DD295873A5 - Microbial production process for cyclosporin A - Google Patents
Microbial production process for cyclosporin AInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung des Oligopeptids Cyclosporin A. Sie verfolgt das Ziel, diesen Wirkstoff in oekonomisch effizienter Weise herzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete technische Aufgabe wird in ihrer biologischen Prozeszstufe in der Weise geloest, dasz in steriler aerober Fermentation in Naehrmedien mit Kohlenstoffsubstraten, darunter vorzugsweise Citrat-Ionen, mit Ammoniumsalzen als einziger Stickstoffquelle und mit ausgewaehlten Mineralsalzen fuer die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen bei Temperaturen von 20C bis 30C jeweils einer der nachfolgend genannten PilzstaemmeTolypocladium inflatum Wb 6-5{Cyclosporin A; Oligopeptid; Immunsuppressivum; mikrobielles Herstellungsverfahren; biologische Prozeszstufe; Pilzstamm; Tolypocladium inflatum Wb 6-5; Sesquicilliopsis rosariensis F 605; Sesquicilliopsis rosariensis GE 440; Mineralsalze}The invention relates to a microbial process for the preparation of the oligopeptide cyclosporin A. It pursues the aim of producing this active ingredient in an economically efficient manner. The technical problem associated with this aim is achieved in its biological process stage by the use of sterile substrates in aerobic fermentation with carbon substrates, preferably citrate ions, with ammonium salts as sole nitrogen source and with selected mineral salts for 5 days to 11 days at temperatures of 20C to 30C each one of the following fungicidal tolypocladium inflatum Wb 6-5 {Cyclosporin A; oligopeptide; immunosuppressant; microbial production process; biological process stage; Fungal strain; Tolypocladium inflatum Wb 6-5; Sesquicilliopsis rosariensis F 605; Sesquicilliopsis rosariensis GE 440; Mineral salts}
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung des Oligopeptids Cyclosporin A. Der gebildete Wirkstoff hat als Immunsuppressivum breiten Eingang in die Therapie von Organtransplantationen gefunden. ^The invention relates to a microbial process for the preparation of the oligopeptide cyclosporin A. The active compound has been widely used as an immunosuppressant in the therapy of organ transplants. ^
Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der mikrobiologisch-pharmazeutischen Industrie. !The field of application of the invention is thus in the microbiological-pharmaceutical industry. !
\ Charakteristik des bekannten Standes der Technik \ Characteristic of the prior art
Mikrobielle Verfahren zur Gewinnung von Cyclosporin A auf fermentativem Wege, nämlich durch Kultivierung ausgewählter pilzlicher Mikroorganismen, sind seit 1975 bekannt (vgl. die Patentschriften CH 589716, CH 603, DD 115695, DE 2455859 und AT 350716).Microbial processes for the production of cyclosporin A by fermentation, namely by cultivation of selected fungal microorganisms, have been known since 1975 (see the patents CH 589716, CH 603, DD 115695, DE 2455859 and AT 350716).
Als wichtigste Mikroorganismen werden Stämme aus den Arten Tolypocladium inflatum sowie Cylindrocarpon lucidum eingesetzt, die submers oder emers auf flüssigen, komplexen Medien bei pH-Werten im Bereich von pH 3,2 bis pH 7,5 und bei Temperaturen von 20°C bis 300C kultiviert werden, wobei das gebildete Produkt aus der gewonnenen Biomasse wie auch aus dem Kulturfiltrat durch Extraktion mit Methanol gewonnen wird. Ausgedehnte Screening-Untersuchungen führten zur Auffindung zahlreicher weiterer pilzlicher Spezies mit Cyclosporin-Bildungsvermögen, die jedoch biotechnologisch bislang nicht genutzt werden, so unter anderem Tolypocladium geodes, Fusarium solani, Trichoderma viride, Neocosmospora vasinfecta, Isaria felina, Verticillium spec., Paecilomyces spec, Acremonium spec, (DREYFUSS, Sydowia Bd.39, 1986, 22-36). Es wurden auch bereits Verfahren vorgeschlagen, in denen als biologisches Material die Stämme Tolypocladium inflatum SF 136 bzw. Sesquicilliopsis rosariensis A84/195(-3) eingesetzt werden.The most important strains of microorganisms of the species Tolypocladium inflatum and Cylindrocarpon lucidum are used, the submerged or emerged manner on liquid complex media at pH values in the range from pH 3.2 to pH 7.5 and at temperatures of 20 ° C to 30 0 C, wherein the product formed is recovered from the recovered biomass as well as from the culture filtrate by extraction with methanol. Extensive screening studies have led to the discovery of numerous other fungal species with cyclosporin-forming capacity, which are not yet used biotechnologically, including Tolypocladium geodes, Fusarium solani, Trichoderma viride, Neocosmospora vasinfecta, Isaria felina, Verticillium spec., Paecilomyces spec, Acremonium Spec, (DREYFUSS, Sydowia Vol. 39, 1986, 22-36). There have also been proposed methods in which the strains Tolypocladium inflatum SF 136 and Sesquicilliopsis rosariensis A84 / 195 (-3) are used as biological material.
Dabei erbrachte die Fermentation dieser Organismen unter den beschriebenen Bedingungen in einem komplexen, kaseinpeptonhaltigen Medium Cyclosporin Α-Ausbeuten von maximal 1200 mg/l bzw. 2460 mg/l und nach 11-bis 15tägiger Kultivierung. Die Verwendung eines Peptons als organische Stickstoffquelle in der Fermentationsstufe eines industriellen Verfahrens (vgl. auch DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol. 3,1976,125-133; AGATHOS et al., Journal of Industrial Microbiology 1,1986,39—48) muß jedoch bei allen genannten technischen Lösungen als erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden.The fermentation of these organisms under the conditions described in a complex casein peptone-containing medium yielded cyclosporin Α yields of a maximum of 1200 mg / l or 2460 mg / l and after 11 to 15 days of cultivation. The use of a peptone as an organic nitrogen source in the fermentation step of an industrial process (see also DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol., 3.1976, 125-133; AGATHOS et al., Journal of Industrial Microbiology, 1,1986 , 39-48) must, however, be regarded as a significant economic disadvantage in all the technical solutions mentioned.
KOBEL und TRABER (Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechn. 14,1982,237-240) verwendeten erstmals unter Laborbedingungen für spezielle Untersuchungen zur Biosynthese von Cyclosporin A ein chemisch definiertes, synthetisches Nährmedium. Unter Verwendung von Monohydroxybernsteinsäure und Saccharose als Hauptkomponenten konnten sie eine Ausbeute von 101 mg Cyclosporin A am 14. Kulturtag belegen. Durch zusätzliche Fütterung eines Produktbildners der Art T. inflatum mit reinen Aminosäuren in einer Konzentration von 8g/l konnte das Ausbeuteniveau zwar verbessert werden, die eingesetzten Nährlösungsbestandteile, die zudem mit Vitaminen wie Thiamin, Biotin und Pyridoxin komplettiert werden, können jedoch fyr ein technisch relevantes Verfahren keinesfalls als ökonomisch tragfähige Lösung angesehen werden.KOBEL and TRABER (Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechn. 14,1982,237-240) used for the first time under laboratory conditions for special studies on the biosynthesis of cyclosporin A a chemically defined, synthetic nutrient medium. Using monohydrosuccinic acid and sucrose as the major components, they were able to demonstrate a yield of 101 mg cyclosporin A on the 14th day of culture. By additionally feeding a product builder of the species T. inflatum with pure amino acids in a concentration of 8 g / l, the yield level could be improved, the used nutrient solution components, which are also completed with vitamins such as thiamine, biotin and pyridoxine, but fyr a technically relevant Process should not be considered as an economically viable solution.
Ähnliche Nachteile weist ein Fermentationsregime von AGATHOS et al. (Ann. N.Y. Acad. Sei. 506,1987,657-662) auf, welches Einsatz eines halbsynthetischen Mediums zwar Werte von 530 \iq CyA/ml in 8tägiger Submerskultur zuläßt, jedoch als C-Quelle die industriell schwer verfügbare Maltose verwendet.Similar disadvantages are exhibited by a fermentation regime of AGATHOS et al. (Ann. NY Acad. Sci. 506,1987,657-662) in which use of a semi-synthetic medium although values of 530 \ iq CyA / ml permits in 8 days submerged culture, but used as a carbon source industrially difficult available maltose.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Die Erfindung verfolgt das Ziel, Cyclosporin A in ökonomisch effizienter Weise herzustellen.The invention aims to produce cyclosporin A in an economically efficient manner.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ökonomisch effizientes mikrobielles Verfahren zu beschreiben, welches, gestützt auf den Einsatz neuer Mikroorganismen, die Herstellung von Cyclosporin A in synthetischen Medien ohne den Einsatz komplexer Stickstoff-Rohstoffe ermöglicht.The invention has for its object to describe an economically efficient microbial process, which, based on the use of new microorganisms, allows the production of cyclosporin A in synthetic media without the use of complex nitrogen raw materials.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in der Weise gelöst, daß man den Mikroorganismus Tolypocladium inflatum WB6-5 oder Stamm GE440 bzw. Stamm F605 des Mikroorganismus Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD in einem Medium mit Ammoniumsalzen als einzig verfügbarer Stickstoffquelle sowie gegebenenfalls auch unter Zusatz von Citrat und in Gegenwart ausgewählter zweiwertiger Kationen kultiviert. Darüber hinaus erwies es sich als vorteilhaft, daß man bei Fermentation der einzelnen Stämme von rotbraun bis schwarzbraun-violett pigmentierten Emerskulturen, die auf einem Mineralsalz-Glukose-Agar mit Ammoniumsalzen angezogen wurden, ausgeht, da diese verfahrensgemäß eine stabile Cyclosporin A-Produktion garantieren. Ferner ist es für die Stämme T. inflatum WB 6-5 und S. rosariensis GE440 besonders günstig, in der Produktionskultur Ammoniumsulfat und/oder Diammoniumhydrogenphosphat als anorganische Stickstoffverbindungen zu verwenden. Die Zinkionenkonzentration bei Kultivierung des Stammes WB 6-5 sollte dabei zweckmäßigerweise im Bereich von 0,5mg/l bis 5mg/l gewählt werden. Auffällig ist, daß die Produktivität des Stammes Wb 6-5 in überraschender Weise durch die Anwesenheit von Kaliumsalzen bzw. -ionen negativ beeinflußbar ist, eine Abhängigkeit, die nicht für die Stämme GE440 und F 605 der Art Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD gilt. Für diese letztgenannten Stämme ist vielmehr die Anwesenheit bestimmter zweiwertiger Metallionen im Fermentationsmedium von Bedeutung, insbesondere die Verfügbarkeit von Magnesium-, Eisen-, Zink- und Kalziumionen, die einen unmittelbaren Einfluß, wenn auch in unterschiedlichem Maße, auf die Syntheseaktivität ausüben. So sollte die Fermentation des Stammes F605 vorzugsweise bei einer Magnesiumionenkonzentration von 250mg/l, einer Eisenionenkonzentration von 20mg/l und einer Zinkionenkonzentration von 0,7 mg/l durchgeführt werden. Insbesondere ist es wichtig, auf eine ausgewogene Menge an Kalziumionen zu achten, wobei die lonenkonzentration vorzugsweise bei Werten von 10 mg/l bis 200 mg/l liegen sollte, da bei Abwesenheit von Kalzium die Produktivität des Stammes F605 unter den übrigen gegebenen Bedingungen nicht effektiv ist.According to the invention the object is achieved in that the microorganism Tolypocladium inflatum WB6-5 or strain GE440 or strain F605 of the microorganism Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD in a medium with ammonium salts as the only available nitrogen source and optionally also with the addition of citrate and in Cultivated the presence of selected divalent cations. In addition, it has proved to be advantageous that one starts on fermentation of the individual strains of red-brown to black-brown-violet pigmented emers cultures, which were grown on a mineral salt-glucose agar with ammonium salts, since these guarantee according to the method stable cyclosporin A production. Furthermore, it is particularly favorable for the strains T. inflatum WB 6-5 and S. rosariensis GE440 to use ammonium sulfate and / or diammonium hydrogen phosphate as inorganic nitrogen compounds in the production culture. The zinc ion concentration when cultivating the strain WB 6-5 should be appropriately chosen in the range of 0.5 mg / l to 5 mg / l. It is striking that the productivity of the strain Wb 6-5 is surprisingly negatively influenced by the presence of potassium salts or ions, a dependence which does not apply to the strains GE440 and F 605 of the species Sesquicilliopsis rosariensis G. ARNOLD. Rather, for these latter strains, the presence of certain divalent metal ions in the fermentation medium is of importance, in particular the availability of magnesium, iron, zinc and calcium ions, which exert an immediate influence, albeit to varying degrees, on the synthesis activity. Thus, the fermentation of the strain F605 should preferably be carried out at a magnesium ion concentration of 250 mg / l, an iron ion concentration of 20 mg / l and a zinc ion concentration of 0.7 mg / l. In particular, it is important to pay attention to a balanced amount of calcium ions, the ion concentration preferably being from 10 mg / L to 200 mg / L, since in the absence of calcium the productivity of the F605 strain is not effective under the other given conditions is.
Gleichzeitig hat es sich für diesen Stamm als ausgesprochen vorteilhaft erwiesen, die Produktionskultur in Gegenwart von Citrationen im Bereich von 5g/l bis 30g/l, vorzugsweise bei 12g/l durchzuführen.At the same time, it has proved to be extremely advantageous for this strain to carry out the production culture in the presence of citrations in the range of 5 g / l to 30 g / l, preferably 12 g / l.
Die Kultivierung des Stammes GE440 hingeen erfolgt ohne Citrat-Zusatz in ähnlicher Weise wie die Fermentation des Stammes Wb 6-5, jedoch hat es sich gezeigt, daß in diesem Falle die Magnesiumionenkonzentration vorzugsweise bei 250mg/l bzw. die Zinkionenkonzentration vorzugsweise bei 50 mg/l liegen sollte.The cultivation of the strain GE440 without citrate addition is similar to the fermentation of the strain Wb 6-5, but it has been shown that in this case the magnesium ion concentration is preferably 250 mg / l or the zinc ion concentration preferably 50 mg / l. l should be.
Trotz der erkannten unterschiedlichen Bedürftigkeit der einzelnen Cyclosporin A-Produzentenstämme hinsichtlich des Gehaltes an bestimmten zweiwertigen Metallionen im Produktionsmedium besteht jedoch für alle Stämme des vorliegenden Verfahrens der entscheidende verfahrenstechnische Fortschritt einer Eliminierung der kostenintensiven, in ihrer Zusammensetzung heterogenen komplexen Stickstoffquelle.However, despite the different needs identified for each cyclosporin A producer strain in terms of the content of certain divalent metal ions in the production medium, all the strains of the present process have the crucial procedural progress of eliminating the costly complex nitrogen source that is heterogeneous in composition.
Dieses Ergebnis war insofern unerwartet, als durch AGATHOS et al. (s. oben) weder Ammonium noch Nitrat als effektiv in bezug auf die Cyclosporin-Produktion nachgewiesen wurden, weshalb sich diese Autoren für ein semisynthetisches Medium, welches die Stickstoffquelle in Form eines Peptons enthält, entschieden. Die zur Cyclosporin Α-Herstellung verwendeten Stämme Wb 6-5, GE440 und F605 sind in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, ZIMET der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR -6900, unter den Registriernummern 43899, IMET43909 und IMET43887 hinterlegt.This result was unexpected in that AGATHOS et al. (supra), neither ammonium nor nitrate was shown to be effective in cyclosporin production and, therefore, these authors opted for a semisynthetic medium containing the nitrogen source in the form of a peptone. The strains Wb 6-5, GE440 and F605 used for cyclosporin Α production are in the depository for microorganisms of the GDR, ZIMET of the AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR -6900, filed under the registration numbers 43899, IMET43909 and IMET43887.
Die Fermentation erfolgt nach einer ein- bzw. zweistufigen Vorzucht in der submersen Hauptkultur unter aeroben und sterilen Bedingungen, indem die unterschiedlichen Produzentenstämme in einem flüssigen Medium bei Temperaturen von 20°C bis 300C sowie einer Acidität von pH 3,2 bis 7,5 für die Dauer von 5 bis 11 Tagen kultiviert werden. Der Ablauf des gesamten Verfahrens läßt sich allgemein wie folgt charakterisieren:The fermentation is carried out after a one- or two-stage vorzucht in the submerged main culture under aerobic and sterile conditions by the different producer strains in a liquid medium at temperatures of 20 ° C to 30 0 C and an acidity of pH 3.2 to 7, 5 for a period of 5 to 11 days. The course of the entire process can generally be characterized as follows:
Rasenstücke aus Schrägagarkulturen oben genannter Stämme bzw. auch deren Sporen werden in physiologischer NaCI-Lösung suspendiert und auf einem Nähragar ausplattiert, welcher als Kohlenstoffquelle mono- oder dimeres Kohlenhydrat sowie (NH4I2HPO4 als Stickstoffquelle enthält und für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen bei 24°C bis 28°C, vorzugsweise bei 24°C, bebrütet wird.Lawns from Schrägagarkulturen above strains or their spores are suspended in physiological NaCl solution and plated on a nutrient agar which contains mono- or dimeric carbohydrate as carbon source and (NH 4 I 2 HPO 4 as nitrogen source and for a period of 14 days incubated at 24 ° C to 28 ° C, preferably at 24 ° C, for 21 days.
Die Anzucht des Stammes F 605 erfolgt in gleicher Weise, jedoch ohne (NH4)2HPO4 im Nähragar. Von den entstandenen Einzelkolonien werden die luftmycelarmen, rot- bis schwarzbraun pigmentierten Exemplare ausgewählt und nach Übertragung auf Mineralsalz-Kohlenhydratagar zur Herstellung von 2cm bis 4cm großen Rasenarealen verwendet. Diese werden als Agarausstich in die erste submerse Vorzuchtpassage übertragen, die aus 100-ml- bzw. 500-ml-Erlenmeyerkolben besteht, welche jeweils 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inokulum enthält Glukose, Maltose oder Saccharose als Kohlenstoffquelle, weiterhin organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach der Beimpfung für die Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden bei 24°C bis 25°C unter Schütteln auf einem Rundschwinger bei 180 bis 240 rpm kultiviert. Nach Ausreifen der 1 .Anzucht in Flüssigkultur (= 1. Vorkultur) erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer 2. Anzucht (= 2. Vorkultur) in einer Menge von 5 % bis 10% des Mediumvolumens. Diese Stufe besteht entweder aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die 100 ml des o.a. Mediums enthalten, oder aus gerührten und belüfteten Kleinfermentoren mit einem Nettovolumen von 5I bis 251 bei üblichen technischem Ausrüstungsgrad für Temperierung und Belüftung.The cultivation of the strain F 605 takes place in the same way, but without (NH 4 ) 2 HPO 4 in the nutrient agar. From the individual colonies formed, the low-atmospheric, red to black-brown pigmented specimens are selected and used after transfer to mineral salt carbohydrate agar for the production of 2cm to 4cm large lawn areas. These are transferred as an agar outlet into the first submerged pre-breeding passage, which consists of 100 ml and 500 ml Erlenmeyer flasks, each containing 20% of their volume as growth medium. The inoculum contains glucose, maltose or sucrose as carbon source, further organic nitrogen substrates and mineral salts and is cultured after inoculation for 48 hours to 72 hours at 24 ° C to 25 ° C with shaking on a rotary oscillator at 180 to 240 rpm. After ripening the 1 .Anzucht in liquid culture (= 1st preculture), if appropriate, the inoculation of a second cultivation (= 2nd preculture) in an amount of 5% to 10% of the medium volume. This stage consists either of 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the above medium or of stirred and ventilated small fermentors with a net volume of 5 liters to 25 liters with the usual temperature and ventilation technical equipment.
Nach 48stündiger Kultivierung wird das Hauptkulturmedium, welches als alleinige Stickstoffquelle Ammoniumsalze enthält, in einer Menge von 5% bis 10% des Volumens mit der Vorkultur beimpft und für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen unter Rühren und Belüften bzw. durch Rundschütteln kultiviert.After culturing for 48 hours, the main culture medium, which contains ammonium salts as sole nitrogen source, is inoculated with the preculture in an amount of 5% to 10% of the volume and cultivated for a period of 5 days to 11 days with stirring and aerating or by shaking.
Unter diesen Bedingungen erreichen die Fermentationsansätze Leistungen von 700mg bis 1150mg Cyclosporin A pro Liter, welches analytisch durch HPLC in bekannter Weise erfaßt wird. Die Kulturbrühen weisen zum Erntezeitpunkt eine rot- bis schwarzbraune Färbung auf.Under these conditions, the fermentation approaches achieve performances of 700 mg to 1150 mg cyclosporin A per liter, which is detected analytically by HPLC in a known manner. The culture broths have a red to black-brown color at harvest time.
Die Isolierung von Cyclosporin A erfolgt in der Weise, daß das Produkt aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbaren, aus dem Kulturfiltrat in organischen, mit Wasser nicht oder wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert wird.The isolation of cyclosporin A is carried out in such a way that the product from the biomass with water miscible or poorly miscible, is extracted from the culture filtrate in organic, water-immiscible or poorly miscible solvents.
Ausführungsbeispieleembodiments
Rasenstücke von Oberflächenkulturen des Stammes Tolypocladium inflatum Wb 6-5 werden zunächst auf Glukose-Mineralsalzagar übertragen, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 20; (NH4I2SO4B, KH2PO4 2, MgSO4 · 7 H2O 0,5, CaCO3 3,4, Agar 20; pH 5,3 bis 5,7, Sterilisation 30 Minuten, 120cC. Nach einer Bebrütungszeit der Petrischalen bei 24°Cfür die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen werden von den entstandenen Arealen die rot- und schwarzbraun pigmentierten ausgewählt. Die Beimpfung der ersten Submersvorkultur erfolgt durch Übertragung eines ca. 1 cm2 großen Rasenstückes auf 100 ml des Anzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l): Glukose 50, Kaseinpepton 10, KH2PO4 1, KCI 2,5 ad 11 Aqua dest.; pH 5,3 bis 5,6, Sterilisation 30 Minuten, 1200C. Die 500-ml-Anzuchtkolben werden 72 Stunden lang bei 24°C bis 25°C mit 180 bis 220 rpm auf Rundschüttlern kultiviert. Siezeigen als Reifekriterium eine braunschwarze Färbung. Sie dienen in einer Menge von 5% als Impfmaterial des Hauptkulturmediums, welches zu je 100 ml in 500-ml-Erlenmeyerkolben abgefüllt, folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 80, (NH4J2HPO4 2, (NH4)2SO4 5, MgSO4 7 H2O 0,5, ZnSO4 7 H2O 0,008, CaCO3 5,1, Aqua dest. ad 11; pH 5,3 bis 5,9, Sterilisation 30 Minuten, 1200C. Die Kultivierung erfolgt 11 Tage lang bei 240C bis 25°C auf einem Rundschwinger mit 180rpm.Lawns of surface cultures of the strain Tolypocladium inflatum Wb 6-5 are first transferred to glucose mineral salt agar having the following composition (g / l): glucose 20; (NH 4 I 2 SO 4 B, KH 2 PO 4 2, MgSO 4 .7H 2 O 0.5, CaCO 3 3.4, agar 20, pH 5.3 to 5.7, sterilization 30 minutes, 120 c C. After a period of incubation of the Petri dishes at 24 ° C. for a period of 14 days to 21 days, the red and black-brown pigmented areas are selected from the resulting areas.The inoculation of the first submucosal culture is carried out by transferring an approximately 1 cm 2 large lawn to 100 ml of the culture medium of the following composition (g / l): glucose 50, casein peptone 10, KH 2 PO 4 1, KCl 2.5 ad 11 aq, pH 5.3 to 5.6, sterilization 30 minutes, 120 ° C. The 500 ml culture flasks are cultured on rotary shakers at 180 to 220 rpm for 72 hours at 24 ° C. to 25 ° C. They show a brown-black color as a maturity criterion and are used in an amount of 5% as inoculum of the main culture medium 100 ml in 500 ml Erlenmeyer flasks, having the following composition (g / l): glucose 80, (NH 4 J 2 HPO 4 2, (NH 4 ) 2 SO 4 5, MgSO 4 .7H 2 O 0.5, ZnSO 4 .7H 2 O 0.008, CaCO 3 5.1, aqua dest. ad 11; pH 5.3 to 5.9, sterilization 30 minutes to 120 0 C. The cultivation is carried out for 11 days at 24 0 C to 25 ° C on a rotary transducer with 180rpm.
Nach Beendigung der Fermentation wird die Kulturbrühe mit Methanol im Verhältnis 5:1 (v/v) versetzt. Nach mehrmaligem gründlichem Aufrühren wird innerhalb von 30 Minuten der Extrakt zur Wertbestimmung verwendet. Diese erfolgt in an sich bekannterWeise durch Beschickung von HPLC-Säulen. Die Leistung derartiger Fermentationsansätze beträgt 1100pg Cyclosporin A/ml.After completion of the fermentation, the culture broth is treated with methanol in a ratio of 5: 1 (v / v). After thorough stirring several times, the extract is used within 30 minutes to determine the value. This is done in a conventional manner by loading HPLC columns. The performance of such fermentation approaches is 1100pg cyclosporin A / ml.
Eine Sporensuspension des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis GE 440 wird zur Gewinnung von Einzelkolonien auf Glukose-Mineralsalzagar plattiert, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l): Glukose 20, (NH4I2SO4 3, (NH4)2HPO4 2, MgSO4- 7 H2O 0,5, CaCO3 6,8; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 60 Minuten, 1100C. Nach einer Bebrütungszeit von 14 bis 21 Tagen bei 24°C werden lila- bis schwarzbraun pigmentierte Einzelkolonien gewonnen, die direkt als Rasenstück oder nach Suspendieren in physiologischer NaCI-Lösung zur Beimpfung des Vorkulturmediums genutzt werden. Das Vorkulturmedium ist dabei wie folgt zusammengesetzt (g/l): Maltose oder Glukose 75, Kaseinpepton 25, KH2PO4 1, KCI 2,5; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 30 Minuten, 1200CJe 100ml des beimpften Vorkulturmediums werden in 500-ml-Erlenmeyerkolbenfür 72 Stunden bei 240C auf einem Rundschwinger mit einer Frequenz von 190 rpm kultiviert.A spore suspension of the strain Sesquicilliopsis rosariensis GE 440 is plated for the recovery of single colonies on glucose-mineral salt agar having the following composition (g / l): glucose 20, (NH 4 I 2 SO 4 3, (NH 4 ) 2 HPO 4 2, MgSO 4 - 7 H 2 O 0.5 CaCO 3 6.8; deionized water pH 5.5; sterilization 60 minutes to 110 0 C. After incubation for 14 to 21 days at 24 ° C are lilac to black-brown pigmented Single colonies obtained directly as turf or suspended in physiological NaCl solution to inoculate the preculture medium The preculture medium is composed as follows (g / l): maltose or glucose 75, casein peptone 25, KH 2 PO 4 1, KCI 2.5; deionized water pH 5.5; sterilization for 30 minutes 120 0 CJE 100ml of the inoculated seed medium are grown in 500 ml Erlenmeyerkolbenfür 72 hours at 24 0 C on a rotary transducer with a frequency of 190 rpm.
Das Hauptkulturmedium beinhaltet folgende Nährlösungsbestandteile (g/l): Glukose 80, (NH4)2 HPO4 4, (NH4)2SO4 6, MgSO4 · 7 H2O 2,5; ZnSO4 · 7 H2O 0,02; CaCO3 6,8; entionisiertes Wasser pH 5,7 bis pH 6,3; Sterilisation 60 Minuten bei 110°C.The main culture medium contains the following nutrient solution components (g / l): glucose 80, (NH 4 ) 2 HPO 4 4, (NH 4 ) 2 SO 4 6, MgSO 4 .7 H 2 O 2.5; ZnSO 4 .7H 2 O 0.02; CaCO 3, 6.8; deionized water pH 5.7 to pH 6.3; Sterilization for 60 minutes at 110 ° C.
100 ml dieses Mediums in 500-ml-Erlenmeyerkolben werden mit 10% des Volumens der Vorkultur beimpft und unter den gleichen Bedingungen wie für die Vorkultur beschrieben kultiviert.100 ml of this medium in 500 ml Erlenmeyer flasks are inoculated with 10% of the volume of the preculture and cultured under the same conditions as described for the preculture.
Der am 11. Tag ermittelte Gehaltan Cyclosporin A betrug biszu700mg/l Kultursuspension.The content of cyclosporin A determined on the 11th day was up to 700 mg / l of culture suspension.
Die Bestimmung des Wirkstoffs erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.The determination of the active ingredient was carried out as described in Example 1.
Von einer Emerskultur des Stammes Sesquicilliopsis rosariensis F 605 auf Malzextraktagar (20g Malzextrakt/l) wird nach mindestens 14 bis 21tägiger Bebrütung bei 24°C eine Sporensuspension hergestellt, die zur Beimpfung einer Vorkultur dient.From a Emers culture of the strain Sesquicilliopsis rosariensis F 605 on malt extract agar (20 g malt extract / l) a spore suspension is prepared after at least 14 to 21 days incubation at 24 ° C, which is used for inoculation of a preculture.
100ml Vorkulturmedium mit einer Zusammensetzung wie im Bsp. 2 beschrieben, wurden mit 1 x 107 Sporen beimpft und in 500-ml-Erlenmeyerkolben bei 24°C für 72 Stunden auf einem Rundschwinger mit einer Frequenz von 190 rpm bebrütet.100 ml of preculture medium having a composition as described in Example 2 were inoculated with 1 × 10 7 spores and incubated in 500 ml Erlenmeyer flasks at 24 ° C. for 72 hours on a rotary oscillator with a frequency of 190 rpm.
Anschließend erfolgt die Übertragung der Kultur in ein Hauptkulturmedium im Verhältnis 1:10, welches sich wie folgt zusammensetzt (g/l): Glukose 60, Diammoniumhydrogencitrat 15, KH2PO4 5, KCI 2,5, MgSO4 · 7 H2O 2,5, FeSO4 · 7 H2O 0,1, ZnSO4 · 7 H2O 0,003; entionisiertes Wasser pH 5,5; Sterilisation 60 Minuten 1100C.Subsequently, the culture is transferred into a main culture medium in a ratio of 1:10, which is composed as follows (g / l): glucose 60, diammonium hydrogen citrate 15, KH 2 PO 4 5, KCl 2.5, MgSO 4 .7H 2 O 2.5, FeSO 4 .7H 2 O 0.1, ZnSO 4 .7H 2 O 0.003; deionized water pH 5.5; Sterilization 60 minutes 110 0 C.
Alle Kulturbedingungen werden entsprechend der Vorkultur gewählt. Der am 11. Tag ermittelte Gehalt an Cyclosporin A betrug maximal 1 150mg/l Kultursuspension.All culture conditions are chosen according to the preculture. The content of cyclosporin A determined on the 11th day was a maximum of 1 150 mg / l of culture suspension.
Die Bestimmung des Wirkstoffs erfolgte wie unter Beispiel 1 beschrieben.The determination of the active ingredient was carried out as described in Example 1.
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