DD276992A3

DD276992A3 - Method for the investigation of ultrafast processes

Info

Publication number: DD276992A3
Application number: DD30812487A
Authority: DD
Inventors: Tobias Damm; Michael Kaschke; Uwe Stamm; Heidrun Wabnitz
Original assignee: Univ Jena Friedrich Schiller
Priority date: 1987-10-21
Filing date: 1987-10-21
Publication date: 1990-03-21
Also published as: DE3831880A1

Abstract

Verfahren zur Messung der ultraschnell ablaufende in Vorgaenge mikroskopischen Proben charakterisierenden optischen Parameter. Die Vorgaenge koennen mit hoher raeumlicher und zeitlicher Aufloesung verrfolgt werden. Verwendet werden zwei Laserstrahlen, ein Anregungs- und ein Teststrahl, die sich in mindestens einem der Parameter Wellenlaenge, Modulation, Polarisationsrichtung und/oder Einfallsrichtung voneinander unterscheiden. Beide Strahlen sind raeumlich unabhaengig voneinander und in beliebiger zeitlicher Abfolge auf die Probe zu bringen.Method for measuring the ultra-fast optical parameters characterizing processes in microscopic samples. The processes can be pursued with high spatial and temporal resolution. Two laser beams are used, an excitation beam and a test beam, which differ in at least one of the parameters wavelength, modulation, polarization direction and / or direction of incidence. Both rays are spatially independent of each other and in any temporal sequence to the sample to bring.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Ve;fahren zur Untersuchung schneller Vorgänge mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in mikroskopischen Proben mit einem Laser-Raster-Mikroskop. Sie läßt sich vorteilhaft bei allen Untersuchungen einsetzen, bei denen eine hohe räumliche Auflösung bei mikroskopischen Objekten mit einer hohen zeitlichen Auflösung kombiniert werden soll. Eine solche Kombination ist von besonderem Interesse bei Objekten aus der Biologie, der Medizin, der Polymerchemie, der Festkörperphysik oder der Halbleiterelektronik.The invention relates to a method for studying fast processes with high spatial and temporal resolution in microscopic samples with a laser scanning microscope. It can be used advantageously in all investigations in which a high spatial resolution is to be combined in microscopic objects with a high temporal resolution. Such a combination is of particular interest in objects from biology, medicine, polymer chemistry, solid state physics or semiconductor electronics.

Characteristic of the known state of the art

Es sind sowohl räumlich als auch zeitlich hochauflösende optische Untersuchungsverfahren (H.Graener, H.R.Felle; Helv.phys.acta 56 [1-3], 393) sowie deren Kombination (M. A. J.Rodgers, Pot.Engin.22, H5 [1983] 521) bekannt. Weiterhin sind zeitauflösende optische Verfahren mit einem Anregungs- und einem Testimpuls bekannt (J.Herrmann, B.Wilhelmi; Laser für ultrakurze Lichtimpulse-Akademie Berlin 1984). Bei den bekannten optischen Verfahren zur Kombination von räumlicher und zeitlicher Auflösung wird eine mikroskopische Probe mit einem kurzen Lichtimpuls angeregt und die entstehende Fluoreszenz zeitaufgelöst registriert. Hierbei läßt sich zwar die hohe räumliche Auflösung des Mikroskops ausnutzen, die zeitliche Auflösung wird jedoch durch die Eigenschaften des verwendeten elektronischen Nachweissystems begrenzt, in dem geschilderten Verfahren durch ein single-photon-counting-System. Es ist dabei eine Zeitauflösung im Bereich von einigen zehn bis hundert Pikosekunden erreichbar, die damit um Größenordnungen über der mit Methoden der Ultrakurzzeitspektroskcpie erreichbaren (gegenwärtig etwa 10 Femtosekunden) liegt. Bei dem genannten Verfahren erweist sich insbesondere die Beschränkung auf fluoreszierende Substanzen als wesentliche Einschränkung der Art der untersuchbaren Objekte.They are both spatially and temporally high-resolution optical investigation methods (H.Graener, HRFelle; Helv.phys.acta 56 [1-3], 393) and their combination (MAJRodgers, Pot.Engin.22, H5 [1983] 521 ) known. Furthermore, time-resolved optical methods with an excitation pulse and a test pulse are known (J.Herrmann, B.Wilhelmi, Laser for ultrashort light impulse academy Berlin 1984). In the known optical methods for combining spatial and temporal resolution, a microscopic sample is excited with a short light pulse and the resulting fluorescence is recorded in a time-resolved manner. Although the high spatial resolution of the microscope can be exploited, the temporal resolution is limited by the properties of the electronic detection system used, in the described method by a single photon counting system. In this case, a time resolution in the range of a few tens to a hundred picoseconds is achievable, which is thus orders of magnitude above that achievable with methods of ultra-short-time spectroscopy (currently about 10 femtoseconds). In the case of the abovementioned method, the restriction to fluorescent substances in particular proves to be an essential limitation of the type of objects that can be examined.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist es, bei der Untersuchung von schnell ablaufenden Elementarprozessen den Informationsumfang zu vergrößern, indem andere spektroskopische Nachweismethoden, unter Beibehaltung der räumlichen Auflösung, angewendet werden, die eine erhöhte zeitliche Auflösung ermöglichen.The aim of the invention is to increase the scope of information in the investigation of fast-running elementary processes by other spectroscopic detection methods, while maintaining the spatial resolution, are applied, which allow an increased temporal resolution.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, schnell ablaufende Prozesse mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung untersuchen zu können und dabei zum einen eine Einschränkung der zeitlichen Auflösung durch eine nachfolgende elektronische Auswertung zu vermeiden und zum anderen die dem gegenwärtigen Stand der Technik entsprechende Einschränkung auf fluoreszierende Untersuchungsobjekte fallen zu lassen.The invention has for its object to be able to investigate fast-running processes with high spatial and temporal resolution and thereby to avoid a limitation of the temporal resolution by a subsequent electronic evaluation and on the other falling the current state of the art restriction to fluorescent objects under investigation allow.

Die Lösung dieser Aufgabe gelingt mit einem Verfahren zur Untersuchung ultraschneller Vorgänge mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in mikroskopischen Proben mit einem Laser-Raster-Mikroskop erfindungsgemäß dadurch, daß bezüglich der Probe mindestens zwei Laserstrahlen ultrakurzer Impulse, von denen mindestens ein orster als Anregungsstrahl und mindestens ein zweiter, der sich in mindestens einem der Parameter Wellenlänge, Modulation, Polarisationsrichtung und/oder Einfallsrichtung von dem ersten unterscheidet, als Teststrahl vorgesehen sind, die räumlich unabhängig voneinander und in boliobigor zeitlicher Abfolge auf die Probe gebracht werden können.The solution of this problem is achieved with a method for investigating ultrafast processes with high spatial and temporal resolution in microscopic samples with a laser scanning microscope according to the invention characterized in that with respect to the sample at least two laser beams ultrashort pulses, of which at least one orster as excitation beam and at least a second, which differs in at least one of the parameters wavelength, modulation, polarization direction and / or direction of arrival from the first, are provided as a test beam, which can be spatially independently and in boliobigor temporal sequence on the sample.

Die orfindungsgemäßo Lösung gelingt vorteilhaft dadurch, daß in einem geeigneten Mikroskop mindestens zwei Laserstrahlen ultrakurzer Impulse unabhängig voneinander räumlich auf der Probe positionierbar sind, von denen mindestens einer als Anregungsstrahl und mindostons einer als Toststrahl diont. Der zeitliche Abstand des Auftreffens der ultrakurzen Lichtimpulse auf dor Probo ist beliebig einstellbar.The orfindungsgemäßo solution succeeds advantageous in that in a suitable microscope at least two laser beams of ultrashort pulses are independently positionable spatially on the sample, of which at least one diont as excitation beam and mindostons one as Toststrahl. The time interval between the impact of the ultrashort light pulses on the Probo can be set as desired.

Als Meßgröße diont die Veränderung (der Intensität, Energie, Polarisation und/oder Wellenlänge) dos transmittierten, roflektiorton, gestreuten und/oder gebeugten Teststrahles durch die angeregte Probe.As a measurand diont the change (the intensity, energy, polarization and / or wavelength) dos transmitted, roflektiorton, scattered and / or diffracted test beam through the excited sample.

Durch ct;<) unabhängige räumliche Positioniei barkeit der Strahlen ultrakurzer Impulse erhält man eine raum-zeitliche Auflösung.By ct; <) independent spatial positionability of the beams of ultrashort pulses one obtains a spatio-temporal resolution.

Im Gegensatz zum bekannten zeitlich auflösenden Laserfluoreszenzmikroskop (Einstrahlverfahren), können mit orfindungsgemäßen Verfahren auch Laufzeiteffekte von Anregungszuständen und räumliche Ausbreitungsphänomene (? B.In contrast to the known time-resolved laser fluorescence microscope (single-beam method), it is also possible with the method according to the invention for transit time effects of excitation states and spatial propagation phenomena (?

Diffusion) raum-zeitlich verfolgt werden. Der die Beeinflussung des Teststrahles hervorrufende physikalische Wechselwirkungsmechanismus in der Probe kann dabei spezifisch hinsichtlich des zu untersuchenden Objektes gewählt werden.Diffusion) are tracked spatiotemporally. The physical interaction mechanism in the sample which causes the test beam to be influenced can be selected specifically with regard to the object to be examined.

Beispielsweise lassen sich vorteilhaft nichtlinear-optische Methoden, wie Vierwellenmischung (FWM), kohärente Antistokas-Raman-Streuung (CARS), Frequenzverdopplung (SHG) u.a. ausnutzen. Bei diesen Methoden ist die Zeitauflösung nur durch die Dauer der verwendeten ultrakurzen Lichtimpulse begrenzt.For example, nonlinear optical methods such as four-wave mixing (FWM), coherent antistocas Raman scattering (CARS), frequency doubling (SHG) and the like can be advantageously used. exploit. In these methods, the time resolution is limited only by the duration of the ultrashort light pulses used.

embodiment

Das Wesen der Erfindung soll an zwei Ausführungsbeispielen, die anhand der in der Zeichnung dargestellten Anordnungen beschrieben werden, näher erläutert werden.The essence of the invention will be explained in more detail with reference to two exemplary embodiments which are described with reference to the arrangements shown in the drawing.

Das erste Ausführungsbeispiel betrifft die Untersuchung der raum-zeitlichen Ausbreitung von Erregungszuständen in Nervengeweben. Dabei wird mit einem Laserstrahl ein physiologisches Erregungsizentrum optisch angeregt. Diese Anregung hat eine Veränderung der optischen Eigenschaften des angeregten Gewebes zur Folge. Die Veränderung der optischen Eigenschaften des Nervengewebes läßt sich mit optischen Methoden nachweisen (z. B. Messung der Reflektivität oder Absorption). Die physiologisch bedingte Fortleitung der Erregung kann folglich ebenfalls mit optischen Methoden nachgewiesen werden.The first embodiment relates to the investigation of the spatiotemporal propagation of excitation states in nerve tissues. In this case, a physiological excitation center is optically excited with a laser beam. This excitation results in a change in the optical properties of the excited tissue. The change in the optical properties of the nerve tissue can be detected by optical methods (eg measurement of reflectivity or absorption). The physiologically induced conduction of the excitation can therefore also be detected by optical methods.

Bei der in der Fig. 1 dargestellten Anordnung wird ein Laser 1 durch einen Steuerimpuls vor. einem Computer 11 gezündet, er emittiert einen optischen Anregungsimpuls, der über ein Spiegelsystem 4 und ein Mikroskopobjektiv 5 auf die Probe fokussiert wird. Durch Absorption dieses Laserimpulses wird der bestrahlte Ort der Probe angeregt. Nach einer vom Computer 11 vorgegebenen Zeitverzögerung At wird ein Laser 2 gezündet, dessen optischer Testirnpuls über ein zweites Positioniersystem 7 und das Objektiv 5 ebenfalls die Probe 6 erreicht. Da die Systeme 4 und 7 unabhängig voneinander arbeiten, ist eine freie Wahl des räumlichen Abstandes 8 zwischen Anregungs-und Testort auf der Probe 6 möglich. Die Intensität des Testimpulses nach der Probe wird mit einem Detektor gemessen, digitalisiert und im Computer 11 abgespeichert. Durch rasterförmiges Verschieben der Probe 6 mit einem x-y-Tisch, dessen Position der Computer 11 vorgibt, wird ein Bild aufgenommen und auf dem Monitor 3 dargestellt, das die Eigenschaften der Probe an jedem Punkt nach einer Zeit At nach der Anregung im Abstand 0 zeigt. Durch Variation des Abstandes und der Zeit At kann die Laufzeit der Erregungszustände gemessen werden. In einem zweiten Ausführungsbeispiei werden die chneh einen integrierten Schaltkreis laufenden elektrischen Schaltflanken verfolgt. Dazu wird die Strahlung eines modensynchronisierter, cw-Lasers 1, der einen kontinuierlichen Zug von sehr kurzen Lichtimpulsen aussendet, mit einem Teilerspiegel 12 geteilt. Der größere Teil (Anregungsimpuls 8) des Laserstrahls wird über eine optische Verzögerungsleitung 13 und ein MiKroskopobjektiv 14 auf den zu untersuchenden Schaltkreis 15 fokussiert. Hier wird durch die erzeugten Photoelektronen ein ausgewählter Transistor periodisch mit den Laserimpulsen umgeschaltet, so daß elektrische Schaltflanken synchron zu den Laserimpulsen durch den Schaltkreis laufen. Der zweite Teil des Laserstrahls (Testimpuls 19) wird durch ein Ablenksystem 17 und das Objektiv 14 auf den Schaltkreis fokussiert und rasterförmig abgelenkt. Der durch diesen Strahl an jedem Objektpunkt erzeugte Photostrom wird aus dem Betriebsstrom mit dem Widerstand 16 in eine Signalspannung U_s umgewandelt, die zum Aufbau eines Photostrombildes dient. Aus diesem Bild kann auf den logischen Zustand des durch den Testimpuls bestrahlten Transistors zur Zeit des Eintreffens dieses Impulses geschlossen werden. Durch Variation der Zeitverschiebung zwischen den Impulsen 18 und 19 von Bild zu Bild kann das Laufen der SchaltflanKe verfolgt werden.In the arrangement shown in Fig. 1, a laser 1 by a control pulse before. ignited by a computer 11, it emits an optical excitation pulse, which is focused on the sample via a mirror system 4 and a microscope objective 5. By absorbing this laser pulse, the irradiated location of the sample is excited. After a time delay Δt predetermined by the computer 11, a laser 2 is ignited whose optical test pulse reaches the sample 6 via a second positioning system 7 and the objective 5. Since the systems 4 and 7 operate independently, a free choice of the spatial distance 8 between the excitation and test location on the sample 6 is possible. The intensity of the test pulse after the sample is measured with a detector, digitized and stored in the computer 11. By moving the sample 6 with an xy table whose position the computer 11 dictates, an image is taken and displayed on the monitor 3, which shows the properties of the sample at each point after a time Δt after the excitation at a distance 0. By varying the distance and time At, the duration of the excitation states can be measured. In a second embodiment, the chneh are tracked an integrated circuit running electrical switching edges. For this purpose, the radiation of a mode-synchronized cw laser 1, which emits a continuous train of very short light pulses, is divided by a splitter mirror 12. The greater part (excitation pulse 8) of the laser beam is focused via an optical delay line 13 and a MiKroskopobjektiv 14 on the circuit 15 to be examined. Here, a selected transistor is periodically switched by the generated photoelectrons with the laser pulses, so that electrical switching edges run synchronously to the laser pulses through the circuit. The second part of the laser beam (test pulse 19) is focused by a deflection system 17 and the lens 14 on the circuit and deflected in a raster pattern. The photocurrent generated by this beam at each object point is converted from the operating current with the resistor 16 into a signal voltage U _s , which serves to build up a photocurrent image. From this image, the logic state of the transistor irradiated by the test pulse at the time of arrival of this pulse can be inferred. By varying the time shift between the pulses 18 and 19 from frame to frame, the running of the switching edge can be tracked.

Claims

A method for measuring the ultra-fast running processes in microscopic samples characterizing optical parameters with high spatial and temporal resolution with a laser scanning microscope, characterized in that in the laser scanning microscope at least two laser beams ultrashort pulses, of which at least a first as Excitation beam and at least a second, which differs from the first in at least one of the parameters wavelength, modulation, polarization device and / or direction of arrival, are provided as a test beam, which are spatially independently and with mutual temporal reference to the sample.

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