DE10025384A1

DE10025384A1 - Quantitative measurement of molecular amounts in complex mixtures

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Publication number: DE10025384A1
Application number: DE10025384A
Authority: DE
Inventors: Johannes Schuchardt; Dieter Beule; Hanspeter Herzel
Original assignee: MICRODISCOVERY GmbH
Current assignee: MICRODISCOVERY GmbH
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2002-02-21
Also published as: WO2001090407A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Messung von Molekülmengen in komplexen Gemischen mittels Mikroarrays und anderen analogen Trägern. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a method for the quantitative measurement of molecular amounts in complex mixtures by means of microarrays and other analog carriers. Fields of application of the invention are molecular biology, medicine and the pharmaceutical industry.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Mes sung von Molekülmengen in komplexen Gemischen mittels Micro arrays und anderen mikrostrukturierten Trägern. Anwendungsge biete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a method for quantitative measurement Solution of molecular amounts in complex mixtures using Micro arrays and other microstructured carriers. Anwendungsge offer the invention are molecular biology, medicine and the pharmaceutical industry.

Microarrays bestehen aus einer Vielzahl polymerischer Molekü le, die mit einer definierten geometrischen Anordnung fest an der Oberfläche eines Trägersubstrates angebunden sind. Micro arrays von Polynukleotiden und Polypeptiden sind inzwischen ein wichtiges Werkzeug der Molekularbiologie sowie verwandter Technologien und Industrien. Sie werden in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt, zum Beispiel im Screening, in der DNA-Sequenzierung und in der Genexpressionsanalyse. Als Microarrays im Sinne dieser Ausführung werden auch komplexere Trägergeometrien (Biochips, Nanotechnologie) aufgefaßt, an deren Oberflächen kontrollierte chemische Reaktionen durchge führt werden. Im Folgenden werden die an der Oberfläche fi xierten Moleküle als Target (Target-Bibliothek) bezeichnet. Das zu untersuchende Substanzgemisch, das mit dem Array in Kontakt gebracht wird, wird als (komplexe) Probe bezeichnet. Probe und Array werden unter Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, nicht bindende Probenmoleküle werden wieder entfernt. Die Zahl der auf dem Träger verbliebenen Probenmo leküle bildet ein Hybridisierungsprofil und erlaubt die Be stimmung der molekulare Zusammensetzung der Probe [1, 2].Microarrays consist of a large number of polymeric molecules le with a defined geometric arrangement are attached to the surface of a carrier substrate. Micro Arrays of polynucleotides and polypeptides are now available an important tool of molecular biology as well as related Technologies and industries. You will be in a number of Applications used, for example in screening, in the DNA sequencing and in gene expression analysis. As Microarrays in the sense of this version are also becoming more complex Carrier geometries (biochips, nanotechnology) understood controlled chemical reactions on their surfaces leads. In the following, the fi xed molecules referred to as the target (target library). The mixture of substances to be investigated, which with the array in Contact is called a (complex) sample. The sample and array are mixed in under hybridization conditions Contacted, non-binding sample molecules are again away. The number of sample moons left on the support leküle forms a hybridization profile and allows loading the molecular composition of the sample [1, 2].

In der Praxis werden die auf dem Array verbliebenen Moleküle durch geeignete Markierung (z. B. fluoreszentes oder radioak tives Labeling) kenntlich gemacht und mit entsprechenden De tektionsverfahren (zum Beispiel Fluoreszenz- oder Laserscan ner) gemessen. Unabhängig von den Details der Arrays und der Detektionstechnik sind die derzeitigen Verfahren ungenau und es ist wenig über den Hybridisierungs- und Meßprozeß und die dabei auftretenden Fehler bekannt. Daher ist insbesondere der quantitative Zusammenhang der Konzentration der Probenmolekü le und des detektierten Signals unsicher. Besonders problema tisch ist der Vergleich verschiedener Arrays, da er eine quantitative Messung der Konzentration der Probenmoleküle er fordert.In practice, the molecules remaining on the array by suitable marking (e.g. fluorescent or radioactive tives labeling) identified and with appropriate de detection method (for example fluorescence or laser scan ner) measured. Regardless of the details of the arrays and the Detection technology, the current methods are imprecise and it is little about the hybridization and measurement process and the known errors that occur. Therefore, in particular quantitative relationship of the concentration of the sample molecule le and the detected signal uncertain. Particularly problematic The table is a comparison of different arrays since it is a quantitative measurement of the concentration of the sample molecules calls.

Bisher wurden folgende Methoden zur quantitative Messung an gewendet:
So far, the following methods have been used for quantitative measurement:

1. Comparison with sample-specific genes of little changeable ex strength of pressure (house keeping genes) [7].
2. Add two alien genes to the sample (spiking) in one fixed concentration [5].
3. Combination of the latter method with variable Target amounts [4].
4. Use of end-labeled sample molecules [3].

Weitere Verfahren sind aus [9] und [10] bekannt.Other methods are known from [9] and [10].

Alle diese Methoden erfassen nur einen Teil der bei der Hy bridisierung und Messung relevanten Parameter und beruhen auf unzureichend gesicherten Annahmen über den Hybridisierungs prozess.All of these methods cover only a part of the Hy bridization and measurement relevant parameters and are based on insufficient assumptions about hybridization process.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bisher bekannten Methoden zu beseitigen und ein Verfahren zu entwickeln, welches die parallele quantitative Messung von Molekülmengen in komplexen Gemischen ermöglicht.The invention has for its object the disadvantages of methods known to eliminate and a method to to develop the parallel quantitative measurement of Molecular amounts in complex mixtures possible.

Die Aufgabe der Erfindung wird mit den in den Ansprüchen be schriebenen Mitteln gelöst.The object of the invention is with the be in the claims written means solved.

Der Kernpunkt der erfindungsgemäßen Messung von Molekülmengen (Anzahlen oder Konzentrationen) in komplexen Gemischen mit tels Mikroarrays besteht darin, daß eine zu untersuchende Probe (z. B. DNA, RNA oder Polypeptide) mit einem komplexen Gemisch von Referenzmolekülen versetzt und auf einen Array aufgebracht wird, welcher neben den zur Probe passenden De tektormolekülen zusätzlich Targetmoleküle enthält, an welche die Referenzmoleküle in an sich bekannter Weise binden.The key point of the measurement of molecular amounts according to the invention (Numbers or concentrations) in complex mixtures with tels microarrays is that one to be examined Sample (e.g. DNA, RNA or polypeptides) with a complex Mixture of reference molecules added to an array is applied, which in addition to the De tector molecules additionally contains target molecules to which bind the reference molecules in a manner known per se.

Die Referenzmoleküle werden so ausgewählt, daß sie ähnliche Bindungscharakteristika wie die Probenmoleküle haben, aber weder untereinander noch mit den Probemolekülen oder den da zugehörenden Detektormolekülen wechselwirken. Ein Beispiel dafür ist, daß zur Untersuchung einer komplexen Probe aus Maus-cDNA ein Gemisch von pflanzenspezifischen Arabidopsis- cDNA Klonen zur Normierung beigegeben wird, welche in ihrem GC-Gehalt den Maus Klonen entsprechen, jedoch aufgrund ihrer Sequenz keine Wechselwirkungen mit diesen eingehen.The reference molecules are chosen to be similar Binding characteristics like the sample molecules have, however neither with each other nor with the sample molecules or those there associated detector molecules interact. An example for that is that to examine a complex sample Mouse cDNA a mixture of plant specific Arabidopsis cDNA clones are added for standardization, which in their GC content correspond to the mouse clones, however due to their Do not interact with the sequence.

Die Konzentrationen der Referenzmoleküle im Referenzgemisch werden vorzugsweise so gewählt, daß sie ein Abbild der Pro benmoleküle im Probengemisch sind.The concentrations of the reference molecules in the reference mixture are preferably chosen so that they represent the Pro Ben molecules are in the sample mixture.

Die Messung erfolgt in der Weise, daß die Referenzmoleküle mehrfach auf dem Array aufgebracht werden und aus dieser Mehrfachmessung der Meßfehler bestimmt wird.The measurement is carried out in such a way that the reference molecules be applied to and from the array several times Multiple measurement of the measurement error is determined.

Zur Überwachung der geometrischen Homogenität des Messvor gangs werden die Targetmoleküle für die Referenzprobe geord net auf dem gesamten Array aufgebracht.To monitor the geometrical homogeneity of the measuring device The target molecules are ordered for the reference sample net applied to the entire array.

Die erfindungsgemäße Methode kann auch auf anderen mi krostrukturierten Trägern wie z. B. Chips oder Nanotiterplat ten durchgeführt werden. Zur Detektion der gebundenen Proben und Referenzmoleküle bzw. der an ihnen befestigten Marker werden optische, elektrische oder mechanische Verfahren ver wendet.The method according to the invention can also be applied to other mi crostructed supports such. B. chips or Nanotiterplat be carried out. For the detection of the bound samples and reference molecules or the markers attached to them are optical, electrical or mechanical processes ver applies.

Durch Zugabe unterschiedlicher Mengen verschiedener Referenz moleküle zur Probe und Aufbringen entsprechender Targets auf dem Array ist eine erhebliche Verbesserung der quantitativen Messung der Konzentration der Probenmoleküle möglich. Damit ist auch die Vergleichbarkeit verschiedener Messungen gewähr leistet.By adding different amounts of different reference molecules to test and apply appropriate targets the array is a significant improvement in quantitative Measurement of the concentration of the sample molecules possible. In order to the comparability of different measurements is also guaranteed guaranteed.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für alle Arten von Molekü len anwendbar, die stöchiometrische Wechselwirkungen eingehen (Schlüssel-Schlosspaare bilden), insbesondere für RNA, PNA, DNA, und Proteine. Es besteht aus den folgenden Schritten:
The method according to the invention can be used for all types of molecules which enter into stoichiometric interactions (form key-lock pairs), in particular for RNA, PNA, DNA and proteins. It consists of the following steps:

1. Choice of reference molecules
2. Choice of the amount of reference molecules in the sample
3. Choice of the amount of reference molecules in the target
4. Choice of the number of reference molecules
5. Determination of the calibration curves and quantification of the pro benmenge
6. Determination of the measurement quality

Das Verfahren ist in Verbindung mit allen möglichen Technolo gien zur Molekülmengenbestimmung anwendbar. Insbesondere ist es unabhängig von der genauen Technologie, die zur Markierung (Labeling) der Moleküle eingesetzt wird, wie zum Beispiel ra dioaktive Markierung oder fluoreszente ein- oder Mehrfarbmar kierung.The procedure is in connection with all possible technolo gien applicable to the determination of the molecular amount. In particular is it regardless of the exact technology used to mark it (Labeling) of the molecules, such as ra dioactive marking or fluorescent single or multi-color mar kierung.

1. Choice of reference molecules

Durch geeignete Auswahl muss sichergestellt werden, dass die als Referenz verwendeten Moleküle möglichst geringe Wechsel wirkung mit den Molekülen aus der Target-Bibliothek zeigen. Die Referenzmoleküle können sowohl bekannte Klone/Proteine z. B. aus vorhandenen Molekül-Bibliotheken als auch neue ge eignet designte Moleküle sein. Die Referenzmoleküle sollen in ihren Bindungseigenschaften die chemischen Charakteristika der Probe reflektieren (z. B. in Längenverteilung oder GC- Gehalt) und gleichzeitig keine Wechselwirkung (etwa Hinter grund-Hybridisierung oder Kreuzhybridisierug) mit den Proben und den Targetmolekülen eingehen. Verfahren zur Auswahl und zum Design geeigneter DNA, RNA und Proteine sind in den fol genden Abschnitten beschrieben.A suitable selection must ensure that the Molecules used as a reference to minimize changes show effect with the molecules from the target library. The reference molecules can both be known clones / proteins z. B. from existing molecule libraries as well as new ge can be designed molecules. The reference molecules should be in the chemical characteristics of their binding properties reflect the sample (e.g. in length distribution or GC Salary) and at the same time no interaction (such as behind basic hybridization or cross hybridization) with the samples and enter into the target molecules. Procedure for selection and DNA, RNA and proteins suitable for the design are shown in fol sections described.

Prinzipiell gibt es zwei Wege, einen Referenzdatensatz zu konstruieren:
Auswahl der Moleküle aus einer fest vorgegebenen Bibliothek (natürlich vorkommend oder synthetisierter Moleküle) oder Neuentwurf synthetischer Moleküle mit bioinformatischen Me thoden. Auch eine Kombination der beiden Ansätze kann sinn voll sein: Bildung von synthetischen Hybridmolekülen aus Fragmenten einer Bibliothek bekannter Moleküle.In principle, there are two ways to construct a reference data record:
Selection of molecules from a predefined library (naturally occurring or synthesized molecules) or redesign of synthetic molecules using bioinformatic methods. A combination of the two approaches can also make sense: formation of synthetic hybrid molecules from fragments of a library of known molecules.

1.1 DNA

Zur Auswahl geeignter Kandidaten aus einer Menge bekannter Klone (Bibliothek) sollten nach Möglichkeit die Sequenzen sämtlicher in der Probe zu erwartenden und aller im Target gespotteten DNA-Moleküle bekannt sein. So kann am sichersten eine störende Wechselwirkung mit der Probe oder den Targetmo lekülen vermieden werden.To select suitable candidates from a number of known ones If possible, clones (library) should include the sequences all expected in the sample and all in the target spotted DNA molecules. This is the safest way an interfering interaction with the sample or the target mo reading should be avoided.

example

Für die Durchführung eines Hefe Hybridisierungsex perimentes sollen Referenzmoleküle ausgesucht werden. Als Suchbibliothek stehen das Genom des Archebakteriums Archeo globus fulgidus und Methanococcus janascii zur Verfügung. Durch Vorgabe einer Ähnlichkeitsschwelle (z. B. einem e-value bei BLAST) wird ein Satz von Molekülkandidaten mit genügend geringer Ähnlichkeit zum Hefegenom ausgewählt. Aus diesen Kandidaten wird ein Satz von nicht homologen Molekülen ausge wählt (z. B. mit dem in [6] beschriebenen Verfahren). Bei Be darf kann eine weitere Auslese nach Kriterien der molekularen Zusammensetzung (Länge, GC-Gehalt) erfolgen. For performing a yeast hybridization ex perimentes reference molecules should be selected. As Search library, the genome of the archae bacterium Archeo globus fulgidus and Methanococcus janascii are available. By specifying a similarity threshold (e.g. an e-value at BLAST) one set of molecular candidates is sufficient selected little similarity to the yeast genome. From these Candidates are given a set of non-homologous molecules chooses (e.g. using the method described in [6]). At Be a further selection based on the molecular criteria Composition (length, GC content).

1.2 oligonucleotides

Bei Oligonukleotiden ist eine de novo Synthese organismen fremder Moleküle naheliegend. Günstige Molekülkandidaten der Länge L (L-Nukleotide) können durch Auswahl schwach bevölker ter Regionen auf dem verallgemeinerten Hyperwürfel [8] der L- Nukleotide gefunden werden. Ein einfaches numerisches Verfah ren dazu versieht die M Oligonukleotide und alle im Genom des zu untersuchenden Organismus auftauchenden L-Nukleotide mit abstossenden Ladungen und sucht durch deterministische oder stochastische Iteration eine Konfiguration minimaler Energie im M.L-dimensionalen Konfigurationsraum der M L-Nukleotide.With oligonucleotides, a de novo synthesis is organisms of foreign molecules. Cheap molecular candidates of the Length L (L-nucleotides) can be sparsely populated by selection regions on the generalized hypercube [8] of the L- Nucleotides can be found. A simple numerical procedure The M oligonucleotides and all in the genome of the L-nucleotides to be examined organism with repelling charges and looking through deterministic or stochastic iteration a configuration of minimal energy in the M.L-dimensional configuration space of the M L nucleotides.

1.3 Proteins

Bei Proteinen und Peptiden ist die Situation komplizierter, da Molekülwechselwirkungen nicht über einfache Paarbindung erfolgen. Ist eine geeignete Funktion zur Beschreibung der molekularen Wechselwirkungen gefunden, so können die obenge nannten Verfahren sofort geeignet erweitert werden: das Ziel ist es wiederum, einen Satz von paarweise wechselwirkenden Molekülen zu suchen, die keine Bindung mit der Probe einge hen. Steht eine solche Wechselwirkungsfunktion nicht zur Ver fügung, so ist jedenfalls bei Oligopeptiden (Länge < 40) eine experimentelle Auswahl von Referenzmolekülen möglich: Ein grosser Satz von potentiellen Referenzmolekülen, etwa eine Zufallsbibliothek, wird in Festphasensynthese auf einem ge eigneten Träger fixiert. Die markierte Probe wird mit der Ma trix in Kontakt gebracht. Peptide, die keine Wechselwirkung eingegangen sind, kommen als Kandidaten in die engere Aus wahl. In Analogie zur oben beschriebenen Auswahl nicht homologer DNA-Moleküle aus der Datenbank werden durch weitere Hybridisierungsstudien nicht miteinander wechselwirkende Pep tide ausgewählt. The situation is more complicated with proteins and peptides, since molecular interactions do not have simple pair bonding respectively. Is a suitable function to describe the molecular interactions found, the above the procedures mentioned can be expanded immediately: the goal is, in turn, a set of pairs interacting Look for molecules that have no bond with the sample hen. Such an interaction function is not available addition, this is in any case for oligopeptides (length <40) Experimental selection of reference molecules possible: On large set of potential reference molecules, such as one Random library, is in solid phase synthesis on a ge suitable carrier fixed. The marked sample is measured with the Ma trix contacted. Peptides that do not interact have come in, come out as candidates in the narrow limit choice. Not in analogy to the selection described above homologous DNA molecules from the database are replaced by others Hybridization studies not interacting pep tide selected.

2. Choice of the amount of reference molecules in the sample

Die Mengen der verschiedenen Referenzmoleküle in der Probe sind so zu wählen, dass sie den gesamten Bereich der zu un tersuchenden Probenmengen abdecken. In der Praxis hat sich eine Abstufung der verschiedenen Mengen in Form einer Verdün nungsreihe bewährt. Eine Untergrenze der Verdünnungsreihe (geringste Molekülkonzentration) ist typischerweise durch die Detektorempfindlichkeit vorgegeben.The amounts of the different reference molecules in the sample are to be chosen so that they cover the entire area of the un cover the sample quantities. In practice it has a gradation of the different amounts in the form of a dilution proven series. A lower limit of the dilution series (lowest molecular concentration) is typically by Detector sensitivity specified.

3. Choice of the amount of reference molecules in the target

Die Menge der Normierungsmoleküle im Target sollte der typi schen Menge der auf dem Array aufgebrachten Targetbibliothek moleküle entsprechen. Ist diese Menge stark variabel, so sollte auch für die Targetmoleküle eine Verdünnungsreihe an gelegt werden. Das Verfahren ist im Abschnitt 5, Beispiel 2 genauer erläutert.The amount of normalization molecules in the target should be the typi The amount of the target library applied to the array correspond to molecules. If this amount is highly variable, so should also include a dilution series for the target molecules be placed. The procedure is in Section 5, Example 2 explained in more detail.

4. Choice of the number of reference molecules

In Abhängigkeit von der Array-Technologie müssen mehrere kri tische Parameter durch Kontrollmessungen oder Kontrollreihen beobachtet werden. Generell sind dies die Anzahl der wechsel wirkenden Moleküle auf dem Träger (Targetmoleküle) und die Anzahl wechselwirkender Moleküle in der komplexen Probe. Wei tere wichtige Parameter für z. B. cDNA Hybridisierungsexperi ment sind die Basenkomposition (gc-Gehalt) und die Länge der DNA-Moleküle. In der Praxis wird man je nach Verlässlichkeit der Technologie von nur wenigen Molekülen (einfache Verdün nungsreihe) bis zu zwanzig Prozent der Moleküle (mehrdimen sionale und wiederholte Verdünnungsreihe) auf dem Träger für die Normierung und Qualitätskontrolle einsetzen. Mit der An zahl der verwendeten Normierungsmoleküle steigt die erzielba re Messgenauigkeit, siehe Abschnitt 6. Depending on the array technology, several kri table parameters through control measurements or control series to be watched. Generally, these are the number of changes acting molecules on the carrier (target molecules) and the Number of interacting molecules in the complex sample. Wei tere important parameters for z. B. cDNA hybridization experiment are the base composition (gc content) and the length of the DNA molecules. In practice you become dependent on reliability the technology of just a few molecules (simple dilution series) up to twenty percent of the molecules (multi-dimen serial and repeated dilution series) on the carrier for use standardization and quality control. With the An The number of standardization molecules used increases the achievable Right measurement accuracy, see section 6.

In der Praxis hat sich die Verwendung eines Standardnormie rungssatzes von 384 Molekülen bewährt, die beim Experiment als Referenzmenge mit gespottet werden. Dieses Vorgehen mini miert Komplikationen bei der Durchführung des Experimentes und gewährleistet eine grosse Reproduzierbarkeit. In Abhän gigkeit vom durchgeführten Experiment kann die Mehrfachauf bringung gleicher oder die Auswahl möglichst vieler verschie dener Referenzmoleküle oder ein Kompromiss dieser beiden Wege sinnvoll sein. Generell erlaubt das wiederholte Aufbringen von Verdünnungsreihen die Abschätzung des Messfehlers, wie unten in Beispiel 1 beschrieben.In practice there has been the use of a standard proven set of 384 molecules that were used in the experiment be spotted as a reference quantity. This procedure mini complications when carrying out the experiment and ensures great reproducibility. Depending The multiple of the experiment can be carried out bring the same or the selection of as many different as possible their reference molecules or a compromise between these two paths make sense. Generally allows repeated application of dilution series the estimation of the measurement error, such as described below in Example 1.

Eine Absicherung des ausgewählten Moleküldatensatzes erfolgt in einer Voruntersuchung, bei der die Referenzmoleküle ein zeln und gemeinsam, aber ohne Beigabe der komplexen Probe mit dem Array in Kontakt gebracht werden: es sollten keine Wech selwirkungen mit den zur Probenmessung bestimmten Targetklo nen auftreten. In einem komplementären Experiment wird die Probe ohne Beigabe von Referenzmolekülen auf den Array aufge bracht: es sollten keine Wechselwirkungen mit den als Refe renz bestimmten Targetklonen auftreten.The selected molecular data set is backed up in a preliminary investigation, in which the reference molecules individually and together, but without adding the complex sample be brought into contact with the array: there should be no changes interactions with the target toilet intended for sample measurement NEN occur. In a complementary experiment, the Sample is added to the array without adding reference molecules brings: there should be no interactions with those as a refe certain target clones occur.

5. Determination of the calibration curve and quantification of the sample amounts

Aus den Signalstärken der Referenzmoleküle kann durch Opti mierung geeigneter Modellparameter oder geeignete Interpola tionsverfahren eine (im allgemeinen nichtlineare) Eichkurve bestimmt werden. Durch analytische oder numerische Inversion dieser Eichkurve kann die Probenmenge aus der Signalstärke bestimmt werden. Liegen freie Parameter vor, die das Bin dungsverhalten der Moleküle beeinflussen, wie z. B. der GC- Gehalt bei DNA-Molekülen, so ist eine ganze Schar von Über tragungsfunktionen zu bestimmen. Im Fall von räumlich inhomo genen Arrays ist ebenfalls die Bestimmung mehrerer Eichkurven erforderlich. From the signal strengths of the reference molecules, Opti suitable model parameters or suitable interpolation a (generally non-linear) calibration curve be determined. Through analytical or numerical inversion This calibration curve can determine the amount of sample from the signal strength be determined. Are there any free parameters that the bin influence behavior of the molecules, such as. B. the GC Content in DNA molecules, so is a whole host of excess to determine carrying functions. In the case of spatially inhomo arrays is also the determination of several calibration curves required.

example 1

Sind alle Targetmoleküle in gleicher Anzahl auf dem Träger aufgebracht und ist der Einfluss weiterer Parameter gering, so genügt eine einfache Verdünnungsreihe, um eine Quantifi zierung des Signales vorzunehmen. Die Referenzmoleküle werden dazu auf verschiedene Konzentrationen verdünnt, z. B. so, dass ihre Konzentration c in zehn Stufen, jeweils um einen Faktor zwei abnimmt (c₁, . . ., c₁₀). Damit kann ein Messbereich von drei Dekaden kontrolliert werden. Die genaue Wahl Verdün nungstufen hängt vom dynamischen Messbereich und der gefor derten experimentellen Genauigkeit ab. Die Normierungsmolekü le werden der komplexen Probe beigegeben (gespiked) und die Komplementmoleküle in einer Anzahl entsprechend der übrigen Targetmoleküle auf dem Träger angebracht. Nach der Durchfüh rung des Hybridisierungsexperimentes wird zu jeder der Ver dünnungsstufen c_k ein entsprechendes Signal s_k gemessen: c_k → s_k. Diese Signale können jetzt verwendet werden, um die Transmissionsfunktion T(c) (Quantifizierungsfunktion) zu be stimmen. Im einfachsten Fall wird diese Funktion durch linea re Interpolation der Messpunkte definiert, im allgemeinen wird man eine Modellfunktion an die Messdaten anpassen (siehe Abb. 1). In diesem speziellen Beispiel (Abb. 1) wurde als Transmissionsfunktion T(x) = α.(1-exp(-(x + β)/α)) ange nommen. Durch Inversion der Transmissionsfunktion kann die Quantifizierungsfunktion Q(s) = T^-1 (s)bestimmt werden. Die Quantifizierungsfunktion erlaubt es, aus jedem gemessenen Si gnal s* auf die zugrundeliegende Molekülkonzentration in der Probe zurückzuschliessen: c* = Q(s*) (siehe Abb. 2).If all of the target molecules are applied in the same number and the influence of other parameters is small, a simple series of dilutions is sufficient to quantify the signal. For this purpose, the reference molecules are diluted to different concentrations, e.g. B. so that their concentration c decreases in ten steps, each by a factor of two (c ₁ ,..., C ₁₀ ). This means that a measuring range of three decades can be controlled. The exact choice of dilution levels depends on the dynamic measuring range and the required experimental accuracy. The normalization molecules are added to the complex sample (spiked) and the complement molecules are attached to the carrier in a number corresponding to the other target molecules. After carrying out the hybridization experiment, a corresponding signal s _{k is} measured for each of the dilution stages c _k : c _k → s _k . These signals can now be used to determine the transmission function T (c) (quantification function). In the simplest case, this function is defined by linear interpolation of the measurement points; in general, a model function will be adapted to the measurement data (see Fig. 1). In this specific example ( Fig. 1), the transmission function T (x) = α. (1-exp (- (x + β) / α)) was assumed. The quantification function Q (s) = T ^-1 (s) can be determined by inversion of the transmission function. The quantification function makes it possible to deduce the underlying molecular concentration in the sample from each measured signal s *: c * = Q (s *) (see Fig. 2).

Example 2

Ist die gemessene Intensität stark von einem oder mehreren weiteren Parametern wie zum Beispiel dem GC-Gehalt der Se quenzen abhängig, so ist eine ganze Schar von Normierungskur ven zu bestimmen. Ein Beispiel ist in Abb. 3 gezeigt.If the measured intensity is heavily dependent on one or more other parameters, such as the GC content of the sequences, a whole host of standardization curves must be determined. An example is shown in Fig. 3.

Bei der Umrechnung von der Signalintensität in die Molekül konzentration ist dann die entsprechende Kurve zu wählen. When converting the signal intensity into the molecule then the corresponding curve is to be selected.

Will man etwa für ein Molekül mit einem GC-Gehalt von 30% die Molekülkonzentration aus dem gemessenen Signal bestimmen, so verwendet man die unterste Quantifizierungskurve. Ist der Einfluss des GC-Gehaltes aus allgemeinen Überlegungen be kannt, so reicht die in Beispiel 1 besprochene eindimensiona le Verdünnungsreihe aus. Der GC-Gehalt taucht dann explizit als zusätzlicher Parameter in der Transmissionsfunktion auf. Ist eine analytische Beziehung nicht bekannt, so muss für ei nen repräsentativen Parameterbereich GC_min . . . GC_max der Einfluss auf die Transmissionsfunktion untersucht werden.If, for example, you want to determine the molecule concentration from the measured signal for a molecule with a GC content of 30%, the lowest quantification curve is used. If the influence of the GC content is known from general considerations, the one-dimensional dilution series discussed in Example 1 is sufficient. The GC content then appears explicitly as an additional parameter in the transmission function. If an analytical relationship is not known, GC _min . , , GC _max the influence on the transmission function can be examined.

Example 3

Ist die Anzahl der Targetmoleküle auf dem Träger für ver schiedene Moleküle verschieden gross und hat einen deutlichen Einfluss auf die Messung, so ist eine zweidimensionale Ver dünnungsreihe erforderlich. Dabei werden in Analogie zu Bei spiel 1 Verdünnungsreihen gebildet. Soll die Probenkonzentra tion c_P auf n Stufen und die Targetkonzentration c_t auf m Stufen gemessen werden, so ist es sinnvoll m × n verschiedene Normierungsmoleküle zu wählen, um die Unabhängigkeit der Ver dünnungsexperimente zu gewährleisten. Jetzt bildet man eine Verdünnungs-Matrix aus n Zeilen uni m Spalten: Jeder Matri xeintrag entspricht einem komplementären Paar von Proben und Targetmolekül.
If the number of target molecules on the carrier is different for different molecules and has a significant influence on the measurement, a two-dimensional dilution series is required. Analogous to Example 1, dilution series are formed. If the sample concentration c _{P is} to be measured at n levels and the target concentration c _t at m levels, it makes sense to choose m × n different standardization molecules to ensure the independence of the dilution experiments. Now a dilution matrix is formed from n rows and columns: each matrix entry corresponds to a complementary pair of samples and target molecule.

Representation of the dilution matrix

Die Konzentration in der komplexen Probe wird von Zeile zu Zeile herabgesetzt, die Konzentration im Target wird von Spalte zu Spalte herabge setzt. Beispiel: Molekül 69 hat eine Probenkonzentration von 1 : 64 der Probenausgangskonzentration und das Komplement auf dem Microarray eine Targetkonzentration von 1 : 256 der Targe tausgangskonzentration.The concentration in the complex sample is degraded from row to row which Concentration in the target is decreased from column to column puts. Example: Molecule 69 has a sample concentration of 1:64 of the sample starting concentration and the complement the microarray has a target concentration of 1: 256 of the target tausgangskonzentration.

Die Konzentration der Probenmoleküle c_p wird entsprechend der Proben-Verdünnungsreihe von Zeile zu Zeile herabgesetzt. Die Konzentration der Targetmoleküle c_t wird entsprechend der Proben-Verdünnungsreihe von Spalte zu Spalte herabgesetzt. Nach Durchführung des Experimentes wird ähnlich wie im Bei spiel 1 eine zweidimensionale Transferfunktion T bestimmt, die es erlaubt, jedem Paar (c_p, c_t) von Proben- und Target konzentration eine Signalstärke s = T(c_p, c_t) zuzuordnen. Wird die Targetkonzentration c_t durch direkte Messung (etwa Absorptionsspektroskopie) bestimmt, so kann die Konzentration c_p* eines untersuchten Moleküls aus dem gemessenen Signal s* durch Bildung einer parametrisierten Umkehrfunktion analog zu Beispiel 1 ermittelt werden: c_p* = T^-1 _ct (s*). The concentration of the sample molecules c _p is reduced from row to row in accordance with the sample dilution series. The concentration of the target molecules c _t is reduced from column to column according to the sample dilution series. After carrying out the experiment, a two-dimensional transfer function T is determined similarly to that in example 1, which allows each pair (c _p , c _t ) of sample and target concentration to be assigned a signal strength s = T (c _p , c _t ). If the target concentration c _{t is} determined by direct measurement (for example absorption spectroscopy), the concentration c _p * of an investigated molecule can be determined from the measured signal s * by forming a parameterized inverse function analogously to Example 1: c _p * = T ^-1 _ct (s *).

6. Determination of the measurement quality

Die Messgüte ist durch die Reproduzierbarkeit von Messungen bestimmt. Die Reproduzierbarkeit ist durch den erwarteten Messfehler bei Wiederholungsmessung gegeben (mittleres Schwankungsquadrat). Der typische Messfehler bei muss in Ab hängigkeit von der gegebenen Signalstärke bestimmt werden. Ein Anhaltspunkt für den Messfehler kann bereits aus Wieder holung der Normierungsreihe gewonnen werden. Mit Hilfe des Fehlerfortpflanzungsgesetzes oder durch Anwendung der Umkehr funktion kann daraus die effektive Messgenauigkeit im gesam ten Messbereich abgeleitet werden (siehe Abb. 1 und Abb. 2). Eine echte Qualitätskontrolle erfordert jedoch die wiederhol te Durchführung des gesamten Experimentes. Die Mehrfachmes sung erlaubt wiederum unter Verwendung der Umkehrfunktion die Bestimmung der effektiven Schwankungsbreite sowohl der indi viduellen Messung, als auch eines gegebenen Intensitätsberei ches.The measurement quality is determined by the reproducibility of measurements. The reproducibility is given by the expected measurement error in the case of a repeat measurement (mean fluctuation square). The typical measurement error at must be determined as a function of the given signal strength. A reference point for the measurement error can already be obtained by repeating the standardization series. With the help of the error propagation law or by using the inverse function, the effective measuring accuracy in the entire measuring range can be derived (see Fig. 1 and Fig. 2). Real quality control, however, requires the entire experiment to be repeated. The multiple measurement in turn allows the effective fluctuation range of both the individual measurement and a given intensity range to be determined using the inverse function.

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[8] P. Schuster: Landscapes and molecular evolution. Physica D 107, 1997
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[8] P. Schuster: Landscapes and molecular evolution. Physica D 107, 1997
[9] US 6,040,138
[10] US 5,620,901

Legends for the illustrations

Abb. 1 Konstruktion der Eichkurve (Transmissionsfunktion T) ausgehend von sechs Wiederholungen einer Verdünnungsreihe. Fig. 1 Construction of the calibration curve (transmission function T) based on six repetitions of a dilution series.

Abb. 2 Rekonstruktion der Molekülkonzentrationen mithilfe der Quantifizierungsfunktion Q. Die sechs Wiederholungen der Verdünnungsreihe dienen zur Schätzung des erwarteten Messfeh lers. Fig. 2 Reconstruction of the molecular concentrations using the quantification function Q. The six repetitions of the dilution series serve to estimate the expected measurement error.

Abb. 3 Ist die beobachtete Signalintensität stark von einem Parameter, wie dem GC-Gehalt abhängig, so ist eine Schar von Quantifizierungsfunktionen zu bestimmen. Fig. 3 If the observed signal intensity is heavily dependent on a parameter such as the GC content, a host of quantification functions must be determined.

Claims

1. A method for measuring amounts of molecules in complex mixtures by means of an array, characterized in that a sample to be examined is mixed with a complex reference mole of coolant mixture and applied to an array which, in addition to the detector molecules matching the sample, additionally contains molecules to which the Bind reference sample molecules.

2. The method according to claim 1, characterized in that the reference molecules on the one hand have similar binding characteristics Stika like the sample molecules, but on the other hand under little interaction with each other and with the sample molecules have kung.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the concentrations of the reference molecules in the reference mixture an image of the concentrations of the sample molecules in the sample are mixed.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detector molecules for the reference samples several times on the Array are applied and from this multiple measurement of Measurement error is determined.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detector molecules for the reference sample are arranged on the entire array and thus the geome trical homogeneity of the measuring process is monitored.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that instead of a microarray, other microstructured carriers (e.g. chips or nanotiter plates) can be used.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that provide the sample and reference molecules with marker molecules are by means of optical, electrical or mechanical Methods are detectable, the sample and reference mo lekülen measurement signals are assigned.

8. The method according to claim 7, characterized in that at least one from the measurement signal strength of the reference molecules Calibration curve is used to determine the amount of molecules of the sample molecules from the measurement signal strengths of the sample molecule le is used.

9. The method according to claim 8, characterized in that by means of dilution series of the sample and reference molecules Measurement signals are obtained, which are used to determine the least a calibration curve can be used.

10. The method according to claim 9, characterized in that ver the reference molecules to different concentrations thins and be added to the sample molecule mixture.

11. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that optical, electrical or mechanical methods for detection on the bound sample and reference molecules or on attached markers can be used.

12. A method for measuring amounts of molecules in complex mixtures using an array, characterized in that
a sample to be examined is mixed with a complex reference molecular mixture and applied to an array which, in addition to the detector molecules matching the sample, additionally contains molecules to which the reference sample molecules bind, the reference molecules having similar binding characteristics to the sample molecules, on the other hand but have little interaction with each other and with the sample molecules;
the sample and reference molecules are provided with marker molecules which can be detected by means of optical, electrical or mechanical methods, with the sample and reference molecules being assigned measurement signals;
the reference molecules are diluted to different concentrations and added to the sample molecule mixture and
from the measurement signal strength of the reference molecules at least one calibration curve is determined, which is used to determine the molar amounts of the sample molecules from the measurement signal strengths of the sample molecules.

13. The method according to claim 12, characterized in that by means of dilution series of the sample and reference molecules Measurement signals are obtained, which are used to determine the least a calibration curve can be used.

14. Procedure for selecting a set of reference molecules len from an existing molecular library, the Refe reference molecules when determining the molecular amounts of a com plexen sample molecule mixture serve as reference, derge stalt that the reference molecules are chosen so that the molecular interaction of the reference molecules with each other and with the sample molecules of the sample molecule mixture mini is lubricated.

15. The method according to claim 14, characterized in that the reference molecules in their binding properties the bin similar properties of the sample molecules.

16. The method according to claim 14 or 15, characterized in that the molecular interaction by means of a functional be is written and the reference molecules are chosen so that the interaction described by the functional mi is minimized.

17. Procedure for selecting a set of reference molecules len from an existing molecular library using a functional that approximates the molecular interaction describes in such a way that the selected Mo read minimal interactions with each other and with the Expect sample molecules.

18. Procedure for selecting a set of reference molecules len through in silico construction and de novo synthesis Using a functional that changes the molecular change interaction approximately describes such that the constructed molecules minimal interactions with each other which and with the sample molecules can be expected.

19. The method according to claim 18, characterized in that the sample molecules are nucleotides and the Sample molecules on weakly populated regions on the ver generalized hypercubes of nucleotides of length L (L- Nucleotides) are searched for.

20. The method according to claim 19, characterized in that
the sample molecules of length L are mapped in the generalized hypercube of the L nucleotides and repulsive charges are assigned to them;
repulsive charges are also assigned to the reference molecules and imaged in the hypercube;
whereby a configuration of minimal energy is sought by deterministic or stochastic iteration.

21. Microstructured support for the quantitative measurement of Molecular amounts in complex samples in which a large number of polymeric molecules in a defined geometric Arrangement firmly on the surface of the microstructured Trä gers are bound characterized in that the bound molecules detector molecules for the detection of the Sample molecules in the complex sample and target molecules for Detection of the reference molecule added to the complex sample len include.