DD296083A5 - Process for the preparation of iodinated peptides and polypeptides - Google Patents
Process for the preparation of iodinated peptides and polypeptidesInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von iodierten Peptiden und Polypeptiden, die freie Aminogruppen am N-Terminus oder in der Seitenkette besitzen. Erfindungsgemaesz werden die Peptide mit * I umgesetzt oder mit * IV acyliert und die Acylpeptide iodiert. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die medizinische Diagnostik.{Iodierung; Peptide; Polypeptide; Acylpeptide; * * Pharmazie; Medizin; Diagnostik}The invention relates to a process for the preparation of iodinated peptides and polypeptides having free amino groups at the N-terminus or in the side chain. According to the invention, the peptides are reacted with * I or acylated with * IV and the acyl peptides are iodinated. The fields of application of the invention are the pharmaceutical industry and medical diagnostics. peptides; polypeptides; acyl peptides; * * Pharmacy; Medicine; diagnosis}
Description
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung von Peptiden/ Polypeptiden, die oxydationsempfindliche Aminosäuren im Verband enthalten, mit dem Ester der Formel I erfolgt.2. The method according to claim 1, characterized in that the reaction of peptides / polypeptides which contain oxidation-sensitive amino acids in the association takes place with the ester of formula I.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung von Peptiden/ Polypeptiden, die keine oxydationsempfindlichen Aminosäuren im Verband enthalten, mit dem Ester der Formel IV erfolgt und die Acyl-peptide bzw. -polypeptide anschließend iodiert werden.3. The method according to claim 1, characterized in that the reaction of peptides / polypeptides which contain no oxidation-sensitive amino acids in the dressing, is carried out with the ester of formula IV and the acyl peptides or polypeptides are then iodinated.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lodierung des Esters der Formel IV bzw. der durch die Umsetzung mit dem Ester der Formel IV gebildeten Acyl-peptide bzw. -polypeptide mit Chloramin T und Kaliumiodid erfolgt.4. The method according to claim 1, characterized in that the iodination of the ester of the formula IV or the acyl peptides or polypeptides formed by the reaction with the ester of the formula IV is carried out with chloramine T and potassium iodide.
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von iodierten Peptiden und Polypeptiden, wobei die zu iodierenden Peptidketten freie Aminogruppen am N-Terminus oder in der Seitenkette besitzen. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie und die medizinische Diagnostik.The invention relates to a process for the preparation of iodinated peptides and polypeptides, wherein the peptide chains to be iodinated possess free amino groups at the N-terminus or in the side chain. The fields of application of the invention are the pharmaceutical industry and medical diagnostics.
Während der üblichen direkten lodierung von Peptiden und Polypeptiden z.B. mit lodmonochlorid (Mc Farlane, A. S. Nature, 190 [1987]), Chloramin T (Greenwood, F.C., Hunter, W.M., Biochem. J. 89 114 [1963]), Natriumhypochlorid (Redshaw, M.R., Lynch, S. 5 BBRC 65 413 [1975J), der lodo-gen-Methode (Traker, P. J., Speck, J. C, BBRC 80 849 [1978J) und auch bei der lodierung mitDuring the usual direct iodination of peptides and polypeptides, e.g. with iodine iodochloride (Mc Farlane, AS Nature, 190 [1987]), chloramine T (Greenwood, FC, Hunter, WM, Biochem., J. 89, 114 [1963]), sodium hypochlorite (Redshaw, MR, Lynch, p.5 BBRC 65 413 [1975J], the lodo gene method (Traker, PJ, Speck, J.C., BBRC 80 849 [1978J) and also in the iodination with
Lactoperoxidase/H202 (Brundish, D.E., Martin, J. R., J. chem. Soc. Perkin 1,1976, 2182) werden die Aminosäuren starken Oxydationsmitteln ausgesetzt. Trotz kurzer Reaktionszeiten treten bei Peptiden mit oxydationsempfindlichen Aminosäuren wie Methionin, Tryptophan, Cystein u.a. zahlreiche Nebenprodukte auf. Das iodierte Peptid wird nach aufwendigen Reinigungsoperationen vom Ausgangsprodukt und den Nebenprodukten abgetrennt und nur in geringer Ausbeute isoliert. Für die lodierung von synthetischen Peptiden ist der Einsatz von iodierten Aminosäuren denkbar (z. B. lodtyrosin, Brundish, D. E., Wade, U., Biochem. J. 165,169 [1977]). Der Nachteil dieser Synthesen besteht jedoch im hohen Synthese- und Reinigungsaufwand.Lactoperoxidase / H 2 O 2 (Brundish, DE, Martin, JR, J. Chem. Soc., Perkin, 1.1976, 2182) are exposed to the oxidizing agents of the amino acids. Despite short reaction times, peptides with oxidation-sensitive amino acids such as methionine, tryptophan, cysteine, etc., have numerous by-products. The iodinated peptide is separated after extensive purification operations from the starting material and the by-products and isolated only in low yield. For the iodination of synthetic peptides, the use of iodinated amino acids is conceivable (eg, iodotyrosine, Brundish, DE, Wade, U., Biochem J. 165, 169 [1977]). The disadvantage of these syntheses, however, is the high synthesis and purification costs.
Durch das Verknüpfen der4-Hydroxy-5-iod-phenylpropionsäure über den N-Hydroxysuccinimidester mit derfreien Aminosäure eines Peptides läßt sich Iod nachträglich gut in Peptide einführen (Bolton, A. E., Hunter, W. M., Biochem. J. 133 529 [1973]). Das iodierte Peptid ist durch Säulenchromatographie von den Ausgangsprodukten abtrennbar.By linking the 4-hydroxy-5-iodo-phenylpropionic acid via the N-hydroxysuccinimide ester with the free amino acid of a peptide, iodine can subsequently be readily introduced into peptides (Bolton, A.E., Hunter, W.M., Biochem J. 133, 529 [1973]). The iodinated peptide is separable from the starting products by column chromatography.
Nachteilig für die Anwendung dieses Verfahrens ist vor allem die geringe Stabilität des Hydrosuccinimidesters der p-Hydroxyphenylpropionsäure.A disadvantage of the use of this method is, above all, the low stability of the hydrosuccinimide ester of p-hydroxyphenylpropionic acid.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Es ist das Ziel der Erfindung, der pharmazeutischen Industrie und der medizinischen Diagnostik iodierte Peptide und Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die sich nach einem vorteilhaften Verfahren herstellen lassen.It is the object of the invention to provide iodinated peptides and polypeptides to the pharmaceutical and medical diagnostics which can be prepared by a favorable process.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, nach dem sich Peptide und Polypeptide in ihre lodderivate überführen lassen. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß freie Aminogruppen enthaltende Peptide oder Polypeptide der allgemeinen Formeln HoderlllmitN(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethycarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid der Formel I, in der I auch für Iod125 steht, umgesetzt oder mit NM-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxyJ-norborn-S-en^.S-dicarboximid der Formel IV acyliert und die Acylpeptide bzw. polypeptide anschließend iodiert werden.The invention has for its object to develop a method by which peptides and polypeptides can be converted into their iodine derivatives. The object is achieved in that free amino group-containing peptides or polypeptides of the general formulas HoderlllmitN (4-hydroxy-5-iodo-phenyl-ethycarbonyloxy) -norborn-5-ene-2,3-dicarboximide of the formula I, in the I also for iodine 125 , or reacted with NM-hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxyJ-norborn-S-en ^ .S-dicarboximide of formula IV acylated and the acyl peptides or polypeptides are then iodinated.
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Die zu iodierenden Peptidketten können aus beliebigen Aminosäureresten bestehen und die zu acylierenden Aminogruppen am N-Terminus oder in der Seitenkette stehen. In den Verbindungen der allgemeinen Formeln Il oder III können die Aminosäurereste AS, bis ASn beliebige Reste und ASx eine Aminosäure mit einer NH2-Gruppe in der Seitenkette (z. B. Lysin) sowie A und B in der Peptidchemie übliche Schutzgruppen oder auch andere organische Reste sein. Die Peptidketten können auch Cystein, Tyrosin, Methionin, Histidin und auch Tryptophan enthalten.The peptide chains to be iodinated may consist of any amino acid residues and the amino groups to be acylated at the N-terminus or in the side chain. In the compounds of the general formulas II or III, the amino acid residues AS, to AS n any residues and AS x an amino acid having a NH 2 group in the side chain (eg lysine) and A and B in peptide chemistry conventional protecting groups or also be other organic radicals. The peptide chains may also contain cysteine, tyrosine, methionine, histidine and also tryptophan.
Zur Acylierung der Aminogruppen wurde ein neuer aktivierter Ester der p-Hydroxyphenylpropionsäure hergestellt, der ohne großen Aufwand in guter Ausbeute und großer Reinheit anfällt, lagerstabil ist und sich in guten Ausbeuten während der Acylierungsreaktion umsetzen läßt {Formel IV). Für die nachträgliche lodierung von Peptiden mit oxydationsempfindlichen Aminosäuren im Peptidverband (z. B. Methionin, Tryptophan und Cystein) wird IV vor der Anknüpfung an die freie Aminogruppe des Peptides mit Chloramin T und Kaliumiodid zum Monoiodderivat I umgewandelt, chromatographisch über HPLC an RP 18 von dem als Nebenprodukt entstehenden Diiodprodukt abgetrennt und mit dem Peptid zum lodderivat quantitativ im 2- bis 3fachen Überschuß umgesetzt. Durch diese Verfahrensweise tritt kaum Verlust an Peptid auf.For the acylation of the amino groups, a new activated ester of p-hydroxyphenylpropionic acid was prepared, which is obtained without much effort in good yield and high purity, is stable on storage and can be reacted in good yields during the acylation reaction {formula IV). For the subsequent iodination of peptides with oxidation-sensitive amino acids in the peptide bond (eg methionine, tryptophan and cysteine), IV is converted to the monoiodo derivative I with chloramine T and potassium iodide prior to attachment to the free amino group of the peptide, chromatographically by HPLC on RP 18 of separated as the by-product diiodo product and reacted with the peptide to the iodine derivative quantitatively in 2 to 3-fold excess. By this procedure hardly any loss of peptide occurs.
Sind im Peptidverband keine oxydationsempfindlichen Aminosäuren vorhanden, so kann das Peptid erst mit dem N-Hydroxynorbom-5-en-2,3-dicarboximidester der Hydroxyphenylpropionsäure-Formel IV nach o.g. Verfahrensweise acyliert und anschließend mit Chloramin T und Kaliumiodid bzw. K126 zum lodderivat modifiziert werden. Die Abtrennung des als Nebenprodukt entstehenden Diiodderivates gelingt ohne Probleme über die Endreinigung durch die HPLC an RP 18.If no oxidation-sensitive amino acids are present in the peptide dressing, then the peptide can only be acylated with the N-hydroxynorbom-5-ene-2,3-dicarboximide ester of the hydroxyphenylpropionic acid formula IV according to the abovementioned procedure and then with chloramine T and potassium iodide or K 126 to the iodine derivative be modified. The separation of the by-produced diiodo derivative succeeds without problems on the final purification by HPLC on RP 18.
Beispiel 1: NM-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxybnorborn-S-en^.S-dicarboximid III 1,66g (10 mMoDHydroxyphenylpropionsäure und 1,79g (1OmMoI) Ы-Нугігоху-погЬогп-б-еп-г.З-аісагЬохітіа (HON) werden in 10ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst, auf 0°C gekühlt, mit 2,475g (12mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Der Ansatz wird mit 2 Tropfen verdünnter Essigsäure versetzt und 30 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Harnstoff wird abgetrennt und mit 2ml Portionen THF zweimal gewaschen. Die gereinigten Filtrate werden eingeengt. Dabei anfallender Harnstoff wird vorher abgetrennt. Das resultierende Öl wird mit Ether versetzt, nochmals eingeengt und der entstandene Feststoff aus Ethanol umkristallisiert.Example 1: NM-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxybnorborn-S-ene-S-dicarboximide III 1.66g (10 mMo-hydroxyphenylpropionic acid and 1.79g (10mMo) Ы-Нугігоху-погЬогп-б-еп-г.З-аісагЬохітіа (HON are dissolved in 10 ml of tetrahydrofuran (THF), cooled to 0 ° C., mixed with 2.475 g (12 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide and placed in the refrigerator overnight The mixture is admixed with 2 drops of dilute acetic acid and stirred for 30 minutes at room temperature The precipitated urea is separated off and washed twice with 2 ml portions of THF.The purified filtrates are concentrated and the resulting urea is separated off.The ether is added to the resulting oil, concentrated again and the resulting solid is recrystallized from ethanol.
Ausbeute: 2,9g 88,6%Yield: 2.9 g 88.6%
weiße Kristalle Fp.: 141-142°white crystals mp .: 141-142 °
M+-C18H17NO5 327,1108 Charakterisierung der Substanz durch den Molekülionenpeak in der Massespektroskopie.M + -C 18 H 17 NO 5 327,1108 Characterization of the substance by the molecular ion peak in mass spectroscopy.
Beispiel 2: N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid IV Zu 32mg (97,8μΜοΙ) NW-Hydroxy-phenylethylcarbonyloxyi-norborn-S-en^S-dicarboximid III in 500 μΙ Dioxan werden 9mg (54μΜοΙ) Kaliumiodid in 200μΙ Natriumacetatpuffer pH 7,5 (0,25molar) gegeben, mit 11 mg (48,9μΜοΙ) Chloramin T in 500μΙ Ammoniumacetatpuffer versetzt und 30sec gerührt. Die Reaktion wird mit 3,7g (24μΜοΙ) Dithioerithritol gestoppt, die klare Reaktionslösung in die HPLC injiziert und die entsprechende Fraktion nach Chromatographie an Vydac RP 18 abgetrennt.Example 2: N (4-Hydroxy-5-iodo-phenyl-ethylcarbonyloxy) -norborn-5-ene-2,3-dicarboximide IV To 32mg (97.8μΜοΙ) of NW-hydroxy-phenylethylcarbonyloxy-norborn-S-ene ^ S dicarboximide III in 500 μM dioxane are added 9 mg (54 μM) of potassium iodide in 200 μM sodium acetate buffer pH 7.5 (0.25 molar), admixed with 11 mg (48.9 μM) of chloramine T in 500 μM ammonium acetate buffer and stirred for 30 seconds. The reaction is stopped with 3.7 g (24 μΜοΙ) of dithioerithritol, the clear reaction solution is injected into the HPLC and the corresponding fraction is separated off after chromatography on Vydac RP 18.
Ausbeute: 10 mg 46% (nach zweimaliger Lyophilisation)Yield: 10 mg 46% (after two lyophilizations)
M+.C8H16NO5 453,0079 Charakterisierung durch die MassespektroskopieM + .C 8 H 16 NO 5 453,0079 Characterization by mass spectroscopy
Beispiel 3: 4-Hydroxy-5-iod-Phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr(SO3Na)-Met-Gly-Trp-Met-at-Asp-PheNH2 10mg (22μΜοΙ) N(4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyloxy)-norborn-5-en-2,3-dicarboximid werden zu 10mg (8,58μΜοΙ) Asp-Tyr(SO3Na)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 in 100μΙ DMF und 100μΙ Pyridin in Gegenwart von 2 μΙ Hünig-Base (NN'-Diisopropylethylamin) gegeben und 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der Ansatz in die HPLC injiziert, die entsprechende Fraktion abgetrennt und zweimal lyophilisiertExample 3: 4-Hydroxy-5-iodo-phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr (SO 3 Na) -Met-Gly-Trp-Met-at-Asp-PheNH 2 10mg (22μΜοΙ) N (4-hydroxy-5- iodo-phenyl-ethylcarbonyloxy) -norborn-5-ene-2,3-dicarboximide are added to 10mg (8.58μΜοΜ) of Asp-Tyr (SO 3 Na) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH 2 in 100μΙ DMF and 100μΙ pyridine in the presence of 2 μΙ Hünig base (NN'-diisopropylethylamine) and stirred for 8 hours at room temperature, the mixture injected into the HPLC, the appropriate fraction separated and lyophilized twice
Ausbeute: 9 mg 77,5% Yield: 9 mg 77.5%
Molmasse 1415Molar mass 1415
Aminosäureanalyse: Asp 2,0 (2,0), Туг 0,8(1)Amino Acid Analysis: Asp 2.0 (2.0), Tug 0.8 (1)
Met 1,95 (2), GIy 1(1),Trp 0,85 (1),Phe 0,94(1)Met 1,95 (2), Gliy 1 (1), Trp 0,85 (1), Phe 0,94 (1)
Die Anwesenheit des 4-Hydroxy-5-iod-phenyl-ethylcarbonyl-Restes konnte durch die Massespektroskopie bewiesen werden: Sequention: C9H7O2J 273,9495The presence of the 4-hydroxy-5-iodo-phenyl-ethylcarbonyl residue could be demonstrated by mass spectroscopy: Sequence: C 9 H 7 O 2 J 273.9495
C8H7OJ 245,9742C 8 H 7 OJ 245.9742
Beispiel 4: 4-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr(SO3Na)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 20mg (17,7μΜοΙ) H-Asp-Tyr(SO3Na)-Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH2 werden in 200μΙ Pyridin und 100 μΙ DMF gelöst, mit 6μΙ (35μΜ) Hünig-Base versetzt und mit 11,8 mg (36μΜοΙ) Nfp-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxyl-norborn-S-en^^-dicarboximid addiert. Nach acht Stunden Reaktionszeit wird der Ansatz in die HPCL injiziert, die entsprechende Fraktion abgetrennt, anschließend eingeengt, mit wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert.Example 4: 4-Hydroxy-phenyl-ethylcarbonyl-Asp-Tyr (SO 3 Na) -Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH 2 20mg (17,7μΜοΙ) H-Asp-Tyr (SO 3 Na) -Nle-Gly-Trp-Nle-Asp-Phe-NH 2 are dissolved in 200μΙ pyridine and 100 μΙ DMF, treated with 6μΙ (35μΜ) Hünig base and with 11.8 mg (36μΜοΙ) of Nfp-hydroxy-phenyl-ethylcarbonyloxyl -norborn-S-en ^^ - dicarboximide added. After eight hours of reaction, the batch is injected into the HPCL, the appropriate fraction separated, then concentrated, taken up with a little water and lyophilized.
Ausbeute: 17 mg (69 %) nach zweimaligem Lyophilisieren.Yield: 17 mg (69%) after twice lyophilization.
Aminosäureanalyse:Amino acid analysis:
Asp 1,8 (2) TyrO,8 (1) Nie 2,2 (2) GIy 0,85 (1) TrpO,75 (1) Phe 0,94(1)Asp 1.8 (2) TyrO, 8 (1) Never 2.2 (2) Gly 0.85 (1) TrpO, 75 (1) Phe 0.94 (1)
Die Anwesenheit des p-Hydroxy-phenylpropionyl-Restes wurde durch die Massespektroskopie nachgewiesen (siehe Beispiel 1).The presence of the p-hydroxy-phenylpropionyl residue was detected by mass spectroscopy (see Example 1).
Die Substanzen werden über Vydac RP 18 (15-2Om) in einer Säule (20 mm i.D. χ 250 mm) in folgenden Elutionsmitteln gereinigt:The substances are purified via Vydac RP 18 (15-2Om) in a column (20 mm i.D. χ 250 mm) in the following eluents:
Beispiel 1 und 2:Example 1 and 2:
Fluß: 20ml/min, UV-Detektion: 220nmFlow: 20ml / min, UV detection: 220nm
Laufmittel:Eluent:
- Beispiel 1: A= 2000 ml 0,025 M Ammoniumacetat pH 6Example 1: A = 2000 ml 0.025 M ammonium acetate pH 6
B = MethanolB = methanol
Gradient: 25% B während 8min auf 26% Retentionszeit: 14,5-20,5min gesammeltGradient: 25% B during 8min to 26% retention time: 14,5-20,5min collected
- Beispiel 2: A:B, 50:50 Retentionszeit: 8,3—15,6min gesammelt- Example 2: A: B, 50:50 retention time: 8.3-15.6 min collected
Analytik: Laufmittel siehe Beispiele 1 und 2Analysis: eluent see examples 1 and 2
- Beispiel 3: R, = 8,2 min einheitlich- Example 3: R, = 8.2 min uniformly
- Beispiel 4: R, = 16,6min einheitlich Säulendimension: 4,6mm i.D. x 250mm, VydacRP 18(15-2Om)- Example 4: R, = 16.6 min uniform column dimension: 4.6 mm i.D. x 250mm, VydacRP 18 (15-2Om)
Claims (1)
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19534046A1 (en) * | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Biotez Berlin Buch Gmbh | Radio-iodinating oligo-nucleotide, protein or peptide |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19534046A1 (en) * | 1995-09-14 | 1997-03-20 | Biotez Berlin Buch Gmbh | Radio-iodinating oligo-nucleotide, protein or peptide |
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