DE10009799A1

DE10009799A1 - Nucleic acids encoding phosphoserine phosphatase and phosphoserine aminotransferase from coryneform bacteria useful to transform microorganisms for the microbial production of L-serine

Info

Publication number: DE10009799A1
Application number: DE10009799A
Authority: DE
Inventors: Petra Peters-Wendisch; Lothar Eggeling; Hermann Sahm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2001-09-13

Abstract

Isolated nucleic acid encoding phosphoserine phosphatase and phosphoserine aminotransferase from coryneform bacteria is new. an isolated nucleic acid (N1) encoding a phosphoserine phosphatase comprising the 1765 or 1627bp sequence fully defined in the specification, or its allele, homologue, derivative or complement, and an isolated nucleic acid (N2) encoding a phosphoserine aminotransferase comprising the 1469 or 1304 bp sequence fully defined in the specification, or its allele, homologue, derivative or complement. Independent claims are also included for the following: (1) phosphoserine phosphatase or its fragment encoded by N1; (2) phosphoserine aminotransferase or its fragment encoded by N2; (3) a genetic construct comprising at least N1 or N2 operatively linked to regulatory sequences; (4) a vector comprising at least N1, N2 or the above construct and nucleotide sequences for selection and replication in a host cell or for integration into a host cell genome; (5) a genetically modified microorganism containing in replicable form at least N1 or N2 where the unmodified form does not express N1/N2 or has fewer N1/N2 copy numbers; (6) a probe for identifying and/or isolating a gene encoding an L-serine biosynthesis protein produced from N1 or N2 and a detection marker; (7) isolating N1 or N2 produced in coryneform bacteria which by transposon mutagenase exhibits defects in the gene; (8) microbial production of L-serine, comprising: (a) isolating at least N1 or N2 from a coryneform bacteria and transferring it to a homologous microorganism, so that expression and/or activity of the expressed polypeptide is higher than the non-transformed microorganism; (b) fermenting the transformed bacteria to produce L-serine; and (c) isolating the expressed L-serine from the culture medium; (9) microbial production of L-serine, comprising: (a) isolating a nucleic acid encoding serB and/or serC and thrE or their allele or derivative from corynebacteria and transferring it to a homologous microorganism so that expression and/or lifespan of the nucleic acid, and/or lifespan and/or activity of the expressed polypeptide is higher than in the transformed microorganism; (b) fermenting the transformed bacteria to produce L-serine, and (c) isolating the expressed L-serine from the culture medium.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien kodierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine sowie Verfahren zu deren Isolierung. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von L-Serin.The present invention relates to nucleotide sequences of coryneform bacteria coding for proteins and processes involved in the biosynthesis of L-serine their insulation. The present invention further relates to an improved method for the production of L-serine.

Aminosäuren, wie beispielsweise L-Glutamat, L-Lysin oder auch verzweigtkettige L- Aminosäuren sind in den letzten Jahren zunehmend in den Focus wirtschaftlichen Interesses gerückt. Dies gilt gleichermaßen auch für die Aminosäure L-Serin, die nicht nur als Vorstufe zur Synthese der aliphatischen Aminosäuren L-Glycin oder L- Cystein, sondern auch zur Herstellung von L-Tryptophan aus Indol und L-Serin dient. Hierbei wird für die Aminosäure L-Serin insbesondere in der Nahrungsmittel- Futtermittel- und Pharmaindustrie sowie in weiten Bereichen der Humanmedizin ein zunehmend wirtschaftliches Potential gesehen.Amino acids, such as L-glutamate, L-lysine or branched-chain L- Amino acids have been increasingly in focus in recent years Interest. This also applies to the amino acid L-serine not only as a precursor to the synthesis of the aliphatic amino acids L-glycine or L- Cysteine, but also for the production of L-tryptophan from indole and L-serine. For the amino acid L-serine, especially in food Feed and pharmaceutical industries as well as in many areas of human medicine increasingly seen economic potential.

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sind in der Literatur zahlreich beschrieben. Auch sind bereits Fermentationen coryneformer Bakterien zur Herstellung von L-Serin bekannt. So ist beispielsweise ein Stamm von Corynebacterium glycinophilum in der Lage L-Serin aus Glycin und Kohlenhydraten zu bilden (Kubota K, Kageyama K, Shiro T und Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K und Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365). An der Umsetzung von Glycin zu L-Serin ist hier das Enzym L-Serin- Hydroxymethyltransferase beteiligt (Kubota K und Yokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67 (6): 387-390). Die verwendeten Bakterienstämme weisen ferner einen verminderten Serin-Abbau auf, der auf eine Verringerung der Aktivität des Enzyms L-Serin-Dehydratase zurückzuführen ist (Kubota K, Kageyama K, Shiro T und Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K (1985) Agricultural Biological Chemistry, 49: 7-12). Methods for the microbial production of L-serine are numerous in the literature described. Fermentations of coryneform bacteria are also already available Production of L-serine known. For example, a strain of Corynebacterium glycinophilum capable of L-serine from glycine and carbohydrates form (Kubota K, Kageyama K, Shiro T and Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K, Kageyama K, Maeyashiki I, Yamada K and Okumura S (1972) Journal of General Applications in Microbiology 18: 365). The enzyme L-serine is involved in the conversion of glycine to L-serine. Hydroxymethyltransferase involved (Kubota K and Yokozeki K (1989) Journal of Fermentation and Bioengeneering, 67 (6): 387-390). The used Bacterial strains also show a reduced serine breakdown, which is due to a Reduction in the activity of the enzyme L-serine dehydratase is due (Kubota K, Kageyama K, Shiro T and Okumura S (1971) Journal of General Applications in Microbiology, 17: 167-168; Kubota K (1985) Agricultural Biological Chemistry, 49: 7-12).

Weiterhin ist die fermentative Herstellung von L-Serin aus Methanol und Glycin mit Hilfe methylotropher Bakterien, beispielsweise der Gattung Hyphomicrobium bei Izumi Y, Yoshida T, Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A und Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432 beschrieben.The fermentative production of L-serine from methanol and glycine is also involved With the help of methylotrophic bacteria, for example the genus Hyphomicrobium Izumi Y, Yoshida T, Miyazaki SS, Mitsunaga T, Ohshiro T, Shiamo M, Miyata A and Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432.

In den zuvor genannten Fällen ist allerdings der Zusatz der Aminosäure Glycin als Vorstufe für die Bildung der Aminosäure L-Serin ausgehend von Kohlenhydraten erforderlich.In the aforementioned cases, however, the addition of the amino acid is glycine Precursor for the formation of the amino acid L-serine from carbohydrates required.

Demgegenüber sind bereits Verfahren zur Fermentation coryneformer Bakterien bekannt, die L-Serin direkt aus Kohlenhydraten, ohne zusätzliche Beigabe weiterer Vorstufen produzieren können. So sind z. B. Bakterienstämme der Gattung Corynebacterium und insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum bei Yoshida H und Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48: 201-208 beschrieben, die durch eine ungerichtete Mutagenese erhalten wurden und sich u. a. dadurch auszeichnen, daß sie resistent gegenüber den L-Serin-Analoga Serin- Hydroxamat bzw. β-Chloroalanin sind. Dies führt u. a. dazu, daß der Stoffwechselfluß vermehrt in Richtung L-Serin Biosynthese fließen kann, da die Aktivität der entsprechenden Enzyme einer geringeren Endprodukthemmung unterliegen.In contrast, there are already processes for the fermentation of coryneform bacteria known, the L-serine directly from carbohydrates, without additional addition Can produce preliminary stages. So z. B. bacterial strains of the genus Corynebacterium and especially the species Corynebacterium glutamicum Yoshida H and Nakayama K (1974) Nihon-Nogei-Kagakukaishi 48: 201-208 described, which were obtained by an undirected mutagenesis and u. a. characterized in that they are resistant to the L-serine analogues serine Hydroxamate and β-chloroalanine are. This leads u. a. that the Metabolic flow can increasingly flow towards L-serine biosynthesis, since the Activity of the corresponding enzymes of a lower end product inhibition subject to.

Aus der EP 0 931 833 sind ferner Bakterienstämme der Spezies Brevibacterium flavum bekannt, die ebenfalls durch ungerichtete Mutagenese erhalten wurden und aufgrund dessen Defekte im Serin-Abbau aufweisen. Ferner weisen die dort beschriebenen Stämme ein verändertes serA-Gen auf, welches für eine feedback desensitive 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase kodiert. Zusätzlich enthalten diese Stämme die aus dem heterologen Organismus Escherichia coli stammenden Gene serB und serC, die für die Enzyme Phosphoserin-Phosphatase bzw. Phosphoserin- Aminotransferase kodieren. Das hier beschriebene System weist somit eine hohe Komplexizität hinsichtlich der Vielzahl zusätzlich eingeführter, z. T. heterologer Genstrukturen auf, verbunden mit einer genetischen Unbestimmtheit der Bakterienstämme hinsichtlich der eingangs erwähnten ungerichteten Mutagenese. Dies birgt die Gefahr einer relativ hohen Instabilität solcher Bakterienstämme im Verlauf eines Produktionsverfahrens im großtechnischen Maßstab in sich. Ferner ist beschrieben, daß durch die hier dargestellten Bakterienstämme lediglich eine um den Faktor 2 bis maximal Faktor 5 gesteigerte L-Serin-Produktion erreicht wird. Dies kann u. a. in einer suboptimalen Expression heterologer Gene begründet sein. Ein weiterer Nachteil heterologer Systeme liegt in der geringen Akzeptanz von Fremd-DNA enthaltenden Systemen, insbesondere zur Produktion von medizinisch, pharmakologisch und Nahrungsmittel-relevanten Substanzen.Bacterial strains of the species Brevibacterium are also from EP 0 931 833 flavum known, which were also obtained by undirected mutagenesis and due to its defects in serine breakdown. Furthermore, they point there described strains an altered serA gene, which for feedback encoded desensitive 3-phosphoglycerate dehydrogenase. They also contain these Strains the genes from the heterologous organism Escherichia coli serB and serC, which are responsible for the enzymes phosphoserine phosphatase and phosphoserine Encode aminotransferase. The system described here thus has a high Complexity with regard to the large number of additional, e.g. T. more heterologous Genetic structures associated with a genetic indeterminacy of the Bacterial strains with regard to the undirected mutagenesis mentioned at the beginning. This carries the risk of a relatively high instability of such bacterial strains in the The course of a production process on an industrial scale. Further is described that only one um by the bacterial strains shown here L-serine production increased by a factor of 2 to a maximum of factor 5. This can u. a. be based on a suboptimal expression of heterologous genes. Another disadvantage of heterologous systems is the low acceptance of Systems containing foreign DNA, in particular for the production of medical, pharmacologically and food-relevant substances.

Folglich ist die Verfügbarkeit der entscheidend an der Biosynthese von L-Serin beteiligten Gene aus coryneformen Bakterien zum Einsatz in einem homologen System wünschenswert.Consequently, the availability of is crucial to the biosynthesis of L-serine involved genes from coryneform bacteria for use in a homologous System desirable.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein System zur Verfügung zu stellen, das die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist und eine verbesserte Produktion von L-Serin oder davon ableitbaren Stoffwechselprodukten ermöglicht.The aim of the present invention is therefore to provide a system that no longer has the disadvantages mentioned above and an improved one Production of L-serine or derived metabolic products.

Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.This object is achieved by the present invention.

Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäure kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase enthaltend ein Gen serB ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 1 oder 5 (Fig. 1) sowie einer isolierten Nukleinsäure kodierend für eine Phosphoserin-Aminotransferase enthaltend ein Gen serC ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 3 oder 7 (Fig. 1) oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenzen oder mit diesen hybridisierende Nukleotidsequenzen.The object of the invention is to provide an isolated nucleic acid coding for a phosphoserine phosphatase containing a gene serB selected from the sequences according to SEQ ID No 1 or 5 ( FIG. 1) and an isolated nucleic acid coding for a phosphoserine aminotransferase containing a gene serC selected from the sequences according to SEQ ID No 3 or 7 ( FIG. 1) or an allele, homologue or derivative of these nucleotide sequences or nucleotide sequences hybridizing with them.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum isoliert werden. Beispiele für in Stammkulturen hinterlegte Wildtypen coryneformer Bakterien sind Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. Beispiele für zur Herstellung von L- Serin geeignete Mutanten oder Produktionsstämme sind Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 und Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. Die vorliegende Erfindung wird durch die Angabe der zuvor genannten Bakterienstämme näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend wirkt.The nucleic acids according to the invention are also characterized in that they from coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum can be isolated. Examples of those stored in regular cultures Wild-type coryneform bacteria are Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 and Brevibacterium divaricatum ATCC 14020. Examples of the production of L- Mutants or production strains suitable for serine are Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 and Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. The present invention is by the specification of the aforementioned bacterial strains is characterized in more detail, however does not have a limiting effect.

Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.Under an isolated nucleic acid or an isolated nucleic acid fragment according to the invention to understand a polymer from RNA or DNA, the single or can be double-stranded and optionally natural, chemically synthesized, may contain modified or artificial nucleotides. The term DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.

Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht.According to the invention, alleles are functionally equivalent, i.e. H. essentially to understand equivalent nucleotide sequences. Functionally equivalent Sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code have the desired functions. Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here as well artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis and optionally to the Codon use of the host organism adapted nucleotide sequences. About that In addition, functionally equivalent sequences include those that have changed Have nucleotide sequence which the enzyme, for example, a desensitivity or confers resistance to inhibitors.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.A functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural ones or artificial mutations of an originally isolated sequence that continue show the desired function. Mutations include substitutions, additions, Deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues. Also included here are so-called sense mutations that refer to Protein level, for example, lead to the exchange of conserved amino acids can, but which do not fundamentally change the activity of the Proteins lead and are therefore functionally neutral. This also includes changes the nucleotide sequence that is at the protein level the N- or C-terminus of a protein affect, but without significantly affecting the function of the protein. These changes can even have a stabilizing influence on the protein structure exercise.

Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym- Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.Such nucleotide sequences are also, for example, by the with the present invention, which can be obtained by modifying the Nucleotide sequence resulting in corresponding derivatives. Target one such modification can, for. B. the further narrowing of those contained therein coding sequence or z. B. also the insertion of further restriction enzyme Interfaces. Functional equivalents are also those variants whose Function, compared to the original gene or gene fragment, weakened or is reinforced.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.The present invention also relates to artificial DNA sequences, as long as they convey the desired properties as described above. Such artificial DNA sequences can be translated back, for example of computer-aided programs (molecular modeling) Proteins or be determined by in vitro selection. Are particularly suitable coding DNA sequences by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host organism. The specific codon usage can be done using molecular genetic methods familiar specialist through computer evaluations of other, already known genes easily determine the organism to be transformed.

Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden. According to the invention, homologous sequences are to be understood as those which belong to the nucleotide sequences according to the invention are complementary and / or with these hybridize. The term hybridizing sequences includes the invention substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA, the specific under stringent conditions known per se Interaction (binding) with the aforementioned nucleotide sequences. This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example 10 to 30, preferably 12 to 15 nucleotides. This includes u. a. also so-called primers or probes.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.According to the invention, the coding regions (structural genes) are also preceding (5 'or upstream) and / or subsequent (3' or downstream) Sequence areas included. In particular, sequence areas are included here regulatory function included. You can see the transcription, the RNA stability or affect RNA processing and translation. examples for regulatory sequences are u. a. Promoters, enhancers, operators, Terminators or translation amplifiers.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Genstruktur enthaltend wenigstens eine der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern.The present invention also relates to a gene structure at least one of the nucleotide sequences described above coding for one Phosphoserine phosphatase or phosphoserine aminotransferase as well as with these operatively linked regulatory sequences which express the expression of the control coding sequences in the host cell.

Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt (Eikmanns, B. J. et al., 1991, Gene, 102: 93-98).An operational link is understood to mean the sequential arrangement for example of the promoter, coding sequence, terminator and possibly other regulatory elements such that each of the regulatory elements has its own Fulfill the function in the expression of the coding sequence as intended can. These regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or obtained by chemical synthesis. As a promoter is fundamental any promoter suitable for gene expression in the corresponding Can control host organism. According to the invention, this can also be act a chemically inducible promoter through which the expression of him underlying genes in the host cell are controlled at some point can be. An example is IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside) inducible promoter called (Eikmanns, B.J. et al., 1991, Gene, 102: 93-98).

Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind.A gene structure is produced by fusion of a suitable promoter with at least one nucleotide sequence according to the present invention Recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden. To connect the DNA fragments to one another, the fragments Adapters or linkers can be used.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.In addition, the present invention relates to a vector containing at least encoding a nucleotide sequence of the type described above for a Phosphoserine phosphatase or phosphoserine aminotransferase, with these operatively linked regulatory nucleotide sequences and additional Nucleotide sequences for the selection of transformed host cells, for replication within the host cell or for integration into the corresponding host cell genome. Furthermore, the vector according to the invention can have a gene structure of the aforementioned type contain.

Als Vektoren eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden (Process Biochem 33 (1998) 147-161). Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119- 124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden. Diese Aufzählung ist für die vorliegende Erfindung jedoch nicht limitierend.Suitable vectors are those which are replicated in coryneform bacteria (Process Biochem 33 (1998) 147-161). Numerous known plasmid vectors such. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)) or pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) are based on the cryptic plasmids pHM1519, pBL1 or pGA1. Other plasmid vectors such as e.g. B. those based on pCG4 (US-A 4,489,160), or pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119- 124 (1990)), or pAG1 (US-A 5,158,891), can be used in the same way be used. However, this list is not for the present invention limiting.

Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können entsprechende Sonden oder auch Primer synthetisiert und dazu verwendet werden, beispielsweise mit Hilfe der PCR-Technik analoge Gene aus anderen Mikroorganismen, bevorzugt coryneformen Bakterien zu amplifizieren und isolieren.Using the nucleic acid sequences according to the invention appropriate probes or primers are synthesized and used to for example with the help of the PCR technique analogous genes from others Microorganisms, preferably to amplify and isolate coryneform bacteria.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen kodierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält. Bei der Sonde kann es sich um einen Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz, beispielsweise aus einem konservierten Bereich handeln, der z. B. eine Länge von 10 bis 30 oder bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden aufweist und unter stringenten Bedingungen spezifisch mit homologen Nukleotidsequenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind aus der Literatur zahlreich bekannt.The present invention thus also relates to a probe for identification and / or isolation of genes coding for the biosynthesis of L-serine Proteins involved, this probe starting from the invention Nucleic acid sequences of the type described above is produced and one for Detection contains suitable marking. The probe can be one Partial section of the sequence according to the invention, for example from a act conserved area, the z. B. a length of 10 to 30 or preferably 12 has up to 15 nucleotides and under stringent conditions specifically with can hybridize homologous nucleotide sequences. Suitable markings are well known from literature.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) oder beispielsweise im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).The specialist can find instructions on this in the manual, for example by Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and with Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994) or for example in the manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization "from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany) and in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Phosphoserin-Phosphatase oder ein Teil davon kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 1 oder 5 (Fig. 1) oder deren Variationen der zuvor beschriebenen Art. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Phosphoserin-Phosphatase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß der SEQ ID No 2 oder 6 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenzen oder Isoformen davon oder Mischungen daraus.The present invention furthermore relates to a phosphoserine phosphatase or a part thereof encoded by a nucleic acid sequence according to the invention selected from the sequences according to SEQ ID No 1 or 5 ( FIG. 1) or their variations of the type described above. The present invention also relates to one Phosphoserine phosphatase with an amino acid sequence selected from the sequences according to SEQ ID No 2 or 6 or a modified form of these polypeptide sequences or isoforms thereof or mixtures thereof.

Ebenso ist eine Phosphoserin-Aminotransferase oder ein Teil davon kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß den SEQ ID No 3 oder 7 (Fig. 1) oder deren Variationen der zuvor beschriebenen Art. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine Phosphoserin- Phosphatase mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus den Sequenzen gemäß der SEQ ID No 4 oder 8 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenzen oder Isoformen davon oder Mischungen daraus.Likewise, a phosphoserine aminotransferase or a part thereof is encoded by a nucleic acid sequence according to the invention selected from the sequences according to SEQ ID No 3 or 7 ( FIG. 1) or their variations of the type described above. The present invention also relates to a phosphoserine phosphatase an amino acid sequence selected from the sequences according to SEQ ID No 4 or 8 or a modified form of these polypeptide sequences or isoforms thereof or mixtures thereof.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide zeichnen sich ferner dadurch aus, daß sie aus coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum stammen. The polypeptides according to the invention are also characterized in that they are characterized by coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum.

Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.Enzymes with the same or comparable substrate and To understand effect specificity, which, however, has a different primary structure exhibit.

Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.According to the invention, modified forms are understood to mean enzymes in which Changes in the sequence, for example at the N and / or C terminus of the Polypeptide or in the range of conserved amino acids, but without the Impair the function of the enzyme. These changes can take the form of Amino acid exchanges can be carried out according to methods known per se.

Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.A special embodiment variant of the present invention comprises variants of the polypeptides according to the invention, their activity, for example, by Amino acid exchanges, compared to the respective starting protein, is weakened or strengthened. The same applies to the stability of the enzymes according to the invention in the cells, for example compared to the Degradation by proteases is increased or reduced susceptible.

Ferner sind Polypeptide mit der Funktion einer Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Aminosäuresequenz derart verändert sind, daß sie gegenüber regulatorisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise die sie in ihrer Aktivität regulierenden Stoffwechsel-Endprodukte desensitiv sind (feedback-desensitiv).Furthermore, polypeptides with the function of a phosphoserine phosphatase or Phosphoserine aminotransferase the present invention, which in its Amino acid sequence are changed so that they are regulatory acting compounds, for example those which regulate their activity Metabolic end products are desensitive (feedback-desensitive).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Übertragung wenigstens einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen oder eines Teils davon kodierend für eine Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase, ein Allel, Homolog oder Derivat davon in ein homologes Wirtssystem. Dies schließt auch die Übertragung eines erfindungsgemäßen Genkonstrukts oder Vektors in ein homologes Wirtssystem ein. Diese Übertragung von DNA in eine Wirtzelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt. The present invention also relates to the transmission of at least one coding the nucleic acid sequences according to the invention or a part thereof for a phosphoserine phosphatase or phosphoserine aminotransferase, an allele, Homologous or derivative thereof in a homologous host system. This also includes the Transfer of a gene construct or vector according to the invention into a homologous host system. This transfer of DNA into a host cell takes place using genetic engineering methods. The preferred method here is Transformation and particularly preferably the transfer of DNA Called electroporation.

Unter einem homologen Wirtssystem sind Mikroorganismen zu verstehen, die alle einer verwandten Familie angehören. Erfindungsgemäß sind hierunter coryneforme Bakterien zu verstehen, in die die erfindungsgemäß aus coryneformen Bakterien isolierten Nukleinsäuren eingebracht werden. Ein aus einer erfolgreich durchgeführten Nukleinsäureübertragung resultierender transformierter Mikroorganismus unterscheidet sich somit von dem entsprechend nicht transformierten Mikroorganismus dadurch, daß er zusätzliche Nukleinsäuren der erfindungsgemäßen Art enthält und entsprechend zur Ausprägung bringen kann. Stellvertretend für ein geeignetes homologes Wirtssystem sei das Bakterium Corynebacterium glutamicum und bevorzugt der Stamm ATCC 13032 genannt, welches unter Standardbedingungen wie folgt kultiviert werden kann:A homologous host system means microorganisms, all of them belong to a related family. According to the invention, these include coryneforms To understand bacteria, in which the according to the invention from coryneform bacteria isolated nucleic acids are introduced. One out of one successful performed nucleic acid transfer resulting transformed Accordingly, the microorganism does not differ from that transformed microorganism in that it has additional nucleic acids contains type according to the invention and can bring to expression accordingly. The bacterium is representative of a suitable homologous host system Corynebacterium glutamicum and preferably called the strain ATCC 13032, which can be cultivated under standard conditions as follows:

Die Kultivierung erfolgt in 500 ml Schüttelkolben bei 120 Umdrehungen/min und 30°C, wobei pro Kolben 50 ml Kulturmedium eingesetzt werden. Die Beimpfung des Kulturmediums erfolgt durch Zugabe einer Bakterien-(Vor)-Kultur des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, der zuvor unter gleichen Bedingungen über einen Zeitraum von 12-16 Stunden gezüchtet wurde, wobei eine optische Dichte der beimpften Kulturmedium im Bereich von 0,7 bis 1,5 eingestellt wird.The cultivation is carried out in 500 ml shake flasks at 120 rpm and 30 ° C, using 50 ml culture medium per flask. The inoculation of the Culture medium takes place by adding a bacterial (pre) culture of the strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, previously under the same conditions was grown over a period of 12-16 hours with an optical density the inoculated culture medium is set in the range from 0.7 to 1.5.

Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium, wie z. B. LB- Medium (T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989)) oder auch ein Mineralsalzmedium, wie z. B. CGXII-Medium (Keilhauer, C. et al. 1993, J. Bacteriol., 175: 5593-5603) geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bakteriensuspension geerntet und zur weiteren Untersuchung, beispielsweise zur Transformation oder zur Isolierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden eingesetzt werden.As a culture medium, depending on the requirements, a complex medium, such as. B. LB- Medium (T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989)) or a mineral salt medium such as e.g. B. CGXII medium (Keilhauer, C. et al. 1993, J. Bacteriol., 175: 5593-5603). After appropriate cultivation, the Bacteria suspension harvested and for further investigation, for example for Transformation or for the isolation of nucleic acids according to common methods be used.

Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere coryneforme Bakterienstämme angewendet werden. Dabei werden als Wirtssysteme Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium bevorzugt. Innerhalb der Gattung Corynebacterium wird besonders die Art Corynebacterium glutamicum und innerhalb der Gattung Brevibacterium besonders die Art Brevibacterium flavum bevorzugt. Zu den Vertretern dieser Gattungen zählen zum einen Stämme, die in ihren Eigenschaften als Wildtyp charakterisiert sind. Hier sind beispielsweise Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 zu nennen.This procedure can be applied analogously to other coryneform bacterial strains be applied. Bacteria of the genus are used as host systems Corynebacterium or Brevibacterium preferred. Within the genus Corynebacterium is particularly the species Corynebacterium glutamicum and within of the genus Brevibacterium particularly preferred the species Brevibacterium flavum. To the representatives of these genera are tribes on the one hand, in their Characteristics are characterized as wild type. Here are for example Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 14752, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium melassecola ATCC 17965, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 and Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 to name.

Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch Bakterienstämme ein, die sich als L-Serin produzierende Mutanten oder Produktionsstämme auszeichnen. Diese können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Stämme sind u. a. Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 und Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. Die vorliegende Erfindung wird durch die ausgewählten Beispiele an Mikroorganismen näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.In addition, the present invention also includes strains of bacteria that distinguish themselves as L-serine producing mutants or production strains. These can e.g. B. starting from wild-type strains by classic (chemical or physical) or genetic engineering methods. examples for strains suitable according to the invention are u. a. Corynebacterium glutamicum ATCC 21586, Corynebacterium glutamicum KY 10150 and Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222. The present invention is illustrated by the examples selected Microorganisms characterized in more detail, but not limited.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der zuvor beschriebenen Art, welche im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt exprimiert wird und/oder deren Kopienzahl erhöht ist. Ebenso umfaßt die vorliegende Erfindung einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus auch ein genetisch veränderter Mikroorganismus enthaltend wenigstens ein erfindungsgemäßes Polypeptid mit der Funktion einer Phosphoserin-Phosphatase oder Phosphoserin-Aminotransferase der zuvor beschriebenen Art, welches eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist. Ein erfindungsgemäß genetisch veränderter Mikroorganismus zeichnet sich ferner dadurch aus, daß er ein coryneformes Bakterium, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, besonders bevorzugt der Spezies Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium flavum ist.The present invention further relates to a genetically modified one Microorganism containing in replicable form at least one Nucleic acid according to the invention of the type described above, which in comparison to the corresponding non-genetically modified microorganism is expressed and / or the number of copies is increased. The present also includes Invention containing a genetically modified microorganism in replicable Form a gene structure or vector of the type described above. Subject the present invention is also a genetically modified one Microorganism containing at least one polypeptide according to the invention with the Function of a phosphoserine phosphatase or phosphoserine aminotransferase previously described type, which one in comparison to the correspondingly not genetically modified microorganism has increased activity. On Microorganism genetically modified according to the invention is also distinguished characterized in that it is a coryneform bacterium, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferred of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum.

Prinzipiell können Gene durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen Nukleotidsequenzen (Primern) amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien in konservierten Bereichen der Gene und/oder unter Berücksichtigung des GC-Gehalts der DNA des zu untersuchenden Mikroorganismus. Diese Methode weist jedoch eine Reihe von Nachteilen auf, die beispielsweise in der Fehlerhaftigkeit der PCR-Methode selbst begründet liegen oder darin, daß die zu identifizierenden Gensequenzen geringere Homologien zu den bereits bekannten Sequenzen aufweisen als anzunehmen ist. Dies kann zu einer unspezifischen oder sogar ausbleibenden Hybridisierung der eingesetzten Primer an die zu untersuchende Nukleinsäuresequenz führen.In principle, genes can be identified by methods known per se, such as, for example Polymerase chain reaction (PCR) using short, synthetic Nucleotide sequences (primers) are amplified and then isolated. The The primers used are generally prepared using known ones Gene sequences due to existing homologies in conserved areas of the Genes and / or taking into account the GC content of the DNA of the investigating microorganism. However, this method exhibits a number of Disadvantages, for example, in the flawedness of the PCR method itself are justified or in that the gene sequences to be identified are smaller Show homologies to the already known sequences than can be assumed. This can lead to unspecific or even non-hybridization of the used primer to the nucleic acid sequence to be examined.

Eine weitere Vorgehensweise zur Isolierung von kodierenden Nukleotidsequenzen ist die Komplementation von sogenannten Defekt-Mutanten des zu untersuchenden Organismusses, die zumindest phänotypisch einen Funktionsverlust in der Aktivität des zu untersuchenden Gens oder entsprechenden Proteins aufweisen. Unter einer Komplementation ist die Aufhebung des Gendefektes der Mutante und weitgehende Wiederherstellung des ursprünglichen Erscheinungsbildes vor der Mutatgenese zu verstehen, die durch die Einbringung funktioneller Gene oder Genfragmente aus dem zu untersuchenden Mikroorganismus erreicht wird.Another approach to isolating coding nucleotide sequences is the complementation of so-called defect mutants of the one to be examined Organism, which is at least phenotypically a loss of function in activity of the gene to be examined or corresponding protein. Under one Complementation is the elimination of the genetic defect of the mutant and extensive Restoration of the original appearance before the mutate genesis understand that by introducing functional genes or gene fragments from the microorganism to be examined is reached.

Ein klassisches Mutagenese-Verfahren zur Herstellung von Defektmutanten ist beispielsweise die Behandlung der Bakterienzellen mit Chemikalien wie z. B. N- Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin oder UV-Bestrahlung. Derartige Verfahren zur Mutationsauslösung sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden. Nachteilig ist hierbei eine Zeit- und kostenintensive Selektion der Mutanten mit dem gewünschten Phänotyp sowie die Tatsache, daß die isolierten Mutanten genetisch undefiniert sind, da die Mutagenese ungerichtet erfolgt. Letzeres führt häufig zu unerwarteten Problemen, beispielsweise hinsichtlich der Stabilität dieser Mutanten im Rahmen eines Produktionsverfahrens im großtechnischen Maßstab. A classic mutagenesis process for the production of defect mutants is for example the treatment of the bacterial cells with chemicals such. B. N- Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV radiation. Such procedures for Mutation initiation is generally known and can be found among others at Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) or in American's "Manual of Methods for General Bacteriology" Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981). The disadvantage here is a time-consuming and costly selection of the mutants with the desired phenotype as well as the fact that the isolated mutants are genetic are undefined because the mutagenesis is undirected. The latter often leads to unexpected problems, for example regarding the stability of these mutants in As part of a production process on an industrial scale.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung von kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus coryneformen Bakterien zur Verfügung zu stellen, welches die genannten Nachteile nicht mehr aufweist. Die erfindungsgemäße Lösung wird durch die nachfolgende Beschreibung näher erläutert.Another object of the present invention is to provide a method for isolation of coding nucleic acid sequences from coryneform bacteria to provide, which no longer has the disadvantages mentioned. The solution according to the invention will become more apparent from the description below explained.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, wobei ein coryneformes Bakterium erzeugt wird, welches durch Transposon-Mutagenese erzeugte Defekte in den Genen serB und serC aufweist.The invention relates to a method for isolating the invention Nucleic acids, whereby a coryneform bacterium is generated, which by Transposon mutagenesis has defects in the genes serB and serC.

Bei der Methode der Transposon-Mutagenese wird die Eigenschaft eines Transposons ausgenutzt, welches in DNA-Sequenzen zu "springen" und dadurch die Funktion des betreffenden Gens zu stören bzw. auszuschalten vermag.In the method of transposon mutagenesis, the property of a Exploited transposons, which "jump" in DNA sequences and thereby the May disrupt or switch off the function of the gene in question.

Beispiele für Transposons coryneformer Bakterien sind nachfolgend aufgeführt. So wurde aus dem Corynebacterium xerosis Stamm M82B das Erythromycinresistenz- Transposon Tn5432 (Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179) und das Chloramphenicolreistenz-Transposon Tn5546 isoliert. Tauch et al. (Plasmid (1995) 34: 119-131 und Plasmid (1998) 40: 126-139) zeigten, daß eine Mutagenese mit diesen Transposons möglich ist. Weiterhin wurde aus Corynebacterium glutamicum ATCC 31831 die Insertionssequenz IS31831 isoliert (Vertes et al., Molecular Microbiology (1994) 11: 739-746). Durch Kombination von IS31831 mit dem Kanamycinresistenzgen aphA wurde das künstliche Transposon Tn31831 konstruiert (Vertes et al., Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405). Vertes et al. (Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405) und Jaeger et al. (FEMS Microbiology Letters (1995) 126: 1-6) demonstrierten die Anwendung dieser Transposons bei den Stämmen Brevibacterium flavum MJ233C und Corynebacterium glutamicum ATCC 13058.Examples of transposons of coryneform bacteria are listed below. So Cyrnebacterium xerosis strain M82B became erythromycin resistance Transposon Tn5432 (Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179) and that Chloramphenicol resistance transposon Tn5546 isolated. Tauch et al. (Plasmid (1995) 34: 119-131 and Plasmid (1998) 40: 126-139) showed that mutagenesis with these transposons is possible. Furthermore, Corynebacterium glutamicum ATCC 31831 isolated the insertion sequence IS31831 (Vertes et al., Molecular Microbiology (1994) 11: 739-746). By combining IS31831 with the Kanamycin resistance gene aphA, the artificial transposon Tn31831 was constructed (Vertes et al., Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405). Vertes et al. (Molecular and General Genetics (1994) 245: 397-405) and Jaeger et al. (FEMS Microbiology Letters (1995) 126: 1-6) demonstrated the application of these Transposons in the Brevibacterium flavum MJ233C and Corynebacterium glutamicum ATCC 13058.

Ein anderes Transposon ist das Transposon Tn5531, das bei Ankri et al. (Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419) beschrieben wird und beispielhaft im Laufe der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird hierzu der Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 14752 einer entsprechenden Mutagenese unterworfen. Wahlweise eignet sich auch der Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 13032. Das Transposon Tn5531 enthält das aph3 Kanamycinresistenzgen und kann in Form des Plasmidvektors pCGL0040 (Fig. 2) verabreicht werden. Die Nukleotidsequenz des Transposons Tn5531 ist unter der Zugangsnummer (accession number) U53587 bei dem National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) frei verfügbar. Die vorliegende Erfindung wird durch die Aufzählung der zuvor genannten Transposons näher charakterisiert, jedoch nicht limitiert.Another transposon is the transposon Tn5531, which Ankri et al. (Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419) and is used by way of example in the course of the present invention. In a special embodiment of the present invention, the Corynebacterium glutamicum strain ATCC 14752 is subjected to a corresponding mutagenesis. The Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 is also optionally available. The transposon Tn5531 contains the aph3 kanamycin resistance gene and can be administered in the form of the plasmid vector pCGL0040 ( FIG. 2). The nucleotide sequence of the transposon Tn5531 is freely available under accession number U53587 from the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA). The present invention is characterized in more detail by the list of the aforementioned transposons, but is not limited.

Im Anschluß an die Transposon-Mutagenese wird eine in dem/n gewünschten Genen defekte Mutante selektioniert. Eine im serB- und/oder serC-Gen defekte Mutante wird erfindungsgemäß daran erkannt, daß sie auf Minimalmedium mit L- Serin gutes Wachstum aber auf Minimalmedium ohne L-Serin jedoch schlechtes Wachstum zeigt.Following the transposon mutagenesis, one is desired in the / n Defective mutant genes selected. One defective in the serB and / or serC gene According to the invention, mutants are recognized by the fact that they are on minimal medium with L- Serine good growth but poor on minimal medium without L-serine Shows growth.

Die entsprechend selektionierten Dekfektmutanten coryneformer Bakterienstämme werden anschließend für die Klonierung und Sequenzierung des serB-, und serC- Gens eingesetzt.The correspondingly selected confection mutants of coryneform bacterial strains are then used for the cloning and sequencing of the serB- and serC- Gene used.

Die Klonierung der Gene kann beispielsweise durch Komplementation der Defektmutanten erfolgen. Hierzu wird eine Genbank von der DNA des zu untersuchenden coryneformen Bakteriums angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiele sind das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K- 12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Erfindungsgemäß eignen sich solche Vektoren, die in coryneformen Bakterien, vorzugsweise Corynebacterium glutamicum, replizieren. Derartige Vektoren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiel sei der Plasmidvektor pZ1 genannt, der bei Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) beschrieben ist. The genes can be cloned, for example, by complementing the Defect mutants occur. For this purpose, a gene bank of the DNA of the investigating coryneform bacterium. The creation of gene banks is written down in well-known textbooks and manuals. As Examples are Winnacker's textbook: Genes and Clones, An Introduction to Genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) or the manual by Sambrook et al .: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996) describe a library of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, which was generated using the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) in E. coli K- 12 strain NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) was created. According to the invention, such vectors are suitable which are in coryne forms Bacteria, preferably Corynebacterium glutamicum, replicate. Such Vectors are known from the prior art. Take the example Plasmid vector called pZ1, which in Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554).

Die Genbank wird anschließend mittels Transformation, erfindungsgemäß bevorzugt durch Elektroporation in den im serB- oder serC-Gen defekten und zuvor beschriebenen Bakterienstamm überführt. Nach an sich bekannten Methoden werden diejenigen transformierten Bakterien ausgewählt, die die Fähigkeit besitzen in Abwesenheit von L-Serin auf Minimalmedium zu wachsen. Die aus diesen selektionierten Transformanden re-isolierten DNA-Fragmente der ursprünglich eingesetzten Genbank können anschließend einer Sequenzanalyse unterzogen werden.The gene bank is then preferred by means of transformation, according to the invention by electroporation in the defects in the serB or serC gene and previously described strain of bacteria transferred. According to known methods those transformed bacteria are selected that have the ability to grow on minimal medium in the absence of L-serine. The one from these selected transformants re-isolated DNA fragments of the original Genbank used can then be subjected to a sequence analysis become.

In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung kann aufgrund der durch Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 erzeugten Defektmutanten eines coryneformen Bakteriums wie z. B. den Stämmen ATCC 14752serB::Tn5531 und ATCC 14752serC::Tn5531 das serB::Tn5531-Allel bzw. das serC::Tn5531-Allel direkt unter Ausnutzung des in dem Transposon enthaltenen Kanamycinresistenzgens aph3 kloniert und isoliert werden. Hierzu verwendet man bekannte Klonierungs- Vektoren wie z. B. pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 und Yanisch- Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119) oder pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE und Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19: 34; Kobs G (1995) Promega Notes 55: 28; Promega Cooperation, Madison, USA). Als Wirtssysteme zur Klonierung eignen sich besonders solche Escherichia coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645- 4649) beschrieben wurde. Die Selektion auf Transformanden erfolgt in Gegenwart von Kanamycin.In a further embodiment of the present invention, the defect mutants generated by mutagenesis with the transposon Tn5531 coryneform bacteria such as B. the strains ATCC 14752serB :: Tn5531 and ATCC 14752serC :: Tn5531 directly the serB :: Tn5531 allele or the serC :: Tn5531 allele using the kanamycin resistance gene contained in the transposon aph3 are cloned and isolated. Known cloning Vectors such as B. pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 and Yanisch- Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119) or pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE and Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19:34; Kobs G (1995) Promega Notes 55:28; Promega Cooperation, Madison, USA). As host systems for cloning Escherichia coli strains that are restricted and are particularly suitable recombination defect. An example of this is the strain DH5αmcr, which is from Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645- 4649). The selection for transformants takes place in the presence from Kanamycin.

Die aus den erhaltenen Transformanden isolierte DNA, welche die interessierenden Gene enthält, wird anschließend sequenziert. Hierzu kann die von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467) beschriebene Dideoxy-Kettenabbruchmethode verwendet werden. Hiernach erhält man die stromaufwärts und stromabwärts des Tn5531-Insertionsortes enthaltenen Gene. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen werden dann mit kommerziell erhältlichen Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) oder dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Deutschland) analysiert und zusammengefügt. Auf die zuvor beschriebene Weise wurden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren des serB- und serC-Gens coryneformer Bakterien isoliert und deren Sequenz bestimmt.The DNA isolated from the transformants obtained, which the interested Contains genes, is then sequenced. For this, the method described by Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467) described dideoxy chain termination method be used. After that you get the upstream and downstream of the Tn5531 insertion site contained genes. The nucleotide sequences obtained are then used with commercially available sequence analysis programs such. B. the Lasergene program package (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) or the HUSAR program package (Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Germany) analyzed and put together. In the way described above were the nucleic acids of the serB and serC gene according to the invention coryneform bacteria isolated and their sequence determined.

Überraschender Weise haben Homologievergleiche mit bekannten Sequenzen ergeben, daß das von serB kodierte Polypeptid eine moderate Ähnlichkeit zu der Phosphoserin-Phosphatase aus Escherichia coli aufweist, während das von serC abgeleitete Polypeptid nur geringe, wenn auch signifikante Ähnlichkeit zu der Phosphoserin-Aminotransferase von Escherichia coli aufweist. Auch zu bekannten Phosphoserin-Phosphatasen bzw. Phosphoserin-Aminotransferasen aus anderen Organismen (z. B. Hefe) weisen die gefundenen corynebacteriellen Gene nur geringe bis moderate Ähnlichkeit auf. Lediglich die abgeleiteten Polypeptidsequenzen der mutmaßlichen serB- und serC-Gene aus Mycobacterium tuberculosis zeigen hohe Ähnlichkeit zu den corynebacteriellen Proteinen. Das Ergebnis eines solchen Homologievergleichs ist in Tabelle 2 dargestellt. Darüber hinaus ergibt die Nukleotidsequenz der coryneformen Gene, daß die in EP 0 931 833 verwendeten PCR-Primer zwar für die Amplifizierung der Gene aus Escherichia coli jedoch aufgrund der besagten geringen Sequenzähnlichkeit nicht für die Isolierung der coryneformen serB und serC Gene geeignet sind.Surprisingly, homology comparisons have been made with known sequences revealed that the polypeptide encoded by serB is moderately similar to that Phosphoserine phosphatase from Escherichia coli, while that of serC derived polypeptide little, albeit significant, similarity to that Escherichia coli phosphoserine aminotransferase. Too well known Phosphoserine phosphatases or phosphoserine aminotransferases from others Organisms (e.g. yeast) only have the corynebacterial genes found little to moderate similarity. Only the derived ones Polypeptide sequences of the putative serB and serC genes from Mycobacterium tuberculosis show high similarity to the corynebacterial proteins. The The result of such a homology comparison is shown in Table 2. About that In addition, the nucleotide sequence of the coryneform genes shows that the in EP 0 931 833 used PCR primers for the amplification of the genes from Escherichia coli however, not for isolation due to said low sequence similarity the coryneforms serB and serC genes are suitable.

Dies verdeutlicht einmal mehr den Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der Transposon-Mutagenese zur Klonierung der Gene serB und serC aus coryneformen Bakterien.This once again illustrates the advantage of the method according to the invention Transposon mutagenesis for cloning the serB and serC genes from coryneforms Bacteria.

Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin, wobei wenigstens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, isoliert aus einem coryneformen Bakterium, in einen homologen Mikroorganismus übertragen und dort exprimiert wird, wobei die Genexpression und/oder die Aktivität des entsprechend kodierten Polypeptids gegenüber dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöht ist, dieser genetisch veränderte Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von L-Serin eingesetzt wird und das entsprechend gebildete L-Serin aus dem Kulturmedium isoliert wird.The present invention also relates to a method for microbial Production of L-serine, at least one of the invention Nucleic acids isolated from a coryneform bacterium into a homologous one Microorganism is transmitted and expressed there, the gene expression and / or the activity of the correspondingly encoded polypeptide against the is increased accordingly not genetically modified microorganism, this Genetically modified microorganism for the fermentative production of L-serine is used and the correspondingly formed L-serine from the culture medium is isolated.

Zur Erzielung einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Serin- Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus, des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.The number of copies can be used to achieve increased gene expression (overexpression) of the corresponding genes can be increased. Furthermore, the promoter and / or Regulatory region and / or the ribosome binding site that is upstream of the structural gene is accordingly changed so that the expression at an increased rate. Expression cassettes act in the same way be installed upstream of the structural gene. Through inducible promoters it is also possible to express in the course of the fermentative L-serine Increase production. By measures to extend the life of the Expression also improves mRNA. The genes or gene constructs can either be present in plasmids with different copy numbers or in Chromosome integrated and amplified. Furthermore, the activity of the Enzyme itself may be increased or by preventing the breakdown, the Enzyme protein can be enhanced. Alternatively, overexpression of the genes concerned by changing the media composition and Culture tour can be achieved.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Instructions for this can be found by Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), at Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in European patent specification EPS 0 472 869, in the US patent 4,601,893, by Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991), by Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), at LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in which Patent application WO 96/15246, to Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in Japanese laid-open patent publication JP-A-10-229891, by Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), at Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) and in well-known textbooks of the Genetics and molecular biology.

Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Serin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.The genetically modified microorganisms produced according to the invention can continuously or discontinuously in batch process (batch cultivation) or in fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive Feed process) for the production of L-serine. A A summary of known cultivation methods is in the textbook by Chmiel (Bioprocess Engineering 1. Introduction to Bio Process Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)).

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. The culture medium to be used must meet the requirements of respective tribes are sufficient. Descriptions of cultural media of various Microorganisms are in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981). As Carbon source can be sugar and carbohydrates such as. B. glucose, sucrose, Lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such as B. Soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as B. Palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as B. glycerin and ethanol and organic acids such as B. acetic acid can be used. These substances can can be used individually or as a mixture. Organic as a nitrogen source Nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, Malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic Compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, Ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture. As a source of phosphorus Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium salts are used. The culture medium must also contain salts of metals such. B. magnesium sulfate or Iron sulfate, which are necessary for growth. After all, essential Growth substances such as amino acids and vitamins in addition to the above Fabrics are used. Suitable precursors can also be used in the culture medium be added. The feedstocks mentioned can be used for culture in the form of a one-off approach or appropriately during the Cultivation to be fed.

Zur pH-Kontroüe der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an L-Serin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, Potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as Phosphoric acid or sulfuric acid used in a suitable manner. For control the foam development can anti-foaming agents such. B. fatty acid polyglycol esters be used. To maintain the stability of plasmids, the Medium suitable selectively acting substances such. B. Antibiotics can be added. Around Maintaining aerobic conditions becomes oxygen or oxygen-containing Gas mixtures such as B. Air entered into the culture. The temperature of the culture is normally 20 ° C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 ° C. The Culture is continued until a maximum of L-serine has formed. This The goal is usually reached within 10 hours to 160 hours.

Die Analyse der L-Serin-Bildung kann durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin Derivatisierung erfolgen so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen so wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) beschrieben.The analysis of L-serine formation can be done using anion exchange chromatography subsequent ninhydrin derivatization is carried out as in Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), or it can be reversed by phase HPLC are carried out as in Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können L- Serin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Mannose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um die zuvor bereits näher beschriebenen Vertreter coryneformer Bakterien handeln.The microorganisms which are the subject of the present invention can L- Serine from glucose, sucrose, lactose, mannose, fructose, maltose, molasses, Manufacture starch, cellulose or from glycerin and ethanol. It can be the Representatives of coryneform bacteria already described in more detail above.

Eine Auswahl an Ergebnissen der Fermentation ist in Tabelle 3 dargestellt. Hierbei zeichnen sich die erfindungsgemäß genetisch veränderten Mikroorganismen durch eine wesentlich verbesserte L-Serin-Produktion gegenüber den entsprechend nicht transformierten Mikroorganismen (Wildtypen) oder den Mikroorganismen aus, die lediglich den Vektor ohne Gen-Insert enthalten.A selection of results from the fermentation is shown in Table 3. Here are characterized by the genetically modified microorganisms according to the invention a significantly improved L-serine production compared to the correspondingly not transformed microorganisms (wild types) or the microorganisms that contain only the vector without gene insert.

In einer besonderen Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung ist gezeigt, daß die Überexpression des homologen serB-Gens in C. glutamicum ATCC 13032 (13032 (pVWEx1serB)) zu einer wenigstens 4-fachen Steigerung der L-Serin- Akkumulation im Medium im Vergleich zu den Kontrollstämmen führt. Durch die Überexpression des homologen serC-Gens (13032 (pVWEx2serC)) kann eine wenigstens 20-fache Steigerung der L-Serin-Akkumulation erreicht werden. Durch die gemeinsame Überexpression beider Gene serB und serC in einem homologen System ist eine noch weitere Steigerung der L-Serin-Produktion zu erwarten.In a special embodiment variant of the present invention it is shown that the overexpression of the homologous serB gene in C. glutamicum ATCC 13032 (13032 (pVWEx1serB)) for an at least 4-fold increase in L-serine Accumulation in the medium compared to the control strains leads. Through the Overexpression of the homologous serC gene (13032 (pVWEx2serC)) can be one at least a 20-fold increase in L-serine accumulation can be achieved. By the common overexpression of both genes serB and serC in a homologous System, a further increase in L-serine production can be expected.

Bemerkenswert ist hier vor allen Dingen, daß die Steigerung der L-Serin- Akkumulation bereits mit dem Wildtyp Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 erreicht wird. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines homologen Aminosäure- Produktionsstammes kann somit eine noch weiter gesteigerte L-Serin-Produktion erreicht werden.It is particularly noteworthy here that the increase in L-serine Accumulation already with the wild type Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 is achieved. By using a homologous amino acid Production strain can thus further increase L-serine production can be achieved.

Unter Aminosäure-Produktionsstämmen sind im Sinne der vorliegenden Erfindung Corynebacterium glutamicum-Stämme oder homologe Mikroorganismen zu verstehen, die durch klassische und/oder molekulargenetische Methoden derart verändert sind, daß ihr Stoffwechselfluß verstärkt in die Richtung der Biosynthese von Aminosäuren oder deren Abkömmlingen verläuft (metabolic engineering). Beispielsweise sind bei diesen Aminosäure-Produktionsstämmen ein oder mehrere Gen(e) und/oder die korrespondierenden Enzyme, die an entscheidenden und entsprechend komplex regulierten Schlüsselpositionen des Stoffwechselweges (Flaschenhals) stehen in ihrer Regulation verändert oder sogar dereguliert. Die vorliegende Erfindung umfaßt hierbei sämtliche bereits bekannte Aminosäure- Produktionsstämme, bevorzugt der Gattung Corynebacterium oder homologer Organismen. Ferner sind erfindungsgemäß auch diejenigen Produktionsstämme umfaßt, die der Fachmann in Analogie zu Erkenntnissen aus anderen Mikroorganismen, beispielsweise Enterobacterien, Bacillaceen oder Hefe-Arten nach gängigen Methoden herstellen kann.Amino acid production strains are within the meaning of the present invention Corynebacterium glutamicum strains or homologous microorganisms understand that through classic and / or molecular genetic methods like this are changed that their metabolic flow increases in the direction of biosynthesis of amino acids or their descendants (metabolic engineering). For example, there are one or more of these amino acid production strains Gene (s) and / or the corresponding enzymes involved in crucial and correspondingly complex regulated key positions of the metabolic pathway (Bottleneck) are changed in their regulation or even deregulated. The The present invention includes all known amino acid Production strains, preferably of the genus Corynebacterium or more homologous Organisms. Furthermore, those production strains are also according to the invention includes the expert in analogy to knowledge from others Microorganisms, for example Enterobacteria, Bacillaceae or yeast species can produce common methods.

Ferner sind erfindungsgemäß auch solche Aminosäure-Produktionsstämme umfaßt, bei denen der Abbau von L-Serin verändert, bevorzugt abgeschwächt ist. Dies kann beispielsweise durch gezielte gentechnische Veränderungen an L-Serin degradierenden Enzymen oder den korrespondierenden Genen erfolgen.Furthermore, according to the invention, such amino acid production strains are also included in which the breakdown of L-serine is changed, preferably weakened. This can for example through targeted genetic engineering changes to L-serine degrading enzymes or the corresponding genes.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der auf zuvor beschriebene Weise hergestellten L-Aminosäuren zum Einsatz in der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und/oder Pharmaindustrie oder in der Humanmedizin. Darüber hinaus finden die erfindungsgemäß hergestellte Aminosäure L-Serin Verwendung als Vorstufe für die Synthese von L-Glycin, L-Cystein und/oder L-Tryptophan und/oder davon ableitbaren Stoffwechselprodukten.The present invention further relates to the use of those described above L-amino acids produced in this way for use in food, feed and / or pharmaceutical industry or in human medicine. In addition, the Amino acid L-serine produced according to the invention. Use as a precursor for Synthesis of L-glycine, L-cysteine and / or L-tryptophan and / or derived therefrom Metabolic products.

Nachfolgend wird die vorliegenden Erfindung durch Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:The present invention is explained in more detail below by examples which: but are not limiting:

General techniques

Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.The isolation of plasmid DNA from Escherichia coli and all techniques for Restriction, Klenow and alkaline phosphatase treatment were carried out according to Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) carried out. The transformation of Escherichia coli was, if not described differently, according to Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).

Cloning and sequencing of the serB and serC gene from Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 1. Transposon mutagenesis

Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 wurde einer Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 unterworfen, dessen Sequenz unter der Accession- Nummer U53587 in der Nukleotid-Datenbank des National Center for Biotechnology Information (Bethesda, USA) hinterlegt ist. Aus dem Methylase-defekten Escherichia coli-Stamm GM2929pCGL0040 (Escherichia coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) wurde das Plasmid pCGL0040 isoliert, welches das zusammengesetzte Transposon Tn5531 enthält (Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 wurde mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) mit dem Plasmid pCGL0040 transformiert. Klone, bei denen das Transposon Tn5531 ins Genom integriert war, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Auf diese Weise wurden 1800 Klone erhalten, welche auf verzögertes Wachstum in Anwesenheit von Seryl-Alanin überprüft wurden. Dazu wurden alle Klone einzeln auf CGXII-Minimalmedium-Agarplatten mit und ohne 2 mM Seryl-Alanin übertragen. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), enthielt aber zusätzlich 25 µg/mL Kanamycin und 15 g/L Agar. Die Zusammensetzung des von Keilhauer et al. beschriebenen Mediums ist in Tabelle 1 dargestellt.The strain Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 was mutagenized with subjected to the transposon Tn5531, the sequence of which under the accession Number U53587 in the National Center for Biotechnology's nucleotide database Information (Bethesda, USA) is deposited. From the methylase-defective Escherichia coli strain GM2929pCGL0040 (Escherichia coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) the plasmid pCGL0040 was isolated, which the contains composite transposon Tn5531 (Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). The strain Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 was determined by means of electroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) with the plasmid pCGL0040. Clones where that Transposon Tn5531 was integrated into the genome based on their Kanamycin resistance on LBHIS agar plates containing 15 µg / mL kanamycin identified (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). To this 1800 clones were obtained, which indicate delayed growth in Presence of seryl alanine were checked. For this purpose, all clones were opened individually Transfer CGXII minimal medium agar plates with and without 2 mM seryl alanine. The Medium was identical to that in Keilhauer et al. described medium CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), but also contained 25 µg / mL Kanamycin and 15 g / L agar. The composition of the by Keilhauer et al. described medium is shown in Table 1.

Die Agarplatten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum nach 12, 18 und 24 Stunden untersucht. Es wurden zwei Transposonmutanten erhalten, die mit Seryl- Alanin vergleichbar mit dem Ausgangsstamm Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 wuchsen, in Abwesenheit von Seryl-Alanin aber kein Wachstum zeigten. Auch mit Serin allein wuchsen die Mutanten, so daß gezeigt war, daß es sich um Serin auxotrophe Mutanten handelt, die einen Defekt im Serin-Stoffwechsel aufweisen müssen. Diese Mutanten wurde als ATCC 14752ser1::Tn5531 und ATCC 14752ser2::Tn5531 bezeichnet.The agar plates were incubated at 30 ° C and growth after 12, 18 and 24 Hours examined. Two transposon mutants were obtained which were treated with seryl Alanine comparable to the parent strain Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 grew but showed no growth in the absence of seryl alanine. Also the mutants grew with serine alone, so that it was shown that it was serine auxotrophic mutants that have a defect in serine metabolism have to. These mutants were identified as ATCC 14752ser1 :: Tn5531 and ATCC 14752ser2 :: Tn5531.

2. Cloning and sequencing of the insertion sites of Tn5531 in ATCC 14752ser1 :: Tn5531 and ATCC 14752ser2 :: Tn5531

Um die stromaufwärts des Transposons Tn5531 gelegenen Insertionsorte in den beschriebenen Mutanten zu klonieren, wurde zunächst die chromosomale DNA dieser Mutantenstämme wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben isoliert und 400 ng davon mit der Restriktionsendonuklease XbaI geschnitten. Der vollständige Restriktionsansatz wurde in den ebenfalls mit XbaI linearisierten Vektor pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) mittels Elektroporation transformiert (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformanden, bei denen auf dem Vektor pUC18 die Insertionsorte des Transposons Tn5531 kloniert vorlagen, wurden anhand ihrer Carbenicillin- und Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin und 25 µg/mL Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus jeweils drei der Transformanden wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse die Größen der klonierten Inserts bestimmt. Die Nukleotidsequenzen der Insertionsorte auf den Plasmiden mit einem ca. 10 kb großen Inserts im Falle von ser1::Tn5531, bzw. 4,5 kb großen Insert im Falle von ser2::Tn5531 wurden nach der Dideoxy- Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden jeweils zunächst ca. 600 bp der beiden Inserts ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'. Mittels Primer-Walking wurden dann jeweils Sequenzverlängerungen durchgeführt, sodaß insgesamt ca. 1,4 kb des Inserts aus ser1::Tn5531, bzw. 1,2 kb des Inserts aus ser2::Tn5531 sequenziert werden konnten. Die Analyse mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) ergab, daß in beiden Fällen das Transposon in den Beginn eines offenen Leserahmens inseriert war.To the insertion sites upstream of the transposon Tn5531 in the to clone the mutants described first became the chromosomal DNA of these mutant strains as in Schwarzer et al. (Bio / Technology (1990) 9: 84-87) described isolated and 400 ng thereof with the restriction endonuclease XbaI cut. The complete restriction approach was also in the XbaI linearized vector pUC18 (Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106) from the company Roche Diagnostics (Mannheim, Germany) ligated. With the whole The ligation approach was the Escherichia coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformed by electroporation (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145). Transformants in which on the Vector pUC18 the insertion sites of the transposon Tn5531 were cloned based on their carbenicillin and kanamycin resistance to 50 µg / mL carbenicillin and LB agar plates containing 25 µg / mL kanamycin were identified. From three each The plasmids were prepared and the transformants were analyzed by restriction analysis Sizes of the cloned inserts determined. The nucleotide sequences of the insertion sites on the plasmids with an approximately 10 kb insert in the case of ser1 :: Tn5531, or 4.5 kb insert in the case of ser2 :: Tn5531 were after the dideoxy Chain termination method by Sanger et al. determined (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). For this purpose, approx. 600 bp of the two inserts were initially based on following oligonucleotide primer sequenced: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3 '. Sequence extensions were then carried out by means of primer walking carried out, so that a total of about 1.4 kb of the insert from ser1 :: Tn5531, or 1.2 kb of the insert from ser2 :: Tn5531 could be sequenced. The analysis with the Lasergene program package (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) found that in both cases the transposon was at the beginning of a open reading frame was advertised.

Zur Identifizierung der stromabwärts des Transposons gelegenen Insertionsorte wurde die chromosomale DNA der Mutanten mit der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten und in den mit EcoRI linearisierten Vektor pUC18 ligiert. Die weitere Klonierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen der Insertionsorte auf einem der Plasmide ausgehend von ser1::Tn5531 mit einem ca. 6,5 kb großen Insert, bzw auf einem der Plasmide ausgehend von ser2::Tn5531 mit einem ca. 5,0 kb großen Insert wurden nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463- 5467). Hierzu wurden ca. 400 bp des Inserts aus ser1::TN5531, bzw. ca. 220 bp des Inserts aus ser2::Tn5531 ausgehend von folgendem Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'.To identify the insertion sites located downstream of the transposon was the chromosomal DNA of the mutants with the restriction endonuclease EcoRI cut and ligated into the vector pUC18 linearized with EcoRI. The further cloning was carried out as described above. The Nucleotide sequences of the insertion sites on one of the plasmids starting from ser1 :: Tn5531 with an approximately 6.5 kb insert, or on one of the plasmids starting from ser2 :: Tn5531 with an approximately 5.0 kb insert, after the Sanger et al. Dideoxy chain termination method determined (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463- 5467). About 400 bp of the insert from ser1 :: TN5531, or about 220 bp of the Inserts from ser2 :: Tn5531 starting from the following oligonucleotide primer sequenced: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3 '.

Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurden mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert und zusammengefügt. Die Nukleotidsequenzen sind als SEQ-ID-No. 1 und SEQ-ID-No. 3 wiedergegeben. Die Analyse ergab die Identifizierung von jeweils einem offenen Leseraster von 1209 bp für ser1::Tn5531, und das entsprechende Gen wurde als ser8 bezeichnet, und von 1128 bp Länge für ser2::Tn5531, und das entsprechende Gen wurde als serC-Gen bezeichnet. Die dazugehörigen Genprodukte umfassen 403 und 376 Aminosäuren und sind als SEQ-ID-No. 2 und SEQ-ID-No. 4 wiedergegeben.The nucleotide sequences obtained were generated using the Lasergene program package (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analyzed and put together. The nucleotide sequences are as SEQ-ID-No. 1 and SEQ-ID-No. 3rd reproduced. The analysis revealed the identification of one open 1209 bp reading frame for ser1 :: Tn5531, and the corresponding gene was identified as designated ser8, and of 1128 bp length for ser2 :: Tn5531, and the corresponding Gen was referred to as the serC gene. The associated gene products comprise 403 and 376 amino acids and are listed as SEQ-ID-No. 2 and SEQ-ID-No. 4 reproduced.

Cloning and sequencing of the serB and serC genes from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Die Gene serB, und serC wurden in den Escherichia coli Klonierungsvektor pGEM-T (Zhou M-Y, Clark SE und Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19: 34; Kobs G (1995) Promega Notes 55: 28; Promega Cooperation, Madison, USA) kloniert. Die Klonierung wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst wurden durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) jeweils die Gene aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 mittels folgender aus SEQ-ID-No. 1 bzw. SEQ-ID-No. 3 abgeleiteter Oligonukleotid-Primer amplifiziert.
serB-forward:
5'-GCAGAGGCACACACTGGAC-3'
serB-reverse:
5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3'
serC-forward:
5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3'
serC-reverse:
5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3'The genes serB, and serC were inserted into the Escherichia coli cloning vector pGEM-T (Zhou MY, Clark SE and Gomez-Sanchez CE (1995) BioTechniques 19:34; Kobs G (1995) Promega Notes 55:28; Promega Cooperation, Madison, USA) cloned. The cloning was carried out in two steps. First, the genes from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 were identified by a polymerase chain reaction (PCR) using the following from SEQ-ID-No. 1 or SEQ-ID-No. 3 derived oligonucleotide primers amplified.
serB-forward:
5'-GCAGAGGCACACACTGGAC-3 '
serB reverse:
5'-CTTGAGGAGGAGGTGGGC-3 '
serC-forward:
5'-CATCGTTTGGGAGACTGCG-3 '
serC reverse:
5'-CGTACTGGTGTAACTGTACGGG-3 '

Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM Deoxynukleotid triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM des entsprechenden Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 1/10 Volumen 10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High Fidelity PCR System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 60 Sekunden, 56°C für 90 Sekunden und 72°C für 2 Minuten.The PCR reaction was carried out in 30 cycles in the presence of 200 µM deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 µM each of the corresponding Oligonucleotides, 100ng chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, 1/10 volume 10-fold reaction buffer and 2.6 units one heat-stable Taq / Pwo DNA polymerase mixture (Expand High Fidelity PCR System from Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) in one Thermal cycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) among the following Conditions performed: 94 ° C for 60 seconds, 56 ° C for 90 seconds and 72 ° C for 2 minutes.

Das amplifizierte etwa 1,7 kb große serB- Fragment sowie das amplifizierte etwa 1,3 kb große serC-Fragment wurden dann im folgenden mit Hilfe des Promega PCR Cloning Kits nach Angaben des Herstellers mit dem Vektor pGEM-T ligiert. Mit beiden Ligationsansätzen wurde der Escherichia coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanden wurden anhand ihrer Ampicillinresistenz auf 50 µg/mL Ampicillin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert: Aus jeweils 10 der Transformanden wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein der 1,7 kb bzw. 1,3 kb PCR-Fragmente als Inserts überprüft. Die so entstandenen rekombinanten Plasmide werden im folgenden mit pGEM-TserB und pGEM-TserC bezeichnet.The amplified approximately 1.7 kb serB fragment and the amplified approximately 1.3 kb Large serC fragments were then analyzed using the Promega PCR Cloning kits ligated to the vector pGEM-T according to the manufacturer. With Escherichia coli strain DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649). Transformants were identified based on their Ampicillin resistance identified on LB agar plates containing 50 µg / mL ampicillin: The plasmids were prepared from 10 each of the transformants and by Restriction analysis for the presence of the 1.7 kb or 1.3 kb PCR fragments checked as inserts. The resulting recombinant plasmids are in the hereinafter referred to as pGEM-TserB and pGEM-TserC.

Die Ermittlung der Nukleotidsequenzen der 1,7 kb bzw. 1,3 kb PCR-Fragmente in Plasmid pGEM-TserBexp bzw. Plasmid pGEM-TserCexp wurden nach der Dideoxy- Kettenabbruchmethode von Sanger et al. durchgeführt (Proceedings of the National Acaderny of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Hierzu wurden die vollständigen Inserts von pGEM-TserB und pGEM-TserC mit Hilfe folgender Primer der Firma Roche Diagnostics (Mannheim, Deutschland) sequenziert.
Universal-Primer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverse-Primer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'The nucleotide sequences of the 1.7 kb and 1.3 kb PCR fragments in plasmid pGEM-TserBexp and plasmid pGEM-TserCexp were determined by the dideoxy chain termination method of Sanger et al. (Proceedings of the National Acaderny of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). For this purpose, the complete inserts of pGEM-TserB and pGEM-TserC were sequenced using the following primers from Roche Diagnostics (Mannheim, Germany).
Universal primer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3 '
Reverse primer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3 '

Die Nukleotidsequenz des Inserts in dem Plasmid pGEM-TserB ist als SEQ-ID-No. 5, die des Inserts in dem Plasmid pGEM-TserC als SEQ-ID-No. 7 wiedergegeben. Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA) analysiert. Die Analyse ergab die Identifizierung von jeweils einem offenen Leseraster von 1209 bp, und 1128 bp Länge. Die entsprechenden Gene wurden als serB und serC bezeichnet. Die dazugehörigen Genprodukte kodieren für Polypeptide, die 403 bzw. 376 Aminosäuren lang sind, und die als SEQ-ID-No. 6 und SEQ-ID-No. 8 wiedergegeben sind.The nucleotide sequence of the insert in the plasmid pGEM-TserB is as SEQ-ID-No. 5, that of the insert in the plasmid pGEM-TserC as SEQ-ID-No. 7 reproduced. The The nucleotide sequence obtained was generated using the Lasergene program package (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). The Analysis revealed the identification of an open reading frame of 1209 bp, and 1128 bp in length. The corresponding genes were identified as serB and serC designated. The associated gene products code for polypeptides that 403 or Are 376 amino acids long, and which as SEQ-ID-No. 6 and SEQ-ID-No. 8th are reproduced.

Overexpression of the genes for the phosphoserine phosphatase serB and the Phosphoserine aminotransferase serC

Zur Untersuchung der Auswirkung der Überexpression der Gene für die Phosphoserin-Phosphatase serB und die Phosphoserin-Aminotransferase serC auf die Serin-Produktion wurden die Expressionsvektoren pVWEXI (Wendisch, V., Dissertation Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997; vermittelt eine Kanamycin- Resistenz) und pVWEX2 (Wendisch, V., Dissertation Heinrich-Heine Universität, Düsseldorf, 1997; vermittelt eine Tetracyclin-Resistenz) verwendet, die eine IPTG- induzierbare Expression (Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) erlauben. In den Vektor pVWEXI wurde das serB Gen und in den Vektor pVWEX2 das serC Gen promotorlos hinein kloniert. Dazu wurden zunächst folgende Primer synthetisiert:
serB-exp-for:
5'-ATCTAGAATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3'
serB-exp-rev:
5'-AGGATCCTTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3'
serC-exp-for:
5'-AGCATGCATGCCCGAAGACATGACCG-3'
serc-exp-rev:
5'-ATCTAGATTACTTCCTTGCAAAACCGC-3'To investigate the effect of the overexpression of the genes for the phosphoserine phosphatase serB and the phosphoserine aminotransferase serC on the serine production, the expression vectors pVWEXI (Wendisch, V., dissertation Heinrich-Heine University, Düsseldorf, 1997; mediated a kanamycin resistance ) and pVWEX2 (Wendisch, V., dissertation Heinrich-Heine University, Düsseldorf, 1997; mediates tetracycline resistance), which allow IPTG-inducible expression (Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) . The serB gene was cloned into the vector pVWEXI and the serC gene into the vector pVWEX2 without a promoter. The following primers were first synthesized:
serB-exp-for:
5'-A TCTAGA ATGATCACAGTGAGCCGTAAAG-3 '
serB-exp-rev:
5'-A GGATCC TTAGGCATTTGTCAATGGAACGC-3 '
serC-exp-for:
5'-A GCATGC ATGCCCGAAGACATGACCG-3 '
serc-exp-rev:
5'-A TCTAGA TTACTTCCTTGCAAAACCGC-3 '

Mittels PCR wurde das promotorlose serB-Gen als ein 1226 bp großes Fragment (SEQ-ID-No. 5 Basen 382 bis 1594) und das promotorlose serC-Gen als 1157 bp Fragment (SEQ-ID-No. 7 Basen 132 bis 1261) aus chromosomaler DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 amplifiziert. Die Primer wurden so gewählt, daß Primer serB-exp-for eine XbaI-Schnittstelle vermittelt, Primer serB-exp- rev eine BamHI-Schnittstelle, Primer serC-exp-for eine SphI-Schnittstelle und Primer serC-exp-rev eine XbaI-Schnittstelle. Die isolierten PCR-Produkte wurden zunächst wie oben beschrieben in den Vektor pGEM-T kloniert, und die Plasmide pGEM- TserBexp und pGEM-TserC-exp erhalten. Anschließend wurde das promotorlose serB-Gen mittels XbaI-BamHI-Restriktion aus dem Vektor pGEM-TserBexp ausgeschnitten, und in den entsprechend mit XbaI-BamHI linearisierten Vektor pVWEX1 ligiert. Das promotorlose serC-Gen wurde nach SpeI-XbaI-Restriktion aus dem Vektor pGEM-TserBexp ausgeschnitten und in den mit XbaI linearisierten Vektor pVWEX2 ligiert. Die erhaltenen Konstrukte pVWEX1 serB (Fig. 3) und pVWEX2serC (Fig. 4) wurden durch Restriktion getestet.The promoterless serB gene was identified as a 1226 bp fragment (SEQ-ID No. 5 bases 382 to 1594) and the promoterless serC gene as a 1157 bp fragment (SEQ-ID No. 7 bases 132 to 1261) by means of PCR. amplified from chromosomal DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. The primers were chosen such that primer serB-exp-for mediates an XbaI interface, primer serB-exp-rev a BamHI interface, primer serC-exp-for a SphI interface and primer serC-exp-rev an XbaI- Interface. The isolated PCR products were first cloned into the vector pGEM-T as described above, and the plasmids pGEM-TserBexp and pGEM-TserC-exp were obtained. The promoterless serB gene was then cut out of the vector pGEM-TserBexp by means of XbaI-BamHI restriction, and ligated into the vector pVWEX1 linearized accordingly with XbaI-BamHI. The promoterless serC gene was cut out of the vector pGEM-TserBexp after SpeI-XbaI restriction and ligated into the vector pVWEX2 linearized with XbaI. The resulting constructs pVWEX1 serB ( FIG. 3) and pVWEX2serC ( FIG. 4) were tested by restriction.

Increased accumulation of L-serine through overexpression of the genes for the Phosohoserine phosphatase serB and the phosphoserine aminotransferase serC

Die Plasmide pVWEX1-serB und pVWEX2-serC wurden jeweils einzeln durch Elektroporation in den Wildtyp Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 13032 eingebracht, resultierend in den Stämmen C. glutamicum 13032(pVWEX1 serB) und C. glutamicum 13032(pVWEX2serC). Als Negativ-Kontrolle wurde der Wildtyp Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sowie der C. glutamicum-Stamm ATCC enthaltend den Vektoren pVWEX1 ohne Insert kultiviert. Die L-Serinausscheidung wurde anschließend von allen zuvor genannten Stämmen bestimmt und vergleichend in Tabelle 3 zusammengefaßt.The plasmids pVWEX1-serB and pVWEX2-serC were each run individually Electroporation in the wild-type Corynebacterium glutamicum strain ATCC 13032 introduced, resulting in the strains C. glutamicum 13032 (pVWEX1 serB) and C. glutamicum 13032 (pVWEX2serC). The wild type was used as a negative control Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 and the C. glutamicum strain ATCC containing the vectors pVWEX1 cultured without insert. L-serine excretion was then determined and compared by all of the aforementioned strains summarized in Table 3.

Dazu wurden die Stämme in Komplexmedium (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press; mit 50 µg/l Kanamycin, 25 µg/l Tetracyclin bzw. 50 µg/l Kanamycin und 25 µg/l Tetracyclin) gezüchtet, und das Fermentationsmedium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) jeweils aus den Vorkulturen getrennt beimpft. Das Medium enthielt zusätzlich das/die entsprechende(n) Antibiotika sowie 200 µg/ml IPTG. Nach Kultivierung für 24 Stunden bei 30°C auf dem Rotationsschüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute wurde die in das Medium akkumulierte L-Serinmenge bestimmt. Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssigkeitchromatographie (J Chromat (1983) 266: 471-482). For this purpose, the strains were in complex medium (2xTY; Molecular Cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; with 50 µg / l kanamycin, 25 µg / l Tetracycline or 50 µg / l kanamycin and 25 µg / l tetracycline), and that Fermentation medium CGXII (J Bacteriol (1993) 175: 5595-5603) each from the Inoculated separately. The medium also contained the corresponding antibiotics and 200 µg / ml IPTG. After cultivation for 24 Hours at 30 ° C on the rotary shaker at 120 revolutions per minute the amount of L-serine accumulated in the medium was determined. The determination of Amino acid concentration was carried out by means of high pressure liquid chromatography (J Chromat (1983) 266: 471-482).

Legend for the figures and tables

Fig. 1: Nukleinsäuresequenzen enthaltend die Gene serB und serC sowie davon abgeleitete Aminosäuresequenzen SerB und SerC aus Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 (SEQ ID No 1-4) und Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (SEQ ID No 5-8) Fig. 1: nucleic acid sequences containing the genes serB and serC and deduced amino acid sequences SerB and SerC from Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 (SEQ ID No 1-4) and Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (SEQ ID No 5-8)

Fig. 2: Schematische Darstellung des Vektors pCGL0040 Fig. 2: Schematic representation of the vector pCGL0040

Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Amp = β-Lactamase-Gen, welches Ampicillin-Resistenz vermittelt
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermitteltThe meaning of the abbreviations used is as follows:
Amp = β-lactamase gene, which mediates ampicillin resistance
Kan = phosphotransferase gene that mediates kanamycin resistance

Ferner sind Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegebenInterfaces for restriction endonucleases are also given

Fig. 3: Schematische Darstellung des Vektors pVWEx1serB Fig. 3: Schematic representation of the vector pVWEx1serB

Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
lacI^q = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
P^tac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coliThe meaning of the abbreviations used is as follows:
Kan = phosphotransferase gene that mediates kanamycin resistance
lacI ^q = quantitatively expressed repressor of the lactose operon from E. coli
P ^tac = IPTG-inducible, artificial promoter composed of the trp promoter and the lac promoter from E. coli

Fig. 4: Schematische Darstellung des Vektors pVWEx1 serC-1 Fig. 4: Schematic representation of the vector pVWEx1 serC-1

Die Bedeutung der verwendeten Abkürzungen ist wie folgt:
Kan = Phosphotransferase-Gen, welches Kanamycin-Resistenz vermittelt
Tet = tetα1-Gen aus dem Plasmid pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), welches Tetracyclin-Resistenz vermittelt
lacI^q = quantitativ exprimierter Repressor des Lactose-Operons aus E. coli
P^tac = IPTG-induzierbarer, artifizieller Promotor zusammengesetzt aus dem trp- Promotor und dem lac-Promotor von E. coliThe meaning of the abbreviations used is as follows:
Kan = phosphotransferase gene that mediates kanamycin resistance
Tet = tetα1 gene from the plasmid pHY163PLK (Ishiwa & Shibahara, 1985, Jpn. J. Genet., 60: 485-498), which confers resistance to tetracycline
lacI ^q = quantitatively expressed repressor of the lactose operon from E. coli
P ^tac = IPTG-inducible, artificial promoter composed of the trp promoter and the lac promoter from E. coli

Ferner sind Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen angegeben Interfaces for restriction endonucleases are also given

Tabelle 1: Zusammensetzung des Mineralsalz-Mediums CGXII zur Kultivierung von coryneformen BakterienTable 1: Composition of the mineral salt medium CGXII for the cultivation of coryneform bacteria

Tabelle 2: Vergleich der Ähnlichkeiten der Phosphoserin-Aminotransferase (PSAT; serC) und der Phosphoserin-Phosphatase (PSP; serB) von Corynebacterium glutamicum zu bekannten Phosphoserin- Aminotransferasen und Phosphoserin-Phosphatasen anderer OrganismenTable 2: Comparison of the similarities of phosphoserine aminotransferase (PSAT; serC) and the phosphoserine phosphatase (PSP; serB) from Corynebacterium glutamicum to known phosphoserine Aminotransferases and phosphoserine phosphatases from other organisms

Tabelle 3: Vergleichende Übersicht der Akkumulation von L-Serin im Kulturüberstand des Corynebacterium glutamicum Wildtyps ATCC 13032 sowie der mit den entsprechenden Plasmiden transformierten Corynebacterium glutamicum Stämme ATCC 13032(pVWEX1), ATCC 13032(pVWEX1serB) und ATCC 13032(pVWEX2serC) Table 3: Comparative overview of the accumulation of L-serine in the culture supernatant of the Corynebacterium glutamicum wild type ATCC 13032 and the one with the corresponding plasmids transformed Corynebacterium glutamicum strains ATCC 13032 (pVWEX1), ATCC 13032 (pVWEX1serB) and ATCC 13032 (pVWEX2serC)

Tabellenbeschreibung Table description

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

Tabelle 3 Table 3

Claims

1. Containing isolated nucleic acid coding for a phosphoserine phosphatase a gene serB selected from the sequences according to SEQ ID No 1 or 5 or an allele, homologue or derivative of these nucleotide sequences or with these hybridizing nucleotide sequences.

2. Isolated nucleic acid coding for a phosphoserine aminotransferase containing a gene serC selected from the sequences according to SEQ ID No 3 or 7 or an allele, homologue or derivative of these nucleotide sequences or with this hybridizing nucleotide sequences.

3. Nucleic acids according to one of claims 1 or 2, characterized in that that they are made of coryneform bacteria, preferably the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum can be isolated.

4. Phosphoserine phosphatase or a part thereof encoded by a Nucleic acid sequence according to one of claims 1 or 3.

5. phosphoserine phosphatase according to claim 4 with an amino acid sequence selected from the sequences according to SEQ ID No. 2 or 6 or one modified form of these polypeptide sequences or isoforms thereof or Mixtures of these.

6. Phosphoserine aminotransferase or a part thereof encoded by a Nucleotide sequence according to one of claims 2 or 3.

7. phosphoserine aminotransferase according to claim 6 with a Amino acid sequence selected from the sequences according to SEQ ID No. 4 or 8 or a modified form of these polypeptide sequences or isoforms thereof or mixtures thereof.

8. Polypeptides according to one of claims 4 to 7, characterized in that they from coryneform bacteria, preferably of the genus Corynebacterium or Brevibacterium, particularly preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Brevibacterium flavum.

9. gene structure containing at least one nucleotide sequence according to Claims 1 to 3 and operationally linked regulatory Sequences.

10. Vector containing at least one nucleotide sequence according to claims 1 to 3 or a gene structure according to claim 9 and additional Nucleotide sequences for selection, for replication in the host cell or for Integration into the host cell genome.

11. Genetically modified microorganism containing in a replicable form at least one nucleic acid according to claims 1 to 3, which in Comparison to the corresponding non-genetically modified microorganism is expressed more and / or the number of copies is increased.

12. Genetically modified microorganism according to claim 11 containing in replicable form a gene structure according to claim 9 or a vector according to claim 10.

13. Genetically modified microorganism according to one of claims 11 or 12 containing at least one polypeptide according to claims 4 to 8, which one compared to the one that is not genetically modified accordingly Microorganism has increased activity.

14. Genetically modified microorganism according to one of claims 11 to 13 characterized in that it is a coryneform bacterium, preferably the Genus Corynebacterium or Brevibacterium.

15. Genetically modified microorganism according to one of claims 11 to 14, characterized in that it is a bacterium of the species Corynebacterium is glutamicum or Brevibacterium flavum.

16. Probe for identifying and / or isolating genes coding for on the Biosynthesis of proteins involved in L-serine characterized in that they starting from nucleic acid sequences according to one of claims 1 to 3 is produced and contains a label suitable for detection.

17. A method for isolating nucleic acids according to one of claims 1 to 3, producing a coryneform bacterium that is transposon- Mutagenesis produced defects in the serB and serC genes.

18. A process for the microbial production of L-serine, characterized in that

a) at least one nucleic acid according to one of claims 1 to 3 isolated from a coryneform bacterium is transferred into a homologous microorganism and expressed there, the gene expression and / or the activity of the correspondingly encoded polypeptide being increased compared to the correspondingly non-genetically modified microorganism,
b) this genetically modified microorganism from step b) is used for the fermentative production of L-serine and
c) the correspondingly formed L-serine is isolated from the culture medium.

19. Use of the L- produced by a process according to claim 18 Amino acids for use in food, feed and / or Pharmaceutical industry or human medicine.

20. Use of those produced by a method according to claim 18 Amino acid L-serine as a precursor for the synthesis of L-glycine, L-cysteine and / or L-tryptophan and / or metabolites derived therefrom.