DD272474A1

DD272474A1 - METHOD FOR OBTAINING A COMPLEX ENZYMPRAEPARATE WITH PROTEINASE AND PEPTIDASE ACTIVITY

Info

Publication number: DD272474A1
Application number: DD31666988A
Authority: DD
Inventors: Joerg Walpuski; Reiner Radosta; Alfred Taeufel; Heinz Ruttloff
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1988-06-13
Filing date: 1988-06-13
Publication date: 1989-10-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines komplexen Enzympraeparates mit Proteinase- und Peptidaseaktivitaet. Das Enzympraeparat ist in der Lebensmittelindustrie sowie fuer spezielle Anwendungsgebiete, z. B. in der Medizin, einsetzbar. Erfindungsgemaess werden Getreidekeime, vorzugsweise Weizen- und Roggenkeime, einer waessrigen Extraktion unterworfen. Nach Trennung des Rohextraktes von grobdispersen und feindispersen Partikeln durch Zentrifugation bzw. Klaerfiltration erfolgt eine weitere Reinigung und Konzentrierung des geklaerten Rohextraktes durch Ultrafiltration, Diafiltration und Entkeimungsfiltration. Der gereinigte und konzentrierte Getreidekeimextrakt wird durch Zerstaeubungstrocknung in ein Festpraeparat mit Proteinase- und Peptidaseaktivitaet ueberfuehrt.The invention relates to a process for obtaining a complex enzyme preparation with proteinase and peptidase activity. The Enzympraeparat is used in the food industry and for special applications, such. B. in medicine, can be used. According to the invention, cereal germs, preferably wheat and rye germs, are subjected to an aqueous extraction. After separation of the crude extract of coarsely dispersed and finely dispersed particles by centrifugation or Klaerfiltration carried out further purification and concentration of the clarified crude extract by ultrafiltration, diafiltration and sterilization filtration. The purified and concentrated cereal germ extract is transferred by spray drying to a solid preparation with proteinase and peptidase activity.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren 2ur Gewinnung eines komplexen Enzympräparat mit Proteinase- und Peptidaseaktivität aus Getreidekeimen, vorzugsweise aus Weizen· odor Roggenkeimen. Nach dem orfindungsgomäßcn Verfahren gewonnene E/izympräparate sind in der Lebensmittelindustrie sowie speziellen Anwendungsgebieten, z. B. in der Medizin, einsetzbar.The invention relates to a process for the recovery of a complex enzyme preparation with proteinase and peptidase activity from cereal germs, preferably from wheat or rye germs. E / izympräparate obtained by the orfindungsgomäßcn method are in the food industry and special applications, eg. B. in medicine, can be used.

Charakteristik der bekannton technischen LösungenCharacteristic of the bekannton technical solutions

Der Stand der Technik Ist Im wesentlichen durch einen Hinwels von FLACZYK und KAMINSKI in einer Originalarbeit (Przemysl Spozywczy 32 [12), 466-468 (1978)) erfaßt; sie stellen darin Präparate mit proteolytlscher Wirkung aus Getreideerzeugnissen vor. Sie extrahieren Weizenkeime, Roggenkeime und Matzkeime mit einer 10%igen Ammoniumsulfetlösung, fällen mit Ammoniumsulfat in Konzentrationen von 40 bis 70% fraktioniert aus, anschließend wird die Lösung dialyslert und lyophllielert. Die Autoren geben an, daß nach den aufgeführten Verfahroneschritten die proteolytlsche Aktivität in den Präparaten im Durchschnitt 2,8fach höher liegt als Im Ausgangsextrakt, wobei die gemessenen Enzymaktivitäten al* gering einzuschätzen sind. Durch den Einsatz hoher Salzkonzentrationen beim Extrahieren und Fällen ist davon auszugehen, daß ouch das Präparat eine sehr hohe Salzkonzentration aufweist, die sich bei einer Applikation nachteilig auswirken kann.The prior art is essentially covered by a reference by FLACZYK and KAMINSKI in an original paper (Przemysl Spozywczy 32 [12], 466-468 (1978)); they present preparations with proteolytic action from cereal products. They extract wheat germ, rye germs and matzo germs with a 10% ammonium sulphate solution, fractionate with ammonium sulphate in concentrations of 40 to 70%, then dialyze the solution and lyophilize. The authors state that the proteolytic activity in the preparations is on average 2.8 times higher in the preparations than in the starting extract, whereby the measured enzyme activities are low. Due to the use of high salt concentrations during extraction and precipitation, it can be assumed that the preparation also has a very high salt concentration, which may have an adverse effect on application.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, die Proteinase- und Peptidaseaktivitäten von Getreidekeimen zu extrahieren und in einer für die Applikation geeigneten Form und Qualität bei möglichst geringem Aktivitätsverlust nutzbar zu machen. Der Erfindung liegt demzufolge die Aufgabe zugrunde, spezielle bzw. detaillierte Verfahrensbedingungen aufzuzeigen, die die obige Zielstellung zu realisieren gestatten.The aim of the invention is to extract the proteinase and peptidase activities of cereal germs and to make them usable in a form and quality suitable for the application with the least possible loss of activity. The invention is therefore based on the object to show special or detailed process conditions that allow to realize the above objective.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur Gewinnung eines komplexen Enzympräparates mit Protelnase· und Peptidaseaktivität aus Getreidekeimen, vorzugsweise Weizen· und Roggenkeimen, die Getreidekeime entweder unbehandelt in der bei ihrer Gewinnung anfallenden Form oder vorbehandelt verwendet werden. Die eingesetzten Getreidekeime können vor den eigentlichen Sehandlungsschritten gemahlen und/oder entfettet sein. Die unbehandelten oder auch behandelten Getreidekeime werden folgenden Behandlungsschritton unterworfen:According to the invention, the object is achieved by using cereal germs either untreated in the form obtained during their production or pretreated to obtain a complex enzyme preparation with protelnase and peptidase activity from cereal germs, preferably wheat and rye germs. The cereal germs used can be ground and / or degreased before the actual Sehandlungsschritten. The untreated or treated cereal germs are subjected to the following treatment stepon:

Wäßrige Extraktion der Keime, Fest-flüssig-Trennung des Rohextraktes von grobdispersen sowie feindiopersen Partikeln, Ultrafiltration des geklärten Extraktes, Diafiltration des bei der Ultrafiltration anfallenden Retentates, Entkeimungsfiltration der anfallenden Lösung und nachfolgende schonende Trocknung (Zerstäubungstrocknung bzw. Gefriertrocknung).Aqueous extraction of the germs, solid-liquid separation of the crude extract of coarsely dispersed and feindiopersen particles, ultrafiltration of the clarified extract, diafiltration of the resulting in ultrafiltration retentate, sterilization filtration of the resulting solution and subsequent gentle drying (spray drying or freeze-drying).

Die wäßrige Extraktion wird bei Extraktionszeiten von 1 bis 120min, vorzugsweise 30 bis 90min, und intensiver DurchmischungThe aqueous extraction is at extraction times of 1 to 120min, preferably 30 to 90min, and intensive mixing

(z. B. Rühren, Schütteln) in einem Temperaturbereich von 293 K bis 333K, vorzugsweise von 303K bis 313K, und im sauren bis neutralen pH-Bereich, vorzugsweise bei pH 3,5 bis 4,5, durchgeführt. Als wäßrige Extraktionsmedien kommen dabei entsprechend pH-Wert eingestelltes Leitungs- oder destilliertes Wasser, vorzugsweise Puffersysteme, zum Einsatz.(For example, stirring, shaking) in a temperature range from 293 K to 333 K, preferably from 303 K to 313 K, and in the acidic to neutral pH range, preferably at pH 3.5 to 4.5 performed. Suitable aqueous extraction media are in accordance with pH adjusted tap or distilled water, preferably buffer systems used.

Dia Menge der zu extrahierenden Getreidekeime, bezogen auf die Extraktionsmittelmenge, wird erfindungsgemäß so gewählt, daß sie zwischen 5 und 30Gew.-%, vorzugsweise zwischen 10 und 25Gew.-%, liegt.The amount of cereal germs to be extracted, based on the amount of extractant, is chosen according to the invention as being between 5 and 30% by weight, preferably between 10 and 25% by weight.

Durch Fest-flüssig-Trennung des Rohextraktes erfolgt die Abtrennung grobdisperser Partikel mittels Zentrifugation bei 9000G und die der feindispersen Partikel durch Filtration über ausgewählte Filterschichten. Es kommen Klärschichten KK5 und Entkeimungsschichten SKS zum Einsatz.By solid-liquid separation of the crude extract, the separation of coarsely dispersed particles by centrifugation at 9000G and the finely dispersed particles by filtration through selected filter layers. Klärschichten KK5 and degerming layers SKS are used.

Die Ultrafiltration und gegebenenfalls eine Reinigung der hochmolekularen Fraktion durch kontinuierliche Diafiltration im pH-Bereich von 3,5 bis 4,5, vorzugsweise 3,8, erfolgt zur Konzentrierung von hochmolekularen Enzymproteinen und Abtrennung niedermolekularer Bestandteile. Danach werden ausgefällte enzymatisch unwirksame Verunreinigungen durch Sterilfiltration über SKS-Schichten abgetrennt.The ultrafiltration and optionally purification of the high molecular weight fraction by continuous diafiltration in the pH range from 3.5 to 4.5, preferably 3.8, takes place for the concentration of high molecular weight enzyme proteins and separation of low molecular weight components. Thereafter, precipitated enzymatically inactive impurities are separated by sterile filtration through SKS layers.

Für don Ultrafiltratlons- und Diafiltrationsprozeß wird eine Zelluloseacetat-Membran CA-M-UF 80-CP (DDR) verwendet, die tangential durch eine pulsierende Strömung mit einer transmembranen Druckdifferenz von 0,2 bis 0,4 MPa angeströmt wird. Der Ultrafiltrationsprozeß wird bis zu einem Volumenkonzentrierungsgrad von 8 bis 15, vorzugsweise 10, und der Diafiltrationsprozeß zu einem Reinigungsfaktor von 2,5 bis 4, vorzugsweise 3,0, im Temperaturbereich von 293 K bis 295 K durchgeführt.For ultrafiltration and diafiltration process, a cellulose acetate membrane CA-M-UF 80-CP (DDR) is used, which is tangentially flowed through a pulsating flow with a transmembrane pressure difference of 0.2 to 0.4 MPa. The ultrafiltration process is carried out to a volume concentration degree of 8 to 15, preferably 10, and the diafiltration process to a purification factor of 2.5 to 4, preferably 3.0, in the temperature range of 293 K to 295 K.

Das erhaltene gereinigte komplexe Enzymkonzentrat wird anschließend mittels Zerstäubungstrocknung bei einer Zulufttemperatur von 413 K bis 433 K und einer Ablufttemperatur von 343 K bis 353 K in den festen, stabilen Zustand überführt.The resulting purified complex enzyme concentrate is then converted into the solid, stable state by means of spray drying at an inlet air temperature of 413 K to 433 K and an exhaust air temperature of 343 K to 353 K.

Des erfindungsgemäß gewonnene komplexe Enzympräparat enthält saure Proteinase, Peptidase, Kohlenhydrate, niedermolekulare Verbindungen (Glucose) sowie Protein.The complex enzyme preparation obtained according to the invention contains acidic proteinase, peptidase, carbohydrates, low molecular weight compounds (glucose) and protein.

Die Erfindung wird in dem nachstehenden Ausführungsbeispiel näher erläutert:The invention is explained in more detail in the following exemplary embodiment:

AusfOhrungsbelspielAusfOhrungsbelspiel

600g gemahlene Weizenkeime werden in 4,810,1 M Acetatpuffer pH 3,8 suspendiert und 1 h bei 30⁰C im Shaker bei einer Frequenz von 250U/mln behandelt.600g ground wheat germs are suspended in 4,810,1 M acetate buffer pH 3.8 and 1 h at 30 ⁰ C in a shaker at a frequency of 250U / mln treated.

Der grob- und feindisperse Partikel enthaltende Rohextrakt wird mittels Westfalia-Kammer-Separator Typ KDD605 bei 90O0G und Druckfiltration bei 0,2MPa über KKö-Klärschichten bzw. SKS-Entkeimungsschichten unter Verwendung des Filtrationsgerätes Sartorius SM16505 vollständig geklärt. Die so entstehende helle klare Extraktlösung besitzt einen Trockensubstanzgehalt von 33,1 mg -ml"¹, eine Gesamtkohlenhydratkonzentration von 21,6mg · ml"¹ und eine proteolytische Enzymaktivität von 4,0 Tyrosin-Einheiten ml"¹ (1).The crude extract containing coarse and finely dispersed particles is completely clarified by means of Westfalia chamber separator type KDD605 at 90 ° C. and pressure filtration at 0.2 MPa via KKö clarification layers or SKS degerming layers using the filtration device Sartorius SM16505. The resulting bright clear extract solution has a dry matter content of 33.1 mg ML ^"1, a total carbohydrate concentration of 21,6mg · ml" ^1, and a proteolytic enzyme activity of 4.0 units of tyrosine-ml ^"1 (1).

31 dieser Extraktlösung werden mit einer AMICON TCF 10-Ultrafiltrationszelle mit Zwischenbehälter und Konzentrations-Dialyse-Wähler CDS 10 einer 10fachen Konizentrierung unter Verwendung einer Zelluloseacetatmembran CAM-UF 80-CP (DDR) mit pulsierender Membrananströmung (0,2-0,4 MPa), einer Überströmungsgeschwindigkeit von 12Ih"¹, unter Temperatur-(293 K) und pH-Konstanthaltung (3,8) unterworfen. Das entstehende UF-Konzentrat, das nur noch einen Trockensubstanz· und31 of this extract solution are mixed with an AMICON TCF 10 ultrafiltration cell with intermediate container and concentration dialysis dial CDS 10 a 10-fold Konizentrierung using a cellulose acetate membrane CAM-UF 80-CP (DDR) with pulsating membrane flow (0.2-0.4 MPa) , an overflow rate of 12 ¹ ", under temperature (293 K) and pH constant maintenance (3.8) .The resulting UF concentrate, the only one dry substance · and

Kohlenhydratgehalt von 30% der Auegangslösung besitzt, wird dann mit einem 3fachen 0,1 M Acetatpuffervolumen (pH - 3,8) unter gleichen Betriebsparametern kontinuierlich dlaflltlert. Das Dlakonzentrr.t enthält noch 12% der Ausgangstrockensubstanz und 15% der Gesamtkohlenhydrate. Die Permeate der Ultra· und Diafiltration enthalten keine Protease· bzw. Peptldaseaktlvltät. Die Enzymausbeute im Retentat betrögt 80%, wahrend die Membranbedeckung mit 2% Gesamtkohlenhydraten, 1 % Trockensubstanz und 8% Enzymprotein gering ist.Carbohydrate content of 30% of the starting solution is then continuously diluted with a 3-fold 0.1 M acetate buffer volume (pH - 3.8) under the same operating parameters. The Dlakonzentrr.t still contains 12% of the initial dry matter and 15% of the total carbohydrates. The permeates of the ultrafiltration and diafiltration contain no protease or peptide dehydrator activity. The enzyme yield in the retentate is 80%, while the membrane coverage with 2% total carbohydrates, 1% dry matter and 8% enzyme protein is low.

Das Diakonzentrat wird dann in einem Laborsprühtrockner (Firma Büchl, Typ 190, Schweiz) bei einer Zulufttemperatur von 430 K und einer Ablufttemperatur von 350K schonend versprüht. Enzymverluste sind nicht nachweisbar. Das anstehende helle Trockenpräparat (9g) mit einer Restfeuchte von 4,5% ist charakterisiert durch: Protelnaseaktivität (1)1160TE · g"¹ Peptidaseaktivität (217OmU · g"^r Gesamtkohlenhydratgehalt: 16,6% Proteingehalt: 56,5%The diaconal concentrate is then gently sprayed in a laboratory spray dryer (company Büchl, type 190, Switzerland) at an inlet air temperature of 430 K and an exhaust air temperature of 350K. Enzyme losses are undetectable. The upcoming bright dry preparation (9 g) with a residual moisture content of 4.5% is characterized by: protelase activity (1) 1160TE · g " ¹ peptidase activity (217 μM · g" ^r total carbohydrate content: 16.6% protein content: 56.5%

Das sprühgetrocknete Diakonzentrat besitzt nach sechsmonatiger Lagerung im Kühlschrank (+4"C) noch seine volle Enzymaktivität.The spray-dried diaconal concentrate still has its full enzyme activity after six months of storage in the refrigerator (+4 "C).

(1) Bestimmung der Proteinaseaktivität in Getreide und Mehl, A.Täufel und I.Emmer, Lebensmittelindustrie 35,31 (1988) (2| Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Proteinasen, H.Kirschke und B. Wiederandere, MLU Halle-Wittenberg Wissenschaftliche Beiträge 1984/11 (R84)(1) Determination of proteinase activity in cereals and flour, A.Täufel and I.Emmer, Lebensmittelindustrie 35, 31 (1988) (2 | Methods for determining the activity of proteinases, H. Kirschke and B. Wiederandere, MLU Halle-Wittenberg Scientific articles 1984 / 11 (R84)

Claims

1. A process for obtaining a complex enzyme preparation with protelnase and peptidase from cereal germs, preferably wheat and rye germs, characterized in that the cereal germs either untreated in the resulting in their recovery form or pretreated subsequent treatment steps are subjected to: aqueous extraction of the untreated or pretreated germs, solid-liquid separation of the crude extract of coarsely dispersed and finely dispersed particles, ultrafiltration of the clarified extract, diafiltration of the obtained during ultrafiltration retentate, sterilization filtration and gentle drying of the resulting concentrate.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cereal germs used are ground before the actual treatment steps and / or degreased.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the aqueous extraction is carried out in the acidic to neutral pH range, preferably between pH 3.5 and pH 4.5.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that are used as aqueous extraction media pH-adjusted tap or distilled water, preferably buffer systems used.

5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that the aqueous extraction in the temperature range between 293K and 333K, preferably between 303K and 313K occurs.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the aqueous extraction at extraction times of 1 to 120 minutes, preferably 30 to 90 minutes, and intensive mixing is performed.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the amount of cereal germs to be extracted, based on the extractant amount between 5 and 30Gew .-%, preferably between 10 and 25Gew .-%.

8. The method according to claim 1, characterized in that for the solid-liquid separation of the crude extract, the separation of coarsely dispersed particles by centrifugation at 9000G and that of the finely dispersed particles by filtration through clarification and Entkeimungsschichten.

9. The method according to claim 1, characterized in that for the concentration of high molecular weight enzyme proteins and separation of low molecular weight components, a treatment by ultrafiltration and purification of the high molecular weight fraction by continuous diafiltration.

10. The method according to claim 1, characterized in that previously precipitated enzymatically inactive impurities are separated by sterilization filtration.

11. The method according to claim 1, characterized in that the transfer of the purified complex enzyme concentrate * takes place in the solid, stable state by means of sputtering or freeze-drying.

12. The method according to claim 1 and 9, characterized in that for the ultrafiltration and Diafiltrationsprozeß a cellulose acetate membrane CA-M-UFeoCP is used, which flows tangentially by a pulsating flow with a transmembrane pressure difference of 0.2 to 0.4 MPa becomes.

13. The method according to claim 1 and 9, characterized in that the ultrafiltration process to a Volumenumentrzentrierungsgrad of 8 to 15, preferably 10, and the continuous diafiltration up to a purification factor of 2.5 to 4, preferably 3.0, in the temperature range of 293 to 295 K is performed.

14. The method according to claim 1 and 9, characterized in that the ultrafiltration and diafiltration process in the pH range of 3.5 to 4.5, preferably 3.8, is performed.

15. The method according to claim 1 and 11, characterized in that the spray drying is carried out at a supply air temperature of 413 to 433K and an exhaust air temperature of 343 to 353K.