DD279506A1

DD279506A1 - DEVICE AND METHOD FOR SEQUENCE ANALYSIS OF DNA BY CHEMICAL DEGRADATION ON A SOLID PHASE

Info

Publication number: DD279506A1
Application number: DD32514089A
Authority: DD
Inventors: Andre Rosenthal; Heide-Renate Billwitz; Horst Kagelmaker; Monika Graetschus; Eckart Erzgraeber; Gerhard Behrendt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-01-19
Filing date: 1989-01-19
Publication date: 1990-06-06

Abstract

Die erfindungsgemaesse Vorrichtung zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase besteht aus Probenhaltern, Traegern fuer Reaktionsgefaesse und ggf. einer Stanze. Der zentrale Teil der Einrichtung ist der Probenhalter - eine quader- oder wuerfelfoermige Grundplatte mit duennen Stiften, auf die ggf. mit dem Stanzer durch Stechen oder durch Klemmen, Kleben und Passen vor dem Verfahrensablauf jeweils kleine geformte Traegersegmente angebracht werden. Die Stifte des Probenhalters koennen auch mit ungeformtem organischen Traegermaterial beschichtet werden. Zur Durchfuehrung der wesentlichen Operationen des Verfahrens zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase wie Immobilisierung, Waschen, DNA-Modifikation, Waschen und Piperidin-Reaktion sowie chemische Elution taucht man die Probenhalter in die jeweiligen Loesungen (markierte DNA-Fragmente, Waschloesungen, DNA-Modifikationsreagenzien, Piperidinloesungen) ein und belaesst sie dort fuer die jeweilig notwendige Zeit. Durch die Verwendung separierter Traegersegmente an den Probenhaltern werden alle Sortierungs- und Pipettierungsschritte sowie andere manuelle Operationen ueberfluessig. Dadurch wird eine einfache manuelle und automatisierte Durchfuehrung des Verfahrens moeglich. Die Erfindung wird in der Molekularbiologie, molekularen Genetik und Gentechnik verwendet.The device according to the invention for the sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase consists of sample holders, carriers for reaction vessels and possibly a punch. The central part of the device is the sample holder - a rectangular or cuboidal base plate with thin pins on which, if necessary, small shaped carrier segments are attached to the punch by piercing or by clamping, gluing and fitting before the procedure. The pins of the sample holder can also be coated with unshaped organic carrier material. To carry out the essential operations of the method for sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase such as immobilization, washing, DNA modification, washing and piperidine reaction and chemical elution immersing the sample holder in the respective solutions (labeled DNA fragments, washing solutions, DNA modification reagents, piperidine solutions) and load them there for the respective time required. By using separate carrier segments on the sample holders, all sorting and pipetting steps as well as other manual operations become redundant. This makes a simple manual and automated implementation of the method possible. The invention is used in molecular biology, molecular genetics and genetic engineering.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase, Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Molekularbiologie, Gentechnik, molekulare Genetik und betrifft dort die Sequenzanalyse von DNA sowie Oligodesoxyribonucleotiden nach chemischer Synthese durch chemische Degradation an fester Phase.The invention relates to a device for sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase, the field of application of the invention is molecular biology, genetic engineering, molecular genetics and there relates to the sequence analysis of DNA and oligodeoxyribonucleotides after chemical synthesis by chemical degradation on solid phase.

Characteristics of the known prior art

Ein von ROSENTHAL und HUNGER entwickeltes Festphasensequenzierungsverfahren zur chemischen Degradation von DNA an einem geeigneten Flächenträger umfaßt 7 Operationen:A solid phase sequencing method developed by ROSENTHAL and HUNGER for the chemical degradation of DNA on a suitable surface support comprises 7 operations:

1. Immobilisierung der Nucleinsäuren1. Immobilization of the nucleic acids

2. Waschen des Trägers2. Washing the carrier

3. Modifikationsreaktion3rd modification reaction

4. Waschen des Trägers4. Washing the carrier

5. Sortieren der Trägersegmente5. Sort the carrier segments

6. Piperidin-Reaktion, chemische Elution der Nucleinsäuren vom Träger und Abtrennen der Eluate6. piperidine reaction, chemical elution of the nucleic acids from the carrier and separation of the eluates

7. Lyophilisierung der Eluate7. Lyophilization of the eluates

und erlaubt, bei manuellem Betrieb 10 verschiedene DNA-Fragmente in etwa 3h basenspezifisch abzubauen (A. Rosenthal und H.-D. Hunger, DD-WP 228906; A. Rosenthal et al. Nucleic Acids Res. 13 [1985| 1173-1184, A. Rosenthal et al.. Methods in Enzymol.and allows to base-degrade 10 different DNA fragments in about 3 hours during manual operation (A. Rosenthal and H.-D. Hunger, DD-WP 228906, A. Rosenthal et al., Nucleic Acids Res., 13 [1985] 1173-1184 , A. Rosenthal et al. Methods in Enzymol.

155(1987)301-331).155 (1987) 301-331).

Um mehr als 10 DNA-Fragmente durchzusetzen, muß man erheblich mehr Zeit für die Immobilisierung (Operation Hund Sortierung der Fragmente (Operation 5) aufwenden. Auch die Entfernung des Trägers aus der Piperidinlösung im Anschluß an die chemische Elution (Operation 7) nimmt bei größeren Probenzahlen mehr Zeit in Anspruch.In order to enforce more than 10 DNA fragments, much more time must be spent on immobilization (Operation Dog Sorting of Fragments (Operation 5).) Removal of the carrier from the piperidine solution following chemical elution (Operation 7) also increases with larger ones Sample numbers take more time.

Der routinemäßige Durchsatz von 10 bis etwa 100 Proben bei Einhaltung einer Zykluszeit von 2 bis 3 Stunden ist nur durch die Verwendung einer Vorrichtung zur mechanisierten manuellen Durchführung aller Operationen des Festphasensequenzierungsverfahren möglich. Eine solche Vorrichtung wurde durch ROSENTHAL et al. kürzlich beschrieben (A.Ros. nthal, H.-D.Hu.nger, H.Kagelmaker, M.Gätschus DD-WP 237329; A.Rosenthal et al., Methods in Enzymol. 155 (1987)The routine throughput of 10 to about 100 samples while maintaining a cycle time of 2 to 3 hours is only possible through the use of a device for mechanized manual execution of all operations of the solid phase sequencing method. Such a device has been described by ROSENTHAL et al. recently described (A.Ros.nthal, H.-D.Hu.nger, H.Kagelmaker, M.Gatschus DD-WP 237329, A. Rosenthal et al., Methods in Enzymol., 155 (1987).

Die Schritte der Immobilisierung der Nucleinsäuren (Operation 1) und des Sortierens der Trägersegmente vor der Durchführung der Piperidinreaktion durch Stanzen (Operation 5) mit der bekannten Vorrichtung verlangen das exakte, geometrisch genaue Einlegen von geeigneten Flächenträgern in spezielle Halterungen bzw. in eine Stanze, die gegenwärtig manuell ausgeführt werden müssen. In Hinblick auf einen automatischen Setrieb der Vorrichtung mit Hilfe eines kommerziellen Industrie- oder Laborroboters müssen diese Schritte jedoch eliminiert werden, da sie automatisch nicht oder nur mit einem ökonomisch nicht vertretbaren Aufwand realisiert werden können. Auch das Trennen der Eluate von den Trägersegmenten in Operation 6 erfordert zusätzliche Pipettierungsschritte und Reaktionsgefäße, auf die beim potentiellen automatischen Betrieb möglichst verzichtet werden sollte. Des weiteren ist für die Durchführung des Schritts der Immobilisierung die Verwendung eines Probendosierers für das gleichzeitige Beimpfen von Trägern mit vielen verschiedenen Proben erforderlich. Der Probendosierer, als Multikanalpipette realisiert, stellt ein relativ teures Einzelgerät in der Gesamtvorrichtung dar.The steps of immobilizing the nucleic acids (operation 1) and sorting the carrier segments prior to performing the piperidine reaction by punching (operation 5) with the known device require the exact, geometrically accurate insertion of suitable surface carriers in special holders or in a punch, the currently have to be done manually. With regard to an automatic Setrieb the device using a commercial industrial or laboratory robot, however, these steps must be eliminated because they can not be realized automatically or only with an economically unreasonable effort. Also, the separation of the eluates from the carrier segments in operation 6 requires additional pipetting steps and reaction vessels that should be avoided as much as possible during the potential automatic operation. Furthermore, to carry out the immobilization step, it is necessary to use a sample dosing device for simultaneously inoculating carriers with many different samples. The sample dispenser, realized as a multichannel pipette, represents a relatively expensive single device in the overall device.

Insgesamt ist die bekannte Vorrichtung in Hinblick auf eine automatische Durchführung des Festphasensequenzierungsverfahrens mit Hilfe kommerzieller Industrie- oder Laborroboter technologisch ungünstig. Auch die manuelle Durchführung des Verfahrens mit Hilfe der bekannten Vorrichtung erfordert noch zu viele kompliziurte Operationen.Overall, the known device is technologically unfavorable with regard to automatic implementation of the solid-phase sequencing method using commercial industrial or laboratory robots. Even the manual implementation of the method using the known device still requires too many kompliziurte operations.

Ziel der ErfinduiujAim of the invention

Ziel der Erfindung ist es, den verfahrenstechnischen bzw. technologischen Ablauf des Verfahrens zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase durch eine Vorrichtung so zu verändern und zu vereinfachen, daß mit Hilfe der Vorrichtung die manuelle Durchführung des Festphasenabbaus bzw. in Kombination mit einem kommerzieli erhältlichen Industrie- oder Laborroboter die automatische Durchführung des Verfahrens leicht und ökonomisch möglich wird und eine große Anzahl von 'erschiedenen DNA-Fragmenten verwechslungsfrei sequenziert werden kann.The aim of the invention is to change the procedural or technological process of the method for sequence analysis of DNA by chemical degradation of solid phase by a device so and simplify that with the aid of the device, the manual implementation of solid phase degradation or in combination with a kommerzieli available industrial or laboratory robots, the automatic implementation of the method is easily and economically possible and a large number of 'different DNA fragments can be sequenced without confusion.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zu entwickeln, mit deren Hilfe eine gleichzeitige Immobilisierung einer großen Anzahl von DNA-Fragmenten möglich ist und eine spezifische Folge von zwei physikalischen Operationen (Waschschritten) und zwei chemischen Weiterbehandlungen (DNA-Modifikation, Piperidin-Reaktion und chemische Elution) sowie am Endo der Prozedur eine Nachbehandlung der eluierten Proben durch Vakuumzentrifugation durchgeführt werden kann.The invention has for its object to develop a device by means of which a simultaneous immobilization of a large number of DNA fragments is possible and a specific sequence of two physical operations (washing steps) and two further chemical treatments (DNA modification, piperidine reaction and chemical elution) and, at the end of the procedure, post-treatment of the eluted samples by vacuum centrifugation.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt mit einer Vorrichtung, die erfindungsgemäß Probenhalter, Träger für Reaktionsgefäße und ggf. einen Stanzer aufweist.The object is achieved with a device which according to the invention has sample holders, carriers for reaction vessels and optionally a punch.

Die Probenhalter stellen den zentralen Teil der Erfindung dar. Sie bestehan aus ^;eweils einer quader- oder würfelförmigen Grundplatte, in die entsprechend der Anzahl η der zu sequenzierenden Proben jeweils η Stahl- oder Plastestifte eingelassen sind. Der Abstand der Stifte wird entsprechend dem Muster der Reaktionsgefäße gewählt, die in die Träger eingelassen oder eingearbeitet sind. Die Stifte der Probenhalter sind so lang, daß sie bequem in die Reaktionsgefäße passen. Die Stifte der Probenhalter sind mechanisch so gearbeitet, daß sie leicht diskrete, geformte Trägersegmente aufnehmen können, die für die Immobilisierung der DNA-Proben dienen. Die Trägersegmente werden an den Stiften der Probenhalter durch z. B. Stechen, Klemmen, Stecken oder Passen befestigt. Die Beladung der Stifte der Probenhalter kann auch durch Beschichtung mit einemThe sample holders are the central part of the invention. They consist of ^; eweils a cuboid or cube-shaped base plate, in each of which η steel or plastic pencils are embedded according to the number η of the samples to be sequenced. The distance of the pins is chosen according to the pattern of the reaction vessels, which are embedded or incorporated in the carrier. The pins of the sample holders are so long that they fit comfortably in the reaction vessels. The pins of the sample holders are mechanically designed to easily accommodate discrete, shaped carrier segments which serve to immobilize the DNA samples. The carrier segments are attached to the pins of the sample holder by z. B. stinging, clamping, plugging or fitting attached. The loading of the pins of the sample holder can also be done by coating with a

geeigneten organischen Trägermaterial erfolgen, wobei die Probenhalterstifte in eine entsprechende Suspension, Dispersion oder Lösung ungeformter organischer Polymere bzw. ihrer monomeren Komponenten ggf. mit Lösungsmittelzusätzen eingetaucht, ggf. eine Reaktion durchgeführt und danach getrocknet werden. Eine Orientierung an der Grundplatte gibt die Orientierung des Probenhalters in bezug auf die Träger für die Reaktionsgefäße an und bewirkt, daß Vertauschungen von Proben ausgeschlossen werden.carried out suitable organic support material, wherein the sample holder pins immersed in a corresponding suspension, dispersion or solution of unshaped organic polymers or their monomeric components, if necessary, with solvent additives, optionally carried out a reaction and then dried. An orientation on the base plate indicates the orientation of the sample holder with respect to the carriers for the reaction vessels and causes swapping of samples to be excluded.

Die Beladung der Stifte der Probenhalter mit den Trägersegmenten kann mit veiscniedenen Mitteln vorgenommen werden, erfolgt aber grundsätzlich vor Beginn der chemischen Degradation an fester Phase. Im Falle einer Stechverbindung wird dazu erfindungsgsmäß eine Stanze verwendet. Sie besteht aus einer Platte mit eingesetzten Stanzstiften, einer Schnittplatte und einem Flächenträgerhalter und zoichnet sich dadurch aus, daß die Stanzstifte ein gleiches Verteilungsmuster wie die Stifte der Probenhalter, aber einen größeren Durchmesser aufweisen. Außerdem sind in die Stanzstifte Hohlräume eingearbeitet, in die die Probenhalterstifte aufgrund ihres nur geringfügig kleineren Durchmessers genau passen. Nach Einlegen eines geeigneten geformten Trägermaterial, z. B. eines Flächenträgers, in den Flächenträgerhalter der Stanze und Einpassen der Stifte eines Probenhalters in die Stanzstifte werden durch Stanzen Trägersegmente auf die Stifte des Probenhalters überführt. Die Träger für Reaktionsgefäße bestehen aus einem quader- oder würfelförmigen Körper, in den Reaktionsgefäße aus geeignetem Glas- oder Plastematerial eingelassen oder eingearbeitet sind. Als Reaktionsgefäße verwendet man standardisierte oder speziell tief gezogene Mikrotiterplatten sowie einzelne Gefäße mit einem Volumen zwischen 5 und 2 000 μΙ, die in die Träger eingearbeitet bzw. eingelassen werden. Einzelgefäße werden mit Hilfe eines gemeinsamen Rahmens manipuliert. Alle Reaktionsgefäße - Mikrotiterplatten oder einzelne Gefäße mit Rahmen - müssen leicht auswechselbar sein. Der Träger weist außerdem eine Markierung auf, um eindeutig mit dem Probenhalter kombiniert werden zu können. Während ein Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen zur Bevorratung der markierten DNA-Fragmente dient, braucht man die anderen Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen zur Durchführung der Piperidin-Reaktion und der gleichzeitig ablaufenden chemischen Elution. Dazu wird der Probenhalter mit den an den Trägersegmenten fixierten DNA-Proben in die Reaktionsgefäße des Trägers eingeführt. Man führt die Strangbruchreaktion und gleichzeitig die chemische Elution aus, nachdem man die entsprechende Piperidinlösung hinzugefügt und die Lösung auf 90⁰C erhitzt hat. Die Reaktionsgefäße können dabei ggf. mit entsprechenden Deckeln und Dichtungen verschlossen werden. Die Piperidinreaktion kann aber auch mit unverschlossenen Trägern durchgeführt werden.The loading of the pins of the sample holder with the carrier segments can be carried out by various means, but in principle takes place before the beginning of the chemical degradation on solid phase. In the case of a lancing a punch is erfindungsgsmäß used. It consists of a plate with inserted punching pins, a cutting plate and a surface carrier and zoichnet characterized by the fact that the punching pins have a same distribution pattern as the pins of the sample holder, but a larger diameter. In addition, cavities are incorporated in the punching pins, in which the sample holder pins fit exactly because of their only slightly smaller diameter. After inserting a suitable shaped carrier material, for. As a surface support, in the surface support holder of the punch and fitting the pins of a sample holder in the punching pins are transferred by punching carrier segments on the pins of the sample holder. The carriers for reaction vessels consist of a cuboid or cube-shaped body in which reaction vessels made of suitable glass or plastic material are embedded or incorporated. The reaction vessels used are standardized or specially deep-drawn microtiter plates and individual vessels with a volume of between 5 and 2,000 μΙ, which are incorporated or embedded in the carriers. Individual vessels are manipulated using a common framework. All reaction vessels - microtiter plates or individual vessels with frames - must be easily interchangeable. The carrier also has a marker to be clearly combined with the sample holder. While a carrier with the corresponding reaction vessels for storing the labeled DNA fragments, you need the other carrier with the appropriate reaction vessels for carrying out the piperidine reaction and the simultaneous chemical elution. For this purpose, the sample holder is introduced into the reaction vessels of the carrier with the DNA samples fixed to the carrier segments. Perform the strand break reaction and simultaneously chemical elution after adding the appropriate piperidine solution and heating the solution to 90 ^° C. If necessary, the reaction vessels can be closed with appropriate lids and gaskets. The piperidine reaction can also be carried out with unsealed carriers.

Das Verfahren zur Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase erfolgt mit einer Vorrichtung, zu deren Grundausstattung zweckmäßigerweise vier Probenhalter, fünf Träger mit den entsprechenden Reaktionsgefäßen und wahlweise Deckel mit entsprechenden Abdichtungen sowie ggf. eine Stanze gehören. Alle wesentlichen Operationen werden mit den Probenhaltern ausgeführt. Die zu sequenzierenden DNA-Proben werden an die Trägersegmente der Probenhalterstifte gebunden und als Immobilisate durch Tauchen in die entsprechenden Reagenzien und Lösungen durch alle Operationsschritte des Festphasenverfahrens geführt. Im Anschluß »n die Piperidinreaktion und chemische Elution werden die Trägersegmente durch Entfernen der Probenhalter mit ihren Stiften aus den Reaktionsgefäßen der Träger schnell und problemlos von den P'peridineluaten separiert, die die abgebauten DNA-Proben enthalten. Anschließend werden die Eluate durch Vakuumzentrifugation eingeengt.The method for sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase is carried out with a device whose basic equipment expediently four sample holder, five carriers with the corresponding reaction vessels and optionally cover with appropriate seals and possibly a punch belong. All essential operations are performed with the sample holders. The DNA samples to be sequenced are bound to the carrier segments of the sample holder pins and passed as Immobilisate by immersion in the appropriate reagents and solutions through all operational steps of the solid phase process. Following the piperidine reaction and chemical elution, the carrier segments are quickly and easily separated from the péperidineluates containing the degraded DNA samples by removing the sample holders with their pins from the reaction tubes of the carriers. Subsequently, the eluates are concentrated by vacuum centrifugation.

Durch die erfindungsgemäße Vorrichtung sind im neuen Operationszyklus keine Operationen wie das Sortieren von Flächenträgersegmenten, das Einlegen von Flächenträgern in spezielle Halterungen zum Zwecke der Durchführung von Immobilisierungs- und Stanzoperationen, Pipettierungsschritte zur Immobilisierung sowie manuelle Operationen zum Separieren der Eluate von den Trägersegmenten im Anschluß an Piperidinreaktion und chemische Elution mehr enthalten. In Kombination mit einem kommerziell erhältlichen Industrie- oder Laborrobotor kann das Verfahren leicht und ökonomisch vorteilhaft automatisiert werden, da alle Operationen mit don an den Probenhaltern fixierten DNA-Proben in geordneter Weise durch einfache Tauchoperationen in entsprechende flüssige Medien realisiert werden.The device according to the invention in the new cycle of operation no operations such as the sorting of surface support segments, the insertion of surface carriers in special holders for the purpose of performing immobilization and punching operations, immobilization pipetting steps and manual operations for separating the eluates from the carrier segments following piperidine reaction and chemical elution more. In combination with a commercially available industrial or laboratory robot, the method can be automated easily and economically advantageously, since all operations with DNA samples fixed to the sample holders are realized in an orderly manner by simple dipping operations into corresponding liquid media.

Ausführungsbeispie!Ausführungsbeispie!

Die Erfindung wird an einem Ausführungsbeispiel und an Hand von Zeichnungen noch näher erläutert.The invention will be explained in more detail using an exemplary embodiment and with reference to drawings.

Fig. 1: halbgeschnittener Probenhalter und Träger mit tiefgezogenen Reaktionsgefäßen während der ProbennahmeFig. 1: half-cut sample holder and carrier with thermoformed reaction vessels during sampling

(Immobilisierung) Fig. 2: halbgeschnittene Stanze mit Probenhalter beim Aufbringen der Trägersegmente auf die Probenhalterstifte vor(Immobilization) Fig. 2: half-cut punch with sample holder during application of the carrier segments on the sample holder pins

Durchführung des Verfahrens Fig. 3: Ablaufschema der Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester PhaseImplementation of the method Fig. 3: Flow chart of the sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase

Die Grundausstattung der Vorrichtung besteht aus vier Probenhaltern 1, fünf Trägern für Reaktionsgefäße 2 und ggf. ei. Stanze 10. Der Probenhalter 1 besteht aus einer quaderförmigen Grundplatte, in die entsprechend der Anzahl η zu sequenzierender DNA-Proben η Stifte 1.1 eingelassen sind, die aus Stahl, Plaste oder anderen Materialien bestehen können. Die Stifte 1.1 müssen exakt gleiche Länge aufweisen. Der Abstand der Stifte 1.1 wird entsprechend dem Gefäßmuster standardisierter oder speziell tiefgezogener Mikrotiterplatten oder einzelner Gefäße gewählt, die als Reaktionsgefäße 2.1 in die quaderförmigen Körper eingelassen oder eingearbeitet sind, die als Träger für die Reaktionsgefäße 2 dienen. Die Reaktionsgefäße, z. B. tiefgezogene Mikrotiterplatten, müssen leicht auswechselbar sein. Die Länge der Stifte 1.1 des Probenhalters 1 wird so gewählt, daß die Probenhalterstifte 1.1 exakt in die Reaktionsgefäße 2.1 des Trägers 2 passen, und daß die an den Stiften 1.1 fixierten Trägersegmente 3 1 durch ein minimales Volumen an Reaktionslösung bedeckt werden können. Die Stanze 10 besteht aus einer Grundplatte mit η eingelassenen Stanzstifien 3.1, einer Schnittplatte 3.3 und einem Flächenträgerhalter. Die Stanzstifte 10.1 haben einen größerei, Durchmesser als die Stifte 1.1 des Probenhalters 1, weisen aber das gleiche räumliche Verteilungsmuster wie diese auf. Am Ende besitzen die Stanzstifte 10.1 einen Hohlraum 10.2, der einen etwas größeren Durchmesser, absr nur einen Bruchteil der Länge wie die Stifte 1.1 des Probenhalters 1 aufweist. Vor der Durchführung der Sequenzanalyse von DNA durch chemische Degradation an fester Phase wird der Probenhalter 1 mit der Stanze 10 so kombiniert, daß die Stifte 1.1 des Probenhalters 1 genau in den Hohlraum 10.2 der Stanzstifte 10.1 passen. NachThe basic equipment of the device consists of four sample holders 1, five carriers for reaction tubes 2 and possibly egg. Punch 10. The sample holder 1 consists of a cuboidal base plate into which η pens 1.1 are embedded in accordance with the number η to be sequenced DNA samples, which may consist of steel, plastic or other materials. The pins 1.1 must have exactly the same length. The spacing of the pins 1.1 is selected according to the vascular pattern of standardized or specially deep-drawn microtiter plates or individual vessels, which are embedded or incorporated as reaction vessels 2.1 in the rectangular body, which serve as a carrier for the reaction vessel 2. The reaction vessels, for. B. deep-drawn microtiter plates must be easily replaceable. The length of the pins 1.1 of the sample holder 1 is selected so that the sample holder pins 1.1 fit exactly into the reaction vessels 2.1 of the carrier 2, and that the fixed to the pins 1.1 support segments 3 1 can be covered by a minimum volume of reaction solution. The punch 10 consists of a base plate with η sunken Stanzstifien 3.1, a cutting plate 3.3 and a surface carrier. The punching pins 10.1 have a larger diameter than the pins 1.1 of the sample holder 1, but have the same spatial distribution pattern as these. In the end, the punches 10.1 have a cavity 10.2, which has a slightly larger diameter, absr only a fraction of the length as the pins 1.1 of the sample holder 1. Before performing the sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase, the sample holder 1 is combined with the punch 10 so that the pins 1.1 of the sample holder 1 fit exactly into the cavity 10.2 of the punching pins 10.1. To

Einlegen des Flächenträgers 3 in den Flächenträgerhalter der Stanze 10 werden durch Stanzen des Flächenträgers, z. B. CCS-Papier 3, die Stifte 1.1 eines Probenhalters 1 mit η Flächenträgersegmenten3.1 versehen, das a's Trägermaterial für die nachfolgende Immobilisierung der DNA-Fragmente verwendet wird. Alle vier Probenhaiter 1 werden auf diese Weise mit Trägersegmenten beschickt (Fig. 2). Zur Immobilisierung der markierten DNA-Fragmente an die Trägersegmente 3.1 der Probenhalterstifte 1.1 werden diese mit den markierten Lösungen 4 der verschiedenen DNA-Fragmente befeuchtet, die in den Reaktionsgefäßen 2.1 einer Mikrotiterplatte bevorratet sind. Dazu taucht man die Stifte 1.1 eines jeden Probenhalters 1 (je ein Frobenhalter für eine der vier notwendigen Modifikationsreaktionen G, A + G, T > Pu und C) in die markierten Lösungen 4 ein. Die DNA-Modifikationsreaktionen 7 und die Waschoperationen 6 der chemischen Degradation an fester Phase mit den immobilisierten DNA-Proben 5 werden realisiert, indem man die Stifte 1.1 der Probenhalter 1 in größere Gefäße mit den jeweiligen Lösungen bzw. chemischen Reagenzien eintaucht und dort für den notwendigen Zeitraum beläßt. Zur Durchführung der Piperidinreaktion sowie der chemischen Elution taucht man die Stifte 1.1 der vier Probenhalter 1 in vier verschiedene Mikrotiterplatten 2.1 der Träger für Reaktionsgefäße 2, die mit 10% Piperidinlösung 8 gefüllt sind, und erhitzt die Lösung für 30 min auf 9O⁰C. Die Reaktionsgefäße 2.1 können, müssen aber während der Piperidinreaktion nicht verschlossen sein. Wähl und der Piperidinreaktion erfolgt ein partieller Strangbruch und die chemische Elution des DNA-Materials 5 vom ^Trägersegment 3.1. Anschließend zieht man die Probenhalter 1 aus den Piperidinlösungen S und separiert dadurch auf einfache Weise die Trägersegmente 3.1 vom Eluat. Die Nachbehandlung der degradierten DNA-Proben urfolgt durch Vakuumzentrifuga'Jon 9 in einer speziellen Zentrifuge, deren Rotor die Mikrotiterplatten 2.1 aufnehmen kann.Insertion of the surface support 3 in the surface support holder of the punch 10 by punching the surface support, z. B. CCS paper 3, the pins 1.1 a sample holder 1 provided with η Flächenächsegmentsegmenten.1.1, the a's carrier material for the subsequent immobilization of the DNA fragments is used. All four sample holders 1 are loaded in this way with carrier segments (FIG. 2). To immobilize the labeled DNA fragments on the carrier segments 3.1 of the sample holder pins 1.1 they are moistened with the labeled solutions 4 of the various DNA fragments, which are stored in the reaction vessels 2.1 a microtiter plate. For this purpose, dip the pins 1.1 of each sample holder 1 (one Frobenhalter for one of the four necessary modification reactions G, A + G, T> Pu and C) in the labeled solutions 4 a. The DNA modification reactions 7 and the solid phase chemical degradation washing operations 6 with the immobilized DNA samples 5 are realized by immersing the pins 1.1 of the sample holders 1 in larger vessels with the respective solutions or chemical reagents and there for the necessary Period leaves. To carry out the piperidine reaction as well as the chemical elution, dip the pins 1.1 of the four sample holders 1 into four different microtiter plates 2.1 of the carriers for reaction tubes ² filled with 10% piperidine solution 8 and heat the solution to 90 ° C. for 30 min Reaction vessels 2.1 may, but need not be closed during the piperidine reaction. Dial-up and the Piperidinreaktion occurs a partial strand break and the chemical elution of the DNA from the material 5 rägersegment ^T 3.1. Subsequently, the sample holder 1 is pulled out of the piperidine solutions S, thereby separating the carrier segments 3.1 from the eluate in a simple manner. The post-treatment of the degraded DNA samples is carried out by Vakuumzentrifuga'Jon 9 in a special centrifuge whose rotor can accommodate the microtiter plates 2.1.

Claims

1. Device for sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase, characterized by at least

a) a sample holder (1) consisting of a base plate, in which pins (1.1) are inserted, which have exactly the same length, and which is provided with an orientation,

b) a support for reaction vessels (2) with reaction vessels (2.1), which are optionally provided with lids and seals,

c) and possibly a punch (10), which consists of a base plate with embedded punching lines (10.1), a cutting plate (10.3) and a surface carrier, wherein the punching pins (10.1) have a larger diameter than the pins of the sample holder (1.1), However, they have the same spatial distribution pattern, and at the end have a cavity (10.2) having a larger diameter, but a fraction of the length of the pins of the sample holder (1.1), wherein sample holder (1), carriers of the reaction vessels (2) and Punch (10) are combined so that the distance of the pins of the sample holder (1.1) corresponds to the pattern of the reaction vessels (2.1) of the carrier for reaction vessels (2), and the pins of the sample holder (1.1) exactly in the cavity (10.2) Punch pins (10.Ί) fit.

2. Apparatus according to claim 1, characterized in that one uses as reaction vessels (2.1) microtiter plates, which are embedded in the carrier of the reaction vessels (2) and are easily interchangeable.

3. Device according to claim 1, characterized in that one uses as reaction vessels (2.1) vessels with a volume .Wischen 5 »ird 2000μΙ, which are embedded in the support of the reaction vessels (2) and are connected to a special frame for simultaneous replacement ,

4. A method for sequence analysis of DNA by chemical degradation on solid phase by means of device according to claim 1 to 3, characterized in that in each case four sample holder (1) and five carriers with reaction vessels (2) are combined with each other, that the carrier materials by stinging, clamping , Glueing, fitting or coating on the pins (1.1) of all Pmbenhalter (1) are attached and then the sequence analysis of the DNA by chemical degradation on solid phase according to known methods with the sample holders (1), wherein first to be sequenced and Secondly, the labeled DNA samples are bound by immersing the pins of all four sample holder in the reaction vessels of the first carrier to the carrier segments of the sample holder pins (1.1), third, all other chemical and physical operations of the process such as washing n, DNA Modifikaf on, piperidine reaction and simultaneous chemical elution with the immobilisates by teuch the sample holder pins into the appropriate reagents and solutions, fourthly following the piperidine reaction and simultaneous chemical elution removed all sample holders with their pins from the reaction vessels of all carriers and fifth The eluates are concentrated with the chemically degraded DNA samples by transferring the reaction vessels in a vacuum centrifuge and lyophilization to dryness.

5. The method according to claim Λ, characterized in that the attachment of the carrier segments to the pins (1.1) of all Probenr age (1) by piercing occurs in that a surface carrier (3) in the surface carrier holder of the punch (10) is inserted by Punch carrier segments (3.1) on the pins (1.1) of all sample holder (1) are transferred.

6. The method according to claim 4, characterized in that the loading of the pins (1.1) of all sample holders (1) by coating with a suitable organic carrier material takes place in that the sample holder pins (1.1) in a corresponding suspension, dispersion or solution of unshaped organic polymers or their monomeric components optionally immersed with solvent additives, if necessary, carried out a reaction and then dried.

For this 2 pages drawings