DD295246A5 - ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE IDENTIFICATION OF SPERMASPURES THROUGH THE DETECTION OF SPERM-SPECIFIC 30 KDA ANTIGEN - Google Patents

ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE IDENTIFICATION OF SPERMASPURES THROUGH THE DETECTION OF SPERM-SPECIFIC 30 KDA ANTIGEN Download PDF

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DD295246A5
DD295246A5 DD34155390A DD34155390A DD295246A5 DD 295246 A5 DD295246 A5 DD 295246A5 DD 34155390 A DD34155390 A DD 34155390A DD 34155390 A DD34155390 A DD 34155390A DD 295246 A5 DD295246 A5 DD 295246A5
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Uwe Karsten
Heide Wissel
Wulfhard Fregin
Helmut Schmechta
Juergen Becker
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Zi Fuer Molekularbiologie,Ag Patent- Neuererwesen,De
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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Enzymimmunoassay zur Identifizierung von Spermaspuren durch den Nachweis spermaspezifischer 30 kDa-Antigene mit einem monoklonalen Antikoerper, der im Testsystem Spermaantigene auch aus denaturiertem Material erkennt. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Kriminalistik und die Gerichtsmedizin. Der erfindungsgemaesze Enzymimmunoassay ist dadurch gekennzeichnet, dasz im indirekten Test der monoklonale Antikoerper A67-C/F10 (ZIM-0509) als Erstantikoerper in Kombination mit einer speziellen Anti-Maus-IgM-Praeparation, gekoppelt mit Alkalischer Phosphatase, eingesetzt wird. Das erfindungsgemaesze Testsystem ermoeglicht durch den Nachweis spermaspezifischer 30 kDa-Antigene aus denaturiertem Material die Identifizierung kriminalistisch relevanter Spermaspuren, auch wenn mikroskopisch Spermatozoen nicht feststellbar sind.{Antigene, spermaspezifische; Antikoerper, monoklonale; Enzymimmunoassay; Spermanachweis; Spermaspuren; Kriminalistik; Gerichtsmedizin}The invention relates to an enzyme immunoassay for the identification of sperm traces by the detection of sperm-specific 30 kDa antigens with a monoclonal antibody which recognizes semen antigens also from denatured material in the test system. Field of application of the invention are the criminalistics and forensic medicine. The enzyme immunoassay according to the invention is characterized in that in the indirect test the monoclonal antibody A67-C / F10 (ZIM-0509) is used as a first antibody in combination with a special anti-mouse IgM preparation, coupled with alkaline phosphatase. The inventive test system makes it possible to identify criminally relevant sperm traces by detecting sperm-specific 30 kDa antigens from denatured material, even if microscopic spermatozoa are not detectable. {Antigens, sperm-specific; Antibodies, monoclonal; enzyme immunoassay; Semen evidence; Traces of sperm; forensics; Coroner}

Description

mit einer speziellen Anti-Maus-lgM-Präparation, die mit Alkalischer Phosphatase markiert ist, die Ziel-Antigene (Epitope) auch in denaturiertem Material, wie es bei den kriminalistisch relevanten Spuren häufig vorliegt, erkennt. Das ausgewählte Reagenspaar, der monoklonale Antikörper A67-C/F10(ZIM-0509, Isotop IgM), dergut mit denaturiertem, eluiertem und an einen festen Träger gebundenem Spermaantigen reagiert, und die mit Alkalischer Phosphatase markierte polygonale Anti-Maus-lgM-Präparation (Herstellung im Forschungsinstitut für Medizinische Diagnostik, Dresden, modifiziert nach E. Engvall, P. Perlmann, 1971, Immunochem. 8,871; J. F. Kearney, et. al., 1979, Immunology, 123,1548; M. J. O. Sullivan, et. al., 1979, Ann. Clin. Biochem., 1979,72,248, Proteinkonzentration 1,31 mg/ml; AP-Aktivität 639/U ml), die sich als effektives Detektionssystem für den gebundenen monoklonalen Erstantikörper erweist, ist der erfindungswesentliche Bestandteil des Enzymimmunoassays. Für die Auswahl des eifindungsgemäßen Antikörperpaares ist darüber hinaus did Eigenschaft des polyklonalen Zweitantikörpers entscheidend, eine gute Markierbarkeit mit Alkalischer Phosphatase aufzuweisen, wodurch eine den Bedingungen der spurenkundlichen Untersuchung entsprechende Visualisierung mit geringem Background der Enzymreaktion erreicht wirdwith a special anti-mouse IgM preparation labeled with alkaline phosphatase which recognizes target antigens (epitopes) also in denatured material, as is common in the criminally relevant lanes. The selected reagent pair that reacts monoclonal antibody A67-C / F10 (ZIM-0509, isotope IgM) that reacts well with denatured, eluted, and solid support-bound sperm antigen, and the alkaline phosphatase-labeled polygonal anti-mouse IgM preparation ( Production in the Research Institute for Medical Diagnostics, Dresden, modified according to E. Engvall, P. Perlmann, 1971, Immunochem 8,871, JF Kearney, et al., 1979, Immunology, 123, 1548, MJO Sullivan, et al., 1979 , Ann. Clin. Biochem., 1979, 72, 248, protein concentration 1.31 mg / ml; AP activity 639 / U ml), which proves to be an effective detection system for the bound monoclonal first antibody, is the essential part of the enzyme immunoassay according to the invention. In addition, for the selection of the antibody pair according to the invention, the characteristic of the polyclonal secondary antibody was decisive to have a good markerability with alkaline phosphatase, whereby a visualization with a low background of the enzyme reaction corresponding to the conditions of the trace-based investigation is achieved

Als Testsystem zum Nachweis von spermaspezifischen Antigenen in kriminalistisch relevanten Spuren mit einem monoklonalen Antikörper wurde ein indirekter Enzymimmunoassay entwickelt, bei dem als Festphasenträger sowohl Glas-Objektträger als vorzugsweise auch Mikrotiterplatten aus Plaste einsetzbar sind. Diese gestatteten eine automatisierte, rechnergestützte und objektivierte Befunderhebung. Die Nachweisgrenze des erfindungsgemäßen Enzymimmunoassay beträgt etwa 1000 ng/ml. Sie liegt somit hinreichend über dem Gehalt des Blutserums bzw. -plasmas. Mit dem erfindungsgemäßon Testsystem kann somit der Beweis für das Vorliegen von Spermaspuren im Sinne der kriminalistischen Identifizierungstheorie erbracht werden, auch wenn im Untersuchungsmaterial mikroskopisch keine Spermatozoon nachweisbar sind. As a test system for the detection of sperm-specific antigens in criminally relevant tracks with a monoclonal antibody, an indirect enzyme immunoassay was developed in which as solid phase support both glass slides and preferably also microtiter plates made of plastic can be used. These allowed an automated, computer-aided and objectified assessment. The detection limit of the enzyme immunoassay according to the invention is about 1000 ng / ml. It is thus sufficiently above the content of the blood serum or plasma. Thus, with the assay system according to the invention, the evidence for the presence of semen traces in the sense of the criminalistic identification theory can be provided, even if microscopically no spermatozoa are detectable in the examination material.

Ausführungsbeispielembodiment Durchführung des Nachweises mit dem erfindungsgemäßen EnzymimmunoassayCarrying out the detection with the enzyme immunoassay according to the invention

Mikrotiterplatten wurden mit Verdünnungsreihen von Bicarbonatpuffer-Eluaten (pH = 9,6) spermaverdächtiger kriminalistisch relevanter Spuren, wie Vaginalabstrich oder Flecken auf Textilien, über Nacht inkubiert. Danach wurde mit PBS-Tween-20-Lösung gewaschen, 50μΙ unverdünnter Kulturbestand A67-C/F 10zugegeben und45 Minuten bei 250C inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte die Inkubation mit 50μ11:500 verdünnter phosphatasemarkierter Anti-Maus-lgM-Präparation (45 Minuten, 250C). Nach weiterem Waschen wurden 50μΙ S'jbstratlösung (1 mg p-Nitrophenylphosphat/1 ml Diethanolaminpufferlösung) zugegeben und die Extinktion nach 30 Minuten bei 405nm gemessen (Photometer Sumal PE 1, one-line Kopplung an Bürocomputer BC A5120). Die Nachweisgrenze entsprach - bei positiver Wertung von Extinktionen > 1 - einer Spermaplasmaverdünnung von etwa 1:1000.Microtiter plates were incubated with serial dilutions of bicarbonate buffer eluates (pH = 9.6) of suspected criminally relevant traces, such as vaginal smears or stains on textiles, overnight. Thereafter, it was washed with PBS-Tween 20 solution, 50μΙ undiluted culture stock A67-C / F 10 added and incubated at 25 0 C for 45 minutes. After washing again, incubation with 50μ11: 500 diluted phosphatase-anti-mouse IgM preparation (45 minutes to 25 0 C). After further washing 50μΙ S'jbstratlösung (1 mg p-nitrophenyl phosphate / 1 ml Diethanolaminpufferlösung) was added and the absorbance after 30 minutes at 405nm measured (Photometer Sumal PE 1, one-line coupling to office computer BC A5120). The detection limit corresponded - with a positive evaluation of extinctions> 1 - a sperm plasma dilution of about 1: 1000.

Bezogen auf die durchschnittliche Konzentration der spermaspezifischen Antigene im Molekulargewichtsbereich um 3OkDa von 1 mg/ml entspricht dies einer Nachweisgrenze von etwa 1000 ng/ml. Diese liegt somit hinreichend über dem Gehalt des Blutserums bzw. -plasmas (bei gesunden Männern etwa 0,5ng/ml und bei Prostata-Tumoren etwa 25ng/ml).Based on the average concentration of sperm-specific antigens in the molecular weight range around 3OkDa of 1 mg / ml, this corresponds to a detection limit of about 1000 ng / ml. This is thus sufficiently above the level of the blood serum or plasma (in healthy men about 0.5 ng / ml and in prostate tumors about 25 ng / ml).

Claims (1)

Enzymimmunoassay zur Identifizierung von Spermaspuren durch den Nachweis spermaspezifischer 30-kDa-Antigene in einem indirekten Testsystem, bestehend aus fester Phase, Erstantikörper und Enzym-markiertem Zweitantikörper, gekennzeichnet dadurch, daß der Erstantikörper der monoklonal Antikörper A67-C/F10 (ZIM-0509) und der Enzym-markierte Zweitantikörper eine mit Alkalischer Phosphatase markierte polyklonale Anti-Maus-IgM-Präparation ist.Enzyme immunoassay for identification of spermatozoa by detection of sperm-specific 30 kDa antigens in an indirect test system consisting of solid phase, first antibody and enzyme-labeled second antibody, characterized in that the first antibody of the monoclonal antibody A67-C / F10 (ZIM-0509) and the enzyme-labeled second antibody is an alkaline phosphatase-labeled polyclonal anti-mouse IgM preparation. Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention Die Erfindung betrifft einen Enzymimmunoassay, in dem spermaspezifische Antigene aus angetrocknetem bzw. denaturiertem Material (Spermaspuren) nachweisbar sind. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Kriminalistik und die Gerichtsmedizin.The invention relates to an enzyme immunoassay in which sperm-specific antigens from dried or denatured material (semen traces) are detectable. Field of application of the invention are the criminalistics and forensic medicine. Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art Neben dem mikroskopischen Nachweis von Spermatozoon bzw. von Spermatozoenköpfen (H. Wisset, W. Fregin, Krimin, for. Wiss., 1986,61/62,141-143) gilt der immunologische Nachweis von spermaspezifischen Antigenen als Methode der Wahl zur Identifizierung von Sperma in kriminalistisch relevantem Untersuchungsmaterial bei der Untersuchung und Aufklärung von Sexualstraftaten. Seit längerem sind Versuche zur Herstellung von Anti-Sperma-Seren bekannt, die einerseits spezifisch mit Spermaantigenen reagieren und andererseits im Sperma vorhandene Antigene auch in angetrocknetem, denaturiertem Material nachweisen (H.Suyama, H.Sawada, Dtsch. Zschr. gerichtl. Med., 1963,53,175-185; W.Klumpen, Diss. Marburg, 1967; A. Rambow, Diss. Mainz, 1978). Derartige polyklonale Antiseren ergeben jedoch Kreuzreaktionen mit anderen Körpormaterialien, wie Nasensekret oder Speichel, die auf das Vorhandensein ubiquitärer Proteine in menschlichen Körperflüssigkeiten zurückzuführen sind (H.Schmechta, B.Kopetz, H.Schlosser, Krimin, for. Wiss., 1982,47,75-85; H.Wissel, W.Fregin, Krimin, for. Wiss., 1986,63/64,327).In addition to the microscopic detection of spermatozoa or of spermatozoa (H. Wisset, W. Fregin, Krimin, for. Wiss., 1986, 61 / 62,141-143), the immunological detection of sperm-specific antigens as a method of choice for the identification of sperm in Criminally relevant research material in the investigation and education of sexual offenses. For some time, attempts have been made to prepare anti-sperm sera which, on the one hand, react specifically with sperm antigens and, on the other hand, detect antigens present in semen also in dried, denatured material (H. Suyama, H. Savada, Gersch. , 1963, 53, 175-185, W. Klopump, Diss. Marburg, 1967, A. Rambow, Diss. Mainz, 1978). However, such polyclonal antisera give cross-reactions with other body materials, such as nasal secretions or saliva, which are due to the presence of ubiquitous proteins in human body fluids (H. Schmechta, B. Kopetz, H. Schlinger, Krimin, for. Wiss., 1982, 47, 75-85, H.Wissel, W.Fregin, Krimin, for .Wiss., 1986, 63/64, 337). Eine wesentliche Voraussetzung für die Erzeugung monospezifischer polyklonaler Antiseren wurde bei der Isolierung des spermaspezifischen Proteins „P30", einem aus dem Prostatasekret stammenden Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 30000D, geschaffen (G.F.Sensabaugh, J. For. Sei., 1978,23,106-115). Im Kaninchen erzeugtes polyklonales Anti-P30 der Firma Seri (USA) ist in verschiedenen immunologischen Verfahren zum Nachweis von Sperma in kriminalistisch relevanten Spuren geeignet (J.Streeter, S.Sugarman, S.Swarner, J. For. Sei. Soc, 1983,23,324; N.A.Stubbings, PJ.Newall, J. For. Sei., 1983,30,604-614; H.Wissel, W. Fregin, Krimin, for. Wiss., 1989,73/74,157-160). Monoklonal Antikörper gegen verschiedene Spermaantigene wurden bereits gewonnen und vor allem in der Tumorforschung eingesetzt. Zum Teil konnte ihre prinzipielle Eignung auch für spurenkundliche Untersuchungen bestätigt werden (L. Kamenev, M. Leclerq, Ch. Francois-Gerard, J. For. Sei. Soc., 1989,29,233-241; A.Tsutsumi, Y. Yamamoto, H. Ishizu, Act. Crim. Japon., 1988, 54,239-246). Neben dem Problem der vom polyklonalen System her bekannten Antigen-Antikörper-Spezifität sind bei Verwendung monoklonaler Antikörper zusätzliche Effekte zu beachten. Diese sind auf Epitop-Paratop-Wechselwirkungen zurückzuführen, die des weiteren eine bisher nicht bekannte „Methodenspezifität" und/oder unerwartete Kreuzreaktivität bewirken können. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, geeignete und exakt aufeinander abgestimmte Antikörper-Kombinationen beim Aufbau von Enzymimmunoassays einzusetzen.An essential prerequisite for the generation of monospecific polyclonal antisera has been provided in the isolation of the sperm specific protein "P30", a prostatic gastric glycoprotein having a molecular weight of about 30000D (GFSensabaugh, J. For. Sei., 1978, 23, 106-115 Rabbit-generated polyclonal anti-P30 from Seri (USA) is suitable in various immunological methods for the detection of semen in criminally relevant lanes (J. Streeter, S.Sugarman, S.Swarner, J. For. 1983, 23, 344; NAStubbings, PJ Newall, J. For. Sci., 1983, 30, 604-614; H. Wissel, W. Fregin, Krimin, for. Wiss., 1989, 73/74, 157-160) Monoclonal antibodies against various sperm antigens have already been obtained and used in particular in tumor research.Also, their principal suitability could also be confirmed for cognitive investigations (L. Kamenev, M. Leclerq, Ch. Francois-Gerard, J. Fors. Sei. Soc. 1989, 29, 233-241; A. Tsut sumi, Y. Yamamoto, H. Ishizu, Act. Crim. Japon., 1988, 54, 239-246). Besides the problem of the antigen-antibody specificity known from the polyclonal system, additional effects must be considered when using monoclonal antibodies. These are due to epitope-paratope interactions, which may also cause a previously unknown "method specificity" and / or unexpected cross-reactivity, resulting in the need to use appropriate and precisely matched antibody combinations in the construction of enzyme immunoassays. Bei der Untersuchung kriminalistisch relevanten biologischen Untersuchungsmaterials ist weiterhin generell mit dem Vorliegen endogener Peroxidaseaktivitäten zu rechnen, die bei der Verwendung von Peroxidase-Markierung für die Visualisierung eine Blockade dieser Aktivität erforderlich machen. Diese Blockadereaktion kann im Einzelfall die Bindung des Erstantikörpers an das Ziel-Antigen (Epitop) beeinträchtigen. Für die Markierung des Zweitantikörpers ist daher ein anderes Enzym zu fordern. Ein kommerziell vertriebenes Testsystem zum Nachweis spermaspezifischer Antigene im Molekulargewichtsbereich um 3OkDa aus kriminalistisch relevanten biologischen Spuren unter Nutzung der allgemein anerkannten Vorteile monoklonaler Antikörper für die Detektion, wie hohe Epitop-Spezifität und unbegrenzte Verfügbarkeit als Voraussetzung für eine Methodenstandardisierung ist bisher nicht bekannt.In the investigation of criminally relevant biological specimens further, the presence of endogenous peroxidase activities is generally to be expected, which requires the blockage of this activity when using peroxidase labeling for visualization. In individual cases, this blockade reaction may impair the binding of the first antibody to the target antigen (epitope). For the labeling of the secondary antibody, therefore, another enzyme is required. A commercially available test system for detecting sperm specific antigens in the molecular weight range around 3OkDa from kriminalistisch relevant biological traces using the generally accepted advantages of monoclonal antibodies for detection, such as high epitope specificity and unlimited availability as a prerequisite for a method standardization is not yet known. Ziel der ErfindungObject of the invention Die Erfindung hat das Ziel, unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen spermaspezifische Antigene im Molekulargewichtsbereich um 3OkDa einen Enzymimmunoassay aufzubauen, mit dem Spermaantigene in angetrocknetem, denaturiertem Material spezifisch für die Identifizierung kriminalistisch relevanter Spermaspuren nachgewiesen werden können, euch wenn keine Spermatozoen feststellbar sind.The invention aims to build an enzyme immunoassay using monoclonal antibodies against sperm specific antigens in the molecular weight range around 3OkDa, with which sperm antigens in dried, denatured material specifically for the identification of kriminalistisch relevant sperm traces can be detected, if you spermatozoa are not detectable. Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Aufgabe der Erfindung ist es, den Test so zu gestalten, daß potentiell kreuzreagierende Antigene, die in anderen kriminalistischen relevanten Körperflüssigkeiten vorhanden sind, im Testsystem keine Antikörperbindung bewirken. Die Nachweisgrenze des Tests ist so zu gestalten, daß physiologische und pathologische Konzentrationen der Spermaantigene in anderen Körperbestandteilen nicht erfaßt werden.The object of the invention is to design the test so that potentially cross-reacting antigens present in other criminally relevant body fluids do not cause antibody binding in the test system. The detection limit of the test shall be such that physiological and pathological concentrations of sperm antigens are not detected in other parts of the body. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Spermaspuren in einem Enzymimmunoassay durch den Nachweis spermaspezifischer 30-kDa-Antigene ist dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte monoklonale Antikörper in VerbindungThe inventive method for identifying sperm traces in an enzyme immunoassay by the detection of sperm specific 30 kDa antigens is characterized in that the monoclonal antibody used in conjunction
DD34155390A 1990-04-12 1990-04-12 ENZYME IMMUNOASSAY FOR THE IDENTIFICATION OF SPERMASPURES THROUGH THE DETECTION OF SPERM-SPECIFIC 30 KDA ANTIGEN DD295246A5 (en)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105675890A (en) * 2015-12-31 2016-06-15 湖南农业大学 Apparatus for detecting pregnancy of laboratory mice, and method thereof

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