DD279268A1

DD279268A1 - METHOD FOR PRODUCING AN AUTONOMY REPLICATING VECTOR

Info

Publication number: DD279268A1
Application number: DD32477889A
Authority: DD
Inventors: Annegret Heidl; Laima P Tichomirowa; Herbert Weber; Gerold Barth; Hans-Georg Mueller; Wolf-Hagen Schunck
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-01-01
Filing date: 1989-01-01
Publication date: 1990-05-30

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines autonom replizierenden Vektors, insbesondere fuer die Hefe Yarrowia lipolytica. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein mitochondriales Fragment der Hefe Candida utilis, das eine autonom replizierende Sequenz beinhaltet, in Kombination mit mindestens einem zum vorgesehenen Wirt homologen Markergen in einen Hefe-E. coli-shuttle-Vektor einkloniert wird. Bevorzugte Ausfuehrungsformen sind: ein 3-4 kb grosses, gegebenenfalls modifiziertes mitochondriales Fragment, das homologe Markergen LEU 2 aus Yarrowia lipolytica, das heterologe Gen fuer die Biosynthese von P-450 von Candida maltosa und der Hefe-E. coli-shuttle-Vektor Yep 24.The invention relates to a method for producing an autonomously replicating vector, in particular for the yeast Yarrowia lipolytica. Field of application of the invention is biotechnology. The process according to the invention is characterized in that a mitochondrial fragment of the yeast Candida utilis which contains an autonomously replicating sequence in combination with at least one marker gene which is homologous to the intended host is introduced into a yeast E. coli shuttle vector is cloned. Preferred embodiments are: a 3-4 kb, optionally modified mitochondrial fragment, the homologous marker gene LEU 2 from Yarrowia lipolytica, the heterologous gene for the biosynthesis of P-450 of Candida maltosa and the yeast E. coli shuttle vector Yep 24.

Description

Hierzu 3 Seiten ZeichnungenFor this 3 pages drawings

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines autonom replizierenden Vektors, insbesondere für die Hefe Yarrowia lipolytica. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Biotechnologie und die molekularbiologische Grundlagenforschung.The invention relates to a method for producing an autonomously replicating vector, in particular for the yeast Yarrowia lipolytica. Field of application of the invention are biotechnology and basic molecular biological research.

Characteristic of the known state of the art

Für die industriell nutzbare Hefe Yarrowia Lipolytica sind bisher keine autonom replizierenden Vektoren bekannt (Gaillardin et al., 1985, Current Genet. 1935,10: 49-58,For the yeast yeast Yarrowia lipolytica which can be used industrially, no autonomously replicating vectors are known (Gaillardin et al., 1985, Current Genet. 1935, 10: 49-58,

Wing, R. Α., Ogrydziak, D. M. in: Molecular Genetics of filamentous fungi, UCCLA Symposia, Vol. 34 1985: 367-382). Eine Vielzahl von Versuchen, rekombinante Vektoren mit homologen oder heterologen Merkmalen in Yarrowia Lipolytica einzubauen, führten stets zur chromosmalen Integration (Davidow et al. 1985, Current Genet, 10: 39-489), Patentanmeldung Davidow, L.S., Oe Zeeuw, J. R. (USA): EP 138508, Gaillardin, C. et al. (Frankreich): EP 166659. Diese chromosomale Integration ergibt nur eine geringe Kopiezahl der eingeführten Gene. Auf Grund fehlender autonom replizierender Vektoren für Yarrowio lipolytica ist es bisher nicht möglich, die Genproduktbildung über eine mögliche Kopiezahlerhöhung des Vektors zu beeinflussen. Ein weiterer Nachteil best3ht darin, daß eine Rückisolation chromosomal integrierter Plasmide methodisch schwierig ist. Wirts-Vektor-Systeme für Yarrowia Lipolytica sind in WP: Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Mikroorganismen vom 23.12.1987 bereits vorgeschlagen worden, autonom replizierende Vektoren wurden dazu aber noch nicht konstruiert.Wing, R.Α., Ogrydziak, D.M .: Molecular Genetics of Filamentous Fungi, UCCLA Symposia, Vol. 34, 1985: 367-382). A variety of attempts to incorporate recombinant vectors with homologous or heterologous features in Yarrowia Lipolytica have always led to chromosomal integration (Davidow et al., 1985, Current Genet, 10: 39-489), patent application Davidow, LS, Oe Zeeuw, JR (USA ): EP 138508, Gaillardin, C. et al. (France): EP 166659. This chromosomal integration gives only a low copy number of the introduced genes. Due to the lack of autonomously replicating vectors for Yarrowio lipolytica, it has not hitherto been possible to influence gene product formation via a possible increase in the number of copies of the vector. A further disadvantage is that back-isolation of chromosomally integrated plasmids is methodically difficult. Host-vector systems for Yarrowia Lipolytica have already been proposed in WP: Methods for the Production of Recombinant Microorganisms of 23.12.1987, but autonomously replicating vectors have not yet been constructed.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, für Wirts-Vektor-Systeme speziell der Hefe Yarrowia lipolytica, einen autonom replizierenden Vektor zu konstruieren.The invention aims to construct, for host-vector systems specifically of the yeast Yarrowia lipolytica, an autonomously replicating vector.

Explanation of the essence of the invention

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines autonom replizierenden Vektors, insbesondere für die Hefe Yarrowia lipolytica, ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Hefe-Ε. coli-shuttle-Vektor mit mindestens einem zum vorgesehenen Wirt, homologen Markergen und mit einem mitochondrialen Fragment der Hefe Candida utilis, das eine autonom replizierende Sequenz beinhaltet, verbunden wird.The inventive method for producing an autonomously replicating vector, in particular for the yeast Yarrowia lipolytica, is characterized in that a yeast Ε. coli shuttle vector is linked to at least one of the intended host, homologous marker gene and a mitochondrial fragment of the yeast Candida utilis, which contains an autonomously replicating sequence.

Das mitochondriale Fragment aus der Hefe Candida utilis ist vorzugsweise 3-4kb groß und wird ggf. vor dor Einführung in den Hefe-E.coli shuttle-Vektor modifiziert. Die Modifikation erfolgt z. B. durch Rekonstruktion von Restriktionsstellen. Das Einklonieren erfolgt bevorzugt in den Hind Ill-Ort des Vektors, es sind aber auch andere Restriktionsorte geeignet. Die Wahl richiet sich nach der Modifikation des mitochondrialen Fragments und den Restriktionsschnittstellen des Vektors. Als Hefe-E.colishuttle-Vektor wird vorzugsweise Yep 24 verwendet. Als homologes Markergen ist LEU 2, bzw. ein Gen der Histidinbiosynthese oder ein Gen der Argjninbiosynthese,) aus der Hefe Yarrowia lipolytica gut geeignet.The mitochondrial fragment from the yeast Candida utilis is preferably 3-4kb in size and may be modified prior to introduction into the yeast E. coli shuttle vector. The modification takes place z. B. by reconstruction of restriction sites. The cloning preferably takes place in the Hind III site of the vector, but other restriction sites are also suitable. The choice depends on the modification of the mitochondrial fragment and the restriction sites of the vector. Yep 24 is preferably used as the yeast E. coli shuttle vector. As a homologous marker gene LEU 2, or a gene of histidine biosynthesis or a gene of Argjninbiosynthese,) from the yeast Yarrowia lipolytica is well suited.

Als Beispiel für heterologe, zu expremierende Gene, welche in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, sind Cytochrom P-450 Proteine und der gewebespezifische Plasminogenaktivator geeignet.As an example of heterologous genes to be expressed, which can be used in the method according to the invention, cytochrome P-450 proteins and the tissue-specific plasminogen activator are suitable.

Die Erfindung soll nachfolgend anhand des Beispiels der Herstellung des Vekturs pA₃ naher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below with reference to the example of the production of the vector pA ₃ .

Als erster Schritt wird aus einer Genbank der Hefe Yarrowia Lipolytica das homologe Markergen LEU 2 gewonnen (Abb. 1). Dazu legt man indem E.coli-Stamm DH 5 eine chromosomale Genbank der Hefe Yarrowia lipolytica an. Dienach Mbol-Spaltung erhaltenen chromsomalen <l-5kb großen DNA-Fragmente werden in den Barn HI-gespaltenen Vektor Yep 24 eingebaut. Nach Transformation der Genbank in den E.coli-Stamm C 600 und anschließendes Replica-Plating können von 100 getesteten Transformatoren 2 leucinprototrophe Klone isoliert werden. Aus diesen Klonen knnn das rekombinante Pasmid pA 1 mit dem Markergen LEU 2 auf dem 4,6kb großen Insert durch Plasmidpräparation, Southernhybridisierung und Restriktionsspaltung nachgewiesen werden.As a first step, the homologous marker gene LEU 2 is obtained from a Yarrowia Lipolytica yeast library (Figure 1). For this purpose, in E.coli strain DH 5, a chromosomal gene bank of the Yarrowia lipolytica yeast is applied. Chromosomal <l-5kb DNA fragments obtained after Mbol cleavage are incorporated into the Barn HI-cleaved Yep 24 vector. After transformation of the Genbank into E.coli strain C 600 and subsequent replica plating, 2 leucine-prototrophic clones can be isolated from 100 transformers tested. From these clones the recombinant plasmid pA 1 with the marker gene LEU 2 can be detected on the 4.6 kb insert by plasmid preparation, Southern hybridization and restriction cleavage.

Aus dem Plasmid pl2 wird nach Hind HI-Restriktion ein 3,4kb großes mitochondriales DNA-Fragment der Hefe Candida utilis gewonnen (Abb. 2).From the plasmid p12, a 3.4 kb mitochondrial DNA fragment of the yeast Candida utilis is obtained after Hind HI restriction (FIG. 2).

Nach Hind HI-Restriktion des rekombinanten Vektors pA, werden 2 Fragmente (4,5kb bzw. 4,6kb) mit dem 3,5kb großen Fragment aus Candida utilis ligiert. Nach Transformation inE.coliC 600 werden Transformanten isoliert, die den etwa 12,5kb großen Vektor pA₃ enthalten. Dieser nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Vektor, bestehend aus dem mitochondrialen Fragment von Candida utilis und dem chromosomalen Fragment mit dem Markergen LEU 2 aus Yarrowia lipolytica, kann ohne vorherige Plasmidlinearisierung z. B. in den Hefestamm Yarrowia Lipolytica B 204-12 C-20 (IMET 43885) mit hoher Transformaiionsfrequenz übertragen werden. Aus leucinprototrophen Transformanten kann das autonom replizierende Plasmid pA₅ isoliert und wieder in E.coli transformiert werden.After Hind HI restriction of the recombinant vector pA, 2 fragments (4.5kb and 4.6kb respectively) are ligated to the 3.5kb fragment from Candida utilis. After transformation into E.coliC 600, transformants containing the approximately 12.5 kb vector pA ₃ are isolated. This vector produced by the process according to the invention, consisting of the mitochondrial fragment of Candida utilis and the chromosomal fragment with the marker gene LEU 2 from Yarrowia lipolytica, can be prepared without previous plasmid linearization z. B. in the yeast strain Yarrowia Lipolytica B 204-12 C-20 (IMET 43885) are transmitted with high transformation frequency. From leucine prototrophic transformants, the autonomously replicating plasmid pA _{5 can be} isolated and transformed back into E. coli.

Es i"t überraschend, daß das mitochondriale Fragment aus Candida utilis in der Hefe Yarrowia lipolytica zur autonomen Vektorreplikation führt. Der Vektor pA₃ eignet sich nicht nur speziell für die Gattung Yarrowia lipolytica, sondern auch für die Gattungen Candida, Saccharomyces und Hansenula.It is surprising that the mitochondrial fragment from Candida utilis in the yeast Yarrowia lipolytica leads to autonomous vector replication.The vector pA ₃ is suitable not only specifically for the genus Yarrowia lipolytica, but also for the genera Candida, Saccharomyces and Hansenula.

Der wesentliche Vorteil des erfindungsgemäß hergestellten Vektors besteht sowohl für die molekularbiologische Grundlagenforschung als auch für die biotechnologische Anwendung, speziell für das Hefesystem Yarrowia lipolytica einerseits in der Möglichkeit der direkten Reisolation des Vektors aus Transformanten, andererseits in der Möglichkeit, verschiedene homologe der heterologe Gene i ι Verbindung mit geeigneten starken Promotoren einzuklonieren und deren Expression durch Kopiezahlerhöhung zu beeinflussen.The main advantage of the vector according to the invention is both for basic molecular biological research and for biotechnological application, especially for the yeast system Yarrowia lipolytica on the one hand in the possibility of direct Reisolation the vector from transformants, on the other hand in the possibility of various homologous heterologous genes i To clone in a compound with suitable strong promoters and to influence their expression by copy number increase.

Damit ist durch das neue Verfahren erstmals eine Möglichksit eröffnet, Fremdgenexpression speziell in Yarrowia lipolytica über autonome Vektorreplikation zu beeinflussen und auf dieser Basis eine technische Nutzung vorzubereiten.This opens up the possibility for the first time to influence foreign gene expression specifically in Yarrowia lipolytica via autonomous vector replication and to prepare a technical use on this basis.

Claims

1. A method for producing an autonomously replicating vector, characterized in that a mitochondrial fragment of the yeast Candida utilis, which contains an autonomously replicating sequence, in combination with at least one intended homologous marker gene in a yeast E. coli shuttle vector is cloned in.

2. The method according to claim 1, dd-gk-, that a 3-4kb large, mitochondrial fragment from the yeast Candida utilis in the Hind HI site of a yeast Ε. coii-shuttie vector is included.

3. The method according to claim 1-2 dd.-gk., that Yep 24 is used as a yeast E. coli shuttle vector.

4. The method according to claim 1 and 2, dd.-gk., that is used as a homologous marker gene LEU 2 from the yeast Yarrowia lipolytica.

5. The method according to claim 1 and 2, dd.-gk., that as a homologous marker gene, a gene of arginine biosynthesis from the yeast Yarrowia lipolytica, is used.

6. The method according to claim 1 and 2, dd.-gk., that is used as a homologous marker gene, a gene of histidine biosynthesis from the yeast Yarrowia lipolytica.