DD292024A5

DD292024A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ERGOSTERINE

Info

Publication number: DD292024A5
Application number: DD33795390A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Ihn; Udo Graefe; Klausjuergen Dornberger; Ernst-Joachim Bormann; Dietrich Krebs; Karl-Heinz Heidenbluth; Wolf-Ruediger Rudat
Original assignee: Zi Fuer Mikrobiologie Und Experimentelle Therapie,De
Priority date: 1990-02-19
Filing date: 1990-02-19
Publication date: 1991-07-18

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterin auf mikrobiologischem Wege. Ziel der Erfindung ist die Herstellung des genannten Sterols, das in der pharmazeutischen Forschung und Industrie als ein bevorzugtes Ausgangsmaterial fuer die Synthese von Vitamin-D3-Pharmaka sowie als Ausgangsmaterial fuer die Synthese pflanzenwachstumsregulatorisch wirksamer Brassinosteroide in den letzten Jahren grosze Bedeutung erlangte. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird dadurch geloest, dasz in der biologischen Prozeszstufe der pilzliche Mikroorganismus Tolypocladium inflatum Wb 6-5, Hinterlegungsnummer IMET 43899, unter sterilen Bedingungen in aerober Submersfermentation kultiviert und das Ergosterin anschlieszend aus dem hierbei erhaltenen Mycel mit organischen Loesungsmitteln extrahiert und nachfolgend gereinigt wird.{Ergosterin; Sterol; Ausgangsmaterial fuer die Synthese pflanzenwachstumsregulatorisch wirksamer Brassinosteroide mit Vitamin D3-Pharmaka; pilzlicher Produktionsorganismus Tolypocladium inflatum Wb 6-5-Hinterlegungsnummer IMET 43899}The invention relates to a process for the production of ergosterol by microbiological means. The aim of the invention is the production of said sterol, which in the pharmaceutical research and industry as a preferred starting material for the synthesis of vitamin D3 drugs and as a starting material for the synthesis of plant growth regulative effective brassinosteroids in recent years obtained great importance. The object associated with this object is achieved by cultivating in the biological process stage the fungal microorganism Tolypocladium inflatum Wb 6-5, deposit number IMET 43899, under sterile conditions in aerobic submerged fermentation and subsequently extracting the ergosterol from the resulting mycelium with organic solvents and subsequently is purified. {ergosterol; sterol; Starting material for the synthesis of plant growth regulative effective brassinosteroids with vitamin D3 drugs; fungal production organism Tolypocladium inflatum Wb 6-5 deposit number IMET 43899}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterin, das als bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Brassinosteroide Anwendung findet. Vitamin-D₃-Pharmaka haben in der Humanmedizin aufgrund ihrer starken Wirkung auf den Calziumstoffwechsel sowie der zeildifferenzierenden und proliferationshemmenden Wirkung zur Behandlung von Tumoren, Schuppenflechte, Skelett- und Nebenschilddrüsenerkrankungen sowie zur Therapie von Nieren- und Leberfunktionsstörungen breiten Eingang gefunden. Die Brassinosteroide haben als Pflanzenwachstumsregulatoren in den letzten Jahren große Bedeutung erlangt. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt somit in der pharmazeutischen Forschung und Industrie sowie in der Landwirtschaft.The invention relates to a process for the production of ergosterol which finds use as a preferred starting material for the synthesis of vitamin D ₃ -harmarmins and brassinosteroids. Due to their strong effect on the calcium metabolism as well as the differentiating and antiproliferative action, vitamin D ₃ -pharmaka have been widely used in the treatment of tumors, psoriasis, skeletal and parathyroid disorders as well as for the treatment of renal and hepatic dysfunction. Brassinosteroids have become very important as plant growth regulators in recent years. The field of application of the invention is thus in the pharmaceutical research and industry as well as in agriculture.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Ergosterin ist als Bestandteil der Zellen von Pilzen und Hefen bekannt. Aufgrund der großen Bedeutung des Ergostprins als Ausgangsverbindung für die Synthese von Vitamin D und als Vorstufe für die Herstellung von synthetischen Steroidrormonen führten ausgedehnte Screening-Untersuchungen zur Auffindung zahlreicher Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen, so unter anderem Pilzstämme der Gattungen Aspergllli und Peniclllia (vgl. Übersicht von El-Rafai, A. H., 1964, Ph. D. Thesis, Cairo Univ.) sowie zahlreiche Hefestämme der Gattungen Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Hansonula, Pichia, Rhodotorula und Torulopsis (vgl. Übersichten von Conzales-Bibiesca, J.L. und Campillo, CC. 1961, Lationomer. Microblol.,4,83; El-Refai,A.H. und El-Kady, I.A. 1968, Zeitschr. AIIg. Mikrobiologie 8,355). Die meisten der hier genannten Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen sind jedoch aufgrund der niedrigen Ausbeuten an Biomasse mit zudem auch nur geringem Ergosteringehalt für biotechnologische Nutzung nicht geeignet. Als geeignetste Mikroorganismen zur Gewinnung von Ergosterin auf fermentativem Wege erwiesen sich Hefestämme der Gattung Saccharomyces (vgl. die Patentschriften US 2059980, US 2276710, US 2817624, DRP 720007) sowie Pilzstämme der Gattungen Trlchoderma, Fusaria und Cephalosporia (Patentschrift DE 2303495 C₂). Diese biotechnologischen Verfahren, bei denen Ergosteringehalte bis zu 200 mg/l Kulturbrühe erhalten werden, benötigen jedoch komplexe organische Nährmedien mit Pepton als Stickstoffquelle, was ils ein erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden muß. Die Gewinnung von Ergosterin neben Ubichinonen aus. Lipid-KW-Extrakten, die bei der mikrobiellen Gewinnung von Eiweiß auf der Basis von KW anfallen, haben die Patentschriften DD 115899, DD 151007, DD 154448 und DD 209187 zum Gegenstand. Die Lipid-KW-Extrakte mit einem Ergosteringehalt von 1 % werden aus einem KW-verwertenden Stamm der Hefe Lodderomyces elonglsporus gewonnen. Die relativ aufwendige und besonders bei hohen KW-Gehalten erschwerte Isolierung des Ergosterins aus dem Hefeextrakt erfordert zunächst eine adsorptive Anreicherung des Sterols an Kieselgel.Ergosterol is known as part of the cells of fungi and yeasts. Due to the great importance of ergostprin as a starting compound for the synthesis of vitamin D and as a precursor for the production of synthetic steroid hormones extended screening studies led to the discovery of numerous microorganisms with ergosterol-forming ability, including fungal strains of the genera Aspergllli and penicillia (see Overview by El-Rafai, AH, 1964, Ph.D. Thesis, Cairo Univ.) as well as numerous yeast strains of the genera Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaromyces, Hansonula, Pichia, Rhodotorula and Torulopsis (see overviews of Conzales). Bibiesca, JL and Campillo, CC, 1961, Lationomer, Microblol., 4, 83; El-Refai, AH and El-Kady, IA, 1968, Journal AIIg. Microbiology 8,355). Most of the microorganisms mentioned here with ergosterol-forming capacity are, however, not suitable for biotechnological use due to the low yields of biomass with low levels of ergosterol. As the most suitable microorganisms for the production of ergosterol fermentative paths yeast strains found to the genus Saccharomyces (see. The patents US 2,059,980, US 2,276,710, US 2,817,624, DRP 720007) and fungal strains of the genera Trlchoderma, fusaria and Cephalosporia (Patent DE 2,303,495 C _2). However, these biotechnological processes, in which ergosterin levels of up to 200 mg / l of culture broth are obtained, require complex organic nutrient media with peptone as nitrogen source, which must be regarded as a significant economic disadvantage. Recovery of ergosterol besides ubiquinones. Lipid HC extracts, which are obtained in the microbial production of protein based on HC, have the patents DD 115899, DD 151007, DD 154448 and DD 209187 the subject. The lipid HC extracts with an ergosterol content of 1% are obtained from a KW-utilizing strain of the yeast Lodderomyces elonglsporus. The relatively complicated isolation of the ergosterol from the yeast extract, which is particularly difficult at high HC contents, first requires adsorptive accumulation of the sterol on silica gel.

Zur Gewinnung von Hefe mit Ergosteringehalten von 0,8% bis 1,5% der Trockensubstanz wird bei Gärprozessen anfallende Hefe wie z. B. Melassesprithefe oder Bierhefe einer aeroben Nachfermentation in Gegenwart von Ammoniumstickstoff, Phosphationen und einer Kohlenstoffquelle unterworfen. Die durch Separation abgetrennte Biomasse (20g Trockensubstanz/l Kulturbrühe) kann zur Gt innung von Ergosterin oder nach UV-Bestrahlung als Vitamin-D₂-haltige Futtermitteikomponente benutzt werden.For the production of yeast with Ergosteringehalten of 0.8% to 1.5% of the dry matter is obtained in fermentation processes yeast such. B. molasses syrup or brewer's yeast subjected to an aerobic Nachfermentation in the presence of ammonium nitrogen, phosphate ions and a carbon source. The biomass separated by separation (20 g dry matter / l culture broth) can be used to provide ergosterol or after UV irradiation as a vitamin D ₂ -containing fattening medium component.

Object of the invention

Die Erfindung hat die ökonomisch günstige Herstellung des Sterols Ergosterin zum Ziel. Damit soll die Palette bekannter Herstellungsverfahren für das in der pharmazeutischen Forschung und Industrie zunehmend bedeutungsvoller werdende Ergosterin durch einen originellen Prozeß erweitert werden.The aim of the invention is the economically favorable production of sterol ergosterol. Thus, the range of known manufacturing processes for the increasingly important in pharmaceutical research and industry ergosterol to be extended by an original process.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, daß die fermentative Herstellung von Ergosterin mittels eines neuen Stammes in synthetischen Medien ohne den Einsatz komplexer organischer Stickstoffquellen in guten Ausbeuten ermöglicht.The invention has for its object to provide a technologically simple method that enables the fermentative production of ergosterol by means of a new strain in synthetic media without the use of complex organic nitrogen sources in good yields.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der Mikroorganismus Tolypocladium inflatum Wb6-5 oder eine seiner Varianten kultiviert werden.According to the invention the object is achieved in that cultivated under aerobic and sterile culture conditions in a liquid nutrient medium with carbon, nitrogen sources and mineral salts of the microorganism Tolypocladium inflatum Wb6-5 or one of its variants.

Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, ZIMET der AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR, unter der Registriernummer IMET 43699 hinterlegt. Die Fermentation erfolgt nach einer ein- bzw. zweistufigen Vorzucht in der submersen Hauptkultur unter aeroben, sterilen Bedingungen, indem der oben genannte Mikroorganismus in einem flüssigen Medium bei Temperaturen von 2O⁰C bis 37°C sowie einer Acidität von pH 3,2 bis pH 7,5 für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen kultiviert werden. Rasenstücke aus Schrägkulturen des Stammes Tolypocladium Inflatum Wb6-5 werden in physiologischer NaCI-Lösung suspendiert und auf einen Nähragar ausplattiert, welcher als Kohlenstoffquelle Glucose, Maltose oder Saccharose, sowie (NH₄I₂SO₄ als Stickstoffquelle enthält und für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen bei 24⁰C bis 28°C bebrütet wird. Von den entstandenen Einzelkolonian werden die luftmycelarmen, rot- bis schwarzbraun pigmentierten Exemplare ausgewählt und nach Übertragung auf Mineralsalz-Glukoseagar zur Herstellung von 2cm bis 4cm großen Rasenarealen verwendet. Diese werden als Agarausstich in die erste submerse Vorzuchtpassage übertragen, die aus 100-ml- bis 500-ml-Erlenmeyerkolben besteht, welche jeweils 20% ihres Volumens als Anzuchtmedium enthalten. Das Inokulum enthält Glukose, Maltose oder Saccharose als Kohlenstoffquelle, weiterhin organische Stickstoffsubstrate sowie Mineralsalze und wird nach Beimpfung für die Dauer von 48 Stunden bis 72 Stunden bei 24⁰C bis 25⁰C unter Schütteln auf einen Rundschwinger bei lOOrpm bis 24Orpm kultiviert. Nach Ausreifen der I.Anzucht in Flüssigkultur erfolgt gegebenenfalls die Beimpfung einer 2 Anzucht in einer Menge von 5% bis 10% des Medienvolumens. Diese Stufe besteht entweder aus 500-ml-Erlenmeyerkolben, die 100ml des o.a. Mediums enthalten, oder aus gerührten und belüfteten Kleinfermentoren mit einem Nettovolumen von 51 bis 251 bei üblichem technischen Ausrüstungsgrad für Temperierung und Belüftung. Nach 48stündiger Kultivierung wird das Hauptkulturmedium, welches als alleinige Stickstoffquelle Ammoniumsalze enthält, in einer Menge von 5% bis 10% des Volumens mit der Vorkultur beimpft und für die Dauer von 5 Tagen bis 11 Tagen unter Rühren und Belüften bzw. durch Rundschütteln kultiviert. Die Isolierung des Ergosterins wird in der Weise durchgeführt, daß das Sterol aus der Biomasse mit Wasser mischbaren oder wenig mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahiert, im Vakuum das Lösungsmittel abdestilliert, anschließend in einem organischen unpolaren Lösungsmittel wieder aufgenommen und einer säulenchromatographischen Trennung unterworfen wird. Die Ergosterin enthaltenden Eluate werden im Vakuum eingeengt, der Rückstand in wäßrigem Methanol aufgenommen, das abgeschiedene Ergosterin abfiltriert und durch Umkristallisieren als reine kristalline Verbindung erhalten.The microorganism which finds use in this process is in the depository for microorganisms of the GDR, ZIMET the AdW, Beutenbergstr. 11, Jena, DDR, under the registration number IMET 43699 deposited. The fermentation is carried out after a one- or two-stage Vorzucht in the submerged main culture under aerobic, sterile conditions by the above-mentioned microorganism in a liquid medium at temperatures of 2O ⁰ C to 37 ° C and an acidity of pH 3.2 to pH 7.5 for a period of 5 days to 11 days to be cultivated. Slants of slant cultures of the strain Tolypocladium inflatum Wb6-5 are suspended in physiological NaCl solution and plated on a nutrient agar containing as carbon source glucose, maltose or sucrose, and (NH ₄ I ₂ SO ₄ as nitrogen source and for a period of 14 days is incubated up to 21 days at 24 ⁰ C to 28 ° C. from the resulting Einzelkolonian be the luftmycelarmen, red to dark brown pigmented copies selected and after transmission used on mineral salt-glucose agar for the preparation of 2cm to 4cm large lawn areas. These are called Agarausstich transferred to the first submerged pre-breeding passage, which consists of 100 ml to 500 ml conical flasks, each containing 20% of their volume as culture medium, containing inoculum glucose, maltose or sucrose as carbon source, organic nitrogen substrates and mineral salts Inoculation for 48 hours to 72 hours b egg 24 ⁰ C to 25 ⁰ C cultured with shaking on a rotary oscillator at lOOrpm to 24Orpm. After maturing of the I.Anzucht in liquid culture, if appropriate, the inoculation of a 2 cultivation in an amount of 5% to 10% of the volume of the medium. This stage consists either of 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the above medium or of stirred and ventilated small fermentors with a net volume of 51 to 251 at the usual technical equipment level for tempering and aeration. After culturing for 48 hours, the main culture medium, which contains ammonium salts as sole nitrogen source, is inoculated with the preculture in an amount of 5% to 10% of the volume and cultivated for a period of 5 days to 11 days with stirring and aerating or by shaking. The isolation of the ergosterol is carried out by extracting the sterol from the biomass with water-miscible or sparingly miscible organic solvents, distilling off the solvent in vacuo, then resuspending in an organic non-polar solvent and subjecting it to column chromatographic separation. The ergosterol-containing eluates are concentrated in vacuo, the residue taken up in aqueous methanol, the deposited ergosterol is filtered off and obtained by recrystallization as a pure crystalline compound.

Properties of ergosterol

Die Identität des Ergosterins wurde durch den Vergleich der physikochemischen und spektralen Eigenschaften mit einer authentischen Probe gesichert.The identity of ergosterol was confirmed by comparing the physicochemical and spectral properties with an authentic sample.

Farblose, mikrokristalline Substanz aus Äthanol Fp.: 165⁰CColorless, microcrystalline substance of ethanol mp .: 165 ^° C

Optische Drehung [a)_D 25°C-129°C (Chloroform, C = 1,0)Optical rotation [a) _D 25 ° C-129 ° C (chloroform, C = 1.0)

Chromatographische Eigenschaften:Chromatographic properties:

DC: RF-Wert 0,59 (DC-Alufolie Kieselgel 60 [Merck),TLC: RF value 0.59 (DC aluminum foil Kieselgel 60 [Merck],

Laufmittel: Essigester/Isopropanol = 95/5, Anfärbung mit Joddampf) GC: Gaschromatograph GCHF-18.3, VEB Chromatron, Berlin, mit FID, Glassäule (1,8m x 3mm) gefüllt mit 3,5% OV-17 auf Gaschrom Q (80-100 mesh) bei Temperaturen (Thermostat 260°C, Injektor 300°C, Detektor 300°C, Trägerfluß 75 ml/min N₂.Mobile phase: ethyl acetate / isopropanol = 95/5, staining with iodine vapor) GC: gas chromatograph GCHF-18.3, VEB Chromatron, Berlin, with FID, glass column (1.8 m × 3 mm) filled with 3.5% OV-17 on gas stream Q ( 80-100 mesh) at temperatures (thermostat 260 ° C, injector 300 ° C, detector 300 ° C, carrier flow 75 ml / min N ₂ .

Retentionszeit für Ergosterin 9,05 minRetention time for ergosterol 9.05 min

IR-Spektrum: X_n,.,, (KBr cm"'): 800,835,965,975,1030,1055,1365,1375,1455,2860,2945,3425IR spectrum: X _n ,.. ,, (KBr cm "'): 800,835,965,975,1030,1055,1365,1375,1455,2860,2945,3425

Die Vorteile des hier beschriebenen Herstellungsverfahrens für das Sterol Ergosterin werden zusammenfassend gesehenThe advantages of the manufacturing process described here for the sterol ergosterol are summarized

- in der Bereitstellung eines Mikroorganismus, der neben Ergosterin keine von dem Sterol schwer abtrennbaren Substanzen im Mycel anreichert,in the provision of a microorganism which, in addition to ergosterol, does not accumulate substances which are difficult to separate from the sterol in the mycelium,

- in der Möglichkeit, in guten Ausbeuten und bei Rückgriff auf billige Einsatzstoffe ein für die pharmazeutische Forschung und Industrie bedeutsames Ausgangsmaterial verfügbar machen zu können, das für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Pflanzenwachstumsregulatoren vom Typ der Brassinosteroide von potentiellem Nutzen ist,- the ability to make available, in good yields and using cheap feedstock, a starting material of major importance to pharmaceutical research and industry, which is of potential use for the synthesis of vitamin D ₃ and Brassinosteroids plant growth regulators,

- in der einfachen Isolierung des Ergosterins aus der Biomasse und der einfachen Abtrennung des Sterols von anderen mikrowellen Metaboliten ohne wesentlichen zusätzlichen Aufwand an Chemikalien, Arbeitszeit und Energie.- in the simple isolation of ergosterol from the biomass and the simple separation of the sterol from other microwave metabolites without significant additional expenditure of chemicals, labor and energy.

Die Erfindung wird durch das nachfolgende Ausführungsbeispiel näher erläutert, jedoch nicht eingeschränkt.The invention is further illustrated by the following embodiment, but not limited.

Rasenstücke von Oberflächenkuituren des Stammes Tolypocladium Inflatum Wb6-5 werden zunächst auf Glucose-Mineralsalzagar übertragen, der folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):Lawns of surface cures of the strain Tolypocladium inflatum Wb6-5 are first transferred to glucose mineral salt agar having the following composition (g / l):

Glucose 20, (NH₄I₂SO₄ 5, KH₂PO₄ 2, MgSO₄ χ 7 H₂O 0,5;Glucose 20, (NH ₄ I ₂ SO ₄ 5, KH ₂ PO ₄ 2, MgSO ₄ χ 7 H ₂ O 0.5;

CaCO₃ 3.4, Agar 20; pH 5,3 bis pH 5,7;CaCO ₃ 3.4, agar 20; pH 5.3 to pH 5.7;

Sterilisation 30min bei 120°C.Sterilization for 30min at 120 ° C.

Nach einer Bebrütungszeit der Petrischalen bei 24°C für die Dauer von 14 Tagen bis 21 Tagen werden von den entstandenen Arealen die rot- bis schwarzbraun pigmentierten ausgewählt. Die Beimpfung der ersten Submersvorkultur erfolgt durch Übertragung eines ca. 1 cm² großen Rasenstückes auf 100 ml des Anzuchtmediums folgender Zusammensetzung (g/l).After a incubation period of the Petri dishes at 24 ° C for a period of 14 days to 21 days are selected from the resulting areas, the red to black brown pigmented. Inoculation of the first Submersvorkultur carried out by transfer of about 1 cm ² large piece of grass per 100 ml of the culture medium of the following composition (g / l).

Glucose 50, Kaseinpepton 10, KH₂PO₄1, KCI 2,5 zu 11 Aqua dest.; pH 5,5 bis pi H 5,6; Sterilisation 30min bei 120°C.Glucose 50, casein peptone 10, KH ₂ PO ₄ 1, KCl 2.5 to 11 aqua dest .; pH 5.5 to pi H 5.6; Sterilization for 30min at 120 ° C.

Die 500-ml-Anzuchtkolben werden 72 Stunden lang bei 24°C bis 25⁰C mit 180 rpm bis 220 rpm auf Rundschüttlern kultiviert. Sie zeigen als Reifekriterien eine braunschwarze Färbung. Sie dienen in einer Menge von 5% als Impfanteil des Hauptkulturmediums, welches zu je 100ml in 500-mt-Erlenmeyerkolben abgefüllt folgende Zusammensetzung aufweist (g/l):The 500 ml culture flasks are cultivated for 72 hours at 24 ° C to 25 ⁰ C with 180 rpm to 220 rpm on rotary shakers. They show as maturity criteria a brown-black color. They are used in an amount of 5% as the inoculum content of the main culture medium, which is filled to 100 ml in 500 m Erlenmeyer flasks and has the following composition (g / l):

Glucose 50, (NH₄I₂SO₄ 5, (NH₄J₂HPO₄ 2, MgSO₄ x 7 H₂O 0,5, ZnSO₄ x 7 H₂O 0,008, CaCO₃ 5,1 zu 11 Aqua dest., pH 5,3 bis pH 5,9; Sterilisation 30min bei 12O⁰C.Glucose 50, (NH ₄ I ₂ SO ₄ 5, (NH ₄ J ₂ HPO ₄ 2, MgSO ₄ .7H ₂ O 0.5, ZnSO ₄ .7H ₂ O 0.008, CaCO ₃ 5.1 to 11 dist ., pH 5.3 to pH 5.9, sterilization 30 minutes at 12O ⁰ C.

Die Kultivierung erfolgt 11 Tagelang bei 24°C bis 25⁰C auf einem Rundschwinger mit 180 rpm.The cultivation is carried out for 11 days at 24 ° C to 25 ⁰ C on a rotary oscillator with 180 rpm.

101 Kulturbrühe, die man auf diese Weise erhält, werden separiert und die erhaltene feuchte Biomasse (ca. 400g) wird 2mal mit je 1,21 Methanol je 5 Stunden bei Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuumrotationsverdampfer weitgehend eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Chloroform aufgenommen und an Aluminiumoxyd neutral mit Chloroform/Äthanol = 98,5/1,5 chromatographiert. Die Ergosterin enthaltenden Fraktionen (Kontrolle mittels DC) werden vereinigt und im Vakuumrotationsverdampfer eingeengt. Der ölige Rückstand wird in wenig Methanol/Wasser = 95/5 aufgenommen und nacch lOstündigem Stehen bei 10⁰C das ausgefallene Rohergosterin abgesaugt. Man erhält 800mg kristallines Ergostarin-Rohprodukt (ca. 90%ig), das zur Feinstreinigung aus Äthanol umkristallisiert werden kann.101 culture broth, which are obtained in this way, are separated and the resulting moist biomass (about 400g) is extracted twice each with 1.21 methanol for 5 hours at room temperature. The extracts are combined and largely concentrated in a vacuum rotary evaporator. The oily residue is taken up in a little chloroform and chromatographed on aluminum oxide neutral with chloroform / ethanol = 98.5 / 1.5. The ergosterol-containing fractions (control by means of TLC) are combined and concentrated in a vacuum rotary evaporator. The oily residue is taken up in a little methanol / water = 95/5 and after lOstündigem standing at 10 ⁰ C, the precipitated crude fermenter sucked. This gives 800 mg of crystalline Ergostarin crude product (about 90% pure), which can be recrystallized from ultrafine ethanol.

Verfahren zur Herstellung von ErgosterinProcess for the production of ergosterol

Bericht über das Ergebnis der Prüfung auf Schutzfähigkeit und Bewertung der technisch-ökonomischen EffektivitätReport on the result of the examination of the ability to protect and evaluation of the technical and economic effectiveness

zu 1.) Es wurden Patente folgender Länder und Regionalfonds im Zeitraum 1970-1989 recherchiert (im AfEP, Berlin, Lesesaal Mohrenstraße)to 1.) patents of the following countries and regional funds in the period 1970-1989 were researched (in AfEP, Berlin, reading room Mohrenstraße)

Land Patentklasse SchriftenCountry Patent Class Fonts

DD C12P33/00 140478-254025DD C12P33 / 00 140478-254025

DE C12P33/00 2303495-3031334DE C12P33 / 00 2303495-3031334

SU C12P33/00 1411336 (!.Schrift)SU C12P33 / 00 1411336 (!.

US C12 P 33/00 4232122-4783402US C12 P 33/00 4232122-4783402

CH C12P33/00 634105-656462CH C12P33 / 00 634105-656462

EP C12P33/00 15308-227588EP C12P33 / 00 15308-227588

Andere Informationsquellen:Other sources of information:

Über die Herstellung von Ergosterin wurde recherchiert inThe production of ergosterol has been researched in

a.) Beilstein: Handbuch der Organischen Chemie, 4. Ergänzungswerk (Literatur bis 1959)a.) Beilstein: Handbook of Organic Chemistry, 4th Supplementary Works (Literature until 1959)

b.) Chemical Abstracts (Columbus/Ohio- USA) published by the American Chem. Soc. 1960-1989, Subject Index, Formel Indexb.) Chemical Abstracts (Columbus / Ohio- USA) published by the American Chem. Soc. 1960-1989, Subject Index, Formula Index

c.) Steroid Kartei (Dokumentation) des ZIMETc.) Steroid file (documentation) of the ZIMET

zu 2.) Ergosterin ist als Bestandteil der Zellen von Pilzen und Hefen bekannt. Aufgrund der großen Bedeutung des Ergosterins als Ausgangsverbindung für die Synthese von Vitamin D und als Vorstufe für die Herstellung von synthetischen Steroidhormonen führten ausgedehnte Screening-Untersuchungen zur Auffindung zahlreicher Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen, so unter anderem Pilzstämme der Gattungen Aspergilll und Penicillin (vgl. Übersicht von El-Refai, A. H., 1964, Ph. D. Thesis, Cairo Univ.) sowie zahlreiche Hefestämme der Gattungen Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomycs, Debaromyces, Hansenula. Plchla, Rhodorula und Torulopsls (vgl. Übersichten von Conzales-Bibiesca, J. L. und Campillo, C. C. 1961, Latinomer. Microbiol., 4,83; El-Refai, A. H. und El-Kady, I.A. 1968, Zeitschr. AIIg. Mikrobiologie 8,355). Die meisten der hier genannten Mikroorganismen mit Ergosterin-Bildungsvermögen sind jedoch aufgrund der niedrigen Ausbeuten an Biomasse mit zudem auch nur geringen Ergosteringehalt für biotechnoiogische Nutzung nicht geeignet. Als geeignetste Mikroorganismen zur Gewinnung von Ergosterin auf fermentativem Wege erwiesen sich Hefestämme der Gattung Saccharomyces (vgl. die Patentschriften US 2059980, US 2276710, US 2817624, DRP 720007) sowie Pilzstämme der Gattungen Trichoderma, Fusaria und Cephalosporia (Patentschrift DE 2303495 C₂). Diese biotechnologischen Verfahren, bei denen Ergosteringehalte bis zu 200mg/l Kulturbrühe erhalten werden, benötigen jedoch komplexe organische Nährmedien mit Pepton als Stickstoffquelle, was als ein erheblicher ökonomischer Nachteil angesehen werden muß. Die Gewinnung von Ergosterin neben Ubichinonen aus Lipid-KW-Extrakten, die bei der mikrobiellen Gewinnung von Eiweiß auf der Basis von KW anfallen, haben die Patentschriften DD 115899,DD 151007, DD 154448 und DD 209187 zum Gegenstand. Die Lipid-KW-Extrakte mit einem Ergosteringehalt von 1 % werden aus einem KW-verwertenden Stamm der Hefe Lodderomyces elongisporus gewonnen. Die relativ aufwendige und besonders bei hohen KW-Gehalten erschwerte Isolierung des Ergosterins aus dem Hefeextrakt erfordert zunächst eine adsorptive Anreicherung des Sterols an Kieselgel. Zur Gewinnung von Hefe mit Ergosteringehalten von 0,8% bis 1,5% der Trockensubstanz wird bei Gärprozessen anfallende Hefe wie z. B. Melassesprithefe oder Bierhefe einer aeroben Nachfermentation in Gegenwart vonto 2.) Ergosterin is known as part of the cells of fungi and yeasts. Due to the great importance of ergosterol as a starting compound for the synthesis of vitamin D and as a precursor for the production of synthetic steroid hormones extensive screening investigations led to the discovery of numerous microorganisms with ergosterol-forming ability, including fungal strains of the genera Aspergill and penicillin (see Overview by El-Refai, AH, 1964, Ph.D. Thesis, Cairo Univ.) as well as numerous yeast strains of the genera Endomyces, Nadsonla, Mycoderma, Saccharomyces, Zygosaccharomycs, Debaromyces, Hansenula. Plchla, Rhodorula and Torulopsls (see reviews by Conzales-Bibiesca, JL and Campillo, CC 1961, Latinomer Microbiol., 4, 83; El-Refai, AH and El-Kady, IA 1968, Journal of Laws of Microbiology 8,355). , Most of the microorganisms mentioned here with ergosterol-forming capacity are, however, not suitable for biotechnoiogische use due to the low yields of biomass and also low ergosterine content. As the most suitable microorganisms for the production of ergosterol fermentative paths yeast strains found to the genus Saccharomyces (see. The patents US 2,059,980, US 2,276,710, US 2,817,624, DRP 720007) and fungal strains of the genera Trichoderma, fusaria and Cephalosporia (Patent DE 2,303,495 C _2). However, these biotechnological processes, which yield ergosteric levels of up to 200 mg / l of culture broth, require complex organic nutrient media with peptone as the source of nitrogen, which must be regarded as a significant economic disadvantage. The production of ergosterol in addition to ubiquinones from lipid HC extracts, which are obtained in the microbial production of protein on the basis of KW, have the patents DD 115899, DD 151007, DD 154448 and DD 209187 the subject. The lipid HC extracts with an ergosterol content of 1% are obtained from a KW-utilizing strain of the yeast Lodderomyces elongisporus. The relatively complicated isolation of the ergosterol from the yeast extract, which is particularly difficult at high HC contents, first requires adsorptive accumulation of the sterol on silica gel. For the production of yeast with Ergosteringehalten of 0.8% to 1.5% of the dry matter is obtained in fermentation processes yeast such. B. molasses syrup or brewer's yeast aerobic Nachfermentation in the presence of

Ammoniumstickstoff, Phosphationen und einer Kohlenstoffquelle unterworfen. Die durch Separation abgetrennte Biomasse (20g Trockensubstanz/l Kulturbrühe) kann zur Gewinnung von Ergosterin oder nach UV-Bestrahlung als Vitamin-Dj-haltige Futtermittelkomponente benutzt werden (vgl. Patentschrift DD 202892).Ammonium nitrogen, phosphate ions and a carbon source. The separated by separation biomass (20 g dry matter / l culture broth) can be used to obtain ergosterol or after UV irradiation as a vitamin Dj-containing feed component (see patent DD 202892).

Wie aus der Patent- und Literaturrecherche hervorgeht, existieren keine Schutzrechte für die gleichzeitige Gewinnung von Ergosterin neben leicht abtrennbarem Cyclosporin, die das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Ergosterin mit Hilfe des Mikroorganismus Tolypocladlum Inflatum Wb6-5 mit der Hinterlegungsnummer IMET 43899 tangieren.As can be seen from the patent and literature search, there are no patents for the simultaneous recovery of ergosterol in addition to easily separable cyclosporin, which affect the inventive method for the production of ergosterol using the microorganism Tolypocladlum Inflatum Wb6-5 with the deposit number IMET 43899.

Störpatente sind nicht bekannt, eine Kollision fremder Patentansprüche mit der eigenen erfinderischen Lösung ist nicht zu erwarten und eine Umgehung entgegenstehender Schutzrechte Dritter ist daher nicht erforderlich. Da es sich um einen nicht bekannten Ergosterinproduzierenden Mikroorganismus handelt, gibt es keine naheliegenden Lösungen.Disturbance patents are not known, a collision of foreign claims with their own inventive solution is not expected and a circumvention of conflicting property rights of third parties is therefore not required. Since it is an unknown ergosterol-producing microorganism, there are no obvious solutions.

zu 3.) Mikrobiologie - Fermentationsbetriebe - pharmazeutische Industrieto 3.) Microbiology - Fermentation Companies - Pharmaceutical Industry

zu 4.) Pie Vorteile des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von Ergosterin liegen darin,to 4.) Pie Advantages of the present process for the production of ergosterol are

- in der Bereitstellung eines Mikroorganismus der neben Ergosterin, außer dem leicht abtrennbaren Cyclosporin, keine weiteren, von dem Sterol schwer abtrennbaren Substanzen im Mycel anreichert.- In the provision of a microorganism in addition to ergosterol, except the easily separable cyclosporin, no further, difficult to separate from the sterol substances in mycelium enriches.

- in der Möglichkeit, in guten Ausbeuten und bei Rückgriff auf billige Einsatzstoffe ein für die pharmazeutische Forschung und Industrie bedeutsames Ausgangsmaterial verfügbar machen zu können, das für die Synthese von Vitamin-D₃-Pharmaka und Pflanzenwachstumsregulatoren vom Typ der Brasinosteroide von potentiellem Nutzen ist.- be able to make in the way, in good yields and with recourse to cheap feedstocks a significant pharmaceutical research and industrial raw material available, which is ₃ -Pharmaka and plant growth regulators on the type of Brasinosteroide of potential use for the synthesis of vitamin D.

- in der einfachen Isolierung des Ergosterins aus der Biomasse und der einfachen Abtrennung des Sterols vom Cyclosporin ohne wesentlichen zusätzlichen Aufwand an Chemikalien, Arbeitszeit und Energie.- In the simple isolation of ergosterol from the biomass and the simple separation of the sterol from cyclosporin without significant additional effort on chemicals, working hours and energy.

zu 5.) Die Erprobung fand bisher im Labor- und im Technikumsmaßstab (2000-Liter-Fermentor) statt. Die Nutzung des Verfahrens soll unmittelbar nach Anmeldung beim AfEP beginnen.to 5.) The testing took place so far in laboratory and pilot plant scale (2000-liter fermenter) instead. The use of the procedure should begin immediately after registration with the AfEP.

Die aufzunehmende Produktion soll den Eigenbedarf im ZIMET abdecken und darüber hinaus den anderer Institutionen der DDRThe production to be included should cover the own needs in the ZIMET and beyond that of other institutions of the GDR

Eine Exportmöglichkeit im SW ist zu prüfen. An export option in SW must be checked.

Claims

1. A process for the production of ergosterol by fermentation under aerobic and sterile conditions in liquid nutrient media containing a carbon, nitrogen source and mineral salts, at a temperature between 20 ⁰ C and 37 ° C, characterized in that the fungal microorganism Tolypocladium inflatum Wb 6 Are cultivated for a period of 5 days to 11 days in a medium with ammonium salts as sole nitrogen source and the ergosterol formed from the mycelium or optionally also from the culture filtrate obtained by extraction and subsequently purified.

2. The method according to item 1, characterized in that one starts in the cultivation of red to black brown pigmented emers cultures, which are grown on a mineral salt-glucose agar with ammonium salts as the sole source of nitrogen.

3. The method according to item 1 and 2, characterized in that one uses for the cultivation of the strain Tolypocladium inflatum Wb 6-5 as ammonium salts ammonium sulfate and / or Diammoniumhydrogenphosphat.

4. The method according to item 1 to 3, characterized in that the mycelium is separated from the culture solution, extracted with an organic solvent, the solution is then concentrated and the ergosterol is isolated by column chromatography on aluminum oxide.

5. The method according to item 1 to 4, characterized in that concentrated to purify the ergosterol column chromatographic fractions, the eluate residues added in aqueous methanol, filtered off separated ergosterol and obtained by recrystallization from an organic solvent in pure form.