-6 bis +1]-pro-Peptid [PLILSRI-Bi] als Antigen. In diesem Testsystem wird das biotinylierte Peptid über Streptavidin an die Festphase beschichtet. Es wird dann geprüft, inwieweit andere/verkürzte Peptide aus dem pro-Peptid-Bereich des PSA in diesem Test die erfindungsgemäßen Antikörper verdrängen können. Es werden Antikörper ausgewählt, welche mit [-5, -6, -7]-proPSA reagieren, [-4]-proPSA aber im Wesentlichen nicht erkennen.Another particularly suitable screening system is a competitive immunoassay with biotinylated PSA - [- 6 to +1] -pro-peptide [PLILSRI-Bi] as an antigen. In this test system, the biotinylated peptide coated on the solid phase via streptavidin. It is then checked to what extent other / shortened peptides in this test displace the antibodies according to the invention from the pro-peptide region of the PSA can. Antibodies are selected which react with [-5, -6, -7] -proPSA, but [-4] -proPSA essentially don't recognize.

Ein alternatives Screening-System, welches in abgewandelter Form (siehe weiter unten) ebenfalls zum Nachweis von proPSA eingesetzt werden kann, ist ein sogenannter Sandwich-Test. In diesem Test werden PSA (z. B. aus Spermien) sowie proPSA und PSA aus PCa-Plasma als Antigene ausgetestet.An alternative screening system, which in a modified form (see below) also for ProPSA detection can be used is a so-called sandwich test. In this test PSA (e.g. from sperm) and proPSA and PSA from PCa plasma tested as antigens.

Die Anbindung des (pro)-PSA an die Streptavidin beschichtete Festphase erfolgt über die F(ab)- Fragmente, eines Antikörpers gegen freies PSA. Nachweisseitig werden die zu testenden neuen Antikörper gegen proPSA eingesetzt. In einem ersten Screening werden Antikörper ausgewählt, welche mit dem proPSA aus dem PCa-Serum reaktiv sind und mit dem PSA aus Sperma nicht reagieren.The (pro) -PSA is bound to the streptavidin-coated solid phase via the F (ab) - Fragments, an antibody against free PSA. The new antibodies to be tested are detected used against proPSA. In a first screening, antibodies are selected which are associated with the proPSA from the PCa serum are reactive and do not react with the PSA from sperm.

Das obige System kann weiterhin eingesetzt werden, um die erfindungsgemäßen Antikörper über geeignete Verdrängungsreaktionen herauszuselektieren. Zu diesem Zweck wird proPSA aus PCa-Serum wie oben an die Festphase gebunden. Die weitere Spezifitätsprüfung erfolgt dann wie weiter oben für Tests mit biotinyliertem proPSA-Peptid als Antigen schon beschrieben.The above system can also be used to transfer the antibodies of the invention select suitable displacement reactions. For this purpose proPSA is made from PCa serum bound to the solid phase as above. The further specificity check then takes place as above for tests already described with biotinylated proPSA peptide as antigen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Antikörper, welche im obigen Kompetitionstest eine gute Kompetition mit dem [-7]-PSA-pro-Peptid, sowie mit dem [-6]-PSA-pro-Peptid und mit dem [-5]- PSA-pro-Peptid aber im wesentlichen keine Kompetition mit dem [-4]-PSA-pro-Peptid zeigen. Unter Kompetition wird hierbei verstanden, dass die [-5, -6, -7]-proPSA-Peptide, effizient mit dem untersuchten Antikörper um die Bindung an das PLILSRI-Peptid auf der Festphase konkurrieren. Im Wesentlichen nicht reaktive Antikörper gegen [-4]-proPSA und kürzere proPSA-Sequenzen sind solche Antikörper, die im Kompetitionstest weniger als 10% der Verdrängungswirkung, besonders bevorzugt weniger als 5% und ganz besonders bevorzugt weniger als 3% der Verdrängungswirkung verglichen zum einem [-5]-proPSA-Peptid zeigen.Another object of the invention is therefore antibodies, which in the above competition test good competition with the [-7] -PSA-pro-peptide, as well as with the [-6] -PSA-pro-peptide and with the [-5] - PSA-pro-peptide but show essentially no competition with the [-4] -PSA-pro-peptide. Under Competition is understood to mean that the [-5, -6, -7] -proPSA peptides, efficiently with the investigated antibodies compete for binding to the PLILSRI peptide on the solid phase. in the Substantially non-reactive antibodies against [-4] -proPSA and shorter proPSA sequences are such Antibodies that are less than 10% of the displacement effect in the competition test, particularly preferred less than 5% and most preferably less than 3% of the displacement effect compared to show a [-5] -proPSA peptide.

Unter dem Begriff "Antikörper" sind im Sinne der Erfindung neben den intakten Immunoglobulinen auch sämtliche Antikörperfragmente zu verstehen. Hierzu gehören beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab)'₂- Fragmente. Der Begriff Antikörper ohne Zusatz "monoklonal" oder "polyklonal" umfaßt immer beide Arten von Antikörpern, sowie eventuelle chimäre Konstrukte und alle oben angeführten Fragmente.In the context of the invention, the term “antibody” is to be understood in addition to the intact immunoglobulins as well as all antibody fragments. These include, for example, Fab, Fab 'or F (ab)' ₂ fragments. The term antibody without the addition "monoclonal" or "polyclonal" always encompasses both types of antibodies, as well as any chimeric constructs and all the fragments mentioned above.

Unter Antikörpern, die im Wesentlichen gleiche Bindeeigenschaften zeigen, werden solche Antikörper verstanden, die mit dem am 16. Mai 2000 unter ACC 2456 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismus und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, hinterlegten Klon um die Bindung an [-5, -6, -7]-proPSA immunologisch konkurrieren.Antibodies that show essentially the same binding properties are such antibodies understood that with the on May 16, 2000 under ACC 2456 at the German Collection for Microorganism and cell cultures (DSMZ), Braunschweig, deposited clones for binding [-5, -6, -7] -proPSA compete immunologically.

Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sind Antikörper, welche im Wesentlichen die gleichen Bindeeigenschaften aufweisen, wie der unter ACC 2456 bei der DSMZ hinterlegte Klon.A particularly preferred embodiment of the invention is antibodies, which essentially are have the same binding properties as the clone deposited under ACC 2456 with the DSMZ.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können eingesetzt werden, um [-5, -6, -7]-proPSA spezifisch nachzuweisen. Besonders bevorzugt sind hierbei immunologische Verfahren, welche auf dem Kompetitionsprinzip oder dem sogenannten "Sandwich-Prinzip" beruhen. Die vielfältigen Ausgestaltungsmöglichkeiten für Immunoassays sind dem Fachmann bekannt, so dass hier auf eine detaillierte Schilderung verzichtet werden kann.The antibodies of the invention can be used to specifically target [-5, -6, -7] -proPSA to prove. Immunological methods which are based on the Principle of competition or the so-called "sandwich principle". The diverse Design options for immunoassays are known to the person skilled in the art, so that here one detailed description can be omitted.

Ein weiteren Gegenstand der Erfindung sind daher immunologische Testverfahren, welche zur Quantifizierung/zum Nachweis des [-5, -6, -7]-proPSA aus einer Probe geeignet sind.The invention therefore furthermore relates to immunological test methods which are used for Quantification / for the detection of [-5, -6, -7] -proPSA from a sample are suitable.

Als Proben können erfindungsgemäß alle dem Fachmann geläufigen biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Bevorzugt werden als Probe Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Blutserum, Blutplasma oder Urin eingesetzt.According to the invention, all biological liquids familiar to the person skilled in the art can be used as samples become. Body fluids such as whole blood, blood serum, blood plasma or urine are preferred as samples used.

Besonders bevorzugt wird das [-5, -6, -7]-proPSA in einem Sandwich-Test nachgewiesen. Als besonders vorteilhaft hat sich dabei erwiesen, den spezifischen Antikörper gegen [-5, -6, -7]-proPSA als spezifischen Fangantikörper einzusetzen. Unter spezifisch wird hierbei verstanden, dass der Fangantikörper die im Screeningteil beschriebenen Spezifitätsanforderungen erfüllt. The [-5, -6, -7] -proPSA is particularly preferably detected in a sandwich test. As special It has proven advantageous to use the specific antibody against [-5, -6, -7] -proPSA as specific Use capture antibodies. Specific is understood here to mean that the capture antibody Screening part described specificity requirements met.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von Antikörpern gegen [-5, -6, -7]- proPSA in Immunoassays zum Nachweis dieser Moleküle.Another object of the invention is therefore the use of antibodies against [-5, -6, -7] - proPSA in immunoassays for the detection of these molecules.

Es hat sich ferner als besonders vorteilhaft erwiesen, beim Nachweis des [-5, -6, -7]-proPSA nachweisseitig einen Antikörper einzusetzen, welcher seinerseits spezifisch mit dem sogenannten freien PSA reagiert. Unter einem Antikörper mit Spezifität für freies PSA ist dabei zu verstehen, dass ein solcher Antikörper PSA-Moleküle, welche mit dem α1-Anti-Chymotrypsin (ACT) komplexiert sind, nicht erkennt.It has also proven to be particularly advantageous to detect the [-5, -6, -7] -proPSA on the detection side to use an antibody, which in turn reacts specifically with the so-called free PSA. An antibody with specificity for free PSA means that such an antibody PSA molecules that are complexed with the α1-anti-chymotrypsin (ACT) are not recognized.

Der Spiegel an [-5, -6, -7]-proPSA erwies sich als gut meßbar. Mit Hilfe des obigen Testsystems wurden deshalb kritische Humanseren, d. h. Humanseren mit ca. 4 bis ca. 10 ng/ml Gesamt-PSA untersucht. Eine Analyse der Meßwerte ergab, dass [-5, -6, -7]-proPSA-Werte wertvolle Zusatzinformationen im klinisch relevanten und kritischen Entscheidungsbereich liefern. Die (-5, -6, -7)-proPSA-Werte können herangezogen werden, um das Vorhandensein eines Prostata-Karzinoms zu diagnostizieren bzw. auszuschließen.The level of [-5, -6, -7] -proPSA turned out to be well measurable. Using the above test system therefore critical human sera, i.e. H. Human sera with approx. 4 to approx. 10 ng / ml total PSA were examined. A Analysis of the measured values showed that [-5, -6, -7] -proPSA values provide valuable additional information in clinical deliver relevant and critical decision area. The (-5, -6, -7) proPSA values can be used to diagnose the presence of prostate carcinoma or to exclude.

Wie eingangs schon erwähnt, ist ein deutlich erhöhter PSA-Wert von <20 ng/ml von sehr hoher klinischer/diagnostischer Aussagekraft. Ein solcher Wert ist ein vergleichsweise sicheres diagnostisches Indiz für das Vorliegen eines PCa. Für Werte unter 20 ng/ml läßt die Aussagekraft stark nach. Ein Wert unter 10 ng/ml kann ebensogut durch BPH, wie durch ein PCa bedingt sein. Gerade in diesem Bereich wäre es jedoch besonders wichtig, eine gutartige Prostatahyperplasie von einem PCa im Frühstadium zu unterscheiden.As already mentioned at the beginning, a significantly increased PSA value of <20 ng / ml is very high clinical / diagnostic significance. Such a value is a comparatively safe diagnostic Indication of the presence of a PCa. For values below 20 ng / ml, the informative value drops significantly. A value below 10 ng / ml can be caused by BPH as well as by PCa. Especially in this area however, it would be particularly important to treat benign prostatic hyperplasia from early-stage PCa differentiate.

Einschlußkriterium für die ausgewählten Seren waren ein PSA (total)-Wert von 4-10 ng/ml, welcher mit den entsprechenden Elecsys®-Test der Firma Roche Diagnostics ermittelt worden war. Neben PSA (total) wurde freies PSA (ebenfalls mit dem entsprechenden Elecsys©-Test von Roche Diagnostics) bestimmt.Inclusion criteria for the selected sera were a PSA (total) value of 4-10 ng / ml, which with the corresponding Elecsys® test from Roche Diagnostics had been determined. In addition to PSA (total) free PSA was determined (also with the corresponding Elecsys © test from Roche Diagnostics).

Im klinisch besonders relevanten Bereich (4-10 ng/ml) wurde die Aussagekraft der getesteten PSA- Marker einzeln und im Verhältnis zueinander über sogenannte ROC-Analysen untersucht.In the clinically particularly relevant range (4-10 ng / ml), the meaningfulness of the tested PSA Markers examined individually and in relation to each other using so-called ROC analyzes.

Unter einer ROC-Analyse (ROC = receiver operator curve) versteht man die Berechnung und Erstellung eines sogenannten Sensitivitäts-Spezifizitäts-Diagramms. Ein Test mit einer guten diagnostischen Trennschärfe zeichnet sich durch einen möglichst großen AUC-Wert (AUC = area under the curve) aus. Je höher dieser Wert, desto besser die Leiitungsmerkmale des bewerteten Tests bezüglich seiner Spezifität und Sensitivität.A ROC analysis (ROC = receiver operator curve) means the calculation and creation a so-called sensitivity-specificity diagram. A test with a good diagnostic Selectivity is characterized by the largest possible AUC value (AUC = area under the curve). The higher this value, the better the performance characteristics of the evaluated test with regard to its specificity and sensitivity.

Das Verhältnis von [-5, -6, -7]-proPSA zu freiem PSA konnte aufgrund des neu entwickelten Immunoassays erstmals gebildet und ausgewertet werden. Erstaunlicherweise hat sich dieses Verhältnis in den durchgeführten ROC-Analysen als besonders aussagekräftig erwiesen, d. h. mit dem Verhältnis von [-5, -6, -7]-proPSA zu freiem PSA ist eine bessere Differenzierung zwischen PHB und PCa möglich, als mit den aus dem Stand der Technik bekannten Parametern. Dieser Vorteil wird bei Betrachtung von Abb. 3 offenkundig.The ratio of [-5, -6, -7] -proPSA to free PSA could be established and evaluated for the first time due to the newly developed immunoassay. Surprisingly, this ratio has proven to be particularly meaningful in the ROC analyzes carried out, ie with the ratio of [-5, -6, -7] -proPSA to free PSA a better differentiation between PHB and PCa is possible than with the parameters known in the prior art. This advantage is evident when looking at Fig. 3.

Eine weitere bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ist daher die vertiefende Analyse von kritischen PSA-Seren, d. h. von Seren mit einem Gesamt-PSA unter ca. 20 ng/ml, besonders bevorzugt mit einer PSA von 2-15 ng/ml und insbesondere von 4-10 ng/ml durch Auswertung des Quotienten von [-5, -6, -7]- proPSA zu freiem PSA oder des inversen Quotienten.Another preferred embodiment of the invention is therefore the in-depth analysis of critical PSA sera, i.e. H. of sera with a total PSA below approx. 20 ng / ml, particularly preferably with a PSA 2-15 ng / ml and especially 4-10 ng / ml by evaluating the quotient of [-5, -6, -7] - proPSA to free PSA or the inverse quotient.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können zudem eingesetzt werden, um die drei verschiedenen proPSA-Formen [-5]-proPSA, [6]-proPSA und/oder [-7]-proPSA einzeln zu bestimmen. Zu diesem Zweck wird ein erfindungsgemäßer Antikörper eingesetzt, um die [-5], [-6] und [-7]-proPSA-Moleküle aus der Probe anzureichern und diese einer weiteren Analyse zugänglich zu machen. Besonders bevorzugt erfolgt die Anreicherung über Immunaffinitätschromatographie oder selektive Immunsorption und der Einzelnachweis der obigen drei proPSA-Formen über massenspektrometrische (MS) Verfahren.The antibodies of the invention can also be used to the three different proPSA forms [-5] -proPSA, [6] -proPSA and / or [-7] -proPSA to be determined individually. To this For this purpose, an antibody according to the invention is used to detect the [-5], [-6] and [-7] proPSA molecules enrich from the sample and make it available for further analysis. Particularly preferred Enrichment takes place via immunoaffinity chromatography or selective immunosorption and Detection of the above three forms of proPSA using mass spectrometric (MS) methods.

Während das erfindungsgemäße immunologische Verfahren die drei proPSA Formen [-5, -6, -7] als Summe erfaßt, ist es über die MS möglich, die drei proPSA Formen einzeln zu quantifizieren.While the immunological method according to the invention the three proPSA forms [-5, -6, -7] as Summed up, it is possible to quantify the three proPSA forms individually via the MS.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die separate Quantifizierung von [-5], [-6] und [-7]- proPSA und die Verwendung dieser Einzelwerte zur Diagnose oder zum Ausschluß eines Prostata Karzinoms.Another object of the invention is therefore the separate quantification of [-5], [-6] and [-7] - proPSA and the use of these individual values for diagnosis or to exclude a prostate Carcinoma.

Die erfindungsgemäßen Antikörper reagieren ebenfalls mit dem [-6]-prohK2, mit der Aminosäuresequenz Prolin-Leucin-Isoleucin-Glutamin-Serin-Arginin (PLIQSR). In Analogie zu den oben beschriebenen Nachweisverfahren und Analyse kann mit den erfindungsgemäßen Antikörpern auch prohK2 bestimmt und zur Diagnose herangezogen werden.The antibodies according to the invention also react with the [-6] -prohK2 with which Amino acid sequence proline-leucine-isoleucine-glutamine-serine-arginine (PLIQSR). In analogy to the Detection methods and analysis described above can also with the antibodies of the invention prohK2 determined and used for diagnosis.

Die Menge an den drei proPSA-Formen [-5], [-6] und [-7] kann zudem mit den zugrundeliegenden Erkrankungen und Verläufen verglichen werden, um damit ein aggressiver Krankheitsverlauf von einem eher langsamen Krankheitsverlauf zu unterscheiden.The amount of the three proPSA forms [-5], [-6] and [-7] can also be compared with the underlying Diseases and courses are compared to make an aggressive course of illness of one to distinguish rather slow course of the disease.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter: The following examples further illustrate the invention:

example 1 Individual detection of different forms of proPSA using mass spectroscopy a) Isolation of free PSA from a PCa serum by immunosorption

Zu 28.7 mg magnetischen Streptavidinbeads wurden in einem 10 ml Röhrchen 4 ml einer Lösung des Antikörpers MAK<PSA<-M-30-IgG-Biotin (c = 25 µg/ml) in PBS pH 7 +1% RSA + 0.1% Tween20 gegeben und für eine Stunde inkubiert. Die Beads wurden anschließend durch einen Magneten präzipitiert, der Überstand abpipettiert und die Beads dreimal mit jeweils 3 ml Waschlösung (PBS pH 7 + 20 mM Octylglucosid) gewaschen. Nach Zugabe von 8 ml Plasma (Gehalt an freiem PSA: 180 ng/ml) wurde wieder für 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Plasma wurde dann abpipettiert und die Beads 4 × mit je 1 ml Waschlösung gewaschen. Anschließend wurden die Beads mit 500 µl Propionsäure 1 M versetzt und die Suspension wieder für eine Stunde geschüttelt. Der Überstand wurde nach Präzipitation der Beads abgenommen, lyophilisiert und dann in 10 µl Aqua dest. aufgenommen. PSA aus Spermien wurde von der Fa. Scripps Laboratories, San Diego, bezogen.To 28.7 mg of magnetic streptavidin beads were added 4 ml of a solution of the in a 10 ml tube Antibody MAK <PSA <-M-30-IgG-Biotin (c = 25 µg / ml) in PBS pH 7 + 1% RSA + 0.1% Tween20 given and incubated for one hour. The beads were then removed using a magnet precipitated, the supernatant pipetted off and the beads three times with 3 ml of washing solution (PBS pH 7 + 20 mM octyl glucoside). After adding 8 ml plasma (content of free PSA: 180 ng / ml) was incubated again for 60 min at room temperature. The plasma was then pipetted off and the beads washed 4 × with 1 ml of washing solution. Then the beads mixed with 500 ul propionic acid 1 M and the suspension shaken again for one hour. The After the beads had been precipitated, the supernatant was removed, lyophilized and then in 10 μl of aqua least added. Sperm PSA was obtained from Scripps Laboratories, San Diego.

b) Identification of free proPSA forms by matrix assisted laser desorption-time of flight Mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Ein erster Hinweis, dass das immunsorptiv gereinigte, freie PSA aus dem Plasma sich in seiner Größe von dem aus Sperma unterscheidet zeigte sich in der MALDI-TOF MS. Dort wurde festgestellt, dass das freie PSA aus dem PCa Plasma mit 29 100 Da ein um ca. 600 da höheres Molekulargewicht zeigte als freies PSA aus Sperma (28 500 Da).A first indication that the immunosorptively purified, free PSA from the plasma is in its size from that from sperm showed up in the MALDI-TOF MS. It was found there that the free PSA from the PCa plasma with 29 100 Da showed a molecular weight that was about 600 da higher as free PSA from sperm (28,500 Da).

Nach Auftrennung des freien PSA aus PCa-Plasma und Sperma durch SDS-PAGE, reduktiver Alkylierung der Banden und Verdau mit Endoprotease Lys-C ergaben sich die in Abb. 1 gezeigten Peptidmuster. Zur Verdeutlichung sind die aus den jeweiligen PSA Formen nachgewiesenen Peptide in Tabelle 1 zusammengefaßt.After separation of the free PSA from PCa plasma and sperm by SDS-PAGE, reductive alkylation of the bands and digestion with endoprotease Lys-C, the peptide pattern shown in Fig. 1 resulted. For clarification, the peptides detected from the respective PSA forms are summarized in Table 1.

Tabelle 1 Table 1

(proPSA-) Peptide aus der MALDI-TOF-Analyse (proPSA) peptides from the MALDI-TOF analysis

Wie aus Abb. 1 sowie Tabelle 1 zu erkennen ist, enthält freies PSA aus PCa-Plasma, vier Peptide, die in PSA aus Sperma nicht vorhanden sind. Es handelt sich dabei um Peptide, die um 2, 4, 5 oder 7 Aminosäuren am N-Terminus des PSA verlängert sind und somit proPSA Formen darstellen.As can be seen from Fig. 1 and Table 1, free PSA from PCa plasma contains four peptides that are not present in PSA from sperm. These are peptides that are extended by 2, 4, 5 or 7 amino acids at the N-terminus of the PSA and thus represent proPSA forms.

Example 2 Production of monoclonal antibodies (MAK) against proPSA a) Immunization of mice

12 Wochen alte, weibliche Balb/C Mäuse wurden mit 100 µg des Peptids P-L-I-L-S-R-I-C (im weiteren als proPSA Peptid bezeichnet), welches an dem Cystein über einen Spacer an KLH (keyhole limpet hemocyanine) gekoppelt war, zusammen mit dem Adjuvans CFA (Komplettes Freund'sches Adjuvans) intraperitoneal erststimuliert. Nach 6 Wochen und danach in monatlichem Abstand, folgten drei weitere Immunisierungen intraperitoneal. Dabei wurde jeder Maus 100 µg des obigen Immunogens zusammen mit IFA (Inkomplettes Freund'sches Adjuvans) verabreicht. Anschließend erfolgten die letzten Immunisierungen intravenös mit je 100 µg des Immunogens in PBS-Puffer am 3. und 2. und letzten Tag vor der Fusion.12-week-old female Balb / C mice were treated with 100 μg of the peptide P-L-I-L-S-R-I-C (hereinafter referred to as proPSA peptide), which is attached to the cysteine via a spacer at KLH (keyhole limpet hemocyanine) was coupled, together with the adjuvant CFA (Complete Freund's Adjuvant) First stimulated intraperitoneally. After 6 weeks and then at monthly intervals, three more followed Intraperitoneal immunizations. Each mouse was put together 100 µg of the above immunogen administered with IFA (Freund's Incomplete Adjuvant). Then the last ones followed Intravenous immunizations with 100 µg of the immunogen in PBS buffer on the 3rd and 2nd and last day before the merger.

b) Fusion and cloning

Die Fusion von Milzzellen der gemäß a) immunisierten Mäuse mit Myelomzellen erfolgt in Anlehnung an Galfré, Methods in Enzymology 73, 1981, 3. Dabei werden ca. 1 × 10⁸ Milzzellen der immunisierten Maus mit 2 × 10⁷ Myelomzellen (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580) gemischt und abzentrifugiert (10 min bei 300 g und 4°C). Die Zellen werden dann einmal mit RPMI-1640-Medium ohne fötalem Kälberserum (FKS) gewaschen und bei 400 g in einem 50 ml Spitzröhrchen erneut abzentrifugiert, 1 ml PEG (Polyethylenglykol) (Molekulargewicht 4000, Merck, Darmstadt) dazugegeben, und durch Pipettieren gemischt. Nach 1 min im Wasserbad bei 37°C werden 5 ml RPMI 1640 ohne FKS zugetropft, durchmischt, auf 50 ml mit Medium (RPMI 1640 + 10% FKS) aufgefüllt und anschließend zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS aufgenommen und in Hypoxanthin-Azaserin-Selektions-Medium (100 mmol/l Hypoxanthin, 1 µg/ml Azaserin in RPMI 1640 + 10% FKS) eingesät. Als Wachstumsfaktor wird dem Medium Interleukin 6 (100 U/ml) zugegeben. Nach ca. 10 Tagen wurden die Primärkulturen auf spezifische Antikörpersynthese getestet.The fusion of spleen cells of the mice immunized according to a) with myeloma cells takes place in accordance with Galfré, Methods in Enzymology 73, 1981, 3. Thereby approx. 1 × 10 ⁸ spleen cells of the immunized mouse with 2 × 10 ⁷ myeloma cells (P3X63-Ag8- 653, ATCC CRL 1580) and centrifuged (10 min at 300 g and 4 ° C). The cells are then washed once with RPMI-1640 medium without fetal calf serum (FKS) and centrifuged again at 400 g in a 50 ml pointed tube, 1 ml of PEG (polyethylene glycol) (molecular weight 4000, Merck, Darmstadt) are added and mixed by pipetting . After 1 min in a water bath at 37 ° C., 5 ml of RPMI 1640 without FCS are added dropwise, mixed, made up to 50 ml with medium (RPMI 1640 + 10% FCS) and then centrifuged. The sedimented cells are taken up in RPMI 1640 medium with 10% FCS and sown in hypoxanthine-azaserine selection medium (100 mmol / l hypoxanthine, 1 µg / ml azaserine in RPMI 1640 + 10% FCS). Interleukin 6 (100 U / ml) is added to the medium as the growth factor. After approximately 10 days, the primary cultures were tested for specific antibody synthesis.

c) Screening test for anti-proPSA peptide antibodies

Für das Screening der Mausseren, der Primärkulturen sowie der klonierten MAKs wurden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 1 µg/ml biotinyliertem proPSA Peptid in PBS plus 0,5% Crotein C beschichtet (100 µl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 × mit 0,9% NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen. Das proPSA Peptid (PLILSRIC-Bi) war in diesem Konjugat mit einem anderen Spacer mit dem Biotin verbunden, als er bei dem oben beschriebenen Immunogen zur Immunisierung der Mäuse verwendet worden war, um Spacer spezifische Antikörper zu vermeiden. Danach wurden 100 µl der zu untersuchenden Antikörper-Lösung in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wurde zum Nachweis von gebundenem Antikörper aus der Probe jeweils 100 µl eines POD-markierten Fab-Fragments eines polyklonalen Antikörpers aus dem Schaf gegen Maus-Fcy (Roche Diagnostics GmbH, Ident.-Nr. 1431323, entsprechend 25 mU/ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 × mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween® 20 gewaschen.For the screening of the mouse sera, the primary cultures and the cloned MAKs with recombinant streptavidin coated MTP (from MicroCoat, Penzberg, order no. 12-K 96 N, Batch MC 289) coated with 1 µg / ml biotinylated proPSA peptide in PBS plus 0.5% Crotein C. (100 µl per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then 3 times with 0.9% NaCl / 0.05% Tween 20 washed. The proPSA peptide (PLILSRIC-Bi) was in this conjugate connected to the biotin with a different spacer than that of the immunogen described above was used to immunize the mice to produce spacer specific antibodies avoid. Then 100 .mu.l of the antibody solution to be examined was coated well and incubated for 1 hour at room temperature with shaking. After washing 3 times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween 20 was used to detect bound antibody 100 µl of a POD-labeled Fab fragment of a polyclonal antibody from the sample the sheep against mouse Fcy (Roche Diagnostics GmbH, ID number 1431323, corresponding to 25 mU / ml) added, incubated for 1 hour at room temperature with shaking and then 3 times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween® 20 washed.

Schließlich wurden jeweils 100 µl/well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.Finally, 100 µl / well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, cat. No. 1204521 and 1204530) and after 30 min at room temperature the extinction at 405/492 nm in one MR700 microplate reader from Dynatech measured.

d) Test of mouse sera and culture supernatants for detection of proPSA in PCa sera

Für das Screening der Mausseren, der Primärkulturen sowie der klonierten MAKs auf Reaktion mit proPSA-Formen in PCa-Serum wurden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, Best.-Nr. 12-K 96 N, Charge MC 289) mit 1 µg/ml biotinyliertem Fab Fragment des monklonalen Antikörpers M-30, der nur freies PSA erkennt, in PBS plus 0,5% Crotein C beschichtet (100 µl pro well, 10 min Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln) und anschließend 3 × mit 0,9% NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen. Danach wird mit 100 µl des unverdünnten oder 1 : 10 mit PBS verdünnten PCa-Serums für 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 100 µl der zu untersuchenden Antikörper- Lösung in ein beschichtetes well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wurde zum Nachweis von gebundenem Antikörper aus der Probe jeweils 100 µl eines POD-markierten Fab- Fragments eines polyklonalen Antikörpers aus dem Schafgegen Maus-Fcy (Roche Diagnostics GmbH, Ident.-Nr. 1431323, ensprechend 25 mU/ml) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 × mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween® 20 gewaschen.For the screening of the mouse sera, the primary cultures and the cloned MAKs for reaction with proPSA forms in PCa serum were coated with recombinant streptavidin MTP (Fa. MicroCoat, Penzberg, order no. 12-K 96 N, batch MC 289) with 1 µg / ml biotinylated Fab Fragment of the monclonal antibody M-30, which only recognizes free PSA, in PBS plus 0.5% crotein C coated (100 µl per well, 10 min incubation at room temperature with shaking) and then washed 3 × with 0.9% NaCl / 0.05% Tween 20. Then with 100 ul of undiluted or 1:10 diluted with PBS PCa serum for 1 h while shaking Incubated at room temperature. In the next step, 100 µl of the antibody to be examined Place the solution in a coated well and shake for 1 hour at room temperature incubated. After washing 3 times with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween 20, the Detection of bound antibody from the sample 100 µl each of a POD-labeled Fab Fragments of a sheep polyclonal antibody to mouse Fcy (Roche Diagnostics GmbH, ID number 1431323, corresponding to 25 mU / ml) added, 1 hour at room temperature incubated with shaking and then 3 × with 0.9% sodium chloride / 0.05% Tween® 20 washed.

Schließlich wurden jeweils 100 µl/well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1204521 und 1204530) zugegeben und nach 20 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen. Als Kontrolle wurde PSA-freies Frauenserum eingesetzt.Finally, 100 µl / well ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, cat. No. 1204521 and 1204530) and after 20 min at room temperature the extinction at 405/492 nm in one MR700 microplate reader from Dynatech measured. As a control, it became PSA-free Women's serum used.

Zur Überprüfung, dass die hergestellten Antikörper keine Reaktion mit freiem PSA aus Sperma zeigten, wurde als Antigen anstatt des PCa-Serums, freies PSA der Fa. Scripps, San Diego, Kat. Nr. P 0714, Charge 98 43 649, 1 µg/ml, gelöst in PBS plus 0,5% Crotein C, eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.To check that the antibodies produced do not react with free PSA from sperm showed, as the antigen instead of the PCa serum, free PSA from Scripps, San Diego, Cat. No. P 0714, batch 98 43 649, 1 µg / ml, dissolved in PBS plus 0.5% Crotein C, was used. The results are summarized in Table 2.

Tabelle 2 Table 2

Reaktion eines hochtitrigen PSA-haltigen PCa-Serums mit Seren von Mäusen, die mit proPSA- Peptid-Immunogen immunisiert worden waren, im Vergleich zu einem Nullserum Reaction of a high-titer PSA-containing PCa serum with sera from mice which had been immunized with proPSA peptide immunogen compared to a zero serum

Ergebnisse [mE] Results [mE]

Das Ergebnis zeigt zum einen, dass die meisten der untersuchten Seren aus gemäß 1a immunisierten Mäusen spezifisch mit dem PSA-haltigen PCa-Serum reagieren. Da sie zum anderen nicht mit freiem PSA aus Sperma, welches einen normalen N-Terminus des reifen PSA besitzt, reagieren, belegen diese Resultate zudem, dass in diesem PCa-Serum proPSA-Formen vorliegen müssen.The result shows, on the one hand, that most of the sera examined immunized from according to 1a Mice react specifically with the PSA-containing PCa serum. On the other hand, they do not have free PPE from sperm, which has a normal N-terminus of the mature PSA, react Results also show that proPSA forms must be present in this PCa serum.

Primärkulturen wurden in analoger Weise getestet und Kulturen, die mit proPSA Peptid sowie dem proPSA-haltigem Serum eine positive Reaktion zeigten aber mit (Sperma-) PSA keine Reaktion aufwiesen, wurden mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsorter in 96er-Zellkulturplatten kloniert. Hierbei wurde dem Medium als Wachstumszusatz Interleukin-6 (100 U/l) zugegeben. Auf diese Weise wurden die Klone der Tabelle 3 erhalten:Primary cultures were tested in an analogous manner, and cultures containing the proPSA peptide and the proPSA-containing serum showed a positive reaction but showed no reaction with (sperm) PSA, were cloned into 96-cell culture plates using a fluorescence-activated cell sorter. Here, the Medium Interleukin-6 (100 U / l) added as growth additive. In this way, the clones of the Get Table 3:

Tabelle 3 Table 3

Klone mit Reaktivität gegen pro-PSA Clones with reactivity to pro-PSA

e) Obtaining immunoglobulin from mouse ascites

Die erhaltenen Hybridomzellen wurden in einem Standardverfahren zur Produktion von IgG durch Ascitesbildung bei Mäusen eingesetzt. Die Reinigung dieser Antikörper aus dem Ascites erfolgte nach proteinchemisch üblichen Methoden (z. B. gemäß Methods in Enzymology 121 (1986), 587-695).The hybridoma cells obtained were screened in a standard IgG production process Ascites formation used in mice. These antibodies were purified from the ascites after Methods customary in protein chemistry (e.g. according to Methods in Enzymology 121 (1986), 587-695).

Example 3 Specificity test for [-5, -6, -7] proPSA

Wie im Beispiel 1d) beschrieben, wurde proPSA aus PCa-Serum in mit Streptavidin vorbeschichteten Näpfen von Mikrotiterplatten gebunden. Anschließend wurden die anti-proPSA-Antikörper zusammen mit den unterschiedlich langen proPSA-Peptiden für 1 Stunde gemeinsam inkubiert. Die zugesetzten freien Peptide können in diesem Schritt mit proPSA aus dem PCa-Serum auf der Festphase um die Bindung an die Antikörper konkurrieren. Peptide, welche gut erkannt werden, führen zu einer Verdrängungsreaktion und damit letztendlich zu einer Signalerniedrigung, weil weniger spezifische Antikörper und damit auch weniger Nachweisantikörper gebunden wurden. Wie aus Abb. 2 hervorgeht, führen nur die Peptide [-6]-proPSA und [-5]-proPSA zu einer starken Verdrängungsreaktion. Das [-7)-proPSA wurde in diesem Experiment nicht mitgeführt. In anderen Experimenten zeigte das [-7]-proPSA-Peptid eine ähnlich gute Kompetition, wie das [-5] oder das [-6]-proPSA-Peptid.As described in Example 1d), proPSA from PCa serum was bound in wells of microtiter plates precoated with streptavidin. The anti-proPSA antibodies were then incubated together with the different lengths of proPSA peptides for 1 hour. In this step, the added free peptides can compete with proPSA from the PCa serum on the solid phase for binding to the antibodies. Peptides that are well recognized lead to a displacement reaction and thus ultimately to a signal reduction, because less specific antibodies and therefore fewer detection antibodies were bound. As can be seen in Fig. 2, only the peptides [-6] -proPSA and [-5] -proPSA lead to a strong displacement reaction. The [-7) -proPSA was not included in this experiment. In other experiments, the [-7] -proPSA peptide showed a similarly good competition as the [-5] or the [-6] -proPSA peptide.

Example 4 Detection of [-5, -6, -7) -proPSA in the ELISA

Der Nachweis von [-5, -6, -7]-proPSA erfolgte in einem sogenannten Sandwich-ELISA mit dem proPSA- MAK als Fangantikörper und einem POD-markierten MAK gegen freies PSA als Nachweisreagenz. Der MAK 1.023.6 wurde über Standardverfahren biotinyliert und in einer Konzentration von 2,5 µg /ml eingesetzt. Dieser Test erfolgte analog zum EnzymunR-Test auf freies PSA, mit dem wichtigen Unterschied, dass als Fangreagenz der erfindungsgemäße (biotinylierte) MAK 1.023.6 eingesetzt wurde.[-5, -6, -7] -proPSA was detected in a so-called sandwich ELISA with the proPSA- MAK as capture antibody and a POD-labeled MAK against free PSA as detection reagent. The MAK 1.023.6 was biotinylated using standard methods and in a concentration of 2.5 µg / ml used. This test was carried out analogously to the EnzymunR test for free PSA, with the important one Difference that the (biotinylated) MAK 1.023.6 according to the invention was used as capture reagent.

Example 5 ROC analyzes with different PSA fractions

In insgesamt 41 Proben mit einem Gesamt-PSA-Wert zwischen 4-10 ng/ml, aber hinsichtlich BPH, bzw. PCa abgesicherter Diagnose, wurden die Parameter freies PSA und gesamt-PSA mit dem automatischen Immunanalyzer ELECSYS® (Roche Diagnostics), und proPSA entsprechend Beispiel 4 bestimmt. Die Quotienten aus freiem PSA zu gesamt-PSA, proPSA zu gesamt-PSA und freiem PSA zu proPSA wurden errechnet und ebenso wie die Einzelparameter einer ROC-Analyse unterworfen. Wie aus Abb. 3 klar hervorgeht, ergibt sich für das Verhältnis von freiem PSA zu proPSA der größte AUC-Wert. Somit trägt dieser "Parameter" wesentlich besser zur Unterscheidung zwischen BPH und PCa bei als die beiden anderen Relativwerte oder die jeweiligen Einzelwerte. In a total of 41 samples with a total PSA value between 4-10 ng / ml, but with regard to diagnosis of BPH or PCa, the parameters free PSA and total PSA were determined using the automatic immunoanalyzer ELECSYS® (Roche Diagnostics), and proPSA determined according to Example 4. The quotients from free PSA to total PSA, proPSA to total PSA and free PSA to proPSA were calculated and, like the individual parameters, subjected to an ROC analysis. As clearly shown in Fig. 3, the ratio of free PSA to proPSA is the greatest AUC value. This "parameter" thus contributes much better to the distinction between BPH and PCa than the other two relative values or the respective individual values.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Antibodies with specificity for [-5, -6, -7] proPSA, characterized in that these antibodies are essentially non-reactive with [-4] -proPSA and shorter forms of proPSA.

2. Antibody according to claim 1, characterized in that these antibodies are monoclonal antibodies.

3. Antibody according to claim 1 or 2, characterized in that these are antibodies which have essentially the same binding properties have, such as monoclonal antibodies, which of the deposited under ACC 2456 at the DSMZ Clone to be secreted.

4. Method of producing antibodies against [-5, -6, -7] proPSA using synthetic carrier-bound peptides which correspond to the proPeptide sequence of [-5], [-6] and / or Correspond to [-7] proPSA, characterized in that Antibodies which are essentially non-reactive are obtained via the screening process with [-4] proPSA or shorter forms of proPSA.

5. Method for the detection of [-5, -6, -7] -proPSA in a sample, characterized in that a specific antibody according to any one of claims 1-3 is used for detection.

6. Method according to claim 5, characterized in that an antibody according to claims 1-3 is used as a specific capture antibody.

7. Method according to one of claims 5 or 6, characterized in that a capture antibody with specificity for (-5, -6, -7] -proPSA, and a detection antibody with specificity is used for free PPE.

8. Method according to one of claims 5, 6, 7, characterized in that the specific capture antibody is biotinylated.

9. Diagnostic test composition for the detection of [-5, -6, -7] -proPSA which antibodies with specificity for [-5, -6, -7] -proPSA, which essentially not with shorter ones proPSA forms are reactive.

10. a method for the detection or exclusion of prostate carcinoma in a sample, characterized in that [-5, -6, -7] -proPSA is determined.

11. Procedure for the detection or exclusion of prostate carcinoma in a sample, characterized in that [-5, -6, -7] -proPSA determined and to other kallikrein fractions or to the total amount of one or several kallikreins are put in relation.

12. The method according to claim 11, characterized in that that is Kallikrein PSA.

13. method for the detection or exclusion of prostate carcinoma in a sample, characterized in that a quotient of proPSA and free PSA is formed.

14. A method for detecting or excluding a prostate carcinoma according to claim 12. characterized in that is determined as proPSA [-5, -6, -7] -proPSA.

15. Procedure for the detection or exclusion of prostate carcinoma, characterized in that [-5, -6, -7] -proPSA purified using the antibodies according to claims 1-3 and each of these three proPSA forms is quantified individually.

16. Use of antibodies according to one of claims 1-3 in a test to detect or exclude prostate carcinoma.

17. Peptide-containing immunogen for the production of antibodies against [-5, -6, -7) -proPSA, characterized in that the synthetic peptide of SEQ ID No: 1; 2 and / or 3 is used.

18. peptide-containing immunogen according to claim 17, characterized in that the peptide of SEQ ID No: 2 is used.