DD281193A5

DD281193A5 - METHOD FOR OBTAINING AN INSULIN-FREE C-PEPTIDE-SUBSTANCE

Info

Publication number: DD281193A5
Application number: DD32723986A
Authority: DD
Inventors: Peter Slonina
Original assignee: Berlin Chemie Veb
Priority date: 1986-04-03
Filing date: 1986-04-03
Publication date: 1990-08-01

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von C-Peptid-haltiger Substanz aus Loesungsmittel enthaltendem Pankreasextrakt, wobei der loesungsmittelhaltige Pankreasextrakt an einem Kationenaustauscher vom Insulin befreit und der das gesamte C-Peptid enthaltende Durchbruch an einem zweiten Kationenaustauscher fraktioniert wird. Das erhaltene Produkt weist ein C-Peptid/Insulin-Verhaeltnis von 10:1 auf.{C-Peptid; Insulin; Pankreas; Ionenaustausch; Loesungsmittel; Konzentration; Kationenaustausch; p H-Wert; Elution; Alkohole}The invention relates to a method for isolating C-peptide-containing substance from solvent-containing pancreatic extract, wherein the solvent-containing pancreatic extract is freed from insulin on a cation exchanger and the breakthrough containing the entire C-peptide is fractionated on a second cation exchanger. The product obtained has a C-peptide / insulin ratio of 10: 1. {C-peptide; Insulin; Pancreas; Ion exchange; Solvent; Concentration; Cation exchange; PH value; elution; alcohols}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer an C-Peptid angereicherten Substanz als Nebenprodukt der Insulingewinnung. Als C-Peptid wird in der Fachliteratur das Peptid bezeichnet, das in der biogenetischen Vorstufe des Insulins, dem Proinsulin, die A- und die B-Kette des daraus regenerierbaren Insulins über je 2 basische Aminosäuren mit der Position Λ1 und B30 des Insiilinmoleküls verbindet. In Abhängigkeit von der Tierspezies unterscheiden sich diese C-Peptide stark voneinander, behalten aber einige grundsätzliche Übereinstimmungen bei diesen Substanzen wie eine Kettenlänge kleiner als 31 Aminosäuren, das Fehlen von aromatischen Resten und schwefelhaltigen Aminosäuren und den ausgeprägt sauren Charakter des Peptides. Das C-Peptid ist Ausgangsmaterial für in der Medizin und Analytik des Insulins benötigte Testmethoden.The invention relates to a method for obtaining a C-peptide-enriched substance as a by-product of insulin production. The C-peptide is referred to in the literature as the peptide which connects in the biogenetic precursor of insulin, the proinsulin, the A and the B chain of the insulin regenerable therefrom via two basic amino acids each with the position Λ1 and B30 of the insiline molecule. Depending on the animal species, these C peptides differ greatly from each other, but retain some basic similarities in these substances, such as a chain length less than 31 amino acids, the absence of aromatic residues and sulfur-containing amino acids, and the highly acidic character of the peptide. The C-peptide is the starting material for test methods required in medicine and analytics of insulin.

Characteristic of the known state of the art

In der Fachliteratur sind mehrere Verfahren zur Gewinnung von C-Peptid beschrieben. Diese beruhen entweder auf der gezielten Isolierung des C-Peptides oder seiner chemischen Synthese. Dabei ist für viele Fälle die Bereitstellung einer C-Peptid-haltigen Fraktion ausreichend, wie sie zum Beispiel für die Immunisierung von Versuchstieren zur Gewinnung von Antiseren benötigt wird. Auch die kommerziell erhältlichen synthetischen Produkte stellen in diesem Sinne für den Einsatzzweck ausreichende C-Peptid-haltige Substanzen dar, obwohl sie, bedingt durch den komplizierten Syntheseweg, bis zu 98% aus C-Peptid-fremden Substanzen bestehen können.In the literature several methods for the recovery of C-peptide are described. These are based either on the targeted isolation of the C-peptide or its chemical synthesis. It is sufficient in many cases, the provision of a C-peptide-containing fraction, as required, for example, for the immunization of experimental animals for the recovery of antisera. The commercially available synthetic products are in this sense for the intended use sufficient C-peptide-containing substances, although they may consist of up to 98% of C-peptide-foreign substances due to the complicated synthesis route.

Erfahrungsgemäß ist eine solche Reinheit ausreichend, um die für die Testmethoden erforderlichen Reaktionen in übersichtlicher Folge zu gewährleisten.Experience has shown that such a purity is sufficient to ensure the required reactions for the test methods in a clear sequence.

In mehreren Publikationen ist die Isolierung von relativ reinem C-Peptid aus C-Peptid-haltigen Fraktionen beschrieben. Dabei bestehen die aufwendigsten Operationen in der Gewinnung solchen C-Peptid-haltigen Ausgangsmaterials.Several publications describe the isolation of relatively pure C-peptide from C-peptide-containing fractions. Here are the most complex operations in the recovery of such C-peptide-containing starting material.

Diese Aufgabe wird bei den bekannten Methoden entweder durch die Gelfiltration oder die fraktionierte Aussalzung in wäßrigen Systemen gelöst. Obwohl zur Insulingewinnung als auch zur Gewinnung des C-Peptides aus Pankreas ausschließlich Lösungsmittel-Extraktionen eingesetzt werden, haben die bekannten Methoden den Nachteil der Lösungsmittel-Abtrennung in früheren Stufen des Aufarbeitungsprozesses.This object is achieved in the known methods either by the gel filtration or the fractional salting out in aqueous systems. Although only solvent extractions are used to recover insulin as well as to obtain the C-peptide from pancreas, the known methods have the disadvantage of solvent separation in earlier stages of the work-up process.

Obwohl in der Arbeit von Markussen u.a. (Hormone and Metablic Research 3,1972, S.229-232) Ansätze zur Verknüpfung mit einem technischen Insulingewinnungsverfahren vorhanden sind, werden bei modernen Insulingewinnungsverfahren Ionenaustauscher eingesetzt (zum Beispiel DT-1492229, SU-389793, SU-332832), die auf diese Methode nicht adaptiert sind.Although in the work of Markussen et al. (Hormones and Metablic Research 3.1972, p.229-232), approaches to linking to a commercial insulin-producing process are used in modern insulin-recovery methods ion exchangers (for example, DT-1492229, SU-389793, SU-332832), which are based on this Method are not adapted.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, das die Abirennung des C-Peptides im Nebenstrom des Insulingewinnungsverfahrens und die Gewinnung einer C-Peptid-haltigen Fraktion ermöglicht.The aim of the invention is to provide a method which allows the separation of the C-peptide in the sidestream insulin recovery process and the recovery of a C-peptide-containing fraction.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, beim Verfahren zur Gewinnung von insulin mittels Ionenaustausch gleichzeitig die Gewinnung einer C-Peptidfraktion zu ermöglichen.The invention is based on the object at the same time to allow the recovery of a C-peptide fraction in the process for obtaining insulin by means of ion exchange.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst, indem der das C-Peptid enthaltende Säulendurchbruch des am Kationenaustauscher gereinigten Pankreasextraktes nach der Abtrennung des sauren Mediums an einem schwach sauren Kationenaustauscher bei pH-Werten von 1,5 bis 2,9 adsorbiert wird.This object is achieved according to the invention by adsorbing the column breakthrough of the p-peptide extract purified on the cation exchanger after the removal of the acidic medium from a weakly acidic cation exchanger at pH values of 1.5 to 2.9.

Von der Säule wird das C-Peptiri durch fraktionierte Elution, die durch eine Veränderung der Lösungsmittelkonzentration im pH-Bereich von 1,5 bis 2,9 erreicht wird, entfernt.From the column, the C-Peptiri is removed by fractional elution, which is achieved by changing the solvent concentration in the pH range of 1.5 to 2.9.

Geeignete Lösungsmittel sind niedere aliphatische Alkohole, wie z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, weiterhin Ketone, v.ie ζ. B. Aceton, und mit Wasser teilweise mischbare Ester, wie z.B. Essigsäuremethylestnr, oder Mischungen hiervon.Suitable solvents are lower aliphatic alcohols, such as. As methanol, ethanol, n-propanol, i-propanol, ketones, v.ie ζ. Acetone, and partially water-miscible esters, e.g. Essigsäuremethylestnr, or mixtures thereof.

Zur pH-Wert-Einstellung sind z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Salzsäure, Phosphorsäure und Schwefelsäure geeignet.For pH adjustment, e.g. Formic acid, acetic acid, propionic acid, citric acid, tartaric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid.

Durch die Elution lassen sich eventuell noch verbliebene Insulinreste vom C-Peptid abtrennen, so daß in der C-Peptid-haltigen Fraktion ein C-Peptid/Insulin-Verhältnis von > 10:1 vorhanden ist.The elution allows any remaining insulin residues to be separated from the C-peptide, so that a C-peptide / insulin ratio of> 10: 1 is present in the C-peptide-containing fraction.

Dieso C-Peptid-Fraktion kann direkt oder nach entsprechender Aufarbeitung eingesetzt werden.This C-peptide fraction can be used directly or after appropriate workup.

Ausführungsbeispieleembodiments

Bolsplel 1Bolsplel 1

7,67 kg Humanpankreas wurden 15 Stunden post mortem tiefgefroren und lieferten nach bekannten Verfahren 30,821 Extrakt mit einem C-Peptidgehalt 0,2μς/ΓηΙ (6,5mg im Ansatz) und einem Insulingehalt von 20pg/ml. Nach Reinigung des Extraktes erfolgt die Aufgabe auf ewine mit Wofatit CA 20 gefüllte Säule (V = 750 ml Ionenaustauscher) mit einer Auftragsgeschwindigkeit von 1500ml/Std. Nachdem Nachwaschen erhält man 30,51 C-Peptid-haltigen Extrakt mit einem C-PeptidgeheltvonO^g/mlbei einem Insulingehalt von 0,4pg/ml. Das Insulin kann nach bekannten Verfahren eluiert und isoliert werden.7.67 kg of human pancreas were frozen 15 hours post-mortem and yielded by known methods 30.821 extract with a C-peptide content of 0.2μς / ηηΙ (6.5 mg in the batch) and an insulin content of 20pg / ml. After purification of the extract, the task is carried out on ewine filled with Wofatit CA 20 column (V = 750 ml of ion exchanger) at a rate of 1500ml / hr. After washing, 30.51 C-peptide containing extract is obtained with a C-peptide content of 0 ^ g / ml at an insulin content of 0.4pg / ml. The insulin can be eluted and isolated by known methods.

Der Säulendurchbruch wird vom Lösungsmittel und Fett befreit. Es wurden 561 Lösung mit HCI auf pH 2,2 eingestellt und am carboxylierten Kationenaustauscher adsorbiert (V = 750ml). Mit 0,1 N Essigsäure/60% Ethanol erfolgt die Elution. Die Fraktionen zwischen 500 und 1100ml werden vereinigt. V = 600ml, c_c = 10pg/ml, Ausbeute = 90% des gesamten C-Peptides.The column breakthrough is freed of solvent and grease. 561 solution was adjusted to pH 2.2 with HCl and adsorbed on the carboxylated cation exchanger (V = 750 ml). With 0.1 N acetic acid / 60% ethanol, the elution takes place. The fractions between 500 and 1100ml are combined. V = 600ml, _c = 10 pg / ml; yield = 90% of the entire C-peptide.

Durch Einengen und Lyophilisieren wird eine Substanz mit einem Gehalt von 6mg C-Peptid und einem Insulingehalt < 0,01 mg erhalten.Concentration and lyophilization yield a substance with a content of 6 mg C-peptide and an insulin content <0.01 mg.

Example 2

1200I Pankreasextrakt mit einem Gehalt von 43pg/ml Insulin und 6ug/ml C-Peptid werden bei 4O⁰C am Kationenaustauscher adsorbiert. Der Säulenduichbruch enthält das gesamte C-Peptid und woniger als 2 pg/ml Insulin.1200I pancreatic extract containing 43pg / ml insulin and 6ug / ml C-peptide are adsorbed at 4O ⁰ C on the cation exchanger. The column crevice contains all of the C-peptide and more than 2 pg / ml of insulin.

Das alkoholische Lösungsmittel wird im Vakuumdünnsohichtverdampfer bei einem pH-Wert von 4,5 abgetrennt. Nach Absitzenlassen wird die wäßrige Phase vom Fett getiennt und bei pH 1,7 am Austauscher adsorbiert.The alcoholic solvent is separated in a vacuum thin-film evaporator at a pH of 4.5. After settling, the aqueous phase is greased and adsorbed at pH 1.7 on the exchanger.

Mit einer Gradientenelution von 0-33Vol.-% Aceton, 1OM HCI, wird eluiert. Die C-Peptid-haltige Fraktion erscheint bei einer Acetonkonzentration von 10%. Nach Abtrennung des Acetons wird mitTrichloressigsäure gefällt und weiter nach bekannten Methoden aufgearbeitet.With a gradient elution of 0-33Vol .-% acetone, 1OM HCl, is eluted. The C-peptide-containing fraction appears at an acetone concentration of 10%. After separation of the acetone is precipitated with trichloroacetic acid and further worked up by known methods.

Man erhält 2,3g gereinigtes C-Peptid.This gives 2.3 g of purified C-peptide.

Claims

1. A process for obtaining an insulin-free C-peptide-containing substance in the secondary stream of Insulinewinnung from solvent-containing pancreatic extracts by using weakly acidic cation exchangers in the presence of water-miscible organic solvents, characterized in that a fractionation by varying the solvent concentration in the pH range of 1, 5 to 2.9 at elution.

2. The method according to claim 1, characterized in that are used as the solvent aliphatic alcohols, aliphatic ketones, hemiacetals and esters of aliphatic carboxylic acids and aliphatic alcohols or mixtures thereof.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the solvent concentration is between 3 and 70 vol .-%.