DD299440A5

DD299440A5 - METHOD FOR THE COMPLETE RESTRICTION OF DNA MOLECULES

Info

Publication number: DD299440A5
Application number: DD33010089A
Authority: DD
Inventors: Detlev Krueger; Viktoras Butkus; Monika Reuter; Arvydas Janulaitis; Maryte Petrusyte; Claus-Dieter Pein; Sigrid Hansen; Dieter Cech
Original assignee: Krueger,Dieter,De; Butkus,Viktoras,Su; Janulaits,Arvydas,Su; Petrusyte,Maryte,Su; Cech,Dieter,De
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1992-04-16

Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur vollstaendigen Restriktion von DNA-Molekuelen dar. Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik, wo eine spezifische Fragmentierung von DNA-Molekuelen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen zu den Basismethoden gehoert. Das Ziel der Erfindung besteht darin, DNA-Molekuele, die unter Verwendung der bisher bekannten Methode durch bestimmte Restriktionsendonukleasen nur inkomplett spaltbar waren vollstaendig und schnell in die spezifischen Restriktionsfragmente zu zerlegen. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dasz solche DNA-Molekuele in Gegenwart einer zweiten DNA-Species (insbesondere Oligonukleotid-Duplexe, die den Erkennungsort fuer die entsprechende Restriktionsendonuklease enthalten) mit der Restriktionsendonuklease inkubiert werden. Als sehr vorteilhaft erwies sich das Verfahren zur Komplettierung und Beschleunigung der spezifischen Spaltung von DNA des Phagen lambda durch die Restriktionsendonukleasen Eco57I und Cfr9I, von DNA des Phagen-Vektors mp18 durch EcoRII und des Plasmids pBR322 durch NarI.{Gentechnik; Restriktionsendonukleasen; DNA; DNA-Spaltung; Oligonukleotide; Phagen; Vektoren; Plasmide; Cfr9I}The invention relates to a process for the complete restriction of DNA molecules. The invention relates to the field of genetic engineering, where a specific fragmentation of DNA molecules by means of restriction endonucleases belongs to the basic methods. The object of the invention is to completely and rapidly break down DNA molecules which were only incompletely cleavable using certain previously known restriction endonucleases using the previously known method into specific restriction fragments. The object was achieved by incubating such DNA molecules with the restriction endonuclease in the presence of a second DNA species (in particular oligonucleotide duplexes which contain the recognition site for the corresponding restriction endonuclease). The method for completing and accelerating the specific cleavage of phage lambda DNA by the restriction endonucleases Eco57I and Cfr9I, DNA of the phage vector mp18 by EcoRII and the plasmid pBR322 by NarI proved to be very advantageous. {Genetic engineering; restriction endonucleases; DNA; DNA cleavage; oligonucleotides; phage; vectors; plasmids; Cfr9I}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik. Sie hat zum Ziel, die spezifische Fragmentierung von DNA-Molekülen durch Restriktionsendonukleasen effektiver zu gestalten. Die Aufgabe besteht darin, DNA-Moleküle, die durch bestimmte Restriktionsendonukleasnn unter den üblichen Reaktionsbedingungen nur partiell geschnitten werden bzw. ungewöhnlich lange Inkubationszeiten zur Erhöhung der Spaltungseffektivität benötigen, durch diese Restriktionsendonukleasen vollständig und schnell zu spalten. Sie betrifft damit eine Basismethode der Gentechnik und ist auf diesem Gebiet anwendbar.The invention relates to the field of genetic engineering. Its goal is to make the specific fragmentation of DNA molecules by restriction endonucleases more effective. The object is to completely and rapidly cleave DNA molecules which are only partially cut by specific restriction endonucleases under the customary reaction conditions or require unusually long incubation times to increase the cleavage efficiency by means of these restriction endonucleases. It thus relates to a basic method of genetic engineering and is applicable in this field.

Characteristic of the known state of the art

Die ortsspezifische Spaltung von DNA-Molehülen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen ist eine Basismethode zur Herstellung definierter Fragmente des genetischen Materials (DNA), die dann weiter analysiert oder gentechnisch neu verkoppelt werden können. Das übliche Vorgehen besteht in der In-vito-Inkubation der gereinigten DNA mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease .inter definierten Temparaturbedingungen (meist 37⁰C) in Gegenwart einer für jede Restriktionsendonuklease charakteristischen Salz· und Kofaktorkonzentration bei entsprechendem pH-Wert (MANIATIS et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York, 1982).The site-specific cleavage of DNA molecules by means of restriction endonucleases is a basic method for the production of defined fragments of the genetic material (DNA), which can then be further analyzed or genetically recombined. The usual procedure consists in the in vitro incubation of the purified DNA with the appropriate restriction endonuclease. Under defined temperature conditions (usually 37 ⁰ C) in the presence of a characteristic for each restriction endonuclease salt and cofactor concentration at the appropriate pH (MANIATIS et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982).

Resistenz von gereinigten DNA-N!olekül9n gegenüber bestimmten Restriktionsendonukleasen trotz des Vorliegens entsprechender Erkennungsorte in der DNA kann durch die Präsenz modifizierter oder unüblicher Basen in der DNA-Erkennungssequenz odor in deren Nähe bedingt sein und durch das Ersetzen dieser Basen durch die vier üblichen Basen Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin überwunden werden (KRUGiR und BICKLE, Microbiol, Reviews 47 (1983) 345-360). Kürzlich wurde gefunden, daß die Resistenz von DNA-Molekülen auch darauf beruhen kann, daß bestimmte Restriktionsendonukleasen besondere Anforderung9n an die Substrat-DNA stellen (z. B. koordiniertes Vorliegen mehrerer Erkennungsorte in der Substrat-DNA) und die resistente DNA diese Anforderungen nicht erfüllte. In diesem Falle besteht ein Weg zur Überwindung der Resistenz in dir Koinkubation der resistenten DNA mit empfindlichen DNA-Species bzw. Oligonukleotid-Duplexen, die den Erkennungsort für die entsprechende Restriktionsendonuklease besitzen (BARCAK et al., Wirtschaftspatent DD 264231; KRÜGER et al., Nucleic Acids Res. 16 [1988] 3997-4008; PEIN et al., FEBS Letters 245 [1989] 141-144). Unabhängig vom Auftreten solcher resistenter DNA-Spedes ist aus der Literatur (z. B. BOLTON et al., Gene 1 β [1988] 31-43) und aus der praktischen Erfahrung in der Gentechnik bekannt, daß sich verschiedene Erkennungsorte in demselben DNA-Molekül durch bestimmte Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlicher Effizienz schneiden lassen. Daraus resultiert, daß die Spaltung solcher DNA-Species durch bestimmte Restriktionsendonukleasen unter den üblichen Reaktionsbedingungen nur inkomplett ist und auch durch längere Inkubationszeiten und mehrmalige Zugabe der Restriktionsendonuklease zum Inkubationsansatz meist nicht komplettiert werden kann. Die molekularen Ursachen des unvollständigen Schneidens von DNA-Species sowie Methoden zur Vervollständigung und Beschleunigung der DNA-Restriktion waren bisher nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung schafft eine solche praktikable Möglichkeit.Resistance of purified DNA molecules to certain restriction endonucleases, despite the presence of corresponding recognition sites in the DNA, may be due to the presence or proximity of modified or unusual bases in the DNA recognition sequence, and by replacing these bases with the four common bases adenine , Guanine, cytosine or thymine (KRUGIR and BICKLE, Microbiol, Reviews 47 (1983) 345-360). Recently, it has been found that the resistance of DNA molecules may also be due to certain restriction endonucleases placing special demands on the substrate DNA (e.g., coordinated presence of multiple recognition sites in the substrate DNA) and the resistant DNA failing to meet these requirements , In this case, one way to overcome resistance is to co-incubate the resistant DNA with sensitive DNA species or oligonucleotide duplexes that have the recognition site for the corresponding restriction endonuclease (BARCAK et al., Wirtschaftspatent DD 264231, KRÜGER et al. Nucleic Acids Res. 16 [1988] 3997-4008; PEIN et al., FEBS Letters 245 [1989] 141-144). Regardless of the occurrence of such resistant DNA spedes, it is known from the literature (eg BOLTON et al., Gene 1β [1988] 31-43) and from practical experience in genetic engineering that different recognition sites are located in the same DNA gene. Cut the molecule through different restriction endonucleases with different efficiency. The result of this is that the cleavage of such DNA species by certain restriction endonucleases under the usual reaction conditions is only incomplete and can usually not be completed by longer incubation times and repeated addition of the restriction endonuclease to the incubation mixture. The molecular causes of incomplete DNA species cutting and methods for completing and accelerating DNA restriction have not been previously known. The present invention provides such a viable option.

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, DNA-Moleküle, die unter Verwendung der bisher bekannten Methoden durch bestimmte Restriktionsendonukleasen nur inkomplett spaltbar sind, vollständig und schnell in die spezifischen Restriktionsfragmente zu zerlegen.The aim of the invention is to completely and rapidly break down into the specific restriction fragments DNA molecules which are only incompletely cleavable using the previously known methods by certain restriction endonucleases.

-2- 299 440 Darlegung des Wesens der Erfindung-2- 299 440 Presentation of the Essence of the Invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das sich zur schnellen und vollständigen Spaltung von DNA-Molekülen eignet. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß DNA-Moleküle, die mit den bisher bekannten Methoden nur unvollständig spaltbar sind, in Gegenwart einer zweiten, empfindlichen DNA-Species (insbesondere Oligonukleotid-Duplexen, die den Erkennungsort für die entsprechende Restriktlonsendonuklease besitzen) mit der Restriktionsendonukl6ase inkubiert werden.The invention has for its object to develop a method that is suitable for the rapid and complete cleavage of DNA molecules. The object was achieved in that DNA molecules which are only incompletely cleavable with the previously known methods, in the presence of a second, sensitive DNA species (in particular oligonucleotide duplexes which have the recognition site for the corresponding Restriktlonsendonuklease) incubated with the Restriktionsendonukl6ase become.

Die verwendeten Oligonukleotid-Duplexe sind vorzugsweise 12 bis 20 Basenpaare lang und enthalten etwa in ihrer Mitte die Erkennungssequenz für das entsprechende Restriktionsenzym. Das mengenmäßige Verhältnis der komplett zu schneidendun DNA zur Aktivator-DNA (Oligonukleotid-Duplexe oder biologisch replizierte, empfindliche DNA-Species) ist so zu gestalten, daß die Zahl von Erkennungsorten für das entsprechende Restriktionsenzym in der Aktivator-DNA mindestens so groß oder größer ist als in der eigentlichen Substrat-DNA. Nach Beendigung der Koinkubation mit der Restriktionsendonuklease werden die entstandenen DNA-Fragmente wie üblich durch Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht (MANIATIS et al., s. oben). Überraschenderweise gelingt es mit dieser Methode, die DNA-Moleküle schnell und vollständig in die spezifischen Restriktonsfragmente zu zerlegen. Das Verfahren ermöglicht es erstmals, eine komplette Spaltung von DNA-Species durch bestimmte Restriktionsendonukleasen zu bewerkstelligen. Die vollständige Spaltung der DNA-Moleküle ist eine für die Lösung der meisten gentechnischen Fragestellungen notwendige Voraussetzung. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, die bisher in den Fällen unvollständiger DNA-Spaltung geübte Praxis einer mehrfachen Zugabe der Restriktionsendonuklease zum Inkubationsansatz sowie einer vielstündigen (über Nacht oder länger) Inkubation zu verbessern und die vollständige Spaltung der DNA durch einmalige Enzymgabe und eine kurze Inkubationszeit zu erreichen. Damit ist das Verfahren, neben der Tatsache, daß so überhaupt erstmalig eine vollständige Fragmentierung von DNA-Molekülen ermöglicht wird, auch zeit- und materialökonomisch.The oligonucleotide duplexes used are preferably 12 to 20 base pairs long and contain approximately in their middle the recognition sequence for the corresponding restriction enzyme. The quantitative ratio of DNA to be completely cut to the activator DNA (oligonucleotide duplexes or biologically replicated sensitive DNA species) should be such that the number of recognition sites for the corresponding restriction enzyme in the activator DNA is at least as large or greater than in the actual substrate DNA. After completion of the co-incubation with the restriction endonuclease, the resulting DNA fragments are separated as usual by gel electrophoresis and visualized (MANIATIS et al., Supra). Surprisingly, this method makes it possible to rapidly and completely break down the DNA molecules into the specific restriction fragments. The method makes it possible for the first time to accomplish a complete cleavage of DNA species by certain restriction endonucleases. The complete cleavage of the DNA molecules is a prerequisite for the solution of most genetic engineering issues. Another advantage of the method is to improve the previously practiced in cases of incomplete DNA cleavage practice of multiple addition of the restriction endonuclease incubation approach and a many hours (overnight or longer) incubation and complete cleavage of the DNA by a single enzyme and a short Reach incubation period. Thus, the method, in addition to the fact that even the first time a complete fragmentation of DNA molecules is made possible, also time and material economics.

Als sehr vorteilhaft hat sich das Verfahren zur Komplettierung und Beschleunigung der spezifischen Spaltung von DNA des Phagen lambda durch die Restriktionsendonukleasen Eco57l und Cfr9l, von DNA des Phagen-Vektors mpl8 durch E-pH11 und des Plasmids pBR322 durch Narl erwiesen. Die verwendeten Oligonukleotid-Duplexe können durch die üblichen chemischen und/oder enzymatischen Verfahren synthetisiert oder aus natürlicher DNA erzeugt werden.The method for completing and accelerating the specific cleavage of phage lambda DNA by the restriction endonucleases Eco571 and Cfr9l, DNA of the phage vector mpl8 by E-pH11 and the plasmid pBR322 by Narl has proven to be very advantageous. The oligonucleotide duplexes used can be synthesized by the usual chemical and / or enzymatic methods or generated from natural DNA.

Ausführungsbeispieleembodiments

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.The invention will be explained below with reference to exemplary embodiments.

example 1

Die Restriktionsendonuklease Cfr91 erkennt die BasensequenzThe restriction endonuclease Cfr91 recognizes the base sequence

3'-GGGCCC ^{im DNA}-^Molekül (BUTKUS et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987] 7091-7102).3'-GGGCCC ^{in the DNA} ^molecule (BUTKUS et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987) 7091-7102).

Die DNA des Bakteriophagen lambda, der auch als Vektor in der Gentechnik Verwendung findet, besitzt 3 Erkennungsorte für diese Restriktionsendonuklease. Auch unter optimalen Reaktionsbedingungen kommt es nur zur unvollständigen Verdauung der lambda-DNA. Zugabe des 12 Basenpaare langen Oligonukleotid-Duplexes •ι λ λ A/"*(**f*/"*/¹^f*Τ/"ΌThe DNA of the bacteriophage lambda, which is also used as a vector in genetic engineering, has 3 recognition sites for this restriction endonuclease. Even under optimal reaction conditions, only incomplete digestion of the lambda DNA occurs. Addition of the 12-base-pair oligonucleotide duplex • ι λ λ A / "* (** f * /" * / ¹ ^ f * Τ / "Ό

V CCTGCCCCCAGC ^zum Reaktionsgemisch ermöglicht eine vollständige Cfr91-Spaltung der Substrat-DNA. V CCTGCCCCCAGC ^{to the} reaction mixture allows complete Cfr91 cleavage of the substrate DNA.

In einem Reaktionsansatz werden 2\ig lambda-DNA, 5 χ 10~⁷ Mol des o.g. Dodekadesoxynukleotid-Duplexes und 5 Einheiten Cfr9l in 20μΙ Reaktionspuffer mit den Kofaktorkonzentrationen 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 5mM MgCI₂,20OmM Natriumglutamat, 1 mM DTTsowie lOOpg/ml Rinderserumalbumin für 1 Stunde bei 37°C inkubiert.In a reaction mixture 2 ig lambda DNA, 5 χ 10 ~ ⁷ mol of the above Dodekadesoxynukleotid duplexes and 5 units Cfr9l in 20μΙ reaction buffer with the cofactor concentrations 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5mM MgCl ₂ , 20OmM sodium glutamate, 1 mM DTT and lOOpg / ml bovine serum albumin for 1 hour at 37 ° C.

Nach Abstoppen der Reaktion (5 min Inkubation bei 65⁰C) erfolgt die Auftrennung der DNA-Fragmente durch Elektrophorese imAfter stopping the reaction (5 min incubation at 65 ⁰ C), the separation of the DNA fragments by electrophoresis in

Agarosegel mit anschließender Sichtbarmachung der Fragmente im UV-Licht (312nm) nach Äthidiumbromidbehandlung desAgarose gel with subsequent visualization of the fragments in UV light (312nm) after treatment with ethidium bromide

Example 2

Wie Beispiel 1, nur da¹} anstelle von 5 Einheiten Cfr9l 10 Einheiten der Restriktionsdonuklease Eco57l sowie anstelle des im Beispiel 1 genannten' )!igonukleotid-Duplexes ein Duplex mit Einzelkettenlängen von 13 bzw. 16 Nukleotiden, der die Eco57l-Erkennungssequenz enthält, in einer Endkonzentration von 2x10"' Mol eingesetzt wurden. Die Inkubationsbedingungen des Restriktionsgemisches waren die für Eco57l optimalen (Katalog des ESP Fermentes „Enzymes for Molecular Biology").As in Example 1, only ¹ } instead of 5 units of Cfr9l 10 units of the restriction dinuclease Eco57l and instead of the ') oligonucleotide duplexes mentioned in Example 1, a duplex with single chain lengths of 13 or 16 nucleotides, which contains the Eco57l recognition sequence, in The incubation conditions of the restriction mixture were those optimal for Eco57I (catalog of ESP Fermentes "Enzymes for Molecular Biology").

Claims

1. A process for the complete restriction of DNA molecules by means of restriction endonucleases, characterized in that DNA molecules which can be cut only incompletely by the known methods by certain restriction endonucleases, with the addition of a second DNA species completely and quickly into specific Fragments are decomposed.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as second DNA specioses synthetically produced oligonucleotide duplexes, biologically replicated DNA molecules or parts thereof, which have recognition sites for the respective restriction endonuclease and carry no specific methylation.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that predominantly oligonucleotide duplexes of 12 to 20 base pairs in length are used, which contain the caging sequences for the restriction endonucleases Cfr9l, Eco57l, EcoRII orNarl.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that a complete digestion of the DNA of the phage lambda by Cfr9l and Eco57l, the Klcnierungsvektors mp 18 by EcoRII and the plasmid pBR322 by Narl is achieved.

5. The method according to claim 1 and 2, characterized in that oligonucleotide duplexes are used, which are synthesized by the usual chemical and / or enzymatic methods or generated from natural DNA.