DE10025384A1 - Quantitative measurement of molecular volumes in complex mixtures - Google Patents

Quantitative measurement of molecular volumes in complex mixtures

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DE10025384A1
DE10025384A1 DE2000125384 DE10025384A DE10025384A1 DE 10025384 A1 DE10025384 A1 DE 10025384A1 DE 2000125384 DE2000125384 DE 2000125384 DE 10025384 A DE10025384 A DE 10025384A DE 10025384 A1 DE10025384 A1 DE 10025384A1
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    • G01N33/54393Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
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    • C12Q1/6813Hybridisation assays
    • C12Q1/6834Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Messung von Molekülmengen in komplexen Gemischen mittels Mikroarrays und anderen analogen Trägern. The invention relates to a method for quantitative measurement of molecular volumes in complex mixtures by means of microarrays and other analogous carriers. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Areas of application of the invention, the molecular biology, medicine and the pharmaceutical industry.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Mes sung von Molekülmengen in komplexen Gemischen mittels Micro arrays und anderen mikrostrukturierten Trägern. The invention relates to a method for the quantitative Mes solution of molecular volumes in complex mixtures by means of microarrays and other microstructured carriers. Anwendungsge biete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Anwendungsge offer of the invention are molecular biology, medicine and the pharmaceutical industry.

Microarrays bestehen aus einer Vielzahl polymerischer Molekü le, die mit einer definierten geometrischen Anordnung fest an der Oberfläche eines Trägersubstrates angebunden sind. Microarrays consist of a plurality of polymeric Molecule le, which are connected with a defined geometric arrangement firmly to the surface of a carrier substrate. Micro arrays von Polynukleotiden und Polypeptiden sind inzwischen ein wichtiges Werkzeug der Molekularbiologie sowie verwandter Technologien und Industrien. Microarrays of polynucleotides and polypeptides have become an important tool of molecular biology and related technologies and industries. Sie werden in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt, zum Beispiel im Screening, in der DNA-Sequenzierung und in der Genexpressionsanalyse. They are used in a number of applications, for example in screening, DNA sequencing, and gene expression analysis. Als Microarrays im Sinne dieser Ausführung werden auch komplexere Trägergeometrien (Biochips, Nanotechnologie) aufgefaßt, an deren Oberflächen kontrollierte chemische Reaktionen durchge führt werden. As microarrays in accordance with this embodiment, more complex geometries carrier (biochip, nanotechnology) to be construed, controlled chemical reactions on the surfaces thereof Runaway leads. Im Folgenden werden die an der Oberfläche fi xierten Moleküle als Target (Target-Bibliothek) bezeichnet. In the following the fi xed on the surface molecules are referred to as a target (target library). Das zu untersuchende Substanzgemisch, das mit dem Array in Kontakt gebracht wird, wird als (komplexe) Probe bezeichnet. The examined substance mixture which is contacted with the array is referred to as (complex) sample. Probe und Array werden unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, nicht bindende Probenmoleküle werden wieder entfernt. Sample and array are brought into contact under hybridization conditions, non-binding sample molecules are removed. Die Zahl der auf dem Träger verbliebenen Probenmo leküle bildet ein Hybridisierungsprofil und erlaubt die Be stimmung der molekulare Zusammensetzung der Probe [1, 2]. The number of remaining on the carrier Probenmo leküle forms a hybridization profile and allows the loading of atmospheric molecular composition of the sample [1, 2].

In der Praxis werden die auf dem Array verbliebenen Moleküle durch geeignete Markierung (z. B. fluoreszentes oder radioak tives Labeling) kenntlich gemacht und mit entsprechenden De tektionsverfahren (zum Beispiel Fluoreszenz- oder Laserscan ner) gemessen. In practice, the remaining molecules on the array by suitable label (e.g., fluorescent or B. radioak tive Labeling) are indicated with corresponding De tektionsverfahren (for example fluorescent or laser scanning ner) measured. Unabhängig von den Details der Arrays und der Detektionstechnik sind die derzeitigen Verfahren ungenau und es ist wenig über den Hybridisierungs- und Meßprozeß und die dabei auftretenden Fehler bekannt. Regardless of the details of the array and the detection technique, current methods are inaccurate and little is known about the hybridization and measuring process and the error occurring. Daher ist insbesondere der quantitative Zusammenhang der Konzentration der Probenmolekü le und des detektierten Signals unsicher. Thus, the quantitative relation of the concentration of Probenmolekü le and the detected signal is particularly uncertain. Besonders problema tisch ist der Vergleich verschiedener Arrays, da er eine quantitative Messung der Konzentration der Probenmoleküle er fordert. Especially problematic is the table comparing different arrays because he he calls for a quantitative measurement of the concentration of the sample molecules.

Bisher wurden folgende Methoden zur quantitative Messung an gewendet: So far the following methods were applied for quantitative measurement of:

  • 1. Vergleich mit probeneigenen Genen wenig veränderlicher Ex pressionsstärke (house keeping genes) [7]. 1. Comparison with samples own genes bit variable Ex pressionsstärke (housekeeping genes) [7].
  • 2. Zugabe zweier artfremder Gene zur Probe (Spiking) in einer festen Konzentration[5]. 2. Addition of two genes from other species to the sample (spiking) in a fixed concentration of [5].
  • 3. Kombination des letztgenannten Verfahrens mit variablen Targetmengen [4]. 3. Combination of the latter method with variable amounts of target [4].
  • 4. Verwendung endgelabelter Probenmoleküle [3]. 4. Use endgelabelter sample molecules [3].

Weitere Verfahren sind aus [9] und [10] bekannt. Other methods are disclosed in [9] and [10].

Alle diese Methoden erfassen nur einen Teil der bei der Hy bridisierung und Messung relevanten Parameter und beruhen auf unzureichend gesicherten Annahmen über den Hybridisierungs prozess. All of these methods detect only a part of the bridisierung in Hy and measuring relevant parameters and based on insufficiently secured assumptions about the hybridization process.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bisher bekannten Methoden zu beseitigen und ein Verfahren zu entwickeln, welches die parallele quantitative Messung von Molekülmengen in komplexen Gemischen ermöglicht. The invention has for its object to eliminate the drawbacks of previously known methods and to develop a method which allows the parallel quantitative measurement of molecular volumes in complex mixtures.

Die Aufgabe der Erfindung wird mit den in den Ansprüchen be schriebenen Mitteln gelöst. The object of the invention is achieved with the BE in the claims written means.

Der Kernpunkt der erfindungsgemäßen Messung von Molekülmengen (Anzahlen oder Konzentrationen) in komplexen Gemischen mit tels Mikroarrays besteht darin, daß eine zu untersuchende Probe (z. B. DNA, RNA oder Polypeptide) mit einem komplexen Gemisch von Referenzmolekülen versetzt und auf einen Array aufgebracht wird, welcher neben den zur Probe passenden De tektormolekülen zusätzlich Targetmoleküle enthält, an welche die Referenzmoleküle in an sich bekannter Weise binden. is the central point of the measurement of molecular quantities (numbers or concentrations) in complex mixtures with means of microarrays according to the invention is that one to be examined sample (eg., DNA, RNA or polypeptides) mixed with a complex mixture of reference molecules and applied to an array which, in addition to matching the sample De additionally contains target molecules tektormolekülen to which bind the reference molecules in known manner.

Die Referenzmoleküle werden so ausgewählt, daß sie ähnliche Bindungscharakteristika wie die Probenmoleküle haben, aber weder untereinander noch mit den Probemolekülen oder den da zugehörenden Detektormolekülen wechselwirken. The reference molecules are selected so that they have similar binding characteristics as the sample molecules, but either among themselves or interact with the sample molecules or as belonging detector molecules. Ein Beispiel dafür ist, daß zur Untersuchung einer komplexen Probe aus Maus-cDNA ein Gemisch von pflanzenspezifischen Arabidopsis- cDNA Klonen zur Normierung beigegeben wird, welche in ihrem GC-Gehalt den Maus Klonen entsprechen, jedoch aufgrund ihrer Sequenz keine Wechselwirkungen mit diesen eingehen. One example is that a mixture of plant-specific Arabidopsis cDNA cloning is added to normalize for assaying a complex sample from mouse cDNA corresponding to the mouse clones in their GC content, but assume on the basis of their sequence no interaction with these.

Die Konzentrationen der Referenzmoleküle im Referenzgemisch werden vorzugsweise so gewählt, daß sie ein Abbild der Pro benmoleküle im Probengemisch sind. The concentrations of the reference molecules in the reference mixture are preferably chosen so that they are an image of the Pro benmoleküle in the sample mixture.

Die Messung erfolgt in der Weise, daß die Referenzmoleküle mehrfach auf dem Array aufgebracht werden und aus dieser Mehrfachmessung der Meßfehler bestimmt wird. The measurement is performed in such a manner that the reference molecules are repeatedly applied to the array, and is determined from the multiple measurements, the measurement error.

Zur Überwachung der geometrischen Homogenität des Messvor gangs werden die Targetmoleküle für die Referenzprobe geord net auf dem gesamten Array aufgebracht. To monitor the geometric homogeneity of the gangs Messvor the target molecules for the reference sample geord net on the entire array to be applied.

Die erfindungsgemäße Methode kann auch auf anderen mi krostrukturierten Trägern wie z. The method of the invention can krostrukturierten on other carriers such mi. B. Chips oder Nanotiterplat ten durchgeführt werden. B. chips or Nanotiterplat th be performed. Zur Detektion der gebundenen Proben und Referenzmoleküle bzw. der an ihnen befestigten Marker werden optische, elektrische oder mechanische Verfahren ver wendet. For detection of the bound sample and reference molecules or fixed to them markers optical, electrical or mechanical methods are aimed ver.

Durch Zugabe unterschiedlicher Mengen verschiedener Referenz moleküle zur Probe und Aufbringen entsprechender Targets auf dem Array ist eine erhebliche Verbesserung der quantitativen Messung der Konzentration der Probenmoleküle möglich. By addition of different amounts of different reference molecules to the sample, and applying the appropriate targets on the array is a considerable improvement in the quantitative measurement of the concentration of the sample molecules is possible. Damit ist auch die Vergleichbarkeit verschiedener Messungen gewähr leistet. Thus the comparability of different measurements is making guarantees.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle Arten von Molekü len anwendbar, die stöchiometrische Wechselwirkungen eingehen (Schlüssel-Schlosspaare bilden), insbesondere für RNA, PNA, DNA, und Proteine. The inventive method is applicable for all types of Molecule len, the stoichiometric interactions received (lock and key pairs), in particular for RNA, PNA, DNA, and proteins. Es besteht aus den folgenden Schritten: It consists of the following steps:

  • 1. Wahl der Referenzmoleküle 1. Choice of reference molecules
  • 2. Wahl der Menge der Referenzmoleküle in der Probe 2. choice of the amount of the reference molecules in the sample
  • 3. Wahl der Menge der Referenzmoleküle im Target 3. Election of the amount of the reference molecules in the target
  • 4. Wahl der Anzahl der Referenzmoleküle 4. Select the number of reference molecules
  • 5. Bestimmung der Eichkurven und Quantifizierung der Pro benmenge 5. Determination of the calibration curves and quantify the Pro benmenge
  • 6. Bestimmung der Messgüte 6. Determination of measurement quality

Das Verfahren ist in Verbindung mit allen möglichen Technolo gien zur Molekülmengenbestimmung anwendbar. The method is technologies in conjunction with any Technolo to the molecular quantity determination applicable. Insbesondere ist es unabhängig von der genauen Technologie, die zur Markierung (Labeling) der Moleküle eingesetzt wird, wie zum Beispiel ra dioaktive Markierung oder fluoreszente ein- oder Mehrfarbmar kierung. In particular, it is independent of the precise technology for labeling (Labeling) is used of the molecules, such as RA dioaktive label or fluorescent kierung mono- or Mehrfarbmar.

1. Wahl der Referenzmoleküle 1. Choice of reference molecules

Durch geeignete Auswahl muss sichergestellt werden, dass die als Referenz verwendeten Moleküle möglichst geringe Wechsel wirkung mit den Molekülen aus der Target-Bibliothek zeigen. By appropriate selection needs to be ensured that the molecules used as a reference to show the lowest possible interaction with the molecules of the target library. Die Referenzmoleküle können sowohl bekannte Klone/Proteine z. The reference molecules can both known clones / proteins such. B. aus vorhandenen Molekül-Bibliotheken als auch neue ge eignet designte Moleküle sein. B. from existing molecule libraries and new ge is to be designed molecules. Die Referenzmoleküle sollen in ihren Bindungseigenschaften die chemischen Charakteristika der Probe reflektieren (z. B. in Längenverteilung oder GC- Gehalt) und gleichzeitig keine Wechselwirkung (etwa Hinter grund-Hybridisierung oder Kreuzhybridisierug) mit den Proben und den Targetmolekülen eingehen. The reference molecules are in their binding properties, the chemical characteristics of the sample reflect (z. B. length distribution or GC content), while no interaction (as background hybridization or Kreuzhybridisierug) received with the sample and the target molecules. Verfahren zur Auswahl und zum Design geeigneter DNA, RNA und Proteine sind in den fol genden Abschnitten beschrieben. A method for the selection and design of suitable DNA, RNA and proteins are described in the fol lowing sections.

Prinzipiell gibt es zwei Wege, einen Referenzdatensatz zu konstruieren: Basically, there are two ways of constructing a reference data set:
Auswahl der Moleküle aus einer fest vorgegebenen Bibliothek (natürlich vorkommend oder synthetisierter Moleküle) oder Neuentwurf synthetischer Moleküle mit bioinformatischen Me thoden. Selection of molecules from a fixed library (naturally occurring or synthesized molecules) or redesign of synthetic molecules with bioinformatic Me methods. Auch eine Kombination der beiden Ansätze kann sinn voll sein: Bildung von synthetischen Hybridmolekülen aus Fragmenten einer Bibliothek bekannter Moleküle. A combination of the two approaches can be fully meaningful: formation of synthetic hybrid molecules from fragments of a library of known molecules.

1.1 DNA 1.1 DNA

Zur Auswahl geeignter Kandidaten aus einer Menge bekannter Klone (Bibliothek) sollten nach Möglichkeit die Sequenzen sämtlicher in der Probe zu erwartenden und aller im Target gespotteten DNA-Moleküle bekannt sein. To select geeignter candidate from a set of known clones (library) should be expected, the sequences of all in the sample and be known to all spotted in the target DNA molecules by chance. So kann am sichersten eine störende Wechselwirkung mit der Probe oder den Targetmo lekülen vermieden werden. It can thus be avoided lekülen safest interference with the sample or the Targetmo.

Beispiel example

Für die Durchführung eines Hefe Hybridisierungsex perimentes sollen Referenzmoleküle ausgesucht werden. To carry out a yeast Hybridisierungsex perimentes reference molecules to be selected. Als Suchbibliothek stehen das Genom des Archebakteriums Archeo globus fulgidus und Methanococcus janascii zur Verfügung. As search library are the genome of the bacterium Ark Archeo globus fulgidus and Methanococcus janascii available. Durch Vorgabe einer Ähnlichkeitsschwelle (z. B. einem e-value bei BLAST) wird ein Satz von Molekülkandidaten mit genügend geringer Ähnlichkeit zum Hefegenom ausgewählt. By setting a similarity threshold (eg. As an e-value at BLAST) a set of candidate molecules with sufficiently low similarity is selected for yeast genome. Aus diesen Kandidaten wird ein Satz von nicht homologen Molekülen ausge wählt (z. B. mit dem in [6] beschriebenen Verfahren). From these candidates a set is of non-homologous molecules selected (z. B. with the method described in [6] The method). Bei Be darf kann eine weitere Auslese nach Kriterien der molekularen Zusammensetzung (Länge, GC-Gehalt) erfolgen. may at Be can not take action on selection criteria by the molecular composition (length, GC content).

1.2 Oligonukleotide 1.2 oligonucleotides

Bei Oligonukleotiden ist eine de novo Synthese organismen fremder Moleküle naheliegend. In oligonucleotides de novo synthesis is obvious organisms foreign molecules. Günstige Molekülkandidaten der Länge L (L-Nukleotide) können durch Auswahl schwach bevölker ter Regionen auf dem verallgemeinerten Hyperwürfel [8] der L- Nukleotide gefunden werden. Cheap candidate molecules of length L (L-nucleotides) weak bevölker ter regions on the generalized hypercube [8] of L- nucleotides can be found by selecting. Ein einfaches numerisches Verfah ren dazu versieht die M Oligonukleotide und alle im Genom des zu untersuchenden Organismus auftauchenden L-Nukleotide mit abstossenden Ladungen und sucht durch deterministische oder stochastische Iteration eine Konfiguration minimaler Energie im ML-dimensionalen Konfigurationsraum der M L-Nukleotide. A simple numerical procedural ren to providing the M oligonucleotides and all in the genome of the examined organism emerging L-nucleotides with repulsive charges and examined by deterministic or stochastic iteration a configuration of minimum energy in the ML-dimensional configuration space of M L-nucleotides.

1.3 Proteine 1.3 proteins

Bei Proteinen und Peptiden ist die Situation komplizierter, da Molekülwechselwirkungen nicht über einfache Paarbindung erfolgen. For proteins and peptides, the situation is more complicated because molecular interactions not take place via simple pair bond. Ist eine geeignete Funktion zur Beschreibung der molekularen Wechselwirkungen gefunden, so können die obenge nannten Verfahren sofort geeignet erweitert werden: das Ziel ist es wiederum, einen Satz von paarweise wechselwirkenden Molekülen zu suchen, die keine Bindung mit der Probe einge hen. Is an appropriate function for describing the interactions found, the obenge can process called immediately extended useful: the goal is to turn to look for a set of pairwise interacting molecules, the hen no bond with the sample taken. Steht eine solche Wechselwirkungsfunktion nicht zur Ver fügung, so ist jedenfalls bei Oligopeptiden (Länge < 40) eine experimentelle Auswahl von Referenzmolekülen möglich: Ein grosser Satz von potentiellen Referenzmolekülen, etwa eine Zufallsbibliothek, wird in Festphasensynthese auf einem ge eigneten Träger fixiert. If such an interaction function is not Ver addition, it is anyhow with oligopeptides (length <40) an experimental selection of reference molecules possible: a large set of potential reference molecules, such as a random library, is fixed in solid phase synthesis on a GE suitable carrier. Die markierte Probe wird mit der Ma trix in Kontakt gebracht. The labeled probe is reacted with the Ma trix brought into contact. Peptide, die keine Wechselwirkung eingegangen sind, kommen als Kandidaten in die engere Aus wahl. Peptides that have been received no interaction considered as candidates shortlisted from either. In Analogie zur oben beschriebenen Auswahl nicht homologer DNA-Moleküle aus der Datenbank werden durch weitere Hybridisierungsstudien nicht miteinander wechselwirkende Pep tide ausgewählt. In analogy to the above-described selection of non-homologous DNA molecules from the database not interacting with each other by further hybridization studies Pep tide are selected.

2. Wahl der Menge der Referenzmoleküle in der Probe 2. choice of the amount of the reference molecules in the sample

Die Mengen der verschiedenen Referenzmoleküle in der Probe sind so zu wählen, dass sie den gesamten Bereich der zu un tersuchenden Probenmengen abdecken. The amounts of the various reference molecules in the sample must be selected so that they cover the entire range of about un tersuchenden sample quantities. In der Praxis hat sich eine Abstufung der verschiedenen Mengen in Form einer Verdün nungsreihe bewährt. In practice, a gradation of different amounts in the form of thinners has proven voltage series. Eine Untergrenze der Verdünnungsreihe (geringste Molekülkonzentration) ist typischerweise durch die Detektorempfindlichkeit vorgegeben. A lower limit of the dilution series (smallest molecule concentration) is typically dictated by the detector sensitivity.

3. Wahl der Menge der Referenzmoleküle im Target 3. Election of the amount of the reference molecules in the target

Die Menge der Normierungsmoleküle im Target sollte der typi schen Menge der auf dem Array aufgebrachten Targetbibliothek moleküle entsprechen. The amount of the normalization molecules in the target should be that of typi rule amount of the applied on the array target library molecules. Ist diese Menge stark variabel, so sollte auch für die Targetmoleküle eine Verdünnungsreihe an gelegt werden. If this amount is highly variable, so a dilution series should be given also to the target molecules. Das Verfahren ist im Abschnitt 5, Beispiel 2 genauer erläutert. The procedure is explained in Section 5, Example 2 in more detail.

4. Wahl der Anzahl der Referenzmoleküle 4. Select the number of reference molecules

In Abhängigkeit von der Array-Technologie müssen mehrere kri tische Parameter durch Kontrollmessungen oder Kontrollreihen beobachtet werden. Depending on the array technology, several kri diagram parameters by control measurements or control lines have to be observed. Generell sind dies die Anzahl der wechsel wirkenden Moleküle auf dem Träger (Targetmoleküle) und die Anzahl wechselwirkender Moleküle in der komplexen Probe. Generally, these are the number of interacting molecules on the support (target molecules) and the number of interacting molecules in the complex sample. Wei tere wichtige Parameter für z. Wei tere important parameters for such. B. cDNA Hybridisierungsexperi ment sind die Basenkomposition (gc-Gehalt) und die Länge der DNA-Moleküle. B. cDNA Hybridisierungsexperi ment, the base composition (GC content) and the length of the DNA molecules. In der Praxis wird man je nach Verlässlichkeit der Technologie von nur wenigen Molekülen (einfache Verdün nungsreihe) bis zu zwanzig Prozent der Moleküle (mehrdimen sionale und wiederholte Verdünnungsreihe) auf dem Träger für die Normierung und Qualitätskontrolle einsetzen. In practice, it is depending on the reliability of the technology to a few molecules (simple thinners voltage series) up to twenty percent of the molecules (mehrdimen dimensional and repeated dilution series) on the support for the standardization and quality control use. Mit der An zahl der verwendeten Normierungsmoleküle steigt die erzielba re Messgenauigkeit, siehe Abschnitt 6. With the number of desired molecules used normalizing the re erzielba measurement accuracy increases, see section. 6

In der Praxis hat sich die Verwendung eines Standardnormie rungssatzes von 384 Molekülen bewährt, die beim Experiment als Referenzmenge mit gespottet werden. In practice, the use of a Standardnormie insurance rate from 384 molecules has proven to be spotted with the experiment as a reference quantity. Dieses Vorgehen mini miert Komplikationen bei der Durchführung des Experimentes und gewährleistet eine grosse Reproduzierbarkeit. This procedure mini mized complications in carrying out the experiment and ensures a great repeatability. In Abhän gigkeit vom durchgeführten Experiment kann die Mehrfachauf bringung gleicher oder die Auswahl möglichst vieler verschie dener Referenzmoleküle oder ein Kompromiss dieser beiden Wege sinnvoll sein. In depen dependence from the experiment conducted the Mehrfachauf can brin supply the same or the selection of as many various Dener reference molecules or a compromise of these two pathways may be useful. Generell erlaubt das wiederholte Aufbringen von Verdünnungsreihen die Abschätzung des Messfehlers, wie unten in Beispiel 1 beschrieben. Generally, the repeated application of dilution series allows the estimation of the measurement error, as described below in Example. 1

Eine Absicherung des ausgewählten Moleküldatensatzes erfolgt in einer Voruntersuchung, bei der die Referenzmoleküle ein zeln und gemeinsam, aber ohne Beigabe der komplexen Probe mit dem Array in Kontakt gebracht werden: es sollten keine Wech selwirkungen mit den zur Probenmessung bestimmten Targetklo nen auftreten. Fusing of the selected molecular data set takes place in a preliminary study, in which the reference molecules are an individually and collectively, but brought into contact without the addition of the complex sample with the array: there should be no Wech selwirkungen occur with the particular for sample measurement Targetklo NEN. In einem komplementären Experiment wird die Probe ohne Beigabe von Referenzmolekülen auf den Array aufge bracht: es sollten keine Wechselwirkungen mit den als Refe renz bestimmten Targetklonen auftreten. In a complementary experiment, the sample without the addition of reference molecules is placed on the array done: it should not interact with as Refe rence particular target clones occur.

5. Bestimmung der Eichkurve und Quantifizierung der Probe mengen 5. Determination of the calibration curve and quantification of sample volumes

Aus den Signalstärken der Referenzmoleküle kann durch Opti mierung geeigneter Modellparameter oder geeignete Interpola tionsverfahren eine (im allgemeinen nichtlineare) Eichkurve bestimmt werden. From the signal strengths of the reference molecules can be prepared by Opti optimization suitable model parameters or suitable Interpola extraction process a (generally non-linear) calibration curve can be determined. Durch analytische oder numerische Inversion dieser Eichkurve kann die Probenmenge aus der Signalstärke bestimmt werden. By analytical or numerical inversion of this curve, determine the amount of sample can be determined from the signal strength. Liegen freie Parameter vor, die das Bin dungsverhalten der Moleküle beeinflussen, wie z. Are free parameters prior to making behavior that Bin influence of molecules such. B. der GC- Gehalt bei DNA-Molekülen, so ist eine ganze Schar von Über tragungsfunktionen zu bestimmen. As the GC content in DNA molecules, it is to determine a whole crowd of over transfer functions. Im Fall von räumlich inhomo genen Arrays ist ebenfalls die Bestimmung mehrerer Eichkurven erforderlich. In the case of spatially inhomo antigenic arrays, the determination of several calibration curves is also required.

Beispiel 1 example 1

Sind alle Targetmoleküle in gleicher Anzahl auf dem Träger aufgebracht und ist der Einfluss weiterer Parameter gering, so genügt eine einfache Verdünnungsreihe, um eine Quantifi zierung des Signales vorzunehmen. If all the target molecules applied in equal number on the carrier and the influence of other parameters is small, it is sufficient a simple dilution series to make a quantifi cation of the signal. Die Referenzmoleküle werden dazu auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, z. The reference to molecules are diluted to various concentrations, for. B. so, dass ihre Konzentration c in zehn Stufen, jeweils um einen Faktor zwei abnimmt (c 1 , . . ., c 10 ). B. so that its concentration c in ten stages in each case by a factor of two decrease (c 1,..., C 10). Damit kann ein Messbereich von drei Dekaden kontrolliert werden. This means a measuring range of three decades can be controlled. Die genaue Wahl Verdün nungstufen hängt vom dynamischen Messbereich und der gefor derten experimentellen Genauigkeit ab. planning stages, the exact choice thinners depends on the dynamic range and Shaped derten experimental accuracy. Die Normierungsmolekü le werden der komplexen Probe beigegeben (gespiked) und die Komplementmoleküle in einer Anzahl entsprechend der übrigen Targetmoleküle auf dem Träger angebracht. The Normierungsmolekü le be attached to the complex sample added (spiked) and the complement molecules in a number corresponding to the rest of the target molecules on the support. Nach der Durchfüh rung des Hybridisierungsexperimentes wird zu jeder der Ver dünnungsstufen c k ein entsprechendes Signal s k gemessen: c k → s k . After the imple tion of the hybridization experiment will dilution limits to each of the Ver c k a corresponding signal s k measured: c k → s k. Diese Signale können jetzt verwendet werden, um die Transmissionsfunktion T(c) (Quantifizierungsfunktion) zu be stimmen. These signals can now be used to determine the transmission function T (c) (quantification function) agree to be. Im einfachsten Fall wird diese Funktion durch linea re Interpolation der Messpunkte definiert, im allgemeinen wird man eine Modellfunktion an die Messdaten anpassen (siehe Abb. 1). In the simplest case, this function is defined by linea re interpolation of the measurement points, in general, will adapt a model function to the data (see Fig. 1). In diesem speziellen Beispiel ( Abb. 1) wurde als Transmissionsfunktion T(x) = α.(1-exp(-(x + β)/α)) ange nommen. In this particular example (Fig. 1) was used as transmission function T (x) = α. (1-exp (- (x + β) / α)) adopted. Durch Inversion der Transmissionsfunktion kann die Quantifizierungsfunktion Q(s) = T -1 (s)bestimmt werden. By inversion of the transmission function of the quantification function Q can be determined (s) = T -1 (s). Die Quantifizierungsfunktion erlaubt es, aus jedem gemessenen Si gnal s* auf die zugrundeliegende Molekülkonzentration in der Probe zurückzuschliessen: c* = Q(s*) (siehe Abb. 2). The quantification function allows * zurückzuschliessen from each measured Si gnal s to the underlying molecule concentration in the sample: c * = Q (s *) (see Fig. 2).

Beispiel 2 example 2

Ist die gemessene Intensität stark von einem oder mehreren weiteren Parametern wie zum Beispiel dem GC-Gehalt der Se quenzen abhängig, so ist eine ganze Schar von Normierungskur ven zu bestimmen. If the measured intensity strongly, for example, sequences from one or more other parameters such as the GC content of the Se-dependent, is to determine a whole host of Normierungskur ven. Ein Beispiel ist in Abb. 3 gezeigt. An example is shown in FIG. 3.

Bei der Umrechnung von der Signalintensität in die Molekül konzentration ist dann die entsprechende Kurve zu wählen. During the conversion of the signal intensity in the molecular concentration the corresponding curve should be selected.

Will man etwa für ein Molekül mit einem GC-Gehalt von 30% die Molekülkonzentration aus dem gemessenen Signal bestimmen, so verwendet man die unterste Quantifizierungskurve. If it is desired for example for a molecule having a GC content of 30% to determine the concentration of molecules from the measured signal, one can use the lowest quantification curve. Ist der Einfluss des GC-Gehaltes aus allgemeinen Überlegungen be kannt, so reicht die in Beispiel 1 besprochene eindimensiona le Verdünnungsreihe aus. The influence of the GC content of general considerations be withdrawn, the discussed in Example 1 eindimensiona le sufficient dilution series. Der GC-Gehalt taucht dann explizit als zusätzlicher Parameter in der Transmissionsfunktion auf. The GC content then appears explicitly as an additional parameter to the transmission function. Ist eine analytische Beziehung nicht bekannt, so muss für ei nen repräsentativen Parameterbereich GC min . Is an analytical relationship is not known, has for ei nen representative parameter range GC min. . , . , GC max der Einfluss auf die Transmissionsfunktion untersucht werden. GC max of influence are examined for the transmission function.

Beispiel 3 example 3

Ist die Anzahl der Targetmoleküle auf dem Träger für ver schiedene Moleküle verschieden gross und hat einen deutlichen Einfluss auf die Messung, so ist eine zweidimensionale Ver dünnungsreihe erforderlich. If the number of target molecules on the support for ver different molecules of different size and has a significant influence on the measurement, is a two-dimensional Ver dünnungsreihe required. Dabei werden in Analogie zu Bei spiel 1 Verdünnungsreihen gebildet. Here are formed in analogy to In Game 1 dilution series. Soll die Probenkonzentra tion c P auf n Stufen und die Targetkonzentration c t auf m Stufen gemessen werden, so ist es sinnvoll m × n verschiedene Normierungsmoleküle zu wählen, um die Unabhängigkeit der Ver dünnungsexperimente zu gewährleisten. If the Probenkonzentra tion c P to n stages and the target concentration c t be measured in m stages so it makes sense to choose m × n different normalization molecules in order to ensure the independence of the dünnungsexperimente Ver. Jetzt bildet man eine Verdünnungs-Matrix aus n Zeilen uni m Spalten: Jeder Matri xeintrag entspricht einem komplementären Paar von Proben und Targetmolekül. Now forming a dilution matrix of n rows m columns uni: Each Matri xeintrag corresponds to a complementary pair of samples and target molecule.

Darstellung der Verdünnungsmatrix Presentation of the dilution matrix

Die Konzentration in der komplexen Probe wird von Zeile zu Zeile herabgesetzt, die Konzentration im Target wird von Spalte zu Spalte herabge setzt. The concentration in the complex sample is decreased from line to line, the concentration in the target is set from column to column herabge. Beispiel: Molekül 69 hat eine Probenkonzentration von 1 : 64 der Probenausgangskonzentration und das Komplement auf dem Microarray eine Targetkonzentration von 1 : 256 der Targe tausgangskonzentration. For example, the molecule 69 has a sample concentration of 1: 64 of the original sample concentration and the complement on the microarray, a target concentration of 1: 256 of the Targe tausgangskonzentration.

Die Konzentration der Probenmoleküle c p wird entsprechend der Proben-Verdünnungsreihe von Zeile zu Zeile herabgesetzt. The concentration of the sample molecules c p is reduced in accordance with the sample dilution series from line to line. Die Konzentration der Targetmoleküle c t wird entsprechend der Proben-Verdünnungsreihe von Spalte zu Spalte herabgesetzt. The concentration of the target molecules c t is reduced according to the sample dilution series from column to column. Nach Durchführung des Experimentes wird ähnlich wie im Bei spiel 1 eine zweidimensionale Transferfunktion T bestimmt, die es erlaubt, jedem Paar (c p , c t ) von Proben- und Target konzentration eine Signalstärke s = T(c p , c t ) zuzuordnen. After carrying out the experiment is similar in Game 1 determined a two-dimensional transfer function T, as in, which allows each pair (c p, c t) concentration of the sample and target signal strength s = T (c p, c t) assigned. Wird die Targetkonzentration c t durch direkte Messung (etwa Absorptionsspektroskopie) bestimmt, so kann die Konzentration c p * eines untersuchten Moleküls aus dem gemessenen Signal s* durch Bildung einer parametrisierten Umkehrfunktion analog zu Beispiel 1 ermittelt werden: c p * = T -1 ct (s*). If the target concentration c t by direct measurement (as absorption spectroscopy), the concentration c * of an examined molecule from the measured signal s * are determined by forming a parameterized inverse function analogously to Example 1 p c p * = T -1 ct (s *).

6. Bestimmung der Messgüte 6. Determination of measurement quality

Die Messgüte ist durch die Reproduzierbarkeit von Messungen bestimmt. The measurement quality is determined by the reproducibility of measurements. Die Reproduzierbarkeit ist durch den erwarteten Messfehler bei Wiederholungsmessung gegeben (mittleres Schwankungsquadrat). The reproducibility is given by the expected measurement error in repeated measurements (mean square deviation). Der typische Messfehler bei muss in Ab hängigkeit von der gegebenen Signalstärke bestimmt werden. The typical measurement error must be from dependence determined by the given signal strength. Ein Anhaltspunkt für den Messfehler kann bereits aus Wieder holung der Normierungsreihe gewonnen werden. An indication of the measurement error can already from re HOLUNG the normalization range are obtained. Mit Hilfe des Fehlerfortpflanzungsgesetzes oder durch Anwendung der Umkehr funktion kann daraus die effektive Messgenauigkeit im gesam ten Messbereich abgeleitet werden (siehe Abb. 1 und Abb. 2). With the aid of the error propagation law or by the application of the inverse function can therefrom the effective measurement accuracy are derived in the TOTAL th measurement range (see Fig. 1 and Fig. 2). Eine echte Qualitätskontrolle erfordert jedoch die wiederhol te Durchführung des gesamten Experimentes. However, a real quality control requires repeatable te implementation of the entire experiment. Die Mehrfachmes sung erlaubt wiederum unter Verwendung der Umkehrfunktion die Bestimmung der effektiven Schwankungsbreite sowohl der indi viduellen Messung, als auch eines gegebenen Intensitätsberei ches. In turn, the Mehrfachmes solution allows using the inverse function of the determination of the effective range of variation both of the indi vidual measurement, as well as of a given intensity preparation ches.

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Legenden zu den Abbildungen LEGENDS TO THE FIGURES

Abb. 1 Konstruktion der Eichkurve (Transmissionsfunktion T) ausgehend von sechs Wiederholungen einer Verdünnungsreihe. Fig. 1 construction of the calibration curve (transmission function T) starting from six repetitions of a dilution series.

Abb. 2 Rekonstruktion der Molekülkonzentrationen mithilfe der Quantifizierungsfunktion Q. Die sechs Wiederholungen der Verdünnungsreihe dienen zur Schätzung des erwarteten Messfeh lers. Fig. 2 reconstruction of molecular concentrations using the quantification function Q. The six repetitions of the dilution series used to estimate the expected Messfeh toddlers.

Abb. 3 Ist die beobachtete Signalintensität stark von einem Parameter, wie dem GC-Gehalt abhängig, so ist eine Schar von Quantifizierungsfunktionen zu bestimmen. Fig. 3 is the observed signal intensity significantly depends on a parameter such as the GC content, so a group of quantification functions is to be determined.

Claims (21)

  1. 1. Verfahren zur Messung von Molekülmengen in komplexen Gemischen mittels eines Arrays, dadurch gekennzeichnet , daß eine zu untersuchende Probe mit einem komplexen Referenzmole külgemisch versetzt und auf einen Array aufgebracht wird, welcher neben den zur Probe passenden Detektormolekülen zu sätzlich Moleküle enthält, an welche die Referenzprobenmole küle binden. 1. A method for measurement of molecular volumes in complex mixtures by means of an array, characterized in that an assayed sample with a complex Referenzmole offset külgemisch and is applied to an array, which to additionally contains molecules in addition to matching the sample detector molecules to which the Referenzprobenmole molecules bind.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzmoleküle einerseits ähnliche Bindungscharakteri stika wie die Probenmoleküle haben, andererseits aber unter einander und mit den Probenmolekülen eine geringe Wechselwir kung aufweisen. 2. The method of claim 1, characterized in that the reference molecules on the one hand stika similar Bindungscharakteri have as the sample molecules, but on the other hand to each other and have with the sample molecules little effect interactions.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentrationen der Referenzmoleküle im Referenzgemisch ein Abbild der Konzentrationen der Probenmoleküle im Proben gemisch sind. 3. The method of claim 1 or 2, characterized in that the concentrations of the reference molecules in the reference mixture an image of the concentrations of the sample molecules in the sample are mixed.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektormoleküle für die Referenzproben mehrfach auf dem Array aufgebracht werden und aus dieser Mehrfachmessung der Meßfehler bestimmt wird. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detector molecules can be applied for the reference sample several times on the array and is determined from the multiple measurements, the measurement error.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektormoleküle für die Referenzprobe geordnet auf dem gesamten Array aufgebracht werden und damit die geome trische Homogenität des Messvorgangs überwacht wird. 5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detector molecules for the reference sample ordered be applied to the entire array, and thus the homogeneity of the geome tric measurement process is monitored.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß statt eines Mikroarrays andere mikrostrukturierte Träger (z. B. Chips oder Nanotiterplatten) verwendet werden. 6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that, instead of a microarray other microstructured support (z. B. chips or nanotiter plates) may be used.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben- und Referenzmoleküle mit Markermolekülen versehen sind, die mittels optischer, elektrischer oder mechanischer Verfahren nachweisbar sind, wobei den Proben- und Referenzmo lekülen Meßsignale zugeordnet werden. 7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the sample and reference molecules are provided with marker molecules, which are detectable by optical, electrical or mechanical methods, wherein the sample and Referenzmo lekülen measurement signals are assigned.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Meßsignalstärke der Referenzmoleküle zumindest eine Eichkurve bestimmt wird, die zur Bestimmung der Molekülmengen der Probenmoleküle aus den Meßsignalstärken der Probenmolekü le verwendet wird. 8. The method according to claim 7, characterized in that at least one calibration curve is determined from the Meßsignalstärke the reference molecules, is used to determine the molecular quantities of the sample molecules from the Meßsignalstärken the Probenmolekü le.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mittels Verdünnungsreihen der Proben- und Referenzmoleküle Meßsignale gewonnen werden, die zur Bestimmung der zumindest einen Eichkurve verwendet werden. 9. The method according to claim 8, characterized in that are obtained by serial dilutions of the sample and reference molecules measuring signals, which are used to determine the at least one calibration curve.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzmoleküle auf verschiedene Konzentrationen ver dünnt und dem Probenmolekülgemisch beigegeben werden. 10. A method according to claim 9, characterized in that the reference molecules thinned ver to various concentrations and added to the sample molecule mixture.
  11. 11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß optische, elektrische oder mechanische Verfahren zur Detekti on der gebundenen Proben- und Referenzmoleküle bzw. der an ihnen befestigten Marker verwendet werden. 11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that optical, electrical or mechanical methods for Detekti on the bound sample and reference molecules or fixed to them markers are used.
  12. 12. Verfahren zur Messung von Molekülmengen in komplexen Ge mischen mittels eines Arrays, dadurch gekennzeichnet, daß 12. A method for measuring quantities molecule in complex Ge mix by means of an array, characterized in that
    eine zu untersuchende Probe mit einem komplexen Referenz molekülgemisch versetzt und auf einen Array aufgebracht wird, welcher neben den zur Probe passenden Detektormole külen zusätzlich Moleküle enthält, an welche die Referenz probenmoleküle binden, wobei die Referenzmoleküle einer seits ähnliche Bindungscharakteristika wie die Probenmole küle haben, andererseits aber untereinander und mit den Probenmolekülen eine geringe Wechselwirkung aufweisen; is mixture of molecules added an assayed sample with a complex reference and applied to an array, which in addition to matching the sample Detektormole addition, molecules cules includes at which sample molecules bind the reference, said molecules have the reference molecules on the one hand similar binding characteristics as the Probenmole, on the other hand but have little interaction with each other and with the sample molecules;
    die Proben- und Referenzmoleküle mit Markermolekülen ver sehen sind, die mittels optischer, elektrischer oder me chanischer Verfahren nachweisbar sind, wobei den Proben- und Referenzmolekülen Meßsignale zugeordnet werden; the sample and reference molecules are seen with marker molecules ver which are detectable by optical, electrical or me chanical method in which the sample and reference molecules measuring signals are allocated;
    die Referenzmoleküle auf verschiedene Konzentrationen ver dünnt und dem Probenmolekülgemisch beigegeben werden und ver thins out the reference molecules to various concentrations and added to the sample molecule mixture, and
    aus der Meßsignalstärke der Referenzmoleküle zumindest ei ne Eichkurve bestimmt wird, die zur Bestimmung der Mole külmengen der Probenmoleküle aus den Meßsignalstärken der Probenmoleküle verwendet wird. ei ne calibration curve for the determination of moles of the sample molecules from the Meßsignalstärken of the sample molecules külmengen is used is determined from the Meßsignalstärke the reference molecules at least.
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß mittels Verdünnungsreihen der Proben- und Referenzmoleküle Meßsignale gewonnen werden, die zur Bestimmung der zumindest einen Eichkurve verwendet werden. 13. The method according to claim 12, characterized in that are obtained by serial dilutions of the sample and reference molecules measuring signals, which are used to determine the at least one calibration curve.
  14. 14. Verfahren zur Auswahl eines Satzes von Referenzmolekü len aus einer vorhandenen Molekülbibliothek, wobei die Refe renzmoleküle bei der Bestimmung der Molekülmengen eines kom plexen Probenmolekülgemisches als Referenz dienen, derge stalt, daß die Referenzmoleküle so gewählt werden, daß die molekulare Wechselwirkung der Referenzmoleküle untereinander und mit den Probenmolekülen des Probenmolekülgemisches mini miert wird. 14. A method for selecting a set of Referenzmolekü len from an existing library of molecules, wherein the Refe rence molecules serve as a reference in the determination of the molecular quantities of a com plex sample molecule mixture, Dege Stalt that the reference molecules are selected such that the molecular interaction of the reference molecules with each other and is mini mized with sample molecules of the sample molecule mixture.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzmoleküle in ihren Bindungseigenschaften den Bin dungseigenschaften der Probenmoleküle ähneln. Similar 15. The method according to claim 14, characterized in that the reference molecules binding properties to Am in their binding properties of the sample molecules.
  16. 16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Wechselwirkung mittels eines Funktionals be schrieben wird, und die Referenzmoleküle so gewählt werden, daß die durch das Funktional beschriebene Wechselwirkung mi nimiert wird. 16. The method of claim 14 or 15, characterized in that the molecular interaction is written by means of a functional BE, and the reference molecules are selected such that the interaction mi described by the functional is nimiert.
  17. 17. Verfahren zur Auswahl eines Satzes von Referenzmolekü len aus einer vorhandenen Molekülbibliothek unter Verwendung eines Funktionales, welches die molekulare Wechselwirkung nä herungsweise beschreibt, dergestalt, daß die ausgewählten Mo leküle minimale Wechselwirkungen untereinander und mit den Probenmolekülen erwarten lassen. 17. A method for selecting a set of Referenzmolekü len from an existing library of molecules using a Functional which herungsweise describes the molecular interaction nä, such that the selected Mo leküle minimal interactions with each other and can be expected with the sample molecules.
  18. 18. Verfahren zur Auswahl eines Satzes von Referenzmolekü len durch in silico Konstruktion und de novo Synthese unter Verwendung eines Funktionales, welches die molekulare Wech selwirkung näherungsweise beschreibt, dergestalt, daß die konstruierten Moleküle minimale Wechselwirkungen untereinan der und mit den Probenmolekülen erwarten lassen. 18. A method for selecting a set of Referenzmolekü len by in silico design and de novo synthesis using a Functional which approximately describes the molecular Wech selwirkung, such that the constructed molecules can expect minimal interactions untereinan of and with the sample molecules.
  19. 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Probenmolekülen um Nukleotide handelt und die Probenmoleküle auf schwach bevölkerten Regionen auf dem ver allgemeinerten Hyperwürfel der Nukleotide der Länge L (L- Nukleotide) gesucht werden. 19. The method according to claim 18, characterized in that it concerns with the sample molecules to the sample molecules to nucleotides and sparsely populated regions on the ver ungeneralized hypercube of nucleotides the length L (L- nucleotides) are sought.
  20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß 20. The method according to claim 19, characterized in that
    die Probenmoleküle der Länge L in den verallgemeinerten Hyperwürfel der L-Nukleotide abgebildet und ihnen absto ßende Ladungen zugeordnet werden; the sample molecules to the length L shown in the generalized hypercube of L-nucleotides and repel them sequent charges are associated;
    den Referenzmolekülen ebenfalls abstoßende Ladungen zuge ordnet und in den Hyperwürfel abgebildet werden; the reference molecules also assigns been repulsive charges and are displayed in the hypercube;
    wobei durch deterministische oder stochastische Iteration eine Konfiguration minimaler Energie gesucht wird. with a configuration of minimum energy is sought by deterministic or stochastic iteration.
  21. 21. Mikrostrukturierter Träger zur quantitativen Messung von Molekülmengen in komplexen Proben, bei dem eine Vielzahl von polymerischen Molekülen in einer definierten geometrischen Anordnung fest an der Oberfläche des mikrostrukturierten Trä gers gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die gebundenen Moleküle Detektormoleküle zur Detektion der Probenmoleküle in der komplexen Probe und Targetmoleküle zur Detektion von der komplexen Probe zugegebenen Referenzmolekü len umfassen. 21. The microstructured carrier for quantitative measurement of molecular volumes in complex samples, wherein a plurality of polymeric molecules in a defined geometric arrangement are firmly bonded to the surface of the microstructured Trä gers, characterized in that the bound molecules detector molecules for the detection of sample molecules in the include complex sample and the target molecules for the detection of the complex sample added Referenzmolekü len.
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