DD296163A5 - ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE DETECTION OF TETANUS TOXIN - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Enzymimmunoassay zum Nachweis von Tetanustoxin, der zur Abloesung des bisherigen Intoxikationstests geeignet ist. Das Wesen der Erfindung besteht darin, dasz zwei unterschiedliche Tetanustoxin-spezifische monoklonale Antikoerper (mAk) - der eine zur Festphasenimmobilisierung, der zweite in enzymmarkierter Form - Verwendung finden. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Enzymimmunoassay; Tetanustoxin; Intoxikationstest; monoklonale Antikoerper (mAk); Festphasenimmobilisierung; Enzymmarkierung; Medizin; Diagnostik}The invention relates to an enzyme immunoassay for the detection of tetanus toxin, which is suitable for the abloesung of the previous intoxication test. The essence of the invention is that two different tetanus toxin-specific monoclonal antibodies (mAbs) - one for solid phase immobilization, the second in enzyme-labeled form - are used. The field of application of the invention is medical diagnostics. {Enzyme immunoassay; Tetanus toxin; Intoxikationstest; monoclonal antibodies (mAbs); Festphasenimmobilisierung; Enzyme label; Medicine; diagnosis}
Description
Die Erfindung bezieht sich auf einen Enzymimmunoassay zum N achweis von Tetanustoxin, der zur Ablösung der bisher üblichen Methoden zur Bestimmung des Toxingehalts z. B. von Impfstoffen, dem Intoxikationstest, geeignet ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.The invention relates to an enzyme immunoassay for N achweis of tetanus toxin, which is used to replace the previously customary methods for the determination of the toxin content z. B. of vaccines, the intoxication test is suitable. The field of application of the invention is medical diagnostics.
Zur Bestimmung des Tetanustoxingehalts stehen eine Reihe von Testsystemen zu Verfügung. Das Tetanustoxin besitzt eine Affinität zu den Gangliosiden verschiedener Nervenzellen (Wellhöner, H.H.; Neville, D.M.: J. Biol. Chem. [1987], 17374-17378). Bereits im Nanomol-Bereich wird die Halbsättigung erreicht, was sich auch in der äußerst geringen Menge Toxin zeigt, die in der Lage ist, eine lähmende oder letale Wirkung im tierischen oder menschlichen Organismus auszulösen (Helting, T. B.; Zwisler, 0.; Wiegandt, H.: J. Biol. Chem. [1977], 196-197, Helting, T. B.; Zwisler.O.: J. Biol. Chem. [1977], 187-193, Wildführ, G.: Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Epidemiologie. G. Thieme Verlag, Leipzig [1959], 309-312). Das Tetanustoxin ist ein Ektotoxin des Clostridium tetani. Es spielt bei der Auslösung des klinischen Bildes des auch heute noch schwer zu beherrschenden Wundstarrkrampfes die entscheidende Rolle. Daher wurde schon sehr früh die Immunisierung als das Mittel der Wahl zur Vermeidung dieser Erkrankung eingesetzt (Bergey, D.H.; Etris,S.: Proc. Soc. Exper. Biol. a. Med. 30 [1933), 1037). Das Toxin selbst ist zwar hoch immunogen, aber nicht zur Immunisierung geeignet. Daher ist man auf eine Detoxifizierung durch Wärme- und Formalinbehandlung angewiesen (Kraus, R.: Wien. ktin.Wschr. [1924], 1059). Da eine Detoxifizierung nie ganz vollständig ist, wird jede Impfstoffcharge auf möglicherweise noch vorhandene Toxinmengen untersucht. Ein weiteres Einsatzgebieteines Toxinnachweises ist die Kontrolle der Toxinproduzierenden Bakterienkulturen bei der Produktion des Impfstoffes (Ozutsumi, K.; Sugimoto, N.; Matsuda, M.: Appl. Environmental Microbiol. [1985], 939-943).To determine the tetanus toxin content, a number of test systems are available. The tetanus toxin has an affinity for gangliosides of various neurons (Wellhöner, H.H., Neville, D.M .: J. Biol. Chem. [1987], 17374-17378). Half saturation is already achieved in the nanomolar range, which is also reflected in the extremely low amount of toxin which is able to cause a debilitating or lethal effect in the animal or human organism (Helting, TB; Zwigler, O. Wiegandt, H.: J. Biol. Chem. [1977], 196-197, Helting, TB; Zwisler.O .: J. Biol. Chem. [1977], 187-193, Wildführ, G .: Medical Microbiology, Immunology and Epidemiology, G. Thieme Verlag, Leipzig [1959], 309-312). Tetanus toxin is an ectotoxin of Clostridium tetani. It plays the decisive role in triggering the clinical picture of the even more difficult to control tetanus. Thus, very early on, immunization was used as the drug of choice for avoiding this disease (Bergey, D.H., E .: Etris, S .: Proc. Soc. Exper. Biol. A., Med. 30 [1933], 1037). Although the toxin itself is highly immunogenic, it is not suitable for immunization. Therefore, detoxification by heat and formalin treatment is required (Kraus, R .: Wien, ktin. Wschr. [1924], 1059). Since detoxification is never complete, each vaccine lot is tested for any remaining toxin levels. Another use of toxin detection is the control of toxin-producing bacterial cultures in the production of the vaccine (Ozutsumi, K. Sugimoto, N., Matsuda, M .: Appl. Environmental Microbiol., 1985, 939-943).
Die bis heute gebräuchlichste Methode ist derToxinnachweis im Mäuse- bzw. Meerschweinchenversuch durch subkutane oder intramuskuläre Injektion einer definierten, sterilfiltrierten Menge der zu untersuchenden Lösung. Es wird hierbei die Tatsache ausgenutzt, daß die Dosis lethalis minima für eine durchschnittlich 15-16g wiegende Maus 0,000013μg Protein-Stickstoff beträgt. Die 30 Minuten auf 100°C erhitzten Toxin-Lösungen sowie die Lösungen, die mit einer definierten Menge eines standardisierten Tetanus-Antitoxins versetzt wurden, werden Mäusen gespritzt, wobei sie abhängig von der Antitoxinmenge überleben müssen. Mit Hilfe der definierten Antitoxine läßt sich die Toxinmenge halbquantitativ ermitteln (Wildführ, G.: ibdi., Ozutsumi, K.: ibdi.). Die Quantifizierung und Beurteilung desToxoids erfolgt zusätzlich durch die Bestimmung der Flockungseinheiten (G. Wildführ: ibid.) oder mit Hilfe des KRAUSschen Bindungsversuchs oder durch den Vergleich mit einem Standardtoxoid nach Schutzeinheiten, die nach Immunisierung erreicht werden (Wildführ, G.: ibdi.. Kraus, R.: idib.). Mit der Etablierung der Methode der Herstellung monoklonaler Antikörper wurde das Tetanustoxoid zu einem wichtigen Modellantigen. Heute sind die wichtigen antigenen Determinanten sowie die für die toxische Wirkung und die Membranbindung wesentlichen Regionen des Toxinmoleküls bekannt (Wellhöner, H. H.: Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. [1982], 1-68, Völckers, C: Promotion A, Univ. Gieesen [1986], Ahnert-Hilger, G.; Bizzini,B.; Goretzki, K.; Müller, H.; Völckers, C; Habermann, E.:The most common method to date is to detect toxin in the mouse or guinea pig experiment by subcutaneous or intramuscular injection of a defined, sterile-filtered amount of the solution to be tested. It exploits the fact that the lethalis minima dose is 0.000013 μg protein nitrogen for an average 15-16 g mouse. The toxin solutions heated to 100 ° C for 30 minutes and the solutions added with a defined amount of a standardized tetanus antitoxin are injected into mice, surviving depending on the amount of antitoxin. With the help of the defined antitoxins the amount of toxin can be determined semi-quantitatively (Wildführ, G .: ibdi., Ozutsumi, K .: ibdi.). The quantification and evaluation of the toxoid is additionally carried out by the determination of the flocculation units (G.Wildführ: ibid.) Or by the KRAUS binding test or by comparison with a standard toxoid after protection units which are obtained after immunization (Wildführ, G .: ibdi .. Kraus, R .: idib.). With the establishment of the method of producing monoclonal antibodies, the tetanus toxoid became an important model antigen. Today, the important antigenic determinants as well as the toxic and membrane binding regions of the toxin molecule are well known (Wellhöner, HH: Rev. Physiol, Biochem Pharmacol., 1982, 1-68, Völckers, C: Promotion A, Univ. Gieesen [1986], Ahnert-Hilger, G .; Bizzini, B .; Goretzki, K .; Müller, H., Völckers, C; Habermann, E .:
Microbiol. Immunol. [1983], 123-135, Matsuda, M.; Yoneda, M.: Biochem. Biophys. Res. Comun. [1977], 268-274, Sheppard, A. J.; Cussell, D.; Hughes, M.: Infekt. Immun. [1984], 710-714, Matsuda, M.; Yoneda, M.: Infect. Immun. [1975], 1147-1153, Helting.T.B.; Zwisler, О.: Biol. Chem. [1977], 187-193). Dabei wurden die gewonnenen Antikörper im wesentlichen hinsichtlich ihrer neutralisierenden Eigenschaften untersucht. AHNERT-HILGER et al. (ibid.) konnten dabei 4 Gruppen monoklonaler Antikörper nachweisen: 1. Anti-Toxoid-Antikörper, die mit dem Toxin, dem Toxoid, den leichten Ketten, dem Fragment B, nicht aber mit dem Fragment C reagieren und nicht neutralisierend in vitro oder in vivo sind, 2. Antikörper, die neutralisierend sind und mit dem Toxin, Toxoid und den leichten Ketten reagieren, 3. Monoklonale Antikörper, die nur das Toxoid erkennen sowie 4. Monoklonal Antikörper die mit dem Toxin, dem Toxoid, dem Fragment C, nicht mit dem Fragment B oder den leichten Ketten reagieren. Weder einzeln noch im Gemisch stellten diese und die Antikörper anderer Autoren eine Alternative zum polyklonalen Antiserum als Therapeuticum dar. Daher wurden auch humane monoklonale Antikörper diesbezüglich untersucht (Zurawski, V.R.; Haber, E.; Black, P.H.: Science [1978], 1439-1441, Boyd, J. E.; Hastings, I.; Farzad, Z.; James, K.; McClelland, D.B.L.: Develop. Biol. Standard [1984], 93-98), ohne daß sich hier der entsprechende Erfolg einstellte.Microbiol. Immunol. [1983], 123-135, Matsuda, M .; Yoneda, M .: Biochem. Biophys. Res. Comun. [1977], 268-274, Sheppard, A.J .; Cussell, D .; Hughes, M .: Infection. Immune. [1984], 710-714, Matsuda, M .; Yoneda, M .: Infect. Immune. [1975], 1147-1153, Helting.T.B .; Zwisler, О .: Biol. Chem. [1977], 187-193). In this case, the antibodies obtained were examined essentially with regard to their neutralizing properties. AHNERT-HILGER et al. (ibid.) were able to detect 4 groups of monoclonal antibodies: 1. anti-toxoid antibodies that react with the toxin, the toxoid, the light chains, the fragment B, but not with the fragment C and not neutralizing in vitro or in 2. antibodies which are neutralizing and react with the toxin, toxoid and the light chains, 3. monoclonal antibodies which only recognize the toxoid and 4. monoclonal antibodies which do not react with the toxin, the toxoid, the fragment C. react with the fragment B or the light chains. Neither individually nor in mixture did these and the antibodies of other authors represent an alternative to the polyclonal antiserum as therapeutic. Therefore, human monoclonal antibodies were also investigated in this respect (Zurawski, VR; Haber, E. Black, PH: Science [1978], 1439- 1441, Boyd, JE, Hastings, I., Farzad, Z., James, K. McClelland, DBL: Develop. Biol. Standard [1984], 93-98), but without the corresponding success.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Es ist das Ziel der Erfindung, den halbquantitativen Intoxifikationsversuch zur Bestimmung des Tetanustoxins zu ergänzen bzw. abzulösen.It is the object of the invention to supplement or replace the semiquantitative Intoxifikationsversuch for the determination of tetanus toxin.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zum Nachweis von Tetanustoxin in Gestalt eines Enzymimmunoassays (EIA) zu entwickeln. Erfindungsgemäß wurde die Aufgabe durch den Einsatz eines monoklonalen Antikörpers (mAK) von der Maus an der festen Phase eines EIA und eines humanen monoklonalen Antikörpers, der indirekt durch ein enzymmarkiertes anti-human-lgG nachgewiesen wird, gelöst.The invention has for its object to develop a novel method for the detection of tetanus toxin in the form of an enzyme immunoassay (EIA). According to the invention, the object has been achieved by the use of a mouse monoclonal antibody (mAb) on the solid phase of an EIA and a human monoclonal antibody indirectly detected by an enzyme-labeled anti-human IgG.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß durch die Kombination zweier monoklonaler Antikörper verschiedener Spezies ein ausschließlicher Nachweis des Tetanustoxins bis zu einer unteren Nachweisgrenze von 1,2ng/ml möglich ist. Erst etwa 2500-5000fach höhere Konzentrationen, wobei allerdings nicht ganz auszuschließen ist, daß dann die in nahezu jedem Toxoid enthaltenen geringen Mengen Toxins im EIA nachgewiesen werden.Surprisingly, it has been found that by the combination of two monoclonal antibodies of different species exclusive detection of tetanus toxin is possible up to a lower detection limit of 1.2ng / ml. Only about 2500-5000fach higher concentrations, although it can not be ruled out that then the contained in almost every toxoid small amounts of toxins are detected in the EIA.
Der genutzte murine monoklonale Antikörper CB-TTG1 wird aus dem Hydridom H-CB-TT-G 1 (ZIM-0489) gewonnen. Er reagiert mit dem Tetanustoxin mit einer Dissoziationskonstante von 3,91 χ 10~9 mol/l. Das potentielle Epitop befindet sich auf der schweren Kette des Toxins, so daß der Antikörper auf dem nicht reduktiv gespaltenen und dem reduktiv gespaltenen Antigen nach dem Western Blot nachweisbar wird.The murine monoclonal antibody CB-TTG1 used is obtained from the hydridome H-CB-TT-G 1 (ZIM-0489). It reacts with the tetanus toxin with a dissociation constant of 3.91 χ 10 ~ 9 mol / l. The potential epitope is located on the heavy chain of the toxin so that the antibody on the non-reductively cleaved and reductively cleaved antigen becomes detectable after Western blotting.
Der als Zweitantikörper verwendete humane Antikörper CB-HTT-G 3 wird nach der Immunisierung gesunder Probanden mit Tetanustoxoid durch PEG-Fusion von Lymphozyten aus dem peripheren Blut mit der Heteromyelonzellinie CB-Fu 2 (ZIM-0314) gewonnen. Die Klone werden zum Nachweis der Antigenspezifität auf Tetanustoxin und Tetanustoxoid in den entsprechenden antigenspezifischen Enzymimmunoassays untersucht. Die Antikörper dieses Klones sind überraschenderweise für den Aufbau eines Enzymimmunoassays zum Nachweis von Tetanustoxin geeignet, da er eine Dissoziationskonstante von 8,48 χ 10"12 mol/l aufweist. Dieser Antikörper erkennt ein Epitop, das nur auf dem nativen Eiweiß vorhanden ist und das durch die für die dem Western Blot vorgeschaltete Natrium-Dodecylsulphat(SDS)-Behandlung für die SDS-Elektrophorese so zerstört wird, daß mit dieser Methode keine Epitopzuordnung vorgenommen werden kann und das Epitop als Konformationsdeterminante zu beschreiben ist. Der monoklonale Antikörper CB-TT-G3 läßt sich mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, ß-Galaktosidase, Urease, Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC), Rhodamin, TNP oder anderen Haptenen oder Markerenzymen markieren.The human antibody CB-HTT-G3 used as a second antibody is obtained after immunization of healthy volunteers with tetanus toxoid by PEG fusion of peripheral blood lymphocytes with the CB-Fu 2 heteromyelone cell line (ZIM-0314). The clones are screened for detection of antigen specificity for tetanus toxin and tetanus toxoid in the appropriate antigen specific enzyme immunoassays. The antibodies of this clone are surprisingly suitable for the development of an enzyme immunoassay for the detection of tetanus toxin, as it χ a dissociation constant of 8.48 10 "12 mol / l. This antibody recognizes an epitope that is only present on the native protein and the is destroyed by the sodium dodecyl sulphate (SDS) treatment preceding the Western Blot for SDS electrophoresis so that no epitope assignment can be made with this method and the epitope is to be described as a conformation determinant. G3 can be labeled with peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase, urease, fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine, TNP or other haptens or marker enzymes.
Der vorgestellte EIA ist aufgrund der einfachen Handhabbarkeit für Anwendungen bei der Kontrolle der Tetanustoxin bzw. -toxoidproduktion gut geeignet.The proposed EIA is well suited for applications in the control of tetanus toxoid or toxoid production due to its ease of handling.
Die Zellinie H-CB-TT-G1 ist in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter der Nummer ZIM-0489 hinterlegt worden, die Heteromyelomzellinie CB-Fu 2 unter der Nummer ZIM-0314.The cell line H-CB-TT-G1 has been deposited in the depository of the Central Institute of Molecular Biology AdW of the GDR, Berlin-Buch, under the number ZIM-0489, the heteromyeloma cell line CB-Fu 2 under the number ZIM-0314.
1.1. Präparation und Herstellung monoklonaler Antikörper1.1. Preparation and production of monoclonal antibodies
Die Herstellung der monoklonalen Antikörper erfolgt nach ausführlicher Immunisierung der Mäuse bzw. gesunder Probanden nach den von Köhler und Milstein (Köhler, G., C. Milstein: Nature 256 [1975],495-497) beschriebenen Methoden. Die Antikörper können, wenn sie in die Massenkultur überführt sind, mit konventionellen Methoden aus dem Zellkulturüberstand gereinigt werden. Eine vorgeschaltete Ultrafiltration über eine Membran (Abscheidegrenze: 100000MG) ermöglicht eine Konzentration der monoklonalen Antikörper um den Faktor 10-20. Durch eine Affinitätschromatographie an insolubilisiertem Protein A und der Elution mit 3 mol/l KSCN werden die Antikörper bis zu einer Reinheit von über 90% angereichert. In dieser Form ist der murine monoklonale Antikörper zur Festphaseninsolubilisierung geeignet. Für den humanen monoklonalen Antikörper ist beim indirekten Nachweis eine Reinigung ganz vermeidbar. Wird jedoch eine direkte Enzymmarkierung angestrebt, ist das oben beschriebene Vorgehen anzuwenden.The monoclonal antibodies are produced after extensive immunization of the mice or healthy volunteers according to the methods described by Köhler and Milstein (Köhler, G., C. Milstein: Nature 256 [1975], 495-497). The antibodies can be purified from the cell culture supernatant by conventional methods when transferred to mass culture. An upstream ultrafiltration through a membrane (separation limit: 100,000MG) allows a concentration of monoclonal antibodies by a factor of 10-20. By affinity chromatography on insolubilized protein A and elution with 3 mol / l KSCN, the antibodies are enriched to a purity of over 90%. In this form, the murine monoclonal antibody is suitable for solid phase insolubilization. For the human monoclonal antibody in the case of indirect detection, purification is entirely avoidable. However, if a direct enzyme label is desired, the procedure described above should be used.
1.2. Konjugate1.2. conjugates
Die Markierung des CB-HTT-G 3 bzw. des nach üblichen Verfahren gewonnenen anti-human-lgG-Antikörpers mit der Peroxidase (POD) erfolgt nach der von Wilson und Nakane (Wilson, M. B., Nakane, P. K. [1978] In: W. Knapp, K. Holubar und G. Wick [Eds.], Immunofluorescence and related staining techniques [Elsevier, Amsterdam], 215) beschriebenen Methode im molaren Verhältnis von 1:4 (lgG:POD).The labeling of the CB-HTT-G 3 or of the anti-human IgG antibody obtained by conventional methods with the peroxidase (POD) is carried out according to the method described by Wilson and Nakane (Wilson, MB, Nakane, PK [1978] In: W Knapp, K. Holubar and G. Wick [Eds.], Immunofluorescence and related staining techniques [Elsevier, Amsterdam], 215) in a molar ratio of 1: 4 (IgG: POD).
1.3. Enzymimmunoassay1.3. Enzyme Immunoassay
Polystyren-Mikrotestplatten wurden mit3,5mg/l H-CB-TTG1 in 0,1 mol/l Carbonatpuffer pH 9,6 benetzt (δΟμΙ/ΚβνϊίδΙ). Die Inkubation erfolgte über Nacht. Nach dem Waschen mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,1 % Tween 20, pH7,2, können die so behandelten Platten über 6 Monate bei -20°C gelagert werden. Zur Bestimmung der unteren (UNG) und Analytischen Nachweisgrenze (ANG) wurden nach dem Auftauen und Waschen 20fach-Bestimmungen von 4 Konzentrationen eines diskelektrophoretisch reinen Tetanustoxins im ansteigenden Teil der Bezugskurve eingesetzt, wobei sich die Bezugskurve durch die GleichungPolystyrene microplates were wetted with 3.5 mg / l H-CB-TTG1 in 0.1 mol / l carbonate buffer pH 9.6 (δΟμΙ / ΚβνϊίδΙ). The incubation took place overnight. After washing with phosphate buffered saline (PBS), 0.1% Tween 20, pH 7.2, the so treated plates can be stored for 6 months at -20 ° C. For the determination of the lower (UNG) and analytical detection limit (ANG), 20-fold determinations of 4 concentrations of a discrete electrophoretically pure tetanus toxin in the ascending part of the reference curve were used after thawing and washing, the reference curve being given by the equation
У =У =
1 + e1 + e
-(clnx+b)- (clnx + b)
darstellen läßt (x = Konzentration, у = Extinktion). Als Verdünnungspufferfür Proben und Standard diente PBS,0,1 %v/v Tween 20:5% v/v Gelatine, 1 mg/l Phenolrot, pH7,2).can represent (x = concentration, у = extinction). The sample and standard dilution buffer used was PBS, 0.1% v / v Tween 20: 5% v / v gelatin, 1 mg / l phenol red, pH 7.2).
Die Reaktionszeit beträgt 120min bei Raumtemperatur. Nach zweimaligem Waschen wird 120min der humane monoklonale Antikörper CB-HTT-G 3 dessen optimale Konzentration (0,25 цд/ті) durch Vorversuche ermittelt wurde, hinzugesetzt. Dessen Nachweis wird indirekt durch ein peroxidasemarkiertes speziesspezifisches anti-human-lgG-POD-Konjugat nach einer weiteren Inkubation von 60min möglich.The reaction time is 120 minutes at room temperature. After washing twice, the human monoclonal antibody CB-HTT-G3, whose optimal concentration (0.25 цd / ті) was determined by preliminary experiments, is added for 120 minutes. Its detection is possible indirectly by a peroxidase-labeled species-specific anti-human IgG-POD conjugate after a further incubation of 60 min.
Danach setzt gebundenes Konjugat das Substrat (5mmol/l ortho-Phenylendiamin, 5 mmol/l H2O2 in 0,1 mol/l Citratpuffer pH 5,0) um. Der Reaktionsabbruch erfolgt nach 25 ± 2min mit 1 mol/l H2SO4,0,05mol/l Na2SO3.Thereafter, bound conjugate converts the substrate (5 mmol / L ortho-phenylenediamine, 5 mmol / L H 2 O 2 in 0.1 mol / L citrate buffer pH 5.0). The reaction is terminated after 25 ± 2min with 1 mol / l H 2 SO 4 , 0.05 mol / l Na 2 SO 3 .
Die Messung wird bichromatisch bei 492nm und 690nm durchgeführt. Als UNG gilt die Konzentration, die sich vom 3S Vertrauensbereich der Leerwertkontrolle unterscheiden läßt. Sie wird durch die Gleichung UNG = xL + 1,5(sL + S1) (x = Mittelwert des Leerwertes, sL = Streuung der Extinktion des Leerwertes, s, = Streuung der Extinktion im ansteigenden Teil der Bezugskurve), beschrieben. Die UNG wird dabei für das Tetanustoxin mit 1,2ng/ml ermittelt. Wird dagegen Tetanustoxoid als Antigen im EIA eingesetzt, sind nachweisbare Extinktionen erst ab einer Konzentration von 2500-5000ng/ml vorhanden.The measurement is performed bichromatically at 492nm and 690nm. The UNG is the concentration which can be distinguished from the 3S confidence range of the blank value control. It is described by the equation UNG = x L + 1.5 (s L + S 1 ) (x = mean of the blank, s L = scattering of the extinction of the blank, s, = scattering of the absorbance in the rising part of the reference curve) , The UNG is determined to be 1.2 ng / ml for tetanus toxin. In contrast, if tetanus toxoid is used as an antigen in the EIA, detectable extinctions are only present from a concentration of 2500-5000 ng / ml.
Konzentration Tetanustoxin TetanustoxoidConcentration tetanus toxin tetanus toxoid
im EIA Ejeo-^gjnm Еб80-492птin the EIA Ejeo- ^ gjnm Еб80-492пт
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| DD (1) | DD296163A5 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1305904C (en) * | 2003-12-30 | 2007-03-21 | 龚小迪 | Human anti-tetanotoxin monoclonal antibody, method for preparation and application |
-
1990
- 1990-05-15 DD DD34067290A patent/DD296163A5/en unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1305904C (en) * | 2003-12-30 | 2007-03-21 | 龚小迪 | Human anti-tetanotoxin monoclonal antibody, method for preparation and application |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
| RPV | Change in the person, the name or the address of the representative (searches according to art. 11 and 12 extension act) |
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